BAB 1 PENDAHULUAN

LATAR BELAKANG
Mikroorganisme di muka bumi sangat beragam macamnya, bahkan dengan ukuran
yang berbeda-beda dan jenis yang berbeda. Selain itu, mikroorganisme memiliki ukuran yang
sangat kecil sehingga memerlukan alat pembesar yang disebut mikroskop dalam
mengamatinya. Identifikasi mikroba merupakan salah satu tugas yang lazim dilakukan di
laboratorium mikrobiologi. Dalam pengklasifikasian mikroorganisme, akan sulit mendeteksi
mikroorganisme dalam lingkungan terbuka tanpa bantuan alat pembesar untuk dapat
mengidentifikasi mikroorganisme. Sehingga digunakan teknik pewarnaan dalam preparat
yang nantinya akan dilihat dengan mikroskop, barulah mikroorganisme dapat di lihat dan di
identifikasikan dengan melihat zat warna yang terserap oleh mikroorganisme.
Pewarnaan mikroorganisme juga di gunakan untuk menunjukkan sebaran dan jenis
bahan kimia berbagai komponen sel, sehingga dapat membedakan golongan-golongan dari
mikroorganisme. Tidak semua mikroorganisme dapat menyerap zat warna yang sama, maka
akan digunakan zat warna sesuai dengan mikroorganisme yan gakan diidentifikasi. Teknik
pewarnaan yang sering digunakan di antaranya adalah pewarnaan gram. Dalam melakukan
identifikasi sebaiknya mengenal morfologi mikrooragisme tersebut, teknik membuat sediaan
untuk pemeriksaan mikroskopis serta mengetahui prinsip dasar beberapa teknik pewarnaan.
itu lingkungan sekitar juga mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme sehingga sangat
sulit untuk menghasilkan biakan murni pada medium buatan yang digunakan.
Pemeriksaan mikrobiologi bahan-bahan alami tentu mengandung berbagai bahan dari
lingkungan mikro, dimana dari masing-masing lingkungan menyediakan tempat tumbuh
untuk spesies yang berbeda-beda. Misalnya dalam penumbuhan kapang dan khamir dalam
media PDA, namun juga umbuh bakteri yang dapat berasal dari kontaminan lingkungan.
Apabila dalam isolasi dengan tipe tertentu mikroorganisme ditanam dengan tepat, maka akan
menghasilkan tipe organisme yang berbeda untuk tiap lingkungan mikro yang ada. Pada
praktikum Isolasi dan Identifikasi ini dilakukan untuk memberikan pemahaman tentang hal
yang berkaitan dengan isolasi pada mikroba dan identifikasi dasar mikroba.
Melihat dan mengamati mikroorganisme dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena
selain tidak berwarna dan transparan, mikroorganisme juga berukuran sangat kecil. Untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel
dapat terlihat jelas dan mudah diamati dan diidentifikasikan. Olek karena itu teknik
pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-
penelitian mikrobiologi.
TUJUAN
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian Isolasi dan Identifikasi
Berbagai macam mikroorganisme dapat ditemukan di alam dalam populasi yang
heterogen. Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan
menumbuhkannya dalam suatu medium buatan.Prinsip dari isolasi mikroba adalah
memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran
bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media
padat, sehingga sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya
(Luis, et all. 2004.).
Jika sel-sel tersebut tumbuh pada media padat di beberapa tempat yang terpisah, maka
setiap sel yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang terpisah, sehingga
memudahkan pemisahan selanjutnya. Bila yang digunakan adalah media cair, maka sel-sel
mikroba sulit dipisahkan karena terlalu kecil dan tidak tetap tinggal di tempatnya. Akan tetapi
bila sel tersebut dipisahkan dengan cara pengenceran, kemudian ditumbuhkan dalam media
padat dan dibiarkan membentuk koloni, maka sel-sel tersebut selanjutnya dapat diisolasi dalam
tabung-tabung reaksi atau cawan petri-cawan petri yang terpisah (Luis, et all. 2004.).
Beberapa faktor yang harus diperhatikan dalam mengisolasi bakteri adalah sebagai
berikut :
1. Sifat dan jenis mikroorganisme
2. Habitat mikroorganisme
3. Medium pertumbuhan
4. Cara menginokulasi dan inkubasi
5. Cara mengidentifikasi bakteri
6. Cara pemeliharaannya (Madigan; Martinko; Parker, 2004)
Ada bermacam-macam metode isolasi yang dapat digunakan. Macam-macam
metodeisolasi tersebut antara lain :
1) Isolasi Tunggal
Merupakan metode isolasi dengan cara meneteskan bahan yang mengandung mikroorganisme
pada suatu kaca penutup dengan menggunakan mikropipet, yang kemudian diteliti dibawah
obyektif mikroskop.
2) Isolasi Gores
Merupakan metode isolasi dengan cara menggeser atau menggoreskan ujung jarum ose
yang telah mengandung mikroorganisme dengan hati-hati di atas permukaan agar secara zig
zag yang dimulai dari dasar tabung menuju ke bagian atas tabung.
3) Isolasi Tebar
Merupakan metode isolasi dengan cara menebarkan bahan yang mengandung
mikroorganisme pada permukaan atas tabung
4) Isolasi Tuang
Merupakan metode isolasi dengan cara mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang
telah diencerkan dan sampel tersebut kemudian disebarkan didalam suatu medium dari kaldu
dan gelatin encer (Madigan; Martinko; Parker, 2004).
Menurut Gram (1884) isolasi mikroba dapat dilakukan dengan dua cara yaitu cara
penggoresan dan cara penaburan.
a. Isolasi Mikroba dengan Cara Penggoresan
Tujuan utama dari penggoresan ini adalah untuk menghasilkan koloni-koloni bakteri yang
terpisah dengan baik dari suspensi sel yang pekat.Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau
dari sudut ekonomi dan waktu, tapi memerlukan ketrampilan yang diperoleh dengan latihan.
Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah.
Ada beberapa teknik goresan, diantaranya adalah :
- Goresan T
- Goresan Kuadran
- Goresan Radian
- Goresan Sinambung
b. Isolasi Mikroba dengan Cara Penaburan
Cara ini berbeda dari cara penggoresan dimana media agar diinokulasi dalam keadaan tetap
cair yaitu pada suhu 450C, dan demikian pula koloni-koloni akan berkembang di seluruh media,
tidak hanya pada permukaan. Hal ini bertujuan untuk mempelajari pertumbuhan kololoni
Streptococcal pada sel-sel darah merah.
Identifikasi mikroba yaitu untuk mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka
bakteri dapat diperiksa dalam keadaan hidup atau mati. Pemeriksaan morfologi bakteri ini
perlu, untuk mengenal nama bakteri dan juga perlu pengenalan sifat-sifat fisiologisnya.
Sedangkan konfirmasi jenis bakteri adalah tindakan untuk mengetahui apakah suatu bakteri
tertentu benar tumbuh pada media spesifik yang digunakan (Dwidjoseputro, 2003).
Media spesifik yaitu media yang digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis
metabolisme suatu mikroba khusus. Media spesifik ini beraneka ragam komposisinya
tergantung nutrisi apa yang diperlukan oleh bakteri tersebut. Untuk menelaah bakteri di
dalam laboratorium , pertama- tama kita harus dapat menumbuhkan bakteri tersebut di dalam
suatu biakan murni. Untuk melakukannya haruslah dimengerti jenis- jenis nutrient yang
disyartakan oleh bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang mana dapat menyebabkan
kondisi yang optimum bagi pertumbuhannya tersbut (Pelczar,2007).
Identifikasi pada mikroba dapat dilakukan dengan cara identifikasi bakteri
berdasarkan morfologi dan identifikasi bakteri berdasarkan uji biokimia.
1. identifikasi bakteri berdasarkan morfologi
 Populasi bakteri tumbuh sangat cepat ketika mereka disertakan dengan gizi dan
kondisi lingkungan yang memungkinkan mereka untuk berkembang. Melalui pertumbuhan
ini, berbagai jenis bakteri kadang-kadang akan menghasilkan koloni yang khas dalam
penampilan. Beberapa koloni mungkin akan berwarna, ada yang berbentuk lingkaran,
sementara yang lain tidak teratur. Karakteristik koloni (bentuk, ukuran, warna, dll) yang
diistilahkan sebagai koloni morfologi. Morfologi koloni adalah cara para ilmuan dapat
mengidentifikasi bakteri.
2. Identifikasi bakteri berdasarkan uji biokimia
Uji biokimia bakteri merupakan suatu cara atau perlakuan yang dilakukan untuk
mengidentifikasi dan mendeterminasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi melalui sifat -
sifat fisiologinya. Suatu bakteri tidak dapat dideterminasi hanya berdasarkan sifat-sifat
morfologinya saja, sehingga perlu diteliti sifat-sifat biokimianya dan faktor-faktor yang
mempengaruhi pertumbuhannya.
Berikut beberapa uji Biokimia yang digunakan untuk identifikasi bakteri antara lain:
Reaksi Fermentasi Karbohidrat (Gula-gula)
Fermentasi merupakan salah satu aktivitas biokimia yang dilakukan oleh mikroba.
Fermentasi adalah proses pengubahan senyawa makromolekul organik menjadi senyawa yang
lebih sederhana oleh aktivitas mikrobia pada kondisi anaerob.Fermentasi dapat menghasilkan
berbagai senyawa akhir, contohnya fermentasi karbohidrat yang dapat menghasilkan berbagai
senyawa asam seperti asam laktat dan propionet, ester-ester, keton dan gas (Pelczar, 2007).
Uji katalase
Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui
apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat.
Dan digunakan unrtuk mengetahui kemampuan mikroorganisme untuk menguraikan
hydrogen peroksida dengan menghasilkan enzim katalase. Bakteri yang memerlukan oksigen
manghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri.
Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya antimetabolit tersebut karena mereka
menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan
oksigen dengan reaksi sebagai berikut :2H2O 2H2O + O2 (Volk dan Wheeler, 1993).
2.2 Jenis Mikroba
2.2.1 Kapang
Kapang adalah fungi multiseluler yang mempunyai filamen, dan pertumbuhannya pada
makanan mudah dilihat karena penampakannya yang berserabut seperti kapas.
Pertumbuhannya mula-mula akan berwarna putih, tetapi jika spora telah timbul akan
terbentuk berbagai warna tergantung dari jenis kapang. Kapang terdiri dari suatu thallus
(jamak = thalli) yang tersusun dari filamen yang bercabang yang disebut hifa (tunggal =
hypha, jamak = hyphae). Kumpulan dari hifa disebut miselium (tunggal = mycelium, Jamak
= mycelia) (Pelczar,2005).
Sifat fisiologi kapang antara lain adalah sebagai berikut :
1. Kebutuhan air
Pada umumnya kebanyakan kapang membutuhkan Aw minimal untuk pertumbuhan lebih
rendah dibandingkan dengan khamir dan bakteri.Kadar air bahan pangan kurang dari 14-
15%, misalnya pada beras dan serealia, dapat menghambat ataumemperlambat pertumbuhan
kebanyakan khamir.
2. Suhu pertumbuhan
Kebanyakan kapang bersifat mesofilik yaitu tumbuh baik pada suhu kamar. Suhu
optimum pertumbuhan untuk kebanyakan kapang adalah sekitar 25-300C tetapi beberapa
dapat tumbuh pada suhu 35-370C atau lebih tinggi. Beberapa kapang bersifat
psikrotrofik dan beberapa bersifat termofilik
3. Kebutuhan oksigen dan pH
Semua kapang bersifat aerobic, yaitu membutuhkan oksigen untuk pertumbuhannya.
Kebanyakan kapang dapat tumbuh pada kisaran pH yang luas, yaitu2-8,5 tetapi biasanya
pertumbuhannya akan lebih baik pada kondisi asam atau pH rendah.
4. Makanan
Pada umumnya kapang dapat menggunakan berbagai komponen makanan, dariyang
sederhana hingga kompleks.Kebanyakan kapang memproduksi enzim hidrolitik, missal
amylase, pectinase, proteinase dan lipase, oleh karena itu dapat tumbuh pada makanan-
makanan yang mengandung pati, pektin, protein atau lipid.
5. Komponen penghambat
Beberapa kapang mengeluarkan komponen yang dapat menghambat organisme
lainnya.Komponen itu disebut antibiotic, misalnya penisilin yang diproduksi oleh Penicillium
chrysogenu dan clavasin yang diprosukdi oleh Aspergillus clavatus.Pertumbuhan kapang
biasanya berjalan lambat bila dibandingkan dengan pertumbuhan khamir dan bakteri.Oleh
karena itu jika kondisi pertumbuhanmemungkinkan semua mikroorganisme untuk tumbuh,
kapang biasanya kalah dalam kompetisi dengan khamir dan bakteri.Tetapi sekali kapanh
dapat mulai tumbuh, pertumbuhan yang ditandai dengan pembentukan miselium
dapat berlangsung dengan cepat (Fardiaz, 1992).
 Kapang mempunyai cirri-ciri morfologi yang spesifik secara makroskopis dan
mikroskopis. Ciri-ciri tersebut dapat digunakan sebagai identifikasi dan
determinasi.Pengamatan secara mikroskopis dapat berupa bersekat atau tidaknya hifa, bentuk
percabangan hifa, stolon, rizoid , sel kaki badan buah, dasar badan buah,pendukung badan
buah, dan bentuk spora (Sutariningsih dkk, 1997).
2.2.2 Khamir
Khamir (yeast) merupakan sel tunggal (uniseluler) yang membentuk tunas dan
pseudohifa (Webster dan Weber, 2007). Hifanya panjang, dapat bersepta atau tidak bersepta
dan tumbuh di miselium. Yeast memiliki ciri khusus bereproduksi secara aseksual dengan
cara pelepasan sel tunas dari sel induk. Beberapa khamir dapat bereproduksi secara seksual
dengan membentuk aski atau basidia dan dikelompokkan ke dalam Ascomycota dan
Basidiomycota. Dinding sel yeast adalah struktur yang kompleks dan dinamis dan berfungsi
dalam menanggapi perubahan lingkungan yang berbeda selama siklus hidupnya (Hoog et al.,
2007).
Menurut Pelczar (2005), khamir hidupnya sebagian ada yang saprofit dan ada beberapa
yang parasitik. Sel khamir mempunyai ukuran yang bervariasi, yaitu dengan panjang 1-5 m
sampai 20-50 m, dan lebar 1-10 m. Khamir termasuk fungi tetapi dibedakan dari kapang
karena bentuknya yang bersifat uniseluler. Reproduksi khamir terutama dengan cara
pertunasan. Sebagai sel tunggal khamir tumbuh dan berkembang biak lebih cepat jika
dibandingkan dengan kapang karena mempunyai perbandingan luas permukaan dengan
volume yang lebih besar.
Khamir pada umumnya diklasifikasikan berdasarkan sifat-sifat fisiologinya dan tidak
atas perbedaan morfologinya seperti pada kapang.Yeast dapat dibedakan atas dua kelompok
berdasarkan sifat metabolismenya yaitu bersifat fermentatif dan oksidatif. Jenis fermentatif
dapat melakukan fermentasi alkohol yaitu memecah gula (glukosa) menjadi alkohol dan gas
contohnya pada produk roti.Sedangkan oksidatif (respirasi) maka akan menghasilkan
CO2 dan H2O. Keduanya bagi yeast adalah dipergunakan untuk energi walaupun energi yang
dihasilkan melalui respirasi lebih tinggi dari yang melalui fermentasi (Natsir, 2003).
2.2.3 Bakteri (Gram Positif dan Negatif)
Menurut Pelczar dan Chan (1988), bakteri adalah protista yang bersifat prokariot yang
khas dan bersel tunggal (uniseluler). Sel-selnya secara khas membentuk bola (kokus), batang
(bacillus) atau spiral (spirullum). Diameternya sekitar 0,5-1,0 m dan panjangnya 1,5-2,6
m. Semua bakteri bersel tunggal walaupun dalam beberapa keadaan dapat dijumpai
gumpalan yang kelihatan bersel banyak. Bakteri dibagi menjadi tiga bentuk yang utama :
1. Kokus bulat
2. Basil berbentuk silinder atau batang
3. Spiral batang melengkung atau melingkar-lingkar. (Fardiaz, 1992).
Berdasarkan komposisi dinding selnya, bakteri dibedakan menjadi dua yaitu bakteri
Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif adalah bakteri yang memiliki
lapisan peptidoglikan (molekul yang terdiri dari asam amino dan gula) yang tebal (20-80 nm)
dan terdiri atas 60-100 persen peptidoglikan. Lapisan peptidoglikan pada bakteri Gram
negatif lebih tipis dibandingkan dengan bakteri Gram positif dan mengandung lebih
sedikit peptidoglikan (10-20 persen), tetapi mempunyai membran luar yang tebal
yang tersusun dari protein, fosfolipida, dan lipopolisakarida sehingga bersama-sama dengan
lapisan peptidoglikan, keduanya membentuk mantel pelindung yang kuat untuk sel (Pelczar,
1988).
Sebagian besar bakteri mempunyai suhu pertumbuhan antara 45 55 oC dan disebut
golongan bakteri thermofilik. Beberapa bakteri mempunyai suhu pertumbuhannya antara 20
45oC disebut golongan bakteri mesofilik, dan lainnya mempunyai suhu pertumbuhan dibawah
20oC disebut bakteri psikrofilik (Muchtadi, 1989).
Umumnya bakteri membutuhkan air (Available Water) yang lebih banyak dari kapang
dan ragi. Sebagian besar daribakteri dapat tumbuh dengan baik pada aw mendekati 1,00. Ini
berarti bakteri dapat tumbuh dengan baik dalam konsentrasi gula dan garam yang rendah
kecuali bakteri bakteri yang memiliki toleransi terhadap konsentrasi gula dan garam yang
tinggi. Media untuk sebagian besar bakteri mengandung gula tidak lebih dari 1% dan garam
tidak lebih dari 0,85% (larutan garam fisiologis). Konsentrasi gula 3% - 4% dan garam 1
2% dapat menghambat pertumbuhan beberapa jenis bakteri (Muchtadi,1989).
2.3 Uji Katalase
Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui
apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat.
Dan digunakan unrtuk mengetahui kemampuan mikroorganisme untuk menguraikan
hydrogen peroksida dengan menghasilkan enzim katalase. Bakteri yang memerlukan oksigen
manghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri.
Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya antimetabolit tersebut karena mereka
menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan
oksigen dengan reaksi sebagai berikut :2H2O 2H2O + O2 (Volk dan Wheeler, 1993).
Beberapa bakteri yang termasuk katalase negatifadalah Streptococcus, Leuconostoc, L
actobacillus, dan Clostridium. Bakteri katalase positif seperti S. Aureus bisa
menghasilkan gelembunggelembung oksigen karena adanya pemecahan H2O2
(hidrogen peroksida) oleh enzim katalase yang dihasilkan oleh bakteri itu sendiri. Bakteri
katalase negatif tidak menghasilkan gelembunggelembung. Hal ini berarti H2O2 yang
diberikan tidak dipecah oleh bakteri katalase negatif, misalnya, L.casei sehingga tidak
menghasilkan oksigen. Bakteri katalase negatif tidak memiliki enzim
katalase yang menguraikan H2O2.
2.4 Pewarnaan Gram

Dwidjoseputro, D. 2003. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama.

Gram, HC. 1884. ber die isolierte Frbung der Schizomyceten in Schnitt- und
Trockenprparaten. Fortschritte der Medizin 2: 185-89

Hoog, J.L., Schwartz C., Noon A. T., Otoole E. T., Mastronarde DN, McIntosh JR, Antony
C. 2007. Organization Of Interphase Microtubules In Fission Yeast Analyzed By
Electron Tomography. Dev Cell. 12(3): 349-61

Luis M. De LA Maza et all. 2004. Bakteriologi Warna. Atlas Kedokteran. Washington, DC:
ASM Press. 103 hlm. ISBN 1-55581-206-6

Madigan, MT; Martinko J; Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (edisi ke-10th
Edition). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 0-13-066271-2

Muchtadi, D. 1989. Petunjuk Laboratorium Evaluasi Nilai Gizi Pangan. Departemen

Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Pusat Antar
Universitas Pangan dan Gizi. Bogor: Institut Pertanian Bogor

Natrsir. 2003. Mikrobiologi Farmasi Dasar. Makassar: Universitas Hasanudin.

Pelczar, M. J., dan Chan, E. S. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.

Pelezar. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid II. Jakarta : Universitas Indonesia Press.

Pelczar, M.J dan E.C.S Chan. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.

Pelczar, et.al.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi.UI Press:Jakarta

Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : Jakarta.