CENTRO UNIVERSITRIO FRANCISCANO UNIFRA

CURSO DE FARMCIA
CONTROLE BIOLGICO DA QUALIDADE DE MEDICAMENTOS

So substncias que, quando injetadas em pacientes causam

elevao da temperatura corporal (pirexia ou febre), podendo
ser:

EXGENOS: Se originam fora do corpo e induzem elevao

trmica quando injetados em animais e no homem.

Exemplos: Origem bacteriana (e seus componentes Gram (+) e

Gram(-), fungos, vrus e no-microbiana (alguns frmacos,
Prof. Marcos R. dos Santos esterides, fraes do plasma).

ENDGENOS: produzido internamente pelo hospedeiro em

Quando purificadas so denominadas de lipopolissacardeos (LPS) para
resposta ao pirognio exgeno (considerado o mediador
enfatizar a sua natureza qumica, quando no purificadas podem conter
primrio da febre). lpides, carboidratos e protenas.

Exemplos: diferentes substncias sintetizadas por diferentes clulas IMPORTANTE: So termoestveis, porm inativadas por ciclos de
do hospedeiro. calor seco, condies alcalinas ou cidas, capazes de provocar
profundas alteraes fisiolgicas quando administradas via parenteral.

Devido a estas propriedades, fica evidente a necessidade de sua

Constituem uma classe de PIROGNIO, so complexos de alto peso
deteco e eliminao por parte de fabricantes de produtos parenterais.
molecular associados membrana externa de bactrias Gram(-)
negativas e representam a mais significativa fonte de contaminantes
pirognicos de produtos estreis para a indstria farmacutica.

1
 A estrutura qumica das endotoxinas consiste de um
polissacardio, ou longas cadeias de acares, e uma gordura, lipdio A. O
polissacardio, que varia de uma espcie bacteriana para outra,
composto da cadeia 0-especfica (construda por unidades que se
repetem, de trs a oito acares) e os ncleos interno e externo. O lipdio
A contm duas glicosaminas modificadas por fosfato (PO4) e nmero
varivel de cidos graxos.

Quimicamente as ENDOTOXINAS so LIPOPOLISSACARDIOS LPS

CADEIA LATERAL NCLEO UNIDADE

O- ESPECFICA OLIGOSSACARDIO LIPDICA

POLISSACARDIO LIPDIO A

(Carter hidroflico aumenta a potncia) (Funo principal na

endotoxicidade)

2
 PRODUO DE MEDIADORES POR ESTIMULAO DOS
MACRFAGOS POR ENDOTOXINAS

Mensagem
estimulatria
MACRFAGO
LIPOPOLISSACARDIO
Muitas atividades biolgicas so atribudas unidade lipdeo A da
(LPS)
endotoxina, a exemplo:
NCLEO - pirogenicidade;
Receptor CD14 para
Protena de ligao- complexo LPS-PLL - toxicidade letal;
lipopolissacardica
(PLL) - leucopenia seguida de leucocitose;
- necrose da medula ssea;
Mediadores da
febre - queda da presso sangunea;
Lipopolissacardio (LPS) (laranja), liga-se protena de ligao- - agregao plaquetria.
lipopolissacardica (PLL) (verde) no sangue. Ento o complexo ativa o
receptor conhecido como CD14, estimulando os macrfagos a - outros fatores.
produzirem mediadores (esferas vermelhas).

NVEIS DE CONTAMINANTES PIROGNICOS EM

PRODUTOS FARMACUTICOS
Pode ser realizada de duas formas:
formas:
Os limites mximos de endotoxinas (K) em produtos farmacuticos,
atualmente considerados aceitveis pelo FDA, USP, Farmacopia Europia - Inativao
e WHO so:
- Remoo de endotoxinas
Limite mximo de endotoxina
(K)
Rota de (Unidades de Endotoxina
Classe de produto
administrao EU) Hidrlise cido
cido--Base reduz ou elimina a atividade biolgica de
lipopolissacardeos, pela desativao do lipdeo A. Ex:
Ex: HCl ( 30 min a 100
100
C)
Pessoa Kg
Parenterais Intratecal 14 0,2 Oxidao Possivelmente atravs da oxidao dos cidos graxos presentes
no lipdeos A do LPS
LPS.. Ex:
Ex: H2O2.
Radiofrmacos Intravenosa 175 2,5

Parenterais (exceto Parenterais (exceto Alquilao Promove a reduo da atividade via substituio nucleoflica na
350 5,0 ligao glucosamina do lipdeo A. Ex:
Ex: xido de etileno.
etileno.
radiofrmacos) intratecais)

3
Tratamento por calor seco estufas e tneis de conveco, conduo ou Lavagem Utilizando solventes estreis e apirognicos.
apirognicos.
irradiao (infravermelho), para materiais termorresistentes
termorresistentes.. Ex:
Ex: ( 250 C
30
min)
min).. Destilao A gua recentemente destilada, coletada e mantida em frascos
estreis e apirognicos.
apirognicos.
Radiao ionizante Uso de 60Co para a reduo da toxicidade de
endotoxinas bacterianas
bacterianas.. Com este processo, aumenta a possibilidade de Ultrafiltrao Uso de membranas com capacidade de reteno de molculas
alteraes qumicas desconhecidas em frmacos e solues parenterais.
parenterais. com tamanho de 100
100..000 daltons ou maiores.
maiores.

Outros mtodos:
mtodos: Osmose reversa, carvo ativo, atrao eletrosttica, atrao
Polimixina B Antibitico catinico que pode anular a atividade biolgica do por membranas hidrfoba..
LPS.
LPS.

1 Teste da hipertermia em coelhos

Deve-se ressaltar a importncia em trabalhar todo o processo
produtivo em condies adequadas de higiene, dos operadores e
2 Mtodo do lisado de amebcitos do Limulus
ambiente, alm de empregar matrias-primas com baixas cargas (LAL)
microbianas, processos validados, pessoal qualificado e treinado.
- gelificao
Em resumo, aplicar todos os conceitos de BPF, de forma que o - turbidimtrico
- cromognico
produto seja obtido apirognico no primeiro processamento,
dispensando preocupaes quanto processos ou tratamentos 3 Ensaio da cultura da linhagem de clulas
adicionais. Ex.: Clulas Mono Mac-6

4
 Teste da hipertermia em coelhos (5.5.2.1
5.5.2.1 PIROGNIOS)
Pg: 226 Farmacopia 5edio

O teste Oficial de Pirognios em coelhos foi descrito

inicialmente na USP XII em 1942:

Fundamenta-se na medida do aumento da temperatura

corporal dos coelhos, aps injeo intravenosa de dose-limite
de 10 ml por Kg de peso, durante perodo no superior a 10
minutos, de soluo estril da substncia ativa ou produto
farmacutico sob anlise.

Seleo dos animais:

Registro de temperatura:
- coelhos adultos e sadios;
- Utilizar termmetro clnico de preciso, graduado em 0,1 C,
- preferencialmente da mesma raa;
com tempo de elevao mxima previamente determinado ou qualquer
- pesando no mnimo 1,5 kg;
outro dispositivo de registro de temperatura de igual sensibilidade.
- mantidos em gaiolas individuais, livre de perturbaes e sob
- Introduzir no reto do animal profundidade aproximada de 6
temperatura controlada (20 C 2 C);
centmetros.
- a reutilizao de animais s pode ser feita aps 48 horas de
- Se for utilizado registrador, que deva permanecer no reto
descanso, desde que o resultado no tenha sido positivo. Neste caso, ser
durante o perodo de teste, conter os coelhos de maneira que fiquem em
necessrio um perodo de 2 semanas de intervalo.
postura natural de repouso.

5
Adaptao dos animais:
Uma semana antes e at o dia anterior ao ensaio realizar testes
de adaptao simulando as condies do dia do teste:
- acomodar o animais nas caixas de conteno e empregar
o termmetro
- injetar soluo fisiolgica estril (10 mL/kg) simulando a
amostra
- acompanhar e anotar as variaes de temperatura.
Valores acima de 0,3C entre as leituras podem indicar
possibilidade de falso-positivo
- suprimir a alimentao na noite anterior ao ensaio e
durante sua realizao
Procedimento do ensaio:
- Utilizar 3 animais para cada amostra.
- No mnimo 40 minutos antes do ensaio determinar a
temperatura controle (inicial) de cada animal mediante duas
leituras feitas com intervalos de 20 minutos. A mdia das
temperaturas considerada como o valor de T C controle do
animal, que a base para a determinao de qualquer aumento
de temperatura resultante da injeo da soluo teste durante o
ensaio.
- No devem ser usados os animais que apresentarem
desvio maior do que + 0,2 C, nas duas leituras da temperatura
controle.
Preparao da amostra:
- todos os utenslios utilizados para a
diluio/preparao da amostra devem ser apirognicos:
vidraria: 200 C 1 h ou 250 C 30 min.
soluo fisiolgica: 121C 15 min. x 3 ciclos
- realizar a diluio no dia do teste
- dose: 0,5 a 10 mL/kg de soluo na concentrao
especificada na monografia do produto
- aquecer a soluo 37 38C antes de injetar
Procedimento do ensaio:
- A disperso da T C controle entre os animais de cada
grupo no deve ser superior a 1,0 C
- No usar animais com temperatura superior a 39,8 C.
- Injetar pela veia marginal da orelha de trs coelhos a
quantidade indicada na monografia. A injeo no deve durar
mais de 10 minutos, a menos que na monografia se especifique
tempo diferente.
- Registrar a temperatura nos tempos de 1:00, 2:00 e
3:00 horas aps a injeo
6
Interpretao dos resultados:
DESVANTAGENS
Se nenhum coelho apresentar um aumento individual de
temperatura igual ou superior 0,5C, em relao t emperatura - Baixa sensibilidade
controle e a soma dos aumentos dos trs no exceder a 1,4C, o - Custo elevado
produto cumpre com os requisitos do teste de pirognios. - Interferncias na resposta

Se algum dos coelhos apresentar um aumento igual ou - Uso de animais

VANTAGENS
superior a 0,5C, repete-se o teste com outros 5 co elhos. Neste - Qualitativo

caso, se no mais que 3 coelhos apresentarem aumentos - Reproduz resposta

individuais de 0,5 C ou, se a soma dos 8 aumentos individuais de fisiopatolgica
temperatura no exceder a 3,3C, o produto em exame cumpre - Detecta pirognios
com os requisitos do teste de pirognios.

http
http:://www.
//www.acciusa
acciusa..com/lal/product/LAL%
com/lal/product/LAL%20
20Reagents/index
Reagents/index..html

Nestes casos a especificidade da resposta est intimamente

relacionada com endotoxinas, excluindo outras substncias
termognicas.

Teste de toxicidade de pirognio bacteriano em embrio de

galinha.
Resposta txica em camundongos.
Reduo de ferro em ratos.

7
(5.5.2.2) Farmacopia Brasileira 5pg
pg:: 227

MTODO DO LISADO DE AMEBCITOS DO LIMULUS

- LAL -

Princpio:

O teste de endotoxina bacteriana usado para detectar ou quantificar

endotoxinas de bactrias gram negativas presentes em amostras para qual
o teste preconizado. Utiliza
Utiliza--se o extrato aquoso dos amebcitos
circulantes do Limulus polyphemus ou do Tachypleus tridentatus preparado
e caracterizado como reagente LAL.

MTODO DO LISADO DE AMEBCITOS DO LIMULUS

- LAL -

Princpio:

um mtodo in vitro onde diluies da amostra so misturadas

com uma soluo do lisado de amebcitos do caranguejo Limulus
Polyphemus. No caso da presena de endotoxinas bacterianas na
amostra sob anlise, estas produzem uma reao de gelificao
com o lisado atravs de um processo enzimtico, possibilitando a
determinao semi-quantitativa da presena de endotoxinas em
produtos farmacuticos.

8
Informaes gerais do ensaio - Farmacopia Brasileira:
H duas tcnicas com sensibilidade diferente para este teste
teste::
1. MTODO DE COAGULAO EM GEL: GEL: baseado na formao de cogulo
ou gel (mtodo semi
semi--quantitativo)
2. MTODOS FOTOMTRICOS quantitativos que incluem
incluem::
O MTODO TURBIDIMTRICO, (baseado no desenvolvimento de turbidez
aps quebra de um substrato endgeno)
endgeno);
O MTODO CROMOGNICO (baseado no desenvolvimento de cor aps
quebra de um complexo peptdeo sinttico cromgeno).
cromgeno).
Qualquer um destes procedimentos pode ser realizado, a menos que
indicado contrrio na monografia
monografia..
Ponto final de Gelificao
O mais simples e amplamente usado dos procedimentos para
deteco de endotoxinas baseia-se na gelificao.
Mtodo de escolha para testes em nmeros reduzidos ou no
freqentes, para amostras que turvem ou com expectativa de
resultado negativo.
Exemplo: Monitoramento em processos de materiais e da gua.
Informaes gerais do ensaio - Farmacopia Brasileira:
- Vidrarias e descartveis:
- Padro de referncia de endotoxinas (PRE) e padro de
endotoxina (PE): Todas as vidrarias devem ser despirogenisadas em estufa
usando um processo validado. Utilize um tempo e temperatura mnimos de 250 C
por 30 minutos. Se utilizar descartveis plsticos, como ponteiras e pipetas usem
somente os certificados que indicam ser livres de endotoxinas para no haver
interferncia no teste.
- Teste da sensibilidade do reagente LAL (confirmar a
sensibilidade declarada do regente).
- Teste de inibio ou potencializao (determinar possveis
interferncias da amostra sobre o ensaio).
- Mxima diluio vlida (diluio da amostra em que no h
endotoxina detectvel).
Ensaios Turbidimtricos
Permite melhor medida quantitativa da endotoxina em grandes faixas
de concentraes.
Concentrao de endotoxinas x aumento da turbidez
Uso em monitoramentos dirios de gua, permitindo medidas de ao
corretiva em caso de desvio de padro da qualidade.
Necessidade de elaborao de curva padro de endotoxinas, para
interpolao dos resultados obtidos a partir das avaliaes das
amostras.
9
Ensaios Cromognicos
Reao positiva:
positiva:
A reao enzimtica interrompida no final do tempo pr-
Formao de
estabelecido pela adio de reagente, antes das leituras.
gel
gel..
Espectrofotmetro (405 nm).

Necessidade de elaborao de curva padro de endotoxinas, para

interpolao dos resultados obtidos a partir das avaliaes das
amostras.

Outros mtodos
- ensaios de microdiluio.
- ensaio de LAL radiomarcado e fluorescente

ENSAIO DO LISADO DE AMEBCITOS

DO LIMULUS

RESULTADOS FALSO NEGATIVOS

agentes desnaturantes
soro ou plasma
pH < 3 ou > 9
Microplate Absorbance Readers ons clcio > 0,67 M
lipdios, emulses para infuso
glutationa, acetil cistena
cloranfenicol, tetraciclina, oxitetraciclina
penicilinas semi-sintticas
bactrias Gram (+) : Achromobacter

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 Mtodo alternativo para teste de pirognios, fundamentado no efeito
das endotoxinas bacterianas, que induzem a secreo de Interleucina-
6 por moncitos humanos ou linhagens de clulas monocticas.
e TNF
DETERMINAO DE IL-6, IL-1
POR ELISA
Calcular a MXIMA DILUIO VLIDA (MDV) para a amostra:
Limite de endotoxinas UE/mL
MDV =
sensibilidade do lisado ()
OU
MDV = Limite de endotoxinas UE/mg ou UE/UI x [ ] do produto
sensibilidade do lisado ()
Verificar o LIMITE DE ENDOTOXINAS (UE/mL ou mg) preconizado para
a amostra nas farmacopias
- Se no citado, deve-se calcular: L. E. = K/M
onde:
L. E. = limite de endotoxina
M = dose humana mxima/kg ou por 70 kg administrada numa injeo
por hora.
K = 5 UE/kg (parenterais);
2,5 UE/kg (radiofrmacos);
0,2 EU/ kg (parenterais adm. intratecal)
EXEMPLO:
Produto: Diclofenaco de sdio
Dose mxima por Kg (M): 1,07 mg/kg ou 75 mg/70 kg
Forma de apresentao: Ampola de 75mg/3 ml
Sensibilidade do Lisado (): 0,06 EU/ml
L.E. = 5 UE/Kg = 4,7 UE/mg
1,07 mg/Kg
MDV = 4,7 UE/mg x 25 mg/ml = 1958 ou 1/1958
0,06 UE/ml
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