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Unin de ligandos

Un ligando es cualquier molcula que se una especficamente a una protena

Caractersticas de los ligandos:

a) Tamao y naturaleza qumica variable


b) El sitio de unin es especfico
c) La unin es reversible Interacciones dbiles- se alcanza el equilibrio entre:

Protena-ligando P libre + ligando libre

Ejemplo: de reconocimiento especfico: Glutamin-tARN sintetasa de E. coli


Especificidad de la unin protena-ligando: modelos

Emil Fischer propuso a finales del siglo


XIX que la unin es del tipo "llave y
cerradura", es decir, que las formas del
sitio de unin y del ligando son
estrictamente complementarias.

En 1958 Daniel Koshland refin este


concepto, proponiendo que en la fase
inicial de la unin la
complementariedad es relativamente
pobre, pero que tras esa unin inicial la
protena sufre un cambio
conformacional que "ajusta" la forma
del sitio de unin a la del ligando. Es la
hiptesis del "ajuste inducido".

Ejemplo: Adenilato kinasa de E. coli


y despus?

1) El ligando no se modifica. Ejemplo transporte

2) El ligando es modificado qumicamente. Ejemplo enzimas

3) La protena sufre un cambio conformacional.

Consecuencias de los cambios conformacionales

a) Modificacin de la afinidad de otro sitio de unin de ligandos: Alosterismo cooperatividad

b) Modificacin de la conformacin del sitio cataltico de una enzima: activacin o inhibicin


alostrica.

Importancia de los cambios conformacionales inducidos:

- Control de los procesos de control metablico

- regulacin de la expresin gnica

- Control hormonal

Cambio conformacional en la protena recoverina inducido por la unin de calcio.


El equilibrio qumico aplicado a la interaccin macromolcula - ligando

Dependencia de la concentracin de ligando

El estudio cuantitativo de la dependencia de la formacin del complejo protena-ligando respecto de la


concentracin de reactantes se desarrollar para el caso particular en el que se cumplen las siguientes
condiciones:

a) La concentracin de ligando es superior a la concentracin de protena. O, lo que es lo mismo, la


concentracin de ligando unido a la protena es despreciable frente a la concentracin total del ligando

b) La protena tiene un nico sitio de unin para el ligando.

La formacin del complejo entre una protena P y un ligando L se puede representar por la siguiente
ecuacin:

K1 Siendo K1 la constante cintica de la


P+L PL asociacin. Sus dimensiones son molar-1.s-1

Dado que la formacin del complejo PL es un proceso reversible, este complejo se disociar segn:

k -1 Siendo K-1 la constante de velocidad de la


PL P+L reaccin de disociacin de P.L. Su dimensin
es inverso de tiempo (s-1)

Si en el medio se encuentran inicialmente P y L libres, al cabo de un tiempo se habr establecido un


equilibrio entre la protena y el ligando libres y el complejo protena ligando. Si consideramos la
disociacin del complejo, el equilibrio se ajustar a:

K -1 V-1 = V1
PL P+L
K -1 [PL] = K1 [P] [L]
K1
K-1 [P] [L]
------ = ---------- = Kd
K1 [PL]

Kd es la denominada Constante de Disociacin, y corresponde a la constante de equilibrio de


la disociacin del complejo P.L. No confundir con K-1, que es la constante de velocidad para
la reaccin de disociacin. Kd tiene unidades de concentracin

[P]total = [PL] + [P]libre ; [P]libre = [P]total [PL]

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[P]libre [L]
Kd = ------------; Kd [PL] = ([P]total - [PL]) [L]; Kd [PL] = [P]total [L] - [PL] [L]
[PL]

Kd [PL] + [PL] [L] = [P]total [L]; [PL] (Kd + [L]) = [P]total [L]

Se puede deducir fcilmente esta ecuacin. Considere que


[P]total [L]
en el equilibrio las velocidades de formacin y de
[PL] = ---------------- disociacin del complejo PL son iguales, y que la
Kd + [L] concentracin de protena libre es igual a la concentracin
total de protena menos la concentracin del complejo PL

En muchas ocasiones lo que interesa conocer es la proporcin de molculas de protena que tienen unido
el ligando, en vez de su concentracin absoluta. Para ello definimos la fraccin de saturacin Y:

n de sitios ocupados [PL]


Y = ---------------------------- = ---------
n total de sitios [P]total

Evidentemente, Y vara entre 0 (ninguna molcula de protena tiene ligando unido) a 1 (todas las
molculas de protena estn unidas al ligando). En el caso de que la protena tenga ms de un sitio de
unin para el ligando la fraccin de saturacin se definira de igual manera, pero ahora habra que
multiplicar [P]total por el nmero de sitios totales por molcula de protena, y la [P.L] por el nmero
medio de sitios ocupados en el complejo.

[L]
Y = ------------
Kd + [L]
Esta ecuacin corresponde a una hiprbola equiltera; la rama horizontal tiende asintticamente
al valor 1 de la fraccin de saturacin; desde un punto de vista estrictamente matemtico, nunca se
alcanza la saturacin total. Un aspecto importante es que el valor numrico de Kd corresponde a la
concentracin de ligando que hace que la fraccin de saturacin valga exactamente 0,5.
El valor de Kd, para una protena y ligando concretos, depende crticamente de las condiciones
experimentales: pH, fuerza inica, temperatura o presencia de otros solutos en el medio. Esto es lgico
si recordamos que todos los factores anteriormente sealados influyen sobre la estructura tridimensional
de las protenas, y que el sitio de unin es una zona concreta con una estructura definida dentro de la
molcula de protena.

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Curvas de saturacin de cuatro ligandos cuyas Kd para una protena hipottica tienen los valores de 1,
10, 50 y 200 unidades de concentracin

En los cuatro casos, cuando la


concentracin del ligando iguala al
valor de Kd, la fraccin de saturacin
vale 0,5.

Note que la diferente forma de las


curvas es un efecto de escala; las cuatro
curvas son similares.

Antes del empleo comn de ordenadores y de los programas de ajuste de datos a funciones no lineales la
determinacin de Kd deba hacerse previa linearizacin de la ecuacin de saturacin. Existen varias
posibilidades, pero una de las ms empleadas ha sido la denominada representacin de Scatchard.

Cuanto menor sea Kd menor es la concentracin de ligando necesaria para saturar la protena, y mayor
es la afinidad de la protena hacia el ligando. Podemos definir la afinidad de una enzima hacia un
ligando como un parmetro semicuantitativo relacionado con la inversa de la constante de disociacin.
Semicuantitativo porque se dice "mucha" o "poca afinidad", o "la afinidad de la protena A hacia L es
mayor que la de B". Esta ltima afirmacin es anloga a decir que la Kd del complejo A.L es menor que
la Kd del complejo B.L.

El hecho de que la curva de saturacin sea hiperblica tiene algunas consecuencias interesantes. En
primer lugar, si la concentracin de ligando es inferior a la Kd, la saturacin depende casi linealmente de
la concentracin de ligando. Hay una proporcionalidad casi perfecta entre ambas:

En el ejemplo se supone que la


Kd vale 10 unidades. En rojo, la
curva de saturacin calculada.
En verde, ajuste lineal.

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Por el contrario, a concentraciones de ligando superiores a 10 veces Kd la fraccin de saturacin resulta
prcticamente independiente de la concentracin del ligando:

Kd, 10 unidades. Note ambas


escalas; un cambio de
concentracin de 200 a 1000
unidades se traduce en un
incremento de la saturacin
mnimo, de 0,95 a 0,98.

Cuando la protena est saturada por encima del 50%, para incrementar la saturacin de la protena en un
factor pequeo es preciso aumentar mucho la concentracin del ligando. Este comportamiento es
antiintuitivo: tendemos a pensar que al duplicar la cantidad total de ligando se aumenta en la misma
medida la cantidad del ligando unido, pero no es as

Significado de las constantes cinticas

Aunque la formacin del complejo P.L. se define habitualmente empleando el valor de Kd, merece la
pena comentar brevemente el significado fsico y los lmites de variacin de las constantes individuales
K1 y K-1.

A) K1 es la constante de velocidad de segundo orden para la unin de la protena al ligando:

Esta constante no puede superar un valor mximo, que viene dado por la velocidad a la que se
pueden encontrar ambas molculas cuando se desplazan al azar en disolucin, y que depende de sus
respectivos Coeficientes de Difusin. En un medio lquido homogneo, este valor mximo se encuentra
en el rango 108 a 109 M-1.s-1. En la mayor parte de los casos los valores de K1 van a ser inferiores a este
mximo, ya que no todos los choques posibles entre dos molculas van a ocurrir con la orientacin
adecuada para que se forme el complejo. De hecho, en la mayor parte de los casos los valores de K1 se
encuentran en el rango 105 - 108 M-1.s-1. Por otra parte, cualquier factor que disminuya el valor de los
coeficientes de difusin (aumento de la viscosidad del medio, aumento del tamao -por agregacin, por
ejemplo- de los reactantes), va a traducirse en una disminucin del valor de esta constante de velocidad.
Como ejemplo, el valor de K1 para la asociacin protena-protena entre la elastasa y la a1-antitripsina se
ha estimado en 6,7.107 M-1.s-1.

B) K-1 es la constante de velocidad de primer orden para la separacin del complejo P.L.

En este caso, y como ocurre para cualquier proceso cintico de primer orden, hay una relacin
sencilla entre la vida media del complejo y el valor de K-1. NO se debe confundir con el periodo de
semidisociacin (anlogo al periodo de semidesintegracin, o semiperiodo, en la desintegracin
radiactiva).

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Relacin entre Kd y la variacin de energa libre en la asociacin

Es importante considerar la variacin de la energa libre que se produce en la formacin del complejo
protena ligando. Para empezar, veamos cuales son las situaciones inicial y final en el sistema protena y
ligando (sin olvidar las molculas de agua en la que se encuentran ambos disueltos):

El sistema puede estar en dos


estados. I: la protena y el
ligando separados, e
interaccionando con molculas
de agua, y II, el complejo
protena ligando formado; las
molculas de agua que antes
estaban unidas a la protena y al
ligando ahora se encuentran
formando parte del conjunto de
disolvente.

La asociacin es exergnica, y por consiguiente la disociacin es endergnica; -si fuese al revs el


complejo no se formara- .El valor absoluto de la variacin de energa libre ser el mismo en ambos
casos, pero el signo de la misma ser opuesto. Es muy importante tener en cuenta que la variacin de
energa libre depende, no solo de los enlaces -inicos, de hidrgeno, de van der Waals- que se formen
entre la protena y el ligando, sino tambin de las interacciones con y entre las molculas de agua. Lo
que resulta significativo es la variacin global de la energa libre en el conjunto del sistema protena-
ligando-disolvente.

La variacin de la energa libre en condiciones estndar (concentracin 1 M de reactantes, pH 7,0, 25


C) est relacionada con la constante de equilibrio de la reaccin por la expresin:

G = - RT ln Keq Siendo R la constante de los gases y T la


temperatura absoluta

En nuestro caso, si queremos saber la energa que se libera cuando se asocian la protena y el ligando,
suponiendo que el sistema se encuentra en equilibrio, y teniendo en cuenta que vamos a emplear
habitualmente Kd, que es la constante de equilibrio de disociacin, se cumple que:

Como era de esperar, cuanto menor sea Kd mas exergnica ser la formacin del complejo P.L; ms
favorecida est la asociacin y mas desfavorecida est la disociacin del complejo. Es fcil calcular el
valor de Gque corresponde a un valor de Kd; algunos ejemplos se muestran en la siguiente tabla (la
temperatura se ha supuesto 25 C o 298,15 K):

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Es interesante ver que un cambio pequeo en la variacin de energa libre estndar corresponde a un
cambio muy notable en el valor de Kd. Y adems, con valores relativamente bajos de DG se
encuentran valores de Kd significativos desde el punto de vista funcional. Por ejemplo, sea un complejo
cuya formacin ocurre con una variacin de energa libre neta de -15 kJ/mol, equivalente a la resultante
de unos 7-10 tomos unidos por fuerzas de dispersin de London; esto es suficiente para que Kd
alcance el valor tpico de muchas interacciones entre enzimas y sus sustratos. En este punto hay que
recordar que la energa de estas interacciones depende crticamente de la distancia [Tema 3:
interacciones no covalentes] y son importantes exclusivamente a distancias interatmicas
extremadamente pequeas. As, una complementariedad perfecta entre las formas del sitio de unin y
del ligando, que permita el contacto directo de muchos tomos y por consiguiente el establecimiento de
un nmero elevado de enlaces dbiles, dar lugar a valores de Kd bajos. Cualquier alteracin en la forma
del ligando, que no permita ese ajuste perfecto, se traducir en un aumento importante del valor de Kd.
Otro tanto cabe decir de los puentes de hidrgeno, que requieren una orientacin precisa para ser
energticamente significativos.

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Un cambio pequeo en una zona
concreta del ligando puede impedir
el ajuste en el conjunto del sitio de
unin, u obligar a un cambio
conformacional, energticamente
costoso, en la molcula de
protena.

El valor ms bajo de Kd (y, por tanto la afinidad ms elevada) que se ha encontrado para un par
protena-ligando es el correspondiente a la unin de la vitamina biotina por la avidina, una protena de la
clara de huevo. No hay una razn biolgica clara para esa excepcional afinidad, resultante de una
tambin excepcional complementariedad entre el sitio de unin de la avidina y la biotina. Tal vez el
secruesto de la biotina en la clara del huevo tenga un efecto inhibidor del crecimiento de bacterias que
pudiesen estar presentes. Sin llegar a este extremo, los valores de Kd para las interacciones hormona-
receptor son tambin muy bajos. En este caso s hay una razn clara: cuanto menor sea Kd. menos
cantidad de hormona habr que liberar a la circulacin que se forme un nmero adecuado de complejos
hormona-receptor. (Ver tambin la pgina anterior)

Es importante entender que en esta pgina y las anteriores hemos estudiado Kd, definida como la
constante de disociacin del complejo P.L, desde tres puntos de vista diferentes y complementarios:

1) Como una medida de la concentracin de ligando necesaria para saturar la protena.

2) Como un parmetro relacionado inversamente con el tiempo que se mantiene formado el complejo
P.L.

3) Como un parmetro relacionado inversamente con la energa que se libera cuando se forma el
complejo.

Cada uno de estos enfoques nos suministra un tipo de informacin diferente sobre la unin del ligando a
la protena.

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Kd y duracin del complejo PL

Dado que Kd, K-1 y K1 estn relacionadas, se puede calcular la vida media de
existencia de un complejo P.L. si conocemos Kd y la constante de asociacin K1.

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Tiempo promedio de existencia de un complejo PL
Vida media = ------
k-1
k-1 1
kd = --------; k-1 = kd k1; vida media = ---------
k1 kd + k1

G kd (M) k1 = 1x106 (M-1s-1) k1 = 1x108 (M-1s-1)


(Kj/mol)
k-1 (s-1) 1 /k-1 (s) k-1 (s-1) 1 /k-1 (s)
-1 0.67 6.7x105 0.0000015 6.7x107 0.000000015
-20 3.12x10-4 3.1x102 0.0032 3.1x104 0.000032
2136.7 2150
DNApol III kcat = 850 1 /kcat =
N/seg 0.0012 s
Cooperatividad: estudio cintico
Muchas protenas son oligomricas, y muchas de ellas poseen varios sitios de unin para un
determinado ligando. Estos sitios pueden ser independientes entre si y los valores de kd para la
disociacin del ligando de cada sitio pueden ser idnticos. El resultado es el mismo que para las
protenas monomricas que se han visto hasta ahora.

Pero que pasa si los valores de kd son distintos? (Cuando la kd deja de ser constante)

Cuando una protena con varios sitios de


unin para un ligando presenta valoras de kd Cooperatividad homotrpica
diferentes para cada sitio, osea, kd es variable
en funcin del grado de saturacin de la
protena

La saturacin de una protena por


un ligando, cuando no hay
cooperatividad es hiperblica
(curva verde).
Cuando los valores de kd son
variables se originan curvas
sigmoideas (hiprbolas no
equilteras).
En estos casos no podemos hablar
de kd, sino de un parmetro
emprico, k50, que se define como
la concentracin de ligando que
hace que Y valga 0.5

Equilibrios de asociacin para una enzima con


cuatro sitios de unin de ligandos
La cooperatividad homotrpica positiva no significa que la afinidad global de la enzima hacia el
ligando sea mayor que sin cooperatividad, sino que se requiere menor variacin de la cantidad de
ligando para modificar el grado de saturacin de la protena.

Cmo se produce la cooperatividad homotrpica?: mecanismo fsico

1) Requiere que la protena tenga dos o ms sitios de unin para el ligando


2) La unin de una molcula de ligando produce un cambio conformacional en la protena
que se transmite a los restantes sitios de unin. Este cambio conformacional se traduce en
una modificacin de la afinidad de la protena hacia otras molculas de ligando:

Esta interaccin FISICA entre sitios distintos se conoce como ALOSTERISMO