Manual Parte 2

20-10-2010
Curso de Especializao Tecnolgica em Qualidade

Ambiental
Manual de monitorizao
microbiolgica ambiental
2.Qualidade microbiolgica da gua
Unidade de formao:
Monitorizao ambiental | microbiologia
Manuela Abelho
Manuela Abelho
Manual de monitorizao
microbiolgica ambiental
2.Qualidade microbiolgica da gua
ndice
1.Qualidade da gua ........................................................................................................ 5
O conceito de qualidade da gua ................................................................................ 5

O conceito de poluio/contaminao da gua .......................................................... 6
2. Microrganismos e qualidade da gua ......................................................................... 7
Os microrganismos como poluentes .......................................................................... 7

Microrganismos como indicadores de poluio ......................................................... 7
3. gua destinada ao consumo humano....................................................................... 10
Legislao aplicvel ................................................................................................... 10

Localizao dos pontos de amostragem .................................................................... 11
Qualidade microbiolgica: valores paramtricos ...................................................... 11
Controlo da qualidade ................................................................................................12
Mtodos analticos de referncia (Decreto-Lei 306/2007) ......................................12
Bactrias coliformes e Escherichia coli (E. coli): norma ISO 9308-1 ............................................... 12
Enterococos: norma ISO 7899-2 ......................................................................................................... 12
Pseudomonas aeruginosa: norma EN ISO 12780 ............................................................................. 13
Enumerao de microrganismos viveis nmero de UFC a 22C e a 37C: norma EN ISO 6222
............................................................................................................................................................... 13
Clostridium perfringens (incluindo esporos) ..................................................................................... 13
4. guas para produo de gua para consumo humano, para suporte de vida
aqucola e guas de rega ................................................................................................14
Legislao aplicvel ....................................................................................................14

guas doces superficiais e subterrneas destinadas produo de gua para
consumo humano.......................................................................................................14
guas para suporte de vida aqucola ......................................................................... 15
guas de rega .............................................................................................................16
Mtodos analticos de referncia (Decreto-Lei 236/98) ...........................................16
Coliformes totais, coliformes fecais e estreptococos fecais ................................................................ 16
Salmonelas ............................................................................................................................................ 17
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Manuela Abelho
Ovos de parasitas intestinais ............................................................................................................... 17
5. guas balneares ......................................................................................................... 17
Legislao aplicvel .................................................................................................... 17

Ponto de amostragem, recolha e conservao das amostras ................................... 18
Mtodos analticos de referncia (Decreto-Lei 135/2009) ...................................... 18
Enterococos intestinais: normas ISO 7899-1 ou ISO 7899-2 ............................................................ 18
Escherichia coli: normas ISO 9308-3 ou ISO 9308-1 ........................................................................ 19
6. Mtodos gerais de anlise microbiolgica ................................................................19
Inoculao de tubos mltiplos e determinao do NMP ......................................... 20

Filtrao por membrana ............................................................................................21
7.Protocolos especficos ................................................................................................ 22
Protocolo 7.1 Recolha de amostras de gua ............................................................ 22

Norma aplicvel: EN 25667-2 | ISO 5667-2:1991 .............................................................................. 22
Recolha de amostras de gua de uma torneira ................................................................................... 22
Recolha de amostras de gua de um curso de gua, de um reservatrio ou de uma praia .............. 23
Protocolo 7.2 Enumerao de microrganismos cultivveis: contagem de colnias

por sementeira em meio extracto de levedura agar ................................................. 23
Norma aplicvel: EN ISO 6222 | ISO 6222:1999 ............................................................................... 23
Primeiro tempo: elaborao do meio de cultura ................................................................................ 23
Meio agar extracto de levedura............................................................................................................ 23
Segundo tempo: recolha, diluio, sementeira e incubao das amostras ....................................... 24
Terceiro tempo: contagem das colnias .............................................................................................. 24
Protocolo 7.3 Deteco e enumerao de Escherichia coli e de bactrias coliformes
pelo mtodo da filtrao por membrana .................................................................. 25
Norma aplicvel: EN ISO 9308-1 | ISO 9308-1:2000 ....................................................................... 25
Primeiro tempo: elaborao de meios de cultura ............................................................................... 25
Meio agar de lactose TTT com heptadecilsulfato de sdio ................................................................. 25
Caldo de triptofano:.............................................................................................................................. 26
Meio agar triptonado de soja (TSA): ................................................................................................... 26
Segundo tempo: recolha, filtrao e incubao das amostras ........................................................... 26
Terceiro tempo: exame e repicagem.................................................................................................... 27
Quarto tempo: diferenciao e contagem ........................................................................................... 27
Protocolo 7.4 Deteco e enumerao de enterococos intestinais pelo mtodo da

filtrao por membrana ............................................................................................ 28
Norma aplicvel: EN ISO 7899-2 | ISO 7899-2:2000 .......................................................................28
Meio Slanetz e Bartley .......................................................................................................................... 29
Meio blis-esculina-azida agar/1000 mL: ........................................................................................... 29
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Manuela Abelho
Segundo tempo: recolha, filtrao e incubao das amostras ........................................................... 29

Terceiro tempo: confirmao e contagem ...........................................................................................30
Protocolo 7.5 Deteco e enumerao de coliformes totais, coliformes fecais e

Escherichia coli pelo mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) ............................ 30
Caldo blis verde brilhante ................................................................................................................... 31
Caldo peptonado ................................................................................................................................... 32
Segundo tempo: recolha das amostras e teste presuntivo ................................................................. 32
Terceiro tempo: verificao da existncia de coliformes e teste final ............................................... 32
Quarto tempo: verificao da existncia de coliformes fecais e de E. coli ........................................ 33
Protocolo 7.6 Deteco e enumerao de estreptococos fecais pelo mtodo do
Nmero Mais Provvel (NMP) ................................................................................. 33
Meio Bagg ............................................................................................................................................. 33
Segundo tempo: recolha das amostras e incubao ........................................................................... 33
Terceiro tempo: verificao da existncia de estreptococos fecais .................................................... 34
Protocolo 7.7 Deteco e enumerao de Clostridium perfringens (incluindo

esporos) ........................................................................................................... 34
Decreto-Lei 306/2007 ......................................................................................................................... 34
Meio m-CP agar .................................................................................................................................... 34
Segundo tempo: recolha das amostras e incubao ........................................................................... 35
Terceiro tempo: diferenciao ............................................................................................................. 35
Referncias citadas ....................................................................................................... 35
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Manuela Abelho
1.Qualidade da gua
A gua um recurso essencial vida, indispensvel para a humanidade mas tambm
para os outros organismos e para a manuteno das funes e da integridade dos
ecossistemas (Mendes, 2010).
A gua um elemento fundamental para o desenvolvimento sustentvel dos pases,

pelo que a falta de gua ou a falta de gua com qualidade diminuem a qualidade de
vida das populaes. Devido ao aumento da populao humana as necessidades de
gua tm vindo a aumentar; no entanto, as actividades humanas directa ou
indirectamente podem diminuir a qualidade da gua, tornando-a imprpria para
determinados fins, ou seja, podem diminuir a quantidade de gua com qualidade
para ser utilizada nalgumas actividades.
Na Unio Europeia, a legislao regula a gesto das guas superficiais,

designadamente as guas interiores, de transio e costeiras, e das guas
subterrneas, de forma a: a) evitar a continuao da degradao e proteger e
melhorar o estado dos ecossistemas aquticos e tambm dos ecossistemas terrestres e
zonas hmidas directamente dependentes dos ecossistemas aquticos, no que
respeita s suas necessidades de gua; b) promover uma utilizao sustentvel de
gua, baseada numa proteco a longo prazo dos recursos hdricos disponveis;
c) obter uma proteco reforada e um melhoramento do ambiente aqutico,
nomeadamente atravs de medidas especficas para a reduo gradual e a cessao ou
eliminao por fases das descargas, das emisses e perdas de substncias prioritrias;
d) assegurar a reduo gradual da poluio das guas subterrneas e evitar o
agravamento da sua poluio; e) mitigar os efeitos das inundaes e das secas;
f) assegurar o fornecimento em quantidade suficiente de gua de origem superficial e
subterrnea de boa qualidade, conforme necessrio para uma utilizao sustentvel,
equilibrada e equitativa da gua; g) proteger as guas marinhas, incluindo as
territoriais; h) assegurar o cumprimento dos objectivos dos acordos internacionais
pertinentes, incluindo os que se destinam preveno e eliminao da poluio no
ambiente marinho (Lei n58/2005).
O conceito de qualidade da gua

O conceito de qualidade da gua relativo, j que depende do uso a que se destina ou
do objectivo do seu utilizador. Assim, a qualidade da gua pode ser definida, para fins
especficos, como o conjunto de caractersticas fsicas, qumicas e biolgicas
adequadas sua utilizao para determinado uso. Para cada uso da gua pois
necessrio estabelecer as exigncias relativas sua qualidade, isto , definir
parmetros de qualidade e estabelecer os seus valores-limite (Mendes, 2010).
5
Manuela Abelho
O Decreto-Lei 236/98, de 1 de Agosto define quatro tipos principais de utilizao da

gua: guas para consumo humano, guas para suporte de vida aqucola, guas
balneares e guas de rega.
As guas para consumo humano so guas doces que podem ter origem em guas
superficiais, em guas subterrneas ou em guas de abastecimento. As guas para
suporte de vida aqucola so guas superficiais, doces ou salobras, continentais ou
litorais, destinadas produo de peixe (guas pisccolas) ou de bivalves (guas
conqucolas). As guas balneares so guas doces lticas e lnticas, comummente
designadas de correntes e paradas, assim como a gua do mar e as guas estuarinas,
que se encontrem classificadas como guas balneares ou, no estando classificadas,
onde o banho no esteja interdito e seja habitualmente praticado por um nmero
considervel de banhistas (aproximadamente 100/dia, durante a poca balnear). A
gua de rega gua superficial ou subterrnea ou gua residual, que vise satisfazer ou
complementar as necessidades hdricas das culturas agrcolas ou florestais (artigo 3
do Decreto-Lei 236/98).
Os limites paramtricos estabelecidos na legislao so principalmente desenvolvidos

para a preveno da ocorrncia de surtos sanitrios, fornecendo uma informao
limitada sobre a proteco do ambiente e da sade. Os limites paramtricos podem
definir-se como (i) a concentrao de uma substncia ou organismo que no
representa um perigo significativo para a sade de um nmero significativo de
utilizadores; (ii) as condies nas quais a exposio a essa substncia ou organismo
no so provveis, ou (iii) uma combinao de ambos (Mendes, 2010). Assim, so
normalmente impostos na legislao dois limites paramtricos, o valor mximo
recomendvel (VMR) e o valor mximo admissvel (VMA). O VMR o valor de norma
de qualidade que no dever ser ultrapassado (Decreto-Lei 236/98) e garante a
manuteno da sade do consumidor e a cobertura das suas necessidades
alimentares. O VMA o valor da norma de qualidade que, de preferncia, deve ser
respeitado ou no excedido (Decreto-Lei 236/98); ou seja, como nem sempre os
valores obtidos so VMR, toma-se em conta o VMA, na perspectiva de que nesse
intervalo de valores (VMR-VMA) no se verificaro riscos significativos para a sade
dos consumidores.
O conceito de poluio/contaminao da gua

A poluio da gua pode ser definida como: (i) a inadequao da sua aplicabilidade
para algum objectivo considerado, (ii) qualquer modificao natural ou artificial que
directa ou indirectamente modifique, altere ou destrua o equilbrio dos ecossistemas
e dos recursos naturais de tal modo que traga perigo para a sade pblica, diminua a
sua adequabilidade ou eficincia e o bem-estar do Homem e das suas comunidades,
ou (iii) a alterao da composio ou do estado da gua de tal forma que se torne
menos adequada para todas ou algumas das funes e fins a que pode ser adequada
6
Manuela Abelho
no seu estado natural. O conceito de contaminao definido como a introduo ou

descarga na gua de organismos patognicos ou de substncias txicas que a tornem
imprpria para consumo pblico e/ou usos domsticos, ou seja, a contaminao pode
ser considerada um aspecto especfico da poluio.
2. Microrganismos e qualidade da gua

Os microrganismos como poluentes
Os poluentes podem ser inorgnicos, organismos e biolgicos, incluindo-se os
microrganismos neste ltimo grupo. Os perigos mais significativos da poluio
biolgica por microrganismos devem-se contaminao das guas por resduos fecais
ou urinrios, provenientes do metabolismo dos animais homeotrmicos1. Embora
muitos microrganismos associados a este tipo de resduos sejam inofensivos para
pessoas saudveis, alguns so agentes patognicos2.
Quando existe contaminao da gua por fezes, as bactrias de origem fecal

(associadas s fezes) so uma causa potencial de vrias doenas que podem ocorrer
sob a forma epidmica doena que afecta simultaneamente muitos indivduos, por
contgio ou sob a forma endmica doena que se verifica permanentemente
numa dada regio. Para alm das bactrias fecais, outros microrganismos presentes
na gua vrus, helmintas, protozorios, podem representar perigos para as
populaes humanas, mas no fazem em geral parte da anlise sistemtica includa
nas normas legais da maioria dos pases no tropicais.
Microrganismos como indicadores de poluio

O nmero de microrganismos presentes nos materiais fecais muito elevado, cerca
de 109 (i.e., 10 000 000 000) de cada um dos grupos pesquisados por cada grama de
1 Animais homeotrmicos (tambm chamados animais de sangue quente) so aqueles que

mantm a sua temperatura corporal constante, independentemente da temperatura
ambiente (e.g., mamferos e aves). Pelo contrrio, os animais poiquilotrmicos (tambm
designados por animais de sangue frio) no conseguem manter a temperatura corporal
constante e aquecem ou arrefecem com as alteraes da temperatura ambiente (e.g.,
rpteis e anfbios).
2 Agentes patognicos so organismos capazes de causar doenas infecciosas nos seus
hospedeiros.
7
Manuela Abelho
material fecal, dos quais apenas alguns so patognicos (Mendes, 2010). Ou seja,
juntamente com os microrganismos patognicos so libertados microrganismos no
patognicos ou de patogenia limitada, pelo que a presena ou ausncia desses
microrganismos numa amostra indica se a gua em questo foi ou no contaminada
por fezes, isto , se apresenta o perigo de conter microrganismos fecais patognicos.
Os microrganismos no patognicos ou de patogenia limitada so indicadores de
contaminao fecal e so utilizados para monitorizar as guas para a contaminao
por fezes (Mendes, 2010). A escolha dos indicadores de qualidade microbiolgica da
gua obedece a vrios critrios (Mendes, 2010):
1. A concentrao do microrganismo indicador na gua contaminada deve ter

uma relao directa com o grau de contaminao;
2. O microrganismo indicador deve ser suficientemente conhecido, de forma a
permitir a atribuio de valores-limite;
3. A anlise do microrganismo indicador deve ter uma metodologia padronizada
e especfica para o microrganismo em causa (i.e., a presena de outros
microrganismos no deve gerar resultados positivos) e suficientemente
sensvel para detectar nveis baixos do indicador;
4. A anlise do microrganismo indicador deve ser rpida, inequvoca e de baixo
custo;
5. O microrganismo indicador deve estar presente sempre que microrganismos
fecais patognicos estejam tambm presentes, e em quantidade superior aos
patognicos;
6. O microrganismo indicador deve ser mais resistente aos agentes desinfectantes
que os microrganismos patognicos (i.e., deve sobreviver mais tempo);
7. O microrganismo indicador no deve reproduzir-se na gua (para no causar
sobre-estimativas da poluio)
8. O microrganismo indicador deve distribuir-se de forma aleatria na massa de
gua;
9. O microrganismo indicador deve ser propcio para a anlise de todos os tipos
de gua: torneira, rios, subterrnea, barragens, esturios, oceanos, guas
residuais (i.e., deve ser capaz de sobreviver nos vrios tipos de gua);
10. O microrganismo indicador deve ser inofensivo para o ser humano.
Os indicadores clssicos de contaminao fecal so (i) o grupo dos coliformes fecais e

no fecais, (ii) o grupo dos enterococos fecais, (iii) Clostridium perfringens; e (iv) o
nmero de UFC a 22C e a 37C.
8
Manuela Abelho
O grupo dos coliformes constitudo por bactrias da famlia Enterobacteriaceae,

habitantes do aparelho intestinal do homem e de outros animais homeotrmicos. So
bactrias Gram-negativas, em forma de bacilo e anaerbias facultativas. Algumas so
oxidase-positivas e crescem em condies aerbias em meio de cultura selectivo
contendo sais biliares; outras so capazes de fermentar lactose a 37C com libertao
de gs e de cido e outras so capazes de fazer a fermentao a 44.5C. A fermentao
da lactose a 44.5C permite distinguir os coliformes no fecais (37C) dos coliformes
fecais (44.5C). Nos coliformes fecais inclui-se, por exemplo, a bactria Escherichia
coli (Mendes, 2010).
Os enterococos fecais so caracterizados pela capacidade de crescerem entre 10 e

45C, a pH 9.6, em meio de cultura contendo 6.5% de cloreto de sdio (NaCl), na
presena de 40% de sais biliares e em concentraes de azida inibidoras do
crescimento dos coliformes. So bactrias Gram-positivas que reduzem azul-de-
metileno em 0.1% de leite e conseguem sobreviver a 60C durante 30 minutos. Nos
enterococos fecais inclui-se, por exemplo, Enterococcus faecalis (Mendes, 2010).
Clostridium perfringens uma bactria anaerbia, esporulada, redutora de sulfito,

Gram-positiva, em forma de bacilo, habitante do intestino do homem e de outros
animais homeotrmicos. Esta bactria tem interesse como indicador de poluio fecal
antiga, devido ao seu longo tempo de permanncia na gua e grande capacidade de
sobrevivncia dos seus esporos (Mendes, 2010).
O nmero de UFC a 22C e a 37C no um indicador especfico de poluio fecal

mas sim de enriquecimento por matria orgnica facilmente degradvel. As
contagens de colnias so teis para a avaliao do estado da gua e dos processos de
tratamento utilizados, por exemplo, nas ETARs. O principal interesse da contagem de
colnias reside na possibilidade de detectar as alteraes em relao ao histrico,
baseando-se num controlo frequente e a longo prazo. A ocorrncia de um aumento
repentino do nmero de UFC pode significar que existe um foco de poluio.
Devido ao aprofundamento dos estudos microbiolgicos, actualmente utilizam-se, em

substituio ou em adio aos indicadores clssicos, outros microrganismos,
chamados novos indicadores. A bactria Escherichia coli substituiu, na legislao
actual, os coliformes fecais como indicadores de contaminao fecal. Esta bactria
apresenta uma grande diversidade de adaptaes ao meio, podendo causar vrias
doenas que originam diarreias (Mendes, 2010).
A bactria Pseudomonas aeruginosa outro dos chamados novos indicadores. No

um habitante especfico do intestino mas aparece em 12% da populao. uma
bactria oportunista, aerbia, Gram-negativa, patognica e com elevada resistncia a
antibiticos (Mendes, 2010).
9
Manuela Abelho
Existem outros microrganismos presentes na gua que podem representar perigo

para as populaes humanas, como os vermes helmintas, alguns protozorios (e.g.,
Giardia, Cryptosporidium, Entamoeba, Acanthamoeba,) e vrus, mas a legislao
actual no prev a sua anlise de rotina (Mendes, 2010).
3. gua destinada ao consumo humano

Legislao aplicvel
Decreto-Lei 306/2007, de 27 de Agosto |
http://dre.pt/pdf1sdip/2007/08/16400/0574705765.pdf
Estabelece o regime da qualidade da gua destinada ao consumo humano,

procedendo reviso do Decreto-Lei 243/2001, de 5 de Setembro, que transps para
o ordenamento jurdico interno a Directiva 98/83/CE, do Conselho, de 3 de
Novembro, tendo por objectivo proteger a sade humana dos efeitos nocivos
resultantes da eventual contaminao dessa gua e assegurar a disponibilizao
tendencialmente universal de gua salubre, limpa e desejavelmente equilibrada na
sua composio. Define como gua destinada ao consumo humano:
(i) Toda a gua no seu estado original, ou aps tratamento, destinada a ser
bebida, a cozinhar, preparao de alimentos, higiene pessoal ou a
outros fins domsticos, independentemente da sua origem e de ser
fornecida a partir de uma rede de distribuio, de um camio ou navio-
cisterna, em garrafas ou outros recipientes, com ou sem fins comerciais;
(ii) Toda a gua utilizada numa empresa da indstria alimentar para fabrico,
transformao, conservao ou comercializao de produtos ou substncias
destinados ao consumo humano, assim como a utilizada na limpeza de
superfcies, objectos e materiais que podem estar em contacto com os
alimentos, excepto quando a utilizao dessa gua no afecta a salubridade
do gnero alimentcio na sua forma acabada.
Define os mtodos de controlo da qualidade da gua, estabelecendo a localizao dos
pontos de amostragem, as frequncias mnimas de amostragem (variveis consoante
o volume de gua fornecida; Anexo II do Decreto-Lei 306/2007), estabelecendo um
controlo de rotina e um controlo de inspeco da qualidade da gua.
10
Manuela Abelho
Localizao dos pontos de amostragem

A localizao dos pontos de amostragem depende da provenincia da gua (artigo
10, nmero 2):
No caso da gua fornecida a partir de uma rede de distribuio, no

ponto em que, no interior de uma instalao ou estabelecimento, sai das
torneiras normalmente utilizadas para consumo humano;
No caso da gua fornecida a partir de fontanrios no ligados rede de
distribuio, no ponto de utilizao;
No caso da gua fornecida por entidades gestoras em alta, nos pontos
de amostragem dos pontos de entrega aos respectivos utilizadores;
No caso da gua fornecida a partir de camies, navios--cisterna e
reservatrios no ligados rede de distribuio, no ponto de utilizao;
No caso da gua destinada venda em garrafas e outros recipientes,
com ou sem fins comerciais, no fim da linha de enchimento;
No caso da gua utilizada numa empresa da indstria alimentar, no
ponto de utilizao.
Qualidade microbiolgica: valores paramtricos

Os valores paramtricos e os parmetros microbiolgicos que a gua destinada ao
consumo humano deve respeitar so divididos em duas partes, uma relativa gua
fornecida por redes de distribuio, fontanrios, camies ou navios-cisterna,
reservatrios e utilizada na indstria alimentar (Tabela 3.1) e outra relativa gua
colocada venda em garrafas ou noutros recipientes (Tabela 3.2).
Tabela 3.1. Parmetros microbiolgicos e valores paramtricos para a gua

fornecida por redes de distribuio, fontanrios, camies ou navios-cisterna,
reservatrios e gua utilizada na indstria alimentar (Decreto-Lei 306/2007,
anexo I, parte I).
Parmetro Valor paramtrico Unidade

Escherichia coli (E. coli) 0 Nmero/100 mL
Enterococos 0 Nmero/100 mL
Tabela 3.2. Parmetros microbiolgicos e valores paramtricos para a gua

colocada venda em garrafas ou outros recipientes (Decreto-Lei 306/2007,
anexo I, parte I).
Parmetro Valor paramtrico Unidade

Escherichia coli (E. coli) 0 Nmero/250 mL
Enterococos 0 Nmero/250 mL
Pseudomonas aeruginosa 0 Nmero/250 mL
N UFC a 22C 100 Nmero/mL
N UFC a 37C 20 Nmero/mL
11
Manuela Abelho
Controlo da qualidade
Os parmetros microbiolgicos a analisar nos controlos de rotina so os constantes
da Tabela 3.3. No controlo de inspeco devem ser analisados os parmetros
constantes da tabela 3.1 ou 3.2, consoante a provenincia da gua.
Tabela 3.3. Parmetros microbiolgicos a analisar nos controlos de rotina

(Decreto-Lei 306/2007, anexo II).
Controlo de rotina 1 Controlo de rotina 2

Bactrias coliformes Clostridium perfringens, incluindo esporos
Escherichia coli (E. coli) Nmero de colnias a 22C
Nmero de colnias a 37C
Pseudomonas aeruginosa
Mtodos analticos de referncia (Decreto-Lei 306/2007)
Bactrias coliformes e Escherichia coli (E. coli): norma ISO 9308-1

Filtrao por membrana, em duplicado, seguida de incubao em meio TTC
Chapman agar durante 213 horas a 362C (coliformes) e 444C (E. coli). As
colnias que crescem a 36C so consideradas coliformes fecais e as colnias que
crescem a 44C so consideradas E. coli.
Aps a incubao, as colnias de vrias espcies diferentes apresentam diferentes

caractersticas:
E. coli e Citrobacter spp. apresentam colnias amarelas com centro laranja;

Enterobacter spp. forma colnias vermelhas ou amarelo-escuro com o centro
laranja e o meio de cultura amarelo;
Klebsiella spp. forma colnias vermelhas ou amarelas, sem colorao
diferenciada no centro e o meio de cultura amarelo;
As bactrias que no fermentam lactose formam colnias prpuras e alteram a
cor do meio de cultura para azul.
Enterococos: norma ISO 7899-2

Filtrao por membrana, em duplicado, seguida de incubao em meio de blis azida
agar durante 213 horas a 352C. As colnias de enterococos aparecem rodeadas de
uma cor castanha. Transferncia dos filtros com as colnias, sem inverter, para uma
caixa de Petri com meio agar de blis azida pr-aquecido a 44C e incubao a
440.5C durante 2 horas para confirmao imediata. As colnias que apresentem
meio com colorao castanha-negra em seu redor so confirmadas como enterococos.
12
Manuela Abelho
Pseudomonas aeruginosa: norma EN ISO 12780

Filtrao por membrana, em duplicado, seguida de incubao em meio CN agar
durante 24-48 horas. Contagem de todas as colnias que apresentem cor azul-
esverdeada como sendo Pseudomonas aeruginosa. Exame das membranas sob
radiao ultravioleta e contagem de todas as colnias que no sejam azul-esverdeadas
mas que emitam fluorescncia como possveis P. aeruginosa. Contagem de todas as
colnias avermelhadas que no emitam fluorescncia como possveis P. aeruginosa.
Para confirmao, repicagem das colnias que necessitam de confirmao para meio
agar nutritivo durante 222 horas a 362C. Teste da oxidase a todas as colnias que
eram inicialmente avermelhadas. Repicagem das colnias com reaco oxidase-
positiva para meio B King agar durante 213 horas (mas o perodo de incubao pode
prolongar-se por um mximo de 5 dias) a 362C. O crescimento das colnias
observado diariamente sob radiao ultra-violeta (UV). A presena de colnias de
Pseudomonas aeruginosa revela-se, sob a radiao UV, pela emisso de
fluorescncia.
Enumerao de microrganismos viveis nmero de UFC a 22C e a 37C: norma

EN ISO 6222
Diluies decimais seguidas de inoculao por incorporao, de caixas de Petri, em
quadruplicado, com meio de extracto de levedura agar. Incubao de duas caixas a
20-22C durante 3 dias e das outras duas a 37C durante 44 horas. Contagem de
UFC.
Clostridium perfringens (incluindo esporos)

Filtrao em membrana, em duplicado, seguida de incubao anaerbia da
membrana em m-CP agar a 44C 1C durante 21 3 horas. Contagem das colnias
amarelas opacas que passam a rosa ou vermelho aps exposio, durante vinte a
trinta segundos, a vapores de hidrxido de amnio.
13
Manuela Abelho
4. guas para produo de gua para consumo humano, para

suporte de vida aqucola e guas de rega
Legislao aplicvel
Decreto-Lei 236/98, de 1 de Agosto |
http://dre.pt/pdf1sdip/1998/08/176A00/36763722.pdf
Estabelece normas, critrios e objectivos de qualidade com a finalidade de proteger o

meio aqutico e melhorar a qualidade das guas em funo dos seus principais usos:
utilizao da gua para consumo humano, para suporte de vida aqucola, para efeitos
balneares (que passou a ser regulamentada pelo Decreto-Lei 135/2009, de 3 de
Junho) e para rega.
No que respeita utilizao da gua para consumo humano, consideram-se trs

tipos: (i) guas doces superficiais destinadas produo de gua para consumo
humano; (ii) guas subterrneas destinadas produo de gua para consumo
humano e (iii) guas de abastecimento para consumo humano (que passaram a ser
regulamentadas pelo Decreto-Lei 306/2007).
guas doces superficiais e subterrneas destinadas produo de gua

para consumo humano
As guas superficiais destinadas produo de gua para consumo humano so
classificadas nas categorias A1, A2 e A3, de acordo com as normas de qualidade
fixadas no anexo I do Decreto-Lei 236/98 (Tabela 4.1), a que correspondem
esquemas de tratamento tipo distintos, definidos no anexo II do mesmo Decreto-Lei,
para as tornar aptas para consumo humano: classe A1-tratamento fsico e
desinfeco, classe A2-tratamento fsico e qumico e desinfeco, classe A3-
tratamento fsico, qumico de afinao e desinfeco.
14
Manuela Abelho
Tabela 4.1 Parmetros microbiolgicos e valores mximos recomendveis para

as guas doces superficiais destinadas produo de gua para consumo
humano (Decreto-Lei 236/98, anexo I).
Valor mximo recomendvel

Parmetro3 Unidade A1* A2 A3
Coliformes totais Nmero/100 mL 50 5000 50000
Coliformes fecais Nmero/100 mL 20 2000 20000
Estreptococos fecais Nmero/100 mL 20 1000 10000
Salmonelas 0 / 5000 mL 0 / 1000 mL -
* Categoria tambm aplicvel qualidade das guas subterrneas utilizveis para produo
de gua para consumo humano.
Consideram-se aptas para poderem ser utilizadas como origem de gua para a
produo de gua para consumo humano as guas subterrneas que apresentem
qualidade superior ou igual da categoria A1 (Tabela 4.1) das guas doces superficiais
destinadas produo de gua para consumo humano, correspondendo-lhes o
esquema de tratamento indicado no anexo II do Decreto-Lei 236/98 para aquela
categoria de guas, com as devidas adaptaes.
guas para suporte de vida aqucola

Do conjunto de guas para suporte de vida aqucola (guas doces superficiais lticas e
lnticas - pisccolas; guas do litoral e salobras - conqucolas e pscicolas), apenas
esto definidas normas de qualidade microbiolgica para as guas do litoral e
salobras com fins conqucolas (Tabela 4.2), controlo a exercer de no mnimo de trs
em trs meses, no na gua mas no corpo do molusco.
As normas de qualidade das guas do litoral e salobras para fins aqucolas guas
conqucolas tm por finalidade proteger e melhorar a qualidade dessas guas a fim de
permitir a vida e o crescimento de moluscos (bivalves e gastrpodes), equinodermes,
3 Na legislao mais recente relativa qualidade microbiolgica de outros tipos de guas, os

estreptococos fecais foram substitudos pelos enterococos um subgrupo mais resistente
s condies do meio, nomeadamente a salinidade, os coliformes fecais foram substitudos
por Escherichia coli e os coliformes totais deixaram de ser considerados indicadores
especficos de poluio fecal e apenas so considerados indicadores de poluio. No
entanto, a avaliao da qualidade microbiolgica deste tipo de guas continua a ser ainda
regulada pelo Decreto-Lei 236/98.
15
Manuela Abelho
tunicados e crustceos, contribuindo para a boa qualidade dos produtos conqucolas

passveis de consumo pelo homem.

o corpo dos moluscos e para o lquido intervalar (Decreto-Lei 236/98, anexo II).
Parmetro Unidade VMR

Coliformes fecais Nmero/100 mL 300
guas de rega
Os critrios e normas de qualidade das guas de rega visam proteger a sade pblica,
a qualidade das guas superficiais e subterrneas, as culturas que podem ser
afectadas pela m qualidade das guas de rega e os solos cuja aptido para a
agricultura pode ser degradada pelo uso sistemtico de guas de rega de m
qualidade. Nas guas de rega, os parmetros microbiolgicos a considerar so os
indicados na Tabela 4.3.

a gua de rega (Decreto-Lei 236/98, anexo XVI).
Parmetro Unidade VMR VMA

Coliformes fecais Nmero/100 mL 100 -
Ovos de parasitas intestinais Nmero/L - 1
Coliformes totais, coliformes fecais e estreptococos fecais

Podem usar-se dois mtodos analticos: filtrao por membrana ou inoculao de
tubos mltiplos. A temperatura de incubao 37C 1C para os coliformes totais e
para os estreptococos fecais e 44.5C 0.5C para os coliformes fecais.
Na filtrao por membrana, a inoculao feita em meio slido especfico adequado

para o efeito e contagem das colnias (UFC). As amostras devem ser diludas ou,
quando apropriado, concentradas a fim de que o nmero de colnias fique
compreendido entre 10 e 100.
Na inoculao de tubos mltiplos, para os coliformes totais e fecais utiliza-se o

mtodo de diluio com fermentao em substratos lquidos em pelo menos trs
tubos em 3 diluies, com subcultura dos tubos positivos em meios de confirmao e
contagem em nmero mais provvel (NMP). Para os estreptococos fecais, utiliza-se o
mtodo de diluio em caldo de azoteto de sdio em pelo menos trs tubos para cada
uma das trs diluies e contagem em NMP.
16
Manuela Abelho
Salmonelas
Concentrao por filtrao (atravs de membrana ou filtro apropriado). Sementeira
em meio de pr-enriquecimento. Enriquecimento, subcultura em meio de
isolamento. Identificao.
Ovos de parasitas intestinais

Contagem ao microscpio
5. guas balneares
Legislao aplicvel
Decreto-Lei 135/2009, de 3 de Junho |
http://dre.pt/pdf1sdip/2009/06/10700/0346003468.pdf
Estabelece o regime jurdico de identificao, gesto, monitorizao e classificao da

qualidade das guas balneares e de prestao de informao ao pblico sobre as
mesmas, transpondo para a ordem jurdica interna a Directiva n. 2006/7/CE, do
Parlamento Europeu e do Conselho, de 15 de Fevereiro, relativa gesto da qualidade
das guas balneares, e complementando a Lei da gua, aprovada pela Lei 58/2005,
de 29 de Dezembro.
Define como guas balneares as guas superficiais, quer sejam interiores, costeiras ou
de transio, tal como definidas na Lei da gua, aprovada pela Lei n. 58/2005, de 29
de Dezembro, em que se preveja que um grande nmero de pessoas se banhe e onde a
prtica balnear no tenha sido interdita ou desaconselhada de modo permanente.
A monitorizao das guas balneares deve ser efectuada no prazo mximo de quatro
dias a contar da data indicada no calendrio de amostragem, o qual estabelecido
pelo INAG para cada poca balnear, antes do seu incio. O ponto de amostragem
estabelecido no local onde: (i) se preveja maior afluncia de banhistas; ou (ii) de
acordo com o perfil das guas balneares, onde exista maior risco de poluio,
entendida como a presena de contaminao microbiolgica ou outros organismos ou
resduos que afectem a qualidade das guas balneares e constituam um risco para a
sade dos banhistas. A monitorizao deve ser efectuada com a frequncia
especificada no anexo II do Decreto-Lei 135/2009, sendo os resultados dessa
monitorizao utilizados na constituio dos conjuntos de dados sobre a qualidade
das guas balneares.
17
Manuela Abelho
Os parmetros microbiolgicos a avaliar na avaliao da qualidade das guas

balneares so os mesmos para as guas interiores (Tabela 5.1.) e para as guas
costeiras e de transio (Tabela 5.2), mas os valores diferem entre os dois tipos de
gua.
Tabela 5.1 Valores paramtricos microbiolgicos a observar na avaliao da

qualidade das guas balneares interiores (Decreto-Lei 135/2009, anexo I).
Qualidade
Parmetro Unidade Excelente Boa Aceitvel
Enterococos intestinais Nmero/100 mL 200 400 330
Escherichia coli Nmero/100 mL 500 1000 900
Tabela 5.2 Valores paramtricos microbiolgicos a observar na avaliao da

qualidade das guas balneares costeiras e de transio (Decreto-Lei 135/2009,
anexo I).
Qualidade
Parmetro Unidade Excelente Boa Aceitvel
Enterococos intestinais Nmero/100 mL 100 200 185
Escherichia coli Nmero/100 mL 250 500 500
Ponto de amostragem, recolha e conservao das amostras

As amostras devero ser recolhidas 30 cm abaixo da superfcie das guas e onde a sua
profundidade seja no mnimo de 1 m. Os frascos a utilizar devem ser de material
transparente e incolor (vidro, polietileno ou polipropileno), com capacidade mnima
de 250 mL e devem encontrar-se estreis. As amostras devem ser claramente
identificadas com tinta indelvel na amostra e no formulrio relativo amostra. As
amostras de gua devem, em todas as fases do transporte, ser protegidas da exposio
luz, em especial luz directa do sol e conservadas a uma temperatura de cerca de
4C at sua anlise. Se for provvel que o transporte para o laboratrio demore
mais de quatro horas, obrigatrio o transporte em frigorfico. O perodo de tempo
decorrido entre a recolha da amostra e a realizao da anlise deve ser o mais curto
possvel, sempre que possvel no mesmo dia e no prazo mximo de vinte e quatro
horas.

Enterococos intestinais: normas ISO 7899-1 ou ISO 7899-2
Consultar a seco relativa anlise das guas destinadas ao consumo humano, para
as quais referido o mesmo mtodo.
18
Manuela Abelho
Escherichia coli: normas ISO 9308-3 ou ISO 9308-1

Consultar a seco relativa anlise das guas destinadas ao consumo humano, para
as quais referido o mesmo mtodo.
6. Mtodos gerais de anlise microbiolgica

Para a pesquisa de coliformes, coliformes fecais, Escherichia coli e
estreptococos/enterococos fecais existem dois mtodos bsicos de referncia: o
mtodo da inoculao de meio lquido em tubos mltiplos com leitura do Nmero
Mais Provvel (NMP) e o mtodo da filtrao por membrana com inoculao de meio
slido. Na legislao portuguesa mais antiga o mtodo de referncia era o dos tubos
mltiplos, mas na legislao mais recente o mtodo de referncia passou a ser o da
filtrao por membrana. Apesar desta alterao das normas legais, ambos os mtodos
possuem vantagens e desvantagens (Tabela 6.1).
Tabela 6.1 Vantagens e desvantagens da filtrao por membrana em relao

inoculao de tubos mltiplos e determinao do NMP
Vantagens da filtrao por membrana

1. Tem boa reprodutibilidade
2. Os resultados so relativamente rpidos
3. Os filtros podem ser transferidos para diferentes meios de cultura
3. Permite o processamento de grandes volumes de amostra de forma a aumentar a
sensibilidade do teste
4. As filtraes podem ser efectuadas no local de recolha da gua
5. um mtodo mais econmico que o NMP
Desvantagens da filtrao por membrana
1. As amostras com gua muito turva impedem a filtrao de grandes volumes
2. Quando existe grandes populaes de outras bactrias, o crescimento pode ser
demasiado elevado para permitir a contagem
3. Se existirem metais e fenis presentes na amostra, podem adsorver aos filtros e
inibir o crescimento bacteriano
19
Manuela Abelho
Inoculao de tubos mltiplos e determinao do NMP

O mtodo da inoculao de tubos mltiplos e determinao do nmero mais provvel
(NMP) pode ser usado para estimar o nmero de microrganismos viveis presentes
numa determinada populao. A amostra diluda (diluies sucessivas ou
inoculao de volumes 10 vezes inferiores para a mesma quantidade de meio 4)
inoculando-se um meio de cultura lquido, especfico para o microrganismo a
pesquisar, com um volume preciso dessas diluies. Desta forma, presume-se que os
meios de cultura inoculados com as ltimas diluies no vo apresentar qualquer
crescimento (resultados negativos) e que ocorrer crescimento nos tubos que
tenham, pelo menos, um microrganismo vivel.
Se a amostra e as diluies forem homogneas e se houver um nmero suficiente de

repeties, possvel tratar estatisticamente os resultados e generaliz-los amostra
inicial. Por cada diluio da amostra inoculam-se, geralmente, 3, 5 ou 10 sries de
tubos com o referido meio de cultura (repeties). A prpria designao do mtodo
aponta claramente para o carcter probabilstico que lhe deve ser atribudo. O
nmero de tubos positivos nos quais ocorreu crescimento em cada diluio
utilizado para determinar o Nmero Mais Provvel (NMP) desse microrganismo na
amostra de gua analisada, consultando uma tabela estatstica (tabela de McGrady)
semelhante Tabela 6.2.
Tabela 6.2 Tabela de McCrady para a determinao do nmero mais provvel

(NMP) de microrganismos com base em 5 repeties de cada diluio
Nmero de tubos positivos nas NMP / Nmero de tubos positivos NMP /
diluies 100 mL de nas diluies 100 mL de
10 mL 1 mL 0.1 mL amostra 10 mL 1 mL 0.1 mL amostra
0 0 0 0 4 0 0 13
0 0 1 2 4 0 1 17
0 0 2 4 4 0 2 20
0 1 0 2 4 0 3 25
0 1 1 4 4 1 0 17
0 0 2 6 4 1 1 20
0 2 0 4 4 1 2 25
0 2 1 6 4 2 0 20
0 3 0 6 4 2 1 25
1 0 0 2 4 2 2 30
4 A utilizao de inculos de 10 mL, 1 mL e 0.1 mL semelhante a inocular a amostra e duas

diluies decimais sucessivas dessa amostra
20
Manuela Abelho
Nmero de tubos positivos nas NMP / Nmero de tubos positivos NMP /

diluies 100 mL de nas diluies 100 mL de
10 mL 1 mL 0.1 mL amostra 10 mL 1 mL 0.1 mL amostra
1 0 1 4 4 3 0 25
1 0 2 6 4 3 1 35
1 0 3 8 4 3 2 40
1 1 0 4 4 4 0 35
1 1 1 6 4 4 1 40
1 1 2 8 4 4 2 45
1 2 0 6 4 5 0 40
1 2 1 8 4 5 1 50
1 2 2 10 4 5 2 55
1 3 0 8 5 0 0 25
1 3 1 10 5 0 1 30
1 4 0 11 5 0 2 45
2 0 0 5 5 0 3 60
2 0 1 7 5 0 4 75
2 0 2 9 5 1 0 35
2 0 3 12 5 1 1 45
2 1 0 7 5 1 2 65
2 1 1 9 5 1 3 85
2 1 2 12 5 1 4 115
2 2 0 9 5 2 0 50
2 2 1 12 5 2 1 70
2 2 2 14 5 2 2 95
2 3 0 12 5 2 3 120
2 3 1 14 5 2 4 150
2 4 0 15 5 2 5 175
3 0 0 8 5 3 0 80
3 0 1 11 5 3 1 110
3 0 2 13 5 3 2 140
3 1 0 11 5 3 3 175
3 1 1 14 5 3 4 200
3 1 2 17 5 3 5 250
3 1 3 20 5 4 0 130
3 2 0 14 5 4 1 170
3 2 1 17 5 4 2 225
3 2 3 20 5 4 3 275
3 3 0 17 5 4 4 350
3 3 1 20 5 4 5 425
3 4 0 20 5 5 0 250
3 4 1 25 5 5 1 350
3 5 0 25 5 5 2 550
5 5 3 900
5 5 4 1600
5 5 5 1800+
Filtrao por membrana

O mtodo da filtrao por membrana efectuado atravs da filtrao de um volume
conhecido de amostra atravs de um filtro de 0.45 m, que retm os microrganismos
na sua superfcie. A membrana depois colocada num meio slido e levada a incubar.
O sucesso do mtodo depende na utilizao de um meio diferencial ou selectivo,
efectivo para o microrganismo que se quer pesquisar.
21
Manuela Abelho
7.Protocolos especficos
Protocolo 7.1 Recolha de amostras de gua
Norma aplicvel: EN 25667-2 | ISO 5667-2:1991
As mos e a roupa dos intervenientes na colheita devem estar limpas. Os recipientes
para colheita das amostras de gua devem ser de material transparente e incolor
(vidro, polietileno ou polipropileno) e estar esterilizados mediante: esterilizao em
autoclave (mnimo de quinze minutos a 121C), esterilizao a seco (mnimo uma
hora a 160C - 170C) ou ser constitudos por recipientes irradiados recebidos
directamente do fabricante. As amostras devem ser claramente identificadas com
tinta indelvel no recipiente e no formulrio relativo amostra.
A amostra de gua deve ser colhida obedecendo aos cuidados de assepsia, deve ser
representativa das caractersticas microbiolgicas do material a analisar e deve ter
volume suficiente para permitir, se necessrio, a repetio dos testes. O recipiente
para a colheita da amostra deve permanecer fechado at ao momento da colheita;
nessa altura enche-se sem enxaguar com a gua a analisar e fecha-se imediatamente,
tendo cuidado para no contaminar durante estas operaes as superfcies interiores
da rolha ou tampa. O frasco no deve ficar completamente cheio, pois algum espao
vazio no seu interior facilitar a agitao e mistura da amostra antes de se efectuarem
as anlises.
Aps a colheita, as amostras de gua devem, em todas as fases do transporte, ser

protegidas da exposio luz, em especial luz directa do sol e devem ser mantidas a
uma temperatura de cerca de 4C at ao seu processamento.
Recolha de amostras de gua de uma torneira

1. Lavar e desinfectar as mos (ou usar luvas estreis);
2. Retirar qualquer filtro e deixar correr o tempo necessrio (1-2 minutos) para
esgotar a gua que tenha estado parada na canalizao;
3. Fechar a torneira e desinfectar o interior e o exterior com lcool;
4. Abrir a torneira com cuidado e deixar a gua correr um pouco;
5. Abrir o frasco esterilizado s neste momento e colher a gua mantendo-o
inclinado para evitar a sua contaminao pelo ar. Manter a rolha na mo
esquerda virada para baixo e nunca tocar no interior da rolha ou no gargalo do
frasco;
6. Recolher a amostra de gua mantendo o frasco inclinado para evitar a sua
contaminao pelo ar e sem encher completamente o frasco;
7. Fechar imediatamente o frasco;
8. Identificar a amostra;
22
Manuela Abelho
9. Transportar as amostras em caixa isotrmica com placas acumuladoras trmicas

congeladas (4C) e realizar a anlise nas 4 horas seguintes colheita.
Recolha de amostras de gua de um curso de gua, de um reservatrio ou de uma

praia
1. Lavar e desinfectar as mos (ou usar luvas estreis);
2. Segurar o frasco numa zona perto da sua base e mergulh-lo na massa de gua
com a boca virada para baixo. Deve mergulhar-se at cerca de metade da altura
da coluna lquida ou pelo menos at cerca de 20 cm abaixo da superfcie da gua;
3. Virar o frasco at que o gargalo aponte ligeiramente para a superfcie e a boca
esteja voltada contra a corrente. Se no existir qualquer corrente (por exemplo,
no caso de um reservatrio) empurrar o frasco horizontalmente;
4. Recolher a amostra e fechar imediatamente o frasco;
5. Seguir os passos 8-9 indicados para a gua recolhida de uma torneira.
Protocolo 7.2 Enumerao de microrganismos cultivveis: contagem

de colnias por sementeira em meio extracto de levedura agar
Norma aplicvel: EN ISO 6222 | ISO 6222:1999
Consiste na enumerao de microrganismos cultivveis5, por contagem de UFC em
meio extracto de levedura agar aps incubao aerbia a 22 e a 36C, em guas
destinadas ao consumo humano. Faz-se a inoculao de um volume conhecido de
amostra ou suas diluies, por homogeneizao com um meio de cultura especfico
em caixas de Petri, com incubao de um conjunto a 36C durante 44 horas e de
outro conjunto a 22C durante 68 horas. No final contam-se as colnias das caixas
contveis e faz-se o clculo do nmero de UFC por mililitro da amostra.
Primeiro tempo: elaborao do meio de cultura

Meio agar extracto de levedura
Triptona: 6.0 g
Extracto de levedura: 3.0 g
5 Todas as bactrias aerbias, leveduras e bolores capazes de formar colnias no meio

especificado e nas condies de ensaio.
23
Manuela Abelho
Agar: 15.0 g
gua destilada: 1000 mL
pH 7.20.2 a 25C;
1. Adicionar todos os ingredientes ou seguir as instrues do preparado em p
(consultar o Protocolo 1.1 da Parte 1 do Manual de Monitorizao
Microbiolgica Ambiental);
2. Esterilizar em autoclave em tubos de 15-20 mL (volume para uma caixa de Petri);
3. Conservar no frigorfico at utilizao.
Segundo tempo: recolha, diluio, sementeira e incubao das amostras

1. Recolher, manipular e preservar as amostras de acordo com o Protocolo 7.1;
2. Fundir o meio de cultura no autoclave ou no microondas, deixar arrefecer e
manter a 451C num banho de gua;
3. Se necessrio (isto , se o tipo de gua fizer prever um grande contedo
microbiano que provoque a coalescncia das colnias), fazer diluies decimais
sucessivas da amostra (consultar o Protocolo 1.4 da Parte 1 do Manual de
Monitorizao Microbiolgica Ambiental);
4. Incorporar um inculo de 1 mL (da amostra ou das suas diluies) em 15-20 mL
do meio de cultura fundido (consultar o Protocolo 1.5 da Parte 1 do Manual de
Monitorizao Microbiolgica Ambiental);
5. Inocular no mnimo duas caixas de Petri por cada temperatura de incubao;
6. Deixar solidificar, inverter e incubar um conjunto a 362C durante 444 h e o
outro conjunto a 222C durante 684 h.
Terceiro tempo: contagem das colnias

1. Observar as caixas assim que terminar o tempo de incubao ou armazen-las a
53C e fazer a observao num perodo de 48h;
2. Contar as colnias observadas em cada caixa (com um nmero contvel de
colnias) e calcular o nmero de UFC presentes num mililitro da amostra para
cada temperatura de incubao (consultar o Protocolo 1.8 da Parte 1 do Manual
de Monitorizao Microbiolgica Ambiental);
3. Se no existirem colnias nas caixas inoculadas com a amostra no diluda,
exprimir os resultados como no detectados num mL;
4. Se existirem mais de 300 colnias nas caixas inoculadas com a diluio maia alta
utilizada, exprimir os resultados como> 300.
5. O relatrio deve incluir a referncia norma de referncia, todos os detalhes
necessrios para a completa identificao da amostra, a tcnica e o meio de
cultura utilizados, o tempo e a temperatura de incubao, os resultados do ensaio
24
Manuela Abelho
e qualquer ocorrncia observado no decurso da anlise e a classificao da

qualidade da gua em funo da sua utilizao e de acordo com a legislao.
Protocolo 7.3 Deteco e enumerao de Escherichia coli e de

bactrias coliformes pelo mtodo da filtrao por membrana
Norma aplicvel: EN ISO 9308-1 | ISO 9308-1:2000
Consiste na deteco e na enumerao de Escherichia coli, que normalmente habita o
intestino do homem e de outros animais homeotrmicos, indicando a contaminao
fecal da gua, e de outros coliformes. A presena de coliformes, embora no prove de
forma conclusiva a contaminao fecal da gua visto que algumas destas bactrias
no de origem intestinal, vivendo no solo e em guas superficiais pode indicar
falhas no tratamento e na distribuio da gua destinada ao consumo humano. O
mtodo est dividido em duas partes, um ensaio standard de referncia (que permite
enumerar separadamente E. coli e outras bactrias coliformes) e um ensaio rpido
opcional (que permite enumerar E. coli), que podem ser efectuados em paralelo.
Neste protocolo apenas abordaremos o ensaio standard de referncia.
Primeiro tempo: elaborao de meios de cultura

Meio agar de lactose TTT com heptadecilsulfato de sdio
Meio de base agar de lactose:
Lactose: 20 g
Peptona: 10 g
Extracto de levedura: 6 g
Extracto de carne: 5 g
Azul de bromotimol: 0.05 g
Agar: 15-25 g
pH 7.20.2 a 25C
Microbiolgica Ambiental) e esterilizar em autoclave;
Soluo TTT:
2. Dissolver 0.05 g de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTT) num pequeno volume
de gua, perfazer at 100 mL, esterilizar por filtrao (0.2 m);
Soluo heptadecilsulfato de sdio:
3. Dissolver 0.2 g de heptadecilsulfato de sdio (Tergitol 7) num pequeno volume de
gua, perfazer at 100 mL, esterilizar em autoclave;
4. Fundir o meio de base e esperar que arrefea at 50C;
25
Manuela Abelho
5. Adicionar a 100 mL de meio de base, 5 mL da soluo TTC e 5 mL da soluo de

heptadecilsulfato de sdio;
6. Misturar completamente evitando que se formem bolhas;
7. Repartir por caixas de Petri (camada de cerca de 5 mm=cerca de 15 mL/caixa);
8. Guardar no frio e no escuro e utilizar no prazo mximo de 10 dias.
Caldo de triptofano:
Digestato trptico de casena: 10 g
L-triptofano: 1 g
Cloreto de sdio: 5 g
pH 7.50.1 a 25C;
9. Repartir em tubos de vidro (cerca de 10 mL em cada tubo) e esterilizar em
autoclave;
Meio agar triptonado de soja (TSA):

Digestato trptico de casena: 15 g
Peptona de soja: 5 g
Agar=15-25 g
pH 7.20.1 a 25C;
11. Esterilizar e repartir por caixas de Petri (camada de cerca de 5 mm=cerca de
15 mL/caixa);
Segundo tempo: recolha, filtrao e incubao das amostras

2. Filtrar 100 mL (ou 250 mL no caso de guas engarrafadas) atravs do filtro de
membrana (pelo menos dois filtros/amostra);
26
Manuela Abelho
3. Colocar o filtro sobre a caixa de Petri com meio agar de lactose TTT com
heptadecilsulfato de sdio;
4. Incubar a 362C durante 213 h
Terceiro tempo: exame e repicagem

1. Examinar a membrana e contar as colnias que apresentem uma cor amarela no
meio por baixo da colnia (colnias lactose-positivas6);
2. Repicar todas essas colnias (ou no mnimo 10) para caixas com meio TSA e para
tubos com caldo de triptofano;
3. Incubar o meio TSA a 362C durante 21 h2 h;
4. Incubar os tubos com caldo de triptofano a 440.5C durante 21 h3 h
Quarto tempo: diferenciao e contagem

1. Preparar o reagente do teste da oxidase, adicionando 0.1 mg de tetrametil-p-
fenilendiamina a 10 mL de gua destilada;
2. Efectuar o teste da oxidase nas colnias incubadas mo meio TSA:
Colocar sobre um papel de filtro duas ou trs gotas do reagente da oxidase;
Utilizando uma vareta de vidro ou de plstico, retirar uma parte da colnia e
deposit-la sobre o papel de filtro molhado;
Considerar que ocorreu uma reaco positiva quando se desenvolve uma cor
azul/violeta escuro em 30 segundos.
3. Efectuar o teste da produo da formao de indol nos tubos com caldo de
triptofano:
Adicionar ao tubo 0.2 a 0.3 mL do reagente de Kovacs;
Considerar que ocorreu a formao do indol quando se desenvolve uma cor roxa-
avermelhada na superfcie do meio.
4. Considerar todas as colnias com reaco negativa ao teste da oxidase como
bactrias coliformes;
6 Bactrias capazes de formar colnias em aerobiose a 362C num meio selectivo e

diferencial com lactose, com produo de cido.
27
Manuela Abelho
5. Considerar todas as colnias com reaco negativa ao teste da oxidase e com

produo de indol como E. coli.
6. O relatrio deve incluir a referncia norma, todos os detalhes necessrios para a
completa identificao da amostra, a tcnica e o meio de cultura utilizados, o
tempo e a temperatura de incubao, os resultados do ensaio e qualquer
ocorrncia observado no decurso da anlise e a classificao da qualidade da gua
em funo da sua utilizao e de acordo com a legislao.
Protocolo 7.4 Deteco e enumerao de enterococos intestinais

pelo mtodo da filtrao por membrana
Norma aplicvel: EN ISO 7899-2 | ISO 7899-2:2000
Consiste na deteco e na enumerao de enterococos7 intestinais, nomeadamente
Enterococcus faecalis, E. faecium, E. durans e E. hirae. Eventualmente tambm se
podero enumerar outras espcies de enterococos e algumas espcies de
estreptococos, em particular Streptococcus bovis e S. equinus. Os enterococos podem
considerar-se como indicadores de contaminao fecal, embora alguns possam ter
outras provenincias. A enumerao dos enterococos intestinais baseia-se na filtrao
de um volume conhecido de amostra, colocando-se o filtro sobre um meio slido
selectivo que contm azida de sdio (a azida de sdio inibe o crescimento das
bactrias Gram-negativas) e cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazolio, um composto incolor
que se reduz a formazo, de cor vermelha, pela aco dos enterococos intestinais. No
meio crescem colnias tpicas, de cor vermelha, castanha ou rosa, total ou no centro
da colnia. Se se formarem colnias tpicas, a confirmao feita por transferncia da
membrana para agar de blis de esculina e azida, previamente aquecido a 44C. Neste
meio os enterococos intestinais hidrolisam a esculina em 2 horas produzindo 6,7-
dihidroxicumarina que se combina com os ies ferro para formar um composto de
cor castanha ou negra que se difunde pelo meio.
7 Microrganismos capazes de reduzir o cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) a formazo e

de hidrolisar a esculina a 44C sobre os meios especificados nesta norma.
28
Manuela Abelho

Meio Slanetz e Bartley
Meio de base:
Triptose: 20 g
Glucose: 2 g
Hidrogenosulfato de di-potssio (K2HPO4): 4 g
Azida de sdio (NaN3): 0.4 g
Agar: 8-18 g
pH a 7.20.1 a 25C
1. Dissolver todos os componentes levando fervura, esterilizar em autoclave;
2. Deixar arrefecer at 50-60C;
Soluo TTC:
3. Dissolver 1 g de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) num pequeno volume de
gua, perfazer at 100 mL, esterilizar por filtrao (0.2 m);
4. Juntar 10 mL da soluo TTC a 1000 mL do meio base arrefecido a 50-60C;

5. Repartir por caixas de Petri (cerca de 20 mL/caixa);
Meio blis-esculina-azida agar/1000 mL:

Triptona=17 g
Peptona=3 g
Extracto de levedura=5 g
Blis desidratada=10 g
Cloreto de sdio=5 g
Esculina=1 g
Citrato de ferro (III) e amnia=0.5 g
Azida de sdio=0.15 g
pH 7.10.1 a 25C;
7. Esterilizar em autoclave e repartir por caixas de Petri (cerca de 15 mL/caixa)
Segundo tempo: recolha, filtrao e incubao das amostras

29
Manuela Abelho
2. Filtrar 100 mL (ou 250 mL no caso de guas engarrafadas) atravs do filtro de

membrana (pelo menos dois filtros/amostra);
3. Colocar o filtro sobre a caixa de Petri com meio Slanetz e Bartley;
4. Incubar a 362C durante 444 h.
Terceiro tempo: confirmao e contagem

1. Examinar as membranas e contar todas as colnias que apresentem uma
colorao vermelha, castanha ou rosa, no centro ou em toda a colnia;
2. Colocar a membrana numa caixa de Petri com meio blis-esculina-azida agar,
previamente aquecida a 44C;
3. Incubar a 440.5C durante 2 h;
4. Considerar um resultado positivo todas as colnias que apresentem, no meio
circundante, uma colorao castanha ou negra e cont-las como enterococos
intestinais
5. O relatrio deve incluir a referncia norma, todos os detalhes necessrios para a
completa identificao da amostra, a tcnica e o meio de cultura utilizados, o
tempo e a temperatura de incubao, os resultados do ensaio e qualquer
ocorrncia observado no decurso da anlise e a classificao da qualidade da gua
em funo da sua utilizao e de acordo com a legislao.
Protocolo 7.5 Deteco e enumerao de coliformes totais,

coliformes fecais e Escherichia coli pelo mtodo do Nmero Mais
Provvel (NMP)
O teste completo permite enumerar os coliformes totais e os coliformes fecais (mas
no especificamente E. coli) para o que so necessrias trs fases: teste presuntivo,
teste confirmativo e teste final. s
No teste presuntivo (verificao da produo de gs) inoculam-se volumes

apropriados da amostra em sries de tubos contendo meio de cultura apropriado, e a
incubam-se a 370,5 C, durante 242 horas. Se findo esse perodo no tiver havido
formao de gs em nenhum tubo, prolonga-se a incubao at s 483 horas. O
meio de cultura inibe o crescimento dos microrganismos Gram-positivos e encoraja o
crescimento dos microrganismos coliformes. Os coliformes usam o oxignio presente
no meio e atravs da fermentao produzem cido e gs sob condies anaerbias. Se
no existir produo de gs o resultado do teste negativo, estabelecendo-se que no
existem coliformes na amostra. A formao de gs (resultado positivo) determina a
presena de coliformes na amostra. O nmero de tubos positivos em cada diluio
utilizado para calcular o NMP de microrganismos coliformes na amostra de gua.
30
Manuela Abelho
No teste confirmativo (confirmao dos resultados) todos os tubos positivos s

24 horas so repicados para um apropriado, incubados a 37C e lidos nas condies
anteriormente descritas. A formao de gs confirma a presena de coliformes na
amostra. Este teste confirma os resultados uma vez que a formao de gs no teste
presuntivo pode ter sido devida actividade de microrganismos no coliformes, como
por exemplo Clostridium perfringens, uma bactria Gram-positiva.
No teste final (verificao da presena de coliformes fecais), repete-se o procedimento

utilizado no teste confirmativo mas a incubao feita a 44.5C durante 24 a 48
horas. A formao de gs determina a presena de coliformes fecais na amostra. Se
no existir formao de gs a 44.5C mas existir a 37C determina-se que existem
coliformes mas que no so fecais. O NMP de coliformes fecais determinado com
base no nmero de tubos positivos em cada diluio.
Um teste adicional permite determinar se a presena ou ausncia de E. coli na

amostra. Adiciona-se aos tubos inoculados para o teste final reagente de Kovacs (teste
do indol). Uma reaco positiva (formao de um anel cor-de-rosa) mostra a
presena de E. coli. Uma reaco negativa (formao de um anel da cor do meio)
mostra que E. coli no faz parte da populao de coliformes fecais presentes na
amostra.

Caldo blis verde brilhante
1. Seguir as instrues do preparado em p (consultar o Protocolo 1.1 da Parte 1 do
Manual de Monitorizao Microbiolgica Ambiental);
2. Colocar tubos Durham invertidos8 dentro de tubos de ensaio pequenos (10 mL) e
distribuir 10 mL de meio em cada tubo de ensaio;
3. Preparar meio com dose dupla (isto , duas vezes a quantidade indicada na
embalagem para a mesma quantidade de gua) numa quantidade igual a 1/3 da
quantidade de meio simples;
8 Os tubos Durham so semelhantes a pequenos tubos de ensaio; acumulam o gs

produzido pelos coliformes permitindo assim a deteco da sua presena numa dada
amostra de gua; a presena de gs nos tubos Durham um resultado positivo para
coliformes.
31
Manuela Abelho
4. Colocar tubos Durham invertidos dentro de tubos de ensaio grandes (20 mL) e
distribuir 10 mL de meio de concentrao dupla em cada tubo de ensaio;
5. Esterilizar em autoclave.
Caldo peptonado
Peptona: 18 g
Extracto de carne: 6 g
6. Distribuir 10 mL de meio em cada tubo de ensaio;

Segundo tempo: recolha das amostras e teste presuntivo

2. Inocular 5 tubos contendo 10 mL de meio verde brilhante duplo com 10 mL da
amostra;
3. Inocular 5 tubos contendo 10 mL de meio verde brilhante simples com 1 mL da
amostra;
4. Inocular 5 tubos contendo 10 mL de meio verde brilhante simples com 0.1 mL da
amostra;
5. Incubar a 370.5 C durante 242 horas ou 483 horas.
Terceiro tempo: verificao da existncia de coliformes e teste final

1. Verificar a produo de gs nos tubos, anotando o nmero de tubos positivos em
cada conjunto de 5 tubos de cada diluio;
2. Usar esses algarismos para determinar o NMP de microrganismos coliformes na
amostra (para evitar falsos positivos, porque a formao de gs no teste
presuntivo pode ter sido devida actividade de microrganismos no coliformes,
deveria ser feito o teste confirmativo, mas neste protocolo vamos saltar esse
passo);
3. Repicar com uma ansa os tubos positivos para novos tubos contendo 10 mL de
meio verde brilhante (cor verde) e para novos tubos contendo meio peptonado
(cor amarela);
4. Levar a incubar a 44.5C durante 24+24 horas
32
Manuela Abelho
Quarto tempo: verificao da existncia de coliformes fecais e de E. coli

1. Verificar a produo de gs nos tubos com meio verde brilhante, anotando o
nmero de tubos positivos em cada diluio;
2. Usar esses algarismos para determinar o NMP de coliformes fecais na amostra;
3. Adicionar uma gota de reagente de Kovacs a cada um dos tubos com meio
peptonado (cor amarela);
4. A formao de um anel cor-de-rosa um resultado positivo que indica a presena
de E. coli na amostra;
5. O relatrio deve incluir a referncia norma e a classificao da qualidade da
gua em funo da sua utilizao e de acordo com a legislao e deve incluir
tambm: a identificao completa da amostra, a tcnica de inoculao e o meio de
cultura utilizado, o tempo e a temperatura de incubao, os resultados obtidos
com os tubos, o NMP de microrganismos coliformes, coliformes fecais e E. coli na
amostra e qualquer ocorrncia particular observada durante o decorrer da
anlise.
Protocolo 7.6 Deteco e enumerao de estreptococos fecais pelo

mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP)
Meio Bagg
1. Seguir as instrues do preparado em p (consultar o Protocolo 1.1 da Parte 1 do
Manual de Monitorizao Microbiolgica Ambiental) e distribuir 10 mL deste
meio em tubos de ensaio pequenos (10 mL);
2. Preparar meio com dose dupla (isto , duas vezes a quantidade indicada na
embalagem para a mesma quantidade de gua) numa quantidade igual a 1/3 da
quantidade de meio simples e distribuir 10 mL deste meio em tubos de ensaio
grandes (20 mL);
Segundo tempo: recolha das amostras e incubao

2. Inocular 5 tubos contendo 10 mL de meio bagg duplo com 10 mL da amostra;
3. Inocular 5 tubos contendo 10 mL de meio bagg simples com 1 mL da amostra;
4. Inocular 5 tubos contendo 10 mL de meio bagg simples com 0.1 mL da amostra;
5. Incubar a 370.5 C durante 242 horas ou 483 horas.
33
Manuela Abelho
Terceiro tempo: verificao da existncia de estreptococos fecais

1. Verificar a alterao da cor do meio de cultura de roxo-violeta para amarelo
(resultado positivo para a presena de estreptococos);
2. Usar esses algarismos para determinar o NMP de estreptococos fecais na
amostra;
3. O relatrio deve incluir a referncia norma e a classificao da qualidade da
gua em funo da sua utilizao e de acordo com a legislao e deve incluir
tambm: a identificao completa da amostra, a tcnica de inoculao e o meio de
cultura utilizado, o tempo e a temperatura de incubao, os resultados obtidos
com os tubos, o NMP de enterococos na amostra e qualquer ocorrncia particular
observada durante o decorrer da anlise.
Protocolo 7.7 Deteco e enumerao de Clostridium perfringens

(incluindo esporos)
Decreto-Lei 306/2007
Meio m-CP agar
Triptose: 30 g
Sacarose: 5 g
Hidrocloreto de L-cistena: 1g
MgSO4.7H2O: 0.1 g
Prpura de bromocresol: 40 mg
Agar: 15 g

Microbiolgica Ambiental);
2. Ajustar o pH a 7.6 e esterilizar em autoclave;
3. Deixar arrefecer e adicionar:
D-ciclocernina: 400 mg
Sulfato de B-poliximina: 60 g dissolvidos em 8 mL de gua destilada e
esterilizada
Soluo de 0.5% de difosfato de fenolftalena: 20 mL filtrados e esterilizados
Soluo 4.5% de FeCl3.6H2O: 2 mL
34
Manuela Abelho
4. Distribuir por caixas de Petri (cerca de 15 mL/caixa) e guardar no frio at sua

utilizao.
Segundo tempo: recolha das amostras e incubao

5. Filtrar 250 mL atravs do filtro de membrana (pelo menos dois filtros/amostra);
6. Colocar o filtro sobre a caixa de Petri com meio m-CP;
7. Incubar a 441C durante 213 h.
Terceiro tempo: diferenciao

1. Examinar as colnias, identificando aquelas que se apresentam com cor amarela
opaca;
2. Expor as colnias a vapores de hidrxido de amnio durante 20-30 segundos
(com cuidados por exemplo, numa hotte - para no inalar os vapores);
3. Contar todas as colnias anteriormente identificadas que passaram a rosa ou
vermelho aps a exposio aos vapores de hidrxido de amnio;
4. O relatrio deve incluir a referncia legislao e a classificao da qualidade da
gua em funo da sua utilizao e deve incluir tambm: a identificao completa
da amostra, a tcnica de inoculao e o meio de cultura utilizado, o tempo e a
temperatura de incubao, os resultados obtidos e qualquer ocorrncia particular
observada durante o decorrer da anlise.
Referncias citadas
Mendes, B. (2010). Microbiologia da gua. Pginas 506-522 in Ferreira, W.F.C,
Sousa, J.C.F. & Lima, N. (coords.). Microbiologia. Lidel-Edies tcnicas, Lda.
Lisboa. 622 pginas. ISBN 978-972-757-515-2.
35

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20-10-2010

Curso de Especializao Tecnolgica em Qualidade

O conceito de qualidade da gua ................................................................................ 5

2. Microrganismos e qualidade da gua ......................................................................... 7

Os microrganismos como poluentes .......................................................................... 7

3. gua destinada ao consumo humano....................................................................... 10

Legislao aplicvel ................................................................................................... 10

Legislao aplicvel ....................................................................................................14

Ovos de parasitas intestinais ............................................................................................................... 17

5. guas balneares ......................................................................................................... 17

Legislao aplicvel .................................................................................................... 17

Inoculao de tubos mltiplos e determinao do NMP ......................................... 20

7.Protocolos especficos ................................................................................................ 22

Protocolo 7.1 Recolha de amostras de gua ............................................................ 22

Protocolo 7.2 Enumerao de microrganismos cultivveis: contagem de colnias

Protocolo 7.4 Deteco e enumerao de enterococos intestinais pelo mtodo da

Segundo tempo: recolha, filtrao e incubao das amostras ........................................................... 29

Protocolo 7.5 Deteco e enumerao de coliformes totais, coliformes fecais e

Protocolo 7.7 Deteco e enumerao de Clostridium perfringens (incluindo

Referncias citadas ....................................................................................................... 35

A gua um elemento fundamental para o desenvolvimento sustentvel dos pases,

Na Unio Europeia, a legislao regula a gesto das guas superficiais,

O conceito de qualidade da gua

O Decreto-Lei 236/98, de 1 de Agosto define quatro tipos principais de utilizao da

Os limites paramtricos estabelecidos na legislao so principalmente desenvolvidos

O conceito de poluio/contaminao da gua

no seu estado natural. O conceito de contaminao definido como a introduo ou

2. Microrganismos e qualidade da gua

Quando existe contaminao da gua por fezes, as bactrias de origem fecal

Microrganismos como indicadores de poluio

1 Animais homeotrmicos (tambm chamados animais de sangue quente) so aqueles que

1. A concentrao do microrganismo indicador na gua contaminada deve ter

Os indicadores clssicos de contaminao fecal so (i) o grupo dos coliformes fecais e

O grupo dos coliformes constitudo por bactrias da famlia Enterobacteriaceae,

Os enterococos fecais so caracterizados pela capacidade de crescerem entre 10 e

Clostridium perfringens uma bactria anaerbia, esporulada, redutora de sulfito,

O nmero de UFC a 22C e a 37C no um indicador especfico de poluio fecal

Devido ao aprofundamento dos estudos microbiolgicos, actualmente utilizam-se, em

A bactria Pseudomonas aeruginosa outro dos chamados novos indicadores. No

Existem outros microrganismos presentes na gua que podem representar perigo

3. gua destinada ao consumo humano

Decreto-Lei 306/2007, de 27 de Agosto |

Estabelece o regime da qualidade da gua destinada ao consumo humano,

Localizao dos pontos de amostragem

No caso da gua fornecida a partir de uma rede de distribuio, no

Qualidade microbiolgica: valores paramtricos

Tabela 3.1. Parmetros microbiolgicos e valores paramtricos para a gua

Parmetro Valor paramtrico Unidade

Tabela 3.2. Parmetros microbiolgicos e valores paramtricos para a gua

Parmetro Valor paramtrico Unidade

Tabela 3.3. Parmetros microbiolgicos a analisar nos controlos de rotina

Controlo de rotina 1 Controlo de rotina 2

Mtodos analticos de referncia (Decreto-Lei 306/2007)

Bactrias coliformes e Escherichia coli (E. coli): norma ISO 9308-1

Aps a incubao, as colnias de vrias espcies diferentes apresentam diferentes

E. coli e Citrobacter spp. apresentam colnias amarelas com centro laranja;

Enterococos: norma ISO 7899-2

Pseudomonas aeruginosa: norma EN ISO 12780

Enumerao de microrganismos viveis nmero de UFC a 22C e a 37C: norma

Clostridium perfringens (incluindo esporos)

4. guas para produo de gua para consumo humano, para

Decreto-Lei 236/98, de 1 de Agosto |

Estabelece normas, critrios e objectivos de qualidade com a finalidade de proteger o

No que respeita utilizao da gua para consumo humano, consideram-se trs