Gentica Molecular A LBCM

Grupo 3 Turno P1

Extraco de RNA (mtodo do isotiocianato de guanidina)

Anlise de RNAs por espectrofotometria e electroforese em gel de agarose
Aristides Mendes N. 32362, Pedro Fonseca N. 32844 e Rute Morais N. 31483

Introduo

A extrema importncia da anlise de RNA em diversas reas da Biologia, nomeadamente a Biologia

Molecular, tornou necessrio o desenvolvimento de procedimentos de extraco de RNA rpidos e eficazes.
Um dos principais problemas da extraco de RNA a omnipresena de Rnases [1]. Para resolver
este problema, todas as solues devem ser tratadas com DEPC (dietil pirocarbonato), uma vez que este
inibe a actividade das RNases atravs de reaces com grupos amina. Posteriormente, estas solues devem
ser autoclavadas para destruir o DEPC, caso contrrio este iria reagir com os cidos nucleicos.
Em 1987, Chomczynski e Sacchi publicaram um protocolo de extraco de RNA, baseando-se na
optimizao do mtodo do tiocianato de guanidina, proposto por Chirgwin e seus colaboradores [2]. Esta
optimizao foi obtida atravs da utilizao de TRIzol [7], uma vez que se trata de uma soluo monofsica
que combina as propriedades desnaturantes do isotiocianato de guanidina e do fenol a pH cido [4,6]. Esta
combinao de reagentes permite a desnaturao das protenas por destruio das pontes dissulfureto e das
restantes interaces que mantm a estrutura tridimensional, inibindo assim a actividade das RNases. O pH
cido promove a desnaturao dos cidos nucleicos. Assim sendo, devido ao tamanho reduzido do RNA
comparativamente ao DNA, o RNA renatura mais rapidamente, ou seja, fica apenas com as suas zonas
hidroflicas expostas [7]. A posterior adio de clorofrmio, seguida de centrifugao, permite uma
separao em fase aquosa e fase orgnica, separando o RNA (fase aquosa) do DNA (interfase), protenas e
restantes componentes celulares (fase orgnica) [6].
O objectivo deste trabalho extrair RNA total de eucarionte, a partir de clulas hepticas,
conservando a integridade dos mRNAs. Para a sua anlise e quantificao foram utilizados mtodos
electroforticos e espectrofotomtricos.

Materiais e Mtodos

A realizao do trabalho experimental teve como base o protocolo laboratorial fornecido pelo
docente [8], com ligeiras modificaes: ao ser adicionado TRIzol, a agitao dos tubos foi acompanhada da
abertura dos eppendorfs de forma a libertar a presso exercida pela volatilizao do fenol, dada a sua
elevada volatilidade (passos 1 e 2); ambos os processos de centrifugao tiveram uma durao de 10
minutos cada (passos 4 e 7); o pellet contendo RNA foi dissolvido em 1 mL de gua previamente tratada com
DEPC (passo 9); ao preparar a soluo para a electroforese (gel de agarose 2%, 70V, 1h) foram utilizados 10
L de RNA e 3 L de tampo de carregamento/loading buffer; para a espectofotometria de UV procedeu-se
a uma diluio de 1/100 da soluo de RNA, com volume final de 750 L.
Tabela 1 Valores de
Resultados absorvncia da amostra
de RNA a determinados
comprimentos de onda
(diluio 1:100).

Abs
(nm) Abs
Corrigida

230 0.178 0.157

260 0.226 0.205

280 0.134 0.113

320 0.021 0

Tabela 2 Razes indicadoras

da pureza do RNA.
Figura 2 Esboo do espectro de absorvncia da
A260/A280 1.814
amostra de RNA aps extraco (diluio 1:100).
Figura 1 Electroforese em gel de agarose A260/A230 1.306
da amostra de RNA resultante da
extraco.
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Tabela 3 Clculo da concentrao terica de RNA extrado.

[RNA]terica = A260 x 40 x (1/factor de diluio) 820g/ml

Discusso e Concluso

No mtodo espectrofotomtrico seria de se esperar valores de 2.0 e 2.2, respectivamente para os

quocientes A260/A280 e A260/A230 [3,5], representativos de uma soluo contendo RNA puro. Contudo,
como visvel na Tabela 2, os valores de ambas as razes encontram-se inferiores aos valores considerados
como identificadores de pureza. Podemos avanar com algumas supostas justificaes. Smbolo de uma
baixa razo A260/230 a existncia de contaminao da nossa amostra por parte de isotiocianato de
guanidina, contido no TRIzol. Para eliminar o TRIzol da soluo procedemos a uma lavagem com isopropanol,
uma vez que tambm absorve a 230nm. Restos de TRIzol ou isopropanol, associados ao pellet pela
incorrecta secagem deste ltimo, podero originar um decrscimo desta razo e, consequentemente, do
grau de pureza. O quociente 260/280 est ligado existncia ou no de contaminaes por parte de
protenas, e como o valor foi inferior ao esperado o nosso RNA encontra-se contaminado. Podero existir
RNases exgenas, aps purificao da amostra, que contribuam para esta diminuio do valor ou, devido a
algumas oscilaes/agitaes, poder ter-se dado a quebra da separao entre a fase orgnica e a fase
aquosa da soluo. de salientar ainda, que o valor de absorvncia a 280nm poder aumentar devido a uma
baixa fora inica [3], o que far diminuir a razo A260/A280.
Na electroforese esperado observarem-se trs bandas electroforticas correspondentes s
subunidades 28S, 18S e 5S do rRNA e algum smear, entre as bandas, correspondente ao mRNA [3].
Procedendo observao da imagem do gel de electroforese (Figura 1) possvel visualizar um arrastamento
ao logo da lane com uma banda no final, assim sendo, o nosso resultado no corresponde ao esperado. Tal
observao indicador de uma degradao de cidos nuclecos levando-nos a concluir que ocorreu
degradao do RNA por parte de RNases exgenas (em linha com o que foi concludo com os resultados de
espectrofotometria), ou o processo de congelamento aps extraco do tecido no foi bem sucedido dando
tempo para a degradao do RNA [3]. Verificamos tambm que este arrastamento ocorre praticamente
desde o poo e no a partir da zona onde se deveria encontrar a banda da subunidade 28S (a de maior peso
molecular), o que indicador de que existia na soluo cidos nuclecos de peso molecular elevado. Por esta
razo, conclumos que houve uma contaminao de DNA, provavelmente originada aquando da separao
da fase aquosa da orgnica por perturbao da zona interfsica. Comparando com os resultados de alguns
dos outros grupos, visveis no gel da Figura 1, verificmos uma menor concentrao de RNA na nossa
migrao (comprovado pelo clculo terico da [RNA]), talvez derivado de uma m dissoluo do fgado.
Em suma, no obtivemos RNA puro, este encontra-se contaminado por outros agentes presentes na
amostra e no est integro, uma vez que sofreu degradao.

Bibliografia:
[1] - Chomczynski, P. 1992. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Res. 20: 3791-
3792.
[2] - Chomczynski, P., Sacchi, N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-
chloroform extraction. Anal Biochem. 162: 156-159.
[3] - Chomczynski, P., Sacchi, N. 2006. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-
phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1: 581-585.
[4] - Hummon, A. B. et al. 2007. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from
patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42: 467-470, 472.
[5] - Pinto, F.L. et al. 2009. Analysis of current and alternative phenol based RNA extraction methodologies for
cyanobacteria. BMC Mol Biol. 10: 79.
[6] - Tan, S.C., Yiap, B.C. 2009. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. J Biomed Biotechnol.
2009.
[7] - Vomelov, I. et al. 2009. Methods of RNA Purification. All Ways (Should) Lead to Rome. Folio Biol. 55: 243-251.
[8] Protocolo de Gentica Molecular A. 2011. Extraco de RNA (Mtodo do isotiocianato de guanidina). FCT UNL.