IV.

ALAT DAN BAHAN

a. Alat:
1. 10 tabung reaksi steril
2. Tabung mikro 1,5 ml
3. Rak tabung mikro
4. Pipet mikro 1000 L dan 200 L dan tip-nya
5. Mikrosentrifus berpendingin
6. Bak es dan es yang telah dihancurkan
7. Beads
b. Bahan :
1. Escherichia coli DH5 (kompeten)
2. Larutan 0,1 M CaCl2 dingin
3. Plasmid/ DNA rekombinan hasil ligasi
4. Medium LB; LA; LA + Ap (10g/mL)
5. Larutan garam fisiologis
6. dH2O steril

V. PROSEDUR KERJA
1. Dimasukkan masing-masing 100 L 0,1 M CaCl 2 steril ke dalam dua tabung
mikro steril. Kemudian pada salah satu tabung (tabung K = kontrol) dimasukkan
20 L dH2O steril dan pada tabung lain (tabung S = sampel) dimasukkan 20 L
larutan 100-500 ng pUC19. Lalu, ditambahkan 200 L sel kompeten DH5 pada
masing-masing tabung mikro.
2. Tabung ditaruh pada 0C (di atas es) selama 90 menit dengan kadang-kadang
digoyang dengan ujung jari telunjuk. Penangas 42C disiapkan.
3. Campuran transforman diinkubasi pada 42C selama 60 detik, kemudian
langsung disimpan di es selama 2 menit. Sementara itu, disiapkan shaker pada
37C untuk tabung reaksi.
4. Masing-masing campuran transformasi dimasukkan pada tabung reaksi steril, lalu
ditambahkan 1 mL LB pada tiap-tiap tabung. Diinkubasikan dengan goyangan
kuat pada 37C selama 90 menit.
5. Pada LA + Ap (10g/mL) disebarkan 50 L suspensi dari tabung A dan masing-
masing 50 dan 100 L suspensi dari tabung B, masing-masing 2-3 cawan,
kemudian disentrifugasi secara singkat dan disebar lagi bagian pelet (supernatan
 dibuang, kemudian sedikit bagian supernatan digunakan untuk meresuspensi pelet
sel). Hasil transformasi disebar menggunakan beads steril.
6. Pada LA, disebarkan 100 L suspensi tabung B dengan pengenceran 10-6 dan 10-7
dengan bantuan beads steril. Diinkubasikan semua kultur di cawan pada 37C
selama semalam (18-24 jam).

VI. ALUR KERJA

gm