Efecto de Las Micorrizas Arbusculares Sobre La Regulación de Genes ...

Universidad de Granada
Consejo Superior de Investigaciones Cientficas
Efecto de las micorrizas arbusculares

sobre la regulacin de genes implicados
en el metabolismo carbonado en plantas
de tomate (Solanum esculentum)
Sonia Garca Rodrguez

Tesis Doctoral
Granada, 2006
Editor: Editorial de la Universidad de Granada
Autor: Sonia Garca Rodrguez
D.L.: Gr. 2495 - 2006
ISBN: 84-338-4185-8
UNIVERSIDAD DE GRANADA
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTFICAS
Efecto de las micorrizas arbusculares sobre la

regulacin de genes implicados en el metabolismo
carbonado en plantas de tomate
(Solanum esculentum)
SONIA GARCA RODRGUEZ
TESIS DOCTORAL
Granada, 2006
Efecto de las micorrizas arbusculares sobre la regulacin
de genes implicados en el metabolismo carbonado en
plantas de tomate (Solanum esculentum)
Memoria que presenta la Licenciada en

Bioqumica Sonia Garca Rodrguez
para aspirar al Ttulo de Doctor
Fdo. Sonia Garca Rodrguez
VB
Las Directoras
Fdo. D. Concepcin Azcn Gonzlez de Aguilar Fdo. D. Nuria Ferrol Gonzlez

Doctora en Biologa Doctora en Qumica
Profesor de Investigacin del C.S.I.C. Cientfico Titular del C.S.I.C.
UNVERSIDAD DE GRANADA
2006
Esta Tesis Doctoral ha sido
realizada en el Departamento de
Microbiologa del Suelo y Sistemas
Simbiticos de la Estacin Experimental del
Zaidn (C.S.I.C.), Granada, y financiada
mediante una beca predoctoral I3P del
C.S.I.C para Desarrollo de Tesis Doctoral en
lneas de investigacin con inters para el
sector industrial (conv. B.O.E. 24/10/01).
NDICE
NDICE I
ABREVIATURAS IX
INTERS DEL TRABAJO, OBJETIVOS Y APORTE CIENTFICO 1
INTRODUCCIN 7
1. MICORRIZAS 9
1.1. Tipos de asociaciones micorrcicas 9
2. LAS MICORRIZAS ARBUSCULARES 11
2.1. Generalidades de los hongos que forman micorrizas
arbusculares 11
2.2. Taxonoma de las micorrizas arbusculares 13
2.3. Ciclo de vida de los hongos formadores de micorrizas
arbusculares 16
2.4. Fisiologa de la simbiosis 23
2.4.1. Intercambio de nutrientes en micorrizas arbusculares 24
2.4.1.1. Absorcin de nutrientes minerales del suelo 25
2.4.1.1.A Nutricin fosforada 25
2.4.1.1.B Nutricin nitrogenada 27
2.4.1.1.C Micronutrientes 29
2.4.1.2. Metabolismo del carbono en los hongos micorrcicos 30
2.4.1.3. Metabolismo del carbono en las plantas micorrizadas 31
3. REGULACIN DEL METABOLISMO CARBONADO EN
PLANTAS SUPERIORES 33
3.1. Sistemas de transporte de azcares en plantas
superiores 33
3.2. Estudio de la regulacin del metabolismo de carbono
de las plantas mediante las interacciones planta-
microorganismo 35
3.3. Localizacin y regulacin de la actividad de las enzimas
clave en el metabolismo de la sacarosa 38
3.3.1. Enzimas implicadas en la sntesis de sacarosa 41
3.3.1.1. Sacarosa-fosfato sintasa 41
3.3.2. Enzimas implicadas en la degradacin y utilizacin de
sacarosa 43
3.3.2.1. Invertasas 44
3.3.2.2. Sacarosa sintasa 48
3.3.2.3. Enzimas que degradan sacarosa y micorrizas 52
3.4. Fructanos 52
I
3.4.1. Relacin de las FEHs y las fructosiltransferasas con las
invertasas 56
3.4.2. FEHs en plantas que no sintetizan fructanos 57
3.4.3. Fructosiltransferasas 58
3.4.3.1. En plantas 58
3.4.3.2. En hongos 59
3.4.3. Fructanos en micorrizas arbusculares 59
3.5. Transportadores de azcares 60
3.5.1. Transportadores de sacarosa 61
3.5.2. Transportadores de monosacridos 62
3.6. Metabolismo de los carbohidratos en ectomicorrizas 63
3.7. Metabolismo de los carbohidratos en tomate 65
MATERIALES Y MTODOS 69
1. MATERIAL BIOLGICO Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO 71
1.1. Material vegetal 71
1.1.1. Planta utilizada 71
1.1.2. Cultivo de plantas 71
1.1.2.1. Substrato: composicin y esterilizacin 71
1.1.2.2. Esterilizacin, germinacin y siembra de las semillas 71
1.1.2.3. Solucin nutritiva para las plantas 71
1.1.2.4. Condiciones de crecimiento en invernadero 72
1.1.2.5. Cosecha de distintos rganos 73
1.1.2.6. Aplicacin de fitohormonas y azcares 73
1.1.3. Determinaciones fisiolgicas 73
1.1.3.1. Produccin de biomasa 73
1.2. Material fngico 73
1.2.1. Hongos micorrcicos utilizados 73
1.2.2. Determinacin de la micorrizacin 73
1.2.3. Estimacin de la colonizacin micorrcica 73
1.2.4. Hongos patgenos utilizados, aplicacin y determinacin
de la infeccin 74
1.3. Experimentos 75
1.3.1. Experimento 1 75
1.3.2. Experimento 2 75
1.4. Material bacteriano 75
II
1.4.1. Cepas de Escherichia coli utilizadas 75
1.4.2. Medios de cultivo 76
1.4.2.1. Medio LB (Luria-Bertani) 76
1.4.2.2. Medio SOC 76
1.4.3. Marcadores de seleccin 77
1.4.4. Preparacin de clulas quimiocompetentes 77
1.4.5. Preparacin de clulas electrocompetentes 78
1.5. Cepas de levadura 78
1.5.1. Cepas de levadura utilizadas 78
1.5.2. Medios de cultivo para S. cerevisiae 79
1.5.2.1 Medio YPD (Yeast extract-Peptone-Dextrose) 79
1.5.2.2. Medio SD (Synthetic-Dextrose) 79
1.6. Mantenimiento de las cepas 80
2. TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR 80
2.1. Plsmidos 80
2.2. Aislamiento de ADN 81
2.2.1. Extraccin de ADN plasmdico de E. coli 81
2.2.2. Extraccin de ADN plasmdico de S. cerevisiae 81
2.2.3. Extraccin de ADN genmico de tomate 82
2.2.3.1. Tratamiento con RNasa del ADN genmico de tomate 83
2.2.4. Extraccin de ADN genmico Gomus mosseae 83
2.3. Cuantificacin de ADN 83

2.4. Visualizacin del ADN mediante electroforesis en geles
de azarosa 84
2.5. Southern blot 84
2.5.1. Digestin del ADN genmico 84
2.5.2. Electroforesis en gel de agarosa y transferencia a membrana 85
2.5.3. Sntesis de la sonda marcada radiactivamente mediante PCR 86
2.5.4. Purificacin de las sondas marcadas radioactivamente 87
2.5.5. Pre-hibridacin e hibridacin 87
2.5.6. Deteccin y revelado 87
2.6. Reaccin en cadena de la polimerasa 87
2.7. Digestin de ADN con endonucleasas de restriccin 90
2.8. Desfosforilacin de vectores de clonacin 90
2.9. Purificacin de fragmentos de ADN a partir de geles
de agarosa 90
III
2.10. Ligacin en vectores de clonacin 91
2.10.1. Productos de PCR 91
2.10.1.1. Ligacin en pGEM-T Easy 91
2.10.1.2. Ligacin en pYES 2.1 TOPO TA 91
2.10.2. Ligacin de fragmentos de restriccin 91
2.11. Transformacin 92
2.11.1. Transformacin de clulas de E. coli 92
2.11.1.1. Transformacin de clulas quimiocompetentes 92
2.11.1.2. Transformacin de clulas electrocompetentes 92
2.11.2. Transformacin de S. cerevisiae 93
2.12. Purificacin de ADN plasmdico 93
2.13. Paseo cromosmico 94
2.14. Extraccin de ARN 94
2.14.1. Extraccin de ARN de tomate 94
2.14.2. Extraccin de ARN de Sacharomices cerevisiae 96
2.14.3. Cuantificacin del ARN 96
2.14.4. Visualizacin del ARN mediante electroforesis en
geles de agarosa 96
2.14.5. Tratamiento del ARN con DNasa 97
2.15. Tcnicas de RACE 98
2.16. Anlisis de PCR cuantitativa a tiempo real 98
2.16.1. Retrotranscripcin in vitro: sntesis de ADNc 98
2.16.2. PCR cuantitativa a tiempo real 99
2.17. Secuenciacin 100
3. TCNICAS BIOQUMICAS Y DETERMINACIONES ENZIMTICAS 100
3.1. Tcnicas bioqumicas 100
3.1.1. Extraccin de protenas totales de levadura 100
3.1.2. Cuantificacin de protenas 101
3.2. Determinaciones enzimticas 101
3.2.1. Determinacin de la actividad invertasa en extractos
proteicos de levadura 101
3.2.2. Determinacin de la actividad fructoexohidrolasa
en extractos proteicos de levadura 102
4. DETERMINACIONES ANALTICAS 103
4.1. Determinacin de azcares solubles 103
4.2. Determinacin de sacarosa, glucosa y fructosa 103
5. MTODOS BIOINFORMTICOS 104
IV
5.1. Identificacin de secuencias de inters en bases de datos 104
5.2. Diseo de cebadores 104
5.3. Comparacin de secuencias 104
5.4. Anlisis de promotores 104
5.5. Obtencin de la secuencia aminoacdica 105
5.6. Prediccin de la topologa de protenas transmembrana 105
6. ANLISIS ESTADSTICO 105
RESULTADOS 107
1. DETERMINACIN DE LOS CAMBIOS INDUCIDOS POR LA
SIMBIOSIS EN LA CONCENTRACIN DE CARBOHIDRATOS DE LA
PLANTA HOSPEDADORA 109
1.1. Efecto de la colonizacin micorrcica sobre el contenido
de azcares solubles totales 109
1.2. Efecto de la colonizacin micorrcica sobre el contenido de
sacarosa, glucosa y fructosa 110
1.3. Efecto de la colonizacin micorrcica sobre las enzimas
implicadas en la fijacin de carbono 112
2. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE GENES QUE CODIFICAN
ENZIMAS IMPLICADAS EN LA HIDRLISIS DE SACAROSA
(invertasa y sacarosa sintasa) 114
2.1. Clonacin de genes que codifican invertasas en
races micorrizadas
2.1.1. Clon genmico de Lin10 121
2.2. Anlisis funcional de los genes clonados Lin9 y Lin10 123
2.2.1. Expresin heterloga de Lin9 y Lin10 en
Saccharomyces cerevisiae 123
2.2.2. Determinacin de la actividad invertasa en extractos
proteicos de levadura 125
2.2.3. Determinacin de la actividad fructo-exohidrolasa en
extractos proteicos de levadura transformada con pLin10 126
2.3. Regulacin por el desarrollo de la simbiosis de la expresin
de los genes aislados y de otras isoformas presentes en
la base de datos 127
2.3.1. Regulacin de la expresin gnica en races 129
2.3.2. Regulacin de la expresin gnica por el fsforo suministrado 132
2.3.3. Regulacin de la expresin gnica en races por el patgeno
de raz Phytoptora parasitica (Phy) 134
V
2.4. Bsqueda y anlisis de los promotores de los genes que se
regulan por la simbiosis 136
2.4.1. Regulacin de los genes de invertasas y fructo-exohidrolasa de
tomate por azcares y hormonas 138
2.5. Anlisis de la regulacin de la expresin de genes que
codifican la sacarosa sintasa de tomate durante la simbiosis
micorrcica 140
2.5.2. Regulacin de la expresin gnica de TOMSSF por el fsforo
suministrado 140
de raz Phytoptora parastica (Phy) 141
2.5.4. Bsqueda y anlisis del promotor de TOMSSF 142
2.6. Anlisis de la expresin de los genes Lin9 y Lin10 en los
distintos rganos de la planta de tomate 145
2.7. Anlisis de la expresin de los genes analizados en hojas 147
TRANSPORTADORES DE AZCARES EN PLANTAS MICORRIZADAS 148
3.1. Clonacin de genes que codifican transportadores de hexosas
en races micorrizadas 149
3.2. Expresin heterloga de LeST3 en levadura 154
3.3. Anlisis de la regulacin por la simbiosis del gen
identificado 154
3.3.2. Regulacin de la expresin gnica en races por el fsforo
suministrado 155
3.3.3. Regulacin de la expresin gnica en hojas 156
3.3.4. Regulacin de la expresin gnica por el patgeno de
raz Phytoptora parasitica (Phy) 156
DISCUSIN 159
CONCLUSIONES 175
BIBLIOGRAFA 179
VI
ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
ABA cido abscsico

AS cido saliclico
BAS Estructura Ramificada de Absorcin
DEPC Dietil-pirocarbonato
DMSO Dimetilsulfxido
EDTA Etilen-diamino-tetraactico
FEH Fructano exohidrolasas
FFT Fructosiltransferasa
IPTG Isopropil--D-tiogalactopiranosido
MOPS cido 4-Morfolinopropanosulfnico
MA Micorrizas arbusculares
PEG Polietilenglicol
RuBisCo Ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa oxigenasa
SDS Dodecil sulfato sdico
SPS Sacarosa-6fosfato-sintasa
SS, SuS Sacarosa sintasa
X-gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactopiranosido
IX
INTERS DEL TRABAJO, OBJETIVOS
Y APORTE CIENTFICO
Inters del trabajo, objetivos y aporte cientfico
En trminos de Agricultura Sostenible, se recomienda un uso mnimo de

productos en cuya composicin o preparacin intervengan materias o procesos
producidos con un gasto de energas no renovables o bien que resulten
contaminantes de los agrosistemas. Por ello, se preconiza la utilizacin y
optimizacin de los recursos naturales, entre los cuales los microorganismos del
suelo son protagonistas destacados (Barea, 1991). La mayora de las plantas
terrestres viven asociadas, formando simbiosis mutualsticas, con ciertos hongos
del suelo, dando lugar a las llamadas micorrizas (hongo-raz). Existen distintos
tipos de micorrizas, de las cuales son las micorrizas arbusculares (MA) las ms
extendidas en la naturaleza. La importancia ecolgica y econmica de las MA est
avalada por su presencia en ms del 80% de las especies vegetales. Entre ellas se
encuentran leguminosas herbceas y leosas, cereales, rboles frutales y otras de
inters en hortofruticultura, industria o en revegetacin de suelos degradados
(Azcn-Aguilar & Barea, 1997). En las MA el hongo coloniza biotrficamente la
corteza de la raz, sobre la que desarrolla un micelio extenso altamente efectivo
que ayuda a la planta a adquirir nutrientes minerales, especialmente fosfato, y
agua del suelo. A su vez, la planta hospedadora proporciona nutrientes orgnicos al
hongo simbionte (Azcn-Aguilar & Bago, 1994). Este intercambio bidireccional de
nutrientes entre ambos simbiontes ocurre a nivel de los arbsculos, estructuras
tpicas de colonizacin que el hongo desarrolla en las clulas corticales. Las
micorrizas juegan un papel clave en la supervivencia de las plantas y en el reciclaje
de nutrientes en el ecosistema (Requena et al., 2001). La optimizacin de las
actividades de los hongos MA y la manipulacin racional de la simbiosis es crucial
para mantener niveles de productividad sostenidos mediante prcticas respetuosas
con el medio ambiente. La aproximacin finalista para desarrollar una biotecnologa
que permita aplicar dichos hongos en cultivos de inters necesita de una
investigacin bsica apropiada, ya que se ignoran los mecanismos moleculares
implicados en la transferencia de nutrientes entre ambos organismos y de aquellos
que controlan la eficiencia simbitica de una determinada asociacin.
En consecuencia, se propuso como objetivo general de esta Tesis Doctoral
el profundizar en el estudio de los cambios inducidos por el desarrollo de la
simbiosis en el metabolismo carbonado de las races hospedadoras, con el fin de
obtener evidencias sobre los mecanismos que controlan la transferencia de
nutrientes de la planta al hongo. Para ello se ha seguido una aproximacin
molecular y se ha investigado la regulacin por parte de las micorrizas arbusculares
de genes implicados en el metabolismo carbonado de la planta. Los resultados
obtenidos se integraran en el modelo general de funcionamiento de la simbiosis y
3
se discutirn en el contexto de su relevancia en la integracin funcional de ambos

simbiontes.
Para abordar ese objetivo general se plantearon los siguientes objetivos
especficos:
1.-Determinar los cambios inducidos por el desarrollo de la simbiosis en la

concentracin de carbohidratos de la planta hospedadora.
2.- Aislar y caracterizar genes que codifican enzimas implicadas en la
hidrlisis de sacarosa (invertasa y sacarosa sintasa).
2.1. Clonacin de genes que codifican invertasas en races
micorrizadas.
2.2. Anlisis funcional de los genes clonados.
2.3. Regulacin por el desarrollo de la simbiosis de la expresin de los
genes aislados y de otras isoformas presentes en las bases de datos.
2.4. Bsqueda y anlisis de los promotores de los genes de invertasa
que se regulan por el desarrollo de la simbiosis.
2.5. Anlisis de la regulacin de la expresin de genes que codifican la
sacarosa sintasa de tomate durante la simbiosis micorrcica.
3.- Aislar y caracterizar genes que codifican transportadores de azcares
en plantas micorrizadas.
3.1. Clonacin de genes que codifican transportadores de hexosas
en races micorrizadas.
3.2. Anlisis de la regulacin por la simbiosis de los genes
identificados.
APORTE CIENTFICO
Los resultados de la investigacin supondrn un avance en los conocimientos

de cmo se regula el metabolismo carbonado de la planta como consecuencia del
establecimiento de la simbiosis y de cmo se produce el intercambio de compuestos
carbonados por parte de la planta al hongo en la simbiosis MA. Estos conocimientos
permitirn desde el mayor entendimiento a nivel molecular mejorar el rendimiento
de la simbiosis, lo que se traducir en una mejora del estado nutricional de la
planta. Esta mejora permitir obtener plantas ms saludables, lo que significa tener
plantas ms resistentes a los distintos estreses medioambientales, lo que a su vez
har a estas plantas mejores candidatas para su utilizacin en la recuperacin de
ambientes degradados. Adems la identificacin de genes implicados en el
metabolismo carbonado de la planta que se regulan como consecuencia del
establecimiento de la simbiosis, permitir desarrollar marcadores moleculares que
4
puedan utilizarse como indicadores de eficiencia simbitica de una determinada

asociacin micorrcica.
5
INTRODUCCIN
Introduccin
1. MICORRIZAS
El trmino micorrizas hace referencia a las asociaciones simbiticas
mutualistas que se establecen entre las plantas y ciertos hongos del suelo, siendo
este tipo de simbiosis la ms extendida en cuanto a hbitats (Barea & Azcn-
Aguilar 1983) y a al nmero de plantas superiores capaces de formar dicha
asociacin, ya que entorno al 90% de las plantas terrestres son capaces de
establecer algn tipo de micorrizas (Smith & Read 1997). Este trmino (procedente
del griego mikos, hongo, y rriza, raz) fue utilizado por primera vez por Frank
(1885) pero no es hasta mediados del siglo XX cuando se empieza a poner de
manifiesto el significado y la importancia de estas asociaciones, as como su
presencia en la casi totalidad de los sistemas suelo-planta (Barea & Jeffries 1995).
La razn principal por la que esta asociacin simbitica se mantiene en el tiempo,
se debe a la mejora de la nutricin mineral que el hongo le proporciona a la planta
hospedadora, de forma, que la colonizacin de la superficie terrestre por parte de
las plantas, fue mediada posiblemente por el establecimiento de esta simbiosis
(Simon et al. 1993; Redecker et al. 2000). Pero no es esta la nica ventaja que las
micorrizas proporcionan a las plantas, sino que contribuyen tambin a su proteccin
frente a estreses biticos (patgenos del suelo) y abiticos (salinidad, sequa,
presencia de metales pesados) (Van Tichelen et al. 2001, Azcn-Aguilar et al.
2002; Ruiz-Lozano 2003). Por su parte, la planta hospedadora proporciona al hongo
los compuestos carbonados derivados de la fotosntesis necesarios para su
desarrollo.
1.1 Tipos de asociaciones micorrcicas

Atendiendo a la estructura y al tipo de plantas y hongos implicados, se
pueden distinguir tres grandes grupos de Micorrizas (Fig. 1):
a) Endomicorrizas: son las ms extendidas en la naturaleza y tienen como
caracterstica principal, que sus hifas penetran en el interior de las
clulas del crtex y/o epidermis de la raz. Otra caracterstica es que no
forman manto. Dentro de este grupo se distinguen varios subgrupos:
a.1) Ericoides. En este caso, las plantas participantes en la asociacin
simbitica son de la familia de las Ericceas y los hongos pueden ser
ascomicetos o basidiomicetos. La caracterstica a destacar de los
hongos que forman esta simbiosis, es su gran versatilidad en cuanto
al uso de fuentes de C, N y P, ya sean de origen orgnico o no. Esta
caracterstica fngica, confiere parte de la capacidad a las plantas
que forman este tipo de Micorrizas, para crecer en suelos con un
9
Introduccin
elevado contenido en materia orgnica (Pearson & Read 1975; St-

John et al. 1985).
a.2) Orquidoides. Formadas entre plantas de la familia Orquidaceae y
hongos basidiomicetos. En la fase hetertrofa del ciclo de vida de
esta familia de plantas, sta, recibe compuestos carbonados a partir
del hongo (Smith 1966). Como caractersticas morfolgicas del
hongo, cabe destacar que tras penetrar en las clulas de la raz
forma ovillos dentro de la clula hospedadora previa invaginacin de
la membrana plasmtica, as como agregados poco organizados de
hifas (pelotones) que liberan los nutrientes cuando degeneran.
a.3) Arbusculares. Los hongos implicados en la formacin de
micorrizas arbusculares, pertenecen al phylum Glomeromycota
(Shler et al. 2001), y dicha asociacin la realizan con la mayora de
las plantas terrestres (entre el 80 y el 85%) (Smith & Read 1997). La
principal caracterstica morfolgica de estos hongos es su
ramificacin dicotmica repetida una vez que han penetrado en las
clulas del crtex de la raz, para la formacin de los arbsculos,
estructuras tpicas de la colonizacin de dichos hongos. Algunas
especies de estos hongos forman otras estructuras en el interior de la
raz llamadas vesculas, que contienen sustancias de reserva y por las
que tambin se ha conocido a estos hongos con el nombre de
vesculo-arbusculares.
b) Ectomicorrizas: se ponen de manifiesto principalmente en especies de
plantas con inters forestal como Fagceas, Betulceas, Pinceas, etc...,
suponiendo tan solo el 3% del total de las asociaciones micorrcicas. Se
caracterizan principalmente porque las hifas del hongo limitan su
desarrollo a los espacios intercelulares del crtex, no llegando a penetrar
nunca en las clulas vegetales de la raz. Este modo de desarrollo en el
interior de la raz, da lugar una estructura caracterstica denominada red
de Hartig. Y en el exterior, un entramado de hifas rodea la raz dando
lugar al llamado manto (Smith & Read 1997). Los hongos que forman
este tipo de Micorrizas son fundamentalmente basidiomicetos, aunque
tambin algunos ascomicetos.
c) Ectendomicorrizas: presentan caractersticas comunes con los dos tipo de
micorrizas expuestos anteriormente y son las menos extendidas. Con las
ectomicorrizas tienen en comn que pueden formar un manto ms o
menos desarrollado y red de Hartig, y con las endomicorrizas, que existe
una ligera penetracin de las hifas en las clulas de la corteza formando
10
Introduccin
enrollamientos u ovillos (Yu et al. 2001). Los hongos que forman estas
micorrizas, son basidiomicetos, y las plantas tipo de estas asociaciones
son fundamentalmente arbutoides o monotropales, pudiendo no obstante
tambin formar ectendomicorrizas con rboles de la misma zona.
ARBUSCULARES
(Endomicorriza)
A
V
H
M
FORMADORAS
C DE MANTO
ORQUIDOIDES
H
(Endomicorriza) P (Ectomicorriza)
ARBUTOIDES
ERICOIDES
(Ectendomicorriza)
(Endomicorriza)
Figura 1. Tipos de micorrizas y simbiontes implicados en su formacin. Se representa

en azul el desarrollo del micelio en cada tipo de micorriza. Leyenda: M= manto, H = red de
Hartig, P= agregados de hifas o pelotones, C=ovillos o coils, A=arbsculos, V=vesculas.
Modificacin de esquema cedido por el Dr. Barea.
2. LAS MICORRIZAS ARBUSCULARES
2.1 Generalidades de los hongos que forman micorrizas arbusculares

La simbiosis micorrcico arbuscular, formada entre hongos del suelo y las
plantas vasculares tiene una larga historia, con registros fsiles que ponen de
manifiesto la existencia de hongos micorrcico arbusculares en las races de las
primeras plantas terrestres de ms de 400 millones de aos (Remy et al. 1994).
Sin embargo, estudios de secuencias y de fsiles de esporas, datan la existencia de
las micorrizas arbusculares incluso anterior, hace ms de 460 millones de aos, lo
que sugiere un papel importante de estos hongos en la transicin de la vida
11
Introduccin
acutica a la terrestre de las plantas (Simon et al. 1993; Redecker et al. 2000).
Hoy en da, la capacidad de formar este tipo de asociaciones esta ampliamente
distribuida por todo el reino vegetal incluyendo angiospermas (al menos el 80% son
capaces de formar simbiosis micorrcico arbuscular), gimnospermas, pteridofitos, y
algunos briofitos (Newman & Reddell 1987; Smith & Read 1997). Solo algunas
familias, entre ellas las Cruciferae, Fumariaceae, Chenopodiaceae, Urticaceae y
Poligonaceae, poseen especies que normalmente no forman este tipo de simbiosis
(Trappe 1986). Como microorganismos biotrofos obligados que son, los hongos
micorricicos necesitan de una planta susceptible de ser colonizada para establecer
la simbiosis, y as, poder completar su ciclo de vida. Esta caracterstica de
simbiontes obligados, da idea de la relacin tan estrecha de dichos hongos con las
plantas terrestres con las que forman la simbiosis.
Los hongos formadores de micorrizas arbusculares no tienen fase de
reproduccin sexual, o al menos no se conoce an, pero si son capaces de formar
esporas de resistencia sobre hifas vegetativas. Dichas esporas son multinucleadas,
y el nmero de ncleos es muy variable dependiendo del hongo en cuestin,
encontrando esporas con 72 ncleos en el caso de Scutellospora castanea (Hosny
et al. 1998), y otras con hasta 2600 en el caso de especies del gnero Gigaspora
(Cooke et al. 1987; Bcard & Pfeffer 1993). El tamao del ADN contenido en las
esporas tambin es muy variable, dependiendo de la especie del hongo micorrcico,
pudiendo ir desde las 16.54 Mb de Glomus intraradices (Hijri & Sanders 2004),
hasta las 1058 Mb descritas por Hosny y colaboradores en 1998 para Scutellospora
gregaria. Estos datos, indican que los hongos micorrcico arbusculares tienen un
genoma ms largo que otros hongos. El genoma haploide (Hijri & Sanders 2004 y
2005) de los hongos micorricicos, esta formado tanto por secuencias de copia
nica, como por secuencias repetidas (aproximadamente el 1.6% en Glomus
intraradices) (Hijri& Sanders 2004). Un naciente nmero de secuencias gnicas
obtenidas de esporas individuales de G. caledonium, G. geosporum y G. mosseae
(Skukenbrock & Rosendahl 2005), indican que el grado de duplicacin gnica en los
hongos micorricicos, debe estar ms limitado, involucrando solo a regiones
especficas del genoma. Tambin, se han encontrado en genoma de estos hongos,
secuencias con homologa a Long Terminal-Repeats (LTRs). Otra caracterstica de
dicho genoma fngico, es el bajo contenido de GC que forman parte del mismo,
slo el 30-35%, y casi el 25% de la cistena esta metilada (Hosny et al. 1997),
siendo este porcentaje demasiado alto para tratarse de hongos.
El estudio a nivel gentico de estos hongos, se complica an ms si tenemos
en cuenta indicios de que dentro de una misma espora, no todos sus ncleos son
iguales, manifestndose polimorfismo a nivel del ADN ribosmico (Clapp et al.
12
Introduccin
2001). Sin embargo, debido a la estructura multinucleada de las esporas de los

hongos micorrcico arbusculares, la fuente de ese polimorfismo intraesporal del
ADNr, no est todava claro. La variacin intrasporal de ARNr podra estar contenida
en su totalidad en un mismo ncleo individual (modelo homocaritico), o distribuida
entre los diferentes ncleos (modelo heterocaritico) (Pawlowska & Taylor 2002;
revisin Pawlowska 2005). Del mismo modo resulta polmico el tipo de
multiplicacin nuclear, con evidencias tanto a favor del modelo clonal, como a favor
de la recombinacin entre ncleos (Rosendahl & Taylor 1997; Vandenkoornhuyse et
al. 2001).
Por otro lado, se ha puesto de manifiesto la fusin de hifas entre las hifas
del micelio de un mismo individuo, entre micelio de individuos del mismo aislado
(Giovannetti et al. 1999, 2001; de la Previdencia et al. 2005), evitando as dicha
fusin entre individuos genticamente diferentes. Por ejemplo, hifas de Glomus
mosseae de aislados de distintas reas geogrficas, se acercan las unas a las otras,
indicando la capacidad de reconocerse entre individuos de la misma especie. Sin
embargo, la retraccin del citoplasma desde los extremos de las hifas
interrelacionadas y la formacin de tabiques antes o durante el contacto entre las
hifas, excluye la formacin de un micelio heterocaritico (Giovannetti et al. 2003).
A pesar de todos estos datos, muchos aspectos de biologa bsica de los
hongos micorrcico arbusculares, incluyendo estructura del genoma, variacin
gentica dentro de un mismo individuo, y modo de reproduccin, son muy poco
conocidos. Estas lagunas en el conocimiento de dicho aspectos, entorpecen la
investigacin sobre los mecanismos de las interacciones de los hongos micorrcicos
con las plantas tanto de forma individual como dentro de las comunidades, y su
aplicacin en la agricultura. Por lo tanto, queda una larga tarea de investigacin
hasta conocer los procesos genticos que se dan en estos hongos (revisado por
Pawlowska 2005).
2.2 Taxonoma de las micorrizas arbusculares

Los hongos formadores de micorrizas arbusculare se consideraban hasta
hace muy pocos aos incluidos en la familia Endoganaceae, dentro del phylum
Zygomicota, clasificacin que estaba basada fundamentalmente en el anlisis de las
caractersticas morfolgicas, estructurales y ontognicas de las esporas que
desarrollan (Gerdemann & Trappe 1974; Morton & Benny 1990; Redecker et al.
2000). De acuerdo con este criterio, las ms de 150 especies descritas hasta la
fecha, se incluyeron en el orden Glomales. Hasta entonces no se haba puesto de
manifiesto el posible origen monofiltico de estos hongos compartiendo un ancestro
comn. Origen monofiltico, que hoy en da se ha podido determinar en base al
13
Introduccin
anlisis de la subunidad pequea del ARNr 18S, agrupndose as en el nuevo

phylum Glomeromycota. Dicho phylum, se encontrara ms prximo de los
ascomicetos y basidiomicetos, con los que compartira un ancestro comn, que con
los zigomicetos (Schuler et al. 2001). Nuevo phylum, que est compuesto por una
sola clase, los Glomeromycetes, que a su vez incluye cuatro rdenes: Glomerales,
Diversisporales, Paraglomerales y Archaesporales (Figura 2B).
14
Introduccin
Figura 2. (A) Filogenia propuesta para los hongos formadores de micorrizas

arbusculares basadas en las secuencias de la subunidad pequea (SSU) del ARNr.
Tomado de Schler et al. (2001). (B) Estructura taxonmica propuesta del
phylum Glomeromycota en base a las secuencias de la SSU del ARNr.
Cada vez hay ms evidencias de que la identificacin basada en criterios

morfolgicos tiene un uso limitado, ya que la baja diversidad morfolgica de las
esporas de los hongos micorricicos, no refleja la gran plasticidad fisiolgica,
diversidad gentica, y posiblemente funcional de sus poblaciones an por describir.
Un ejemplo, es la escisin del gnero Glomus, en al menos tres grupos distintos en
la nueva clasificacin: Glomus A, B y C. Los grupos A y B, pertenecen al orden
Glomerales, mientras que el grupo C pertenece a los Diversisporales.
Debido a la limitacin de material fngico disponible para ser analizado como
consecuencia del carcter de simbiontes obligados de estos hongos, la aplicacin de
tcnicas basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa (en ingls, PCR) ha
supuesto un avance muy importante en la caracterizacin gentica de estos
microorganismos (Sanders et al. 1996; Clapp et al. 2002). Del mismo modo,
tcnicas como el anlisis de los genes ribosmicos o metodologas como PCR-SSCP
(Polimerase Chain Reaction-Single Strand Conformational Polimorfism) o PCR-TGGE
(Polimerase Chain Reaction-Tempereture Gradient Gel Electrophoresis), estn
ayudando a estudiar la diversidad de las poblaciones de los hongos micorricicos
(Chelius & Troplett 1999; Daniell et al. 2001; Fitter 2001; Clapp et al. 2001;
15
Introduccin
Prosser 2002). Todos estos avances en el anlisis de la diversidad gentica de los

hongos formadores de micorrizas arbusculares, llevan ha hacer muy difcil, una
definicin de especie, e incluso de individuo en estos hongos (Clapp et al. 2002).
2.3 Ciclo de vida de los hongos formadores de micorrizas arbusculares

Como se ha mencionado anteriormente, los hongos formadores de
micorrizas arbusculares son simbiontes estrictos, por lo que necesitan la raz de una
planta susceptible de ser colonizada para completar su ciclo de vida.
Se acepta que existen en el suelo tres formas de propgulos que se
diferencian en su capacidad de supervivencia y potencial infectivo. Las tres formas
son, las esporas, que son las formas de resistencia de estos hongos, los fragmentos
de races micorrizadas de plantas preexistentes y por ltimo, las redes de hifas que
sobreviven en el suelo. Estos propgulos, pueden mantener su capacidad infectiva
incluso tras permanecer en el suelo seco durante varios meses (Tommerup & Abbot
1981).
El ciclo de vida se inicia con la germinacin de las esporas que los hongos
micorricicos producen de forma asexual, y que poseen un gran nmero de ncleos
y de glbulos lipdicos (Bcard & Pfeffer 1993). Esta primera fase, es un proceso
independiente de la presencia o no de la planta hospedadora, requiriendo tan solo
unas condiciones adecuadas de humedad y temperatura. No obstante, s es cierto
que determinados factores qumicos, como elevadas concentraciones de CO2, y
biolgicos, como la presencia exudados radicales (Becard & Pich 1989), as como
factores fsicos, como exponer a las esporas durante unos das a temperaturas de
4C (Hepper 1981), y los derivados de una amplia variedad de hongos y bacterias
del suelo (Azcn-Aguilar et al. 1986; Azcn 1987; Hildebrandt et al. 2002) aceleran
el ritmo de germinacin de dichas esporas. El primer proceso que se da cuando
germinan las esporas en condiciones favorables, es la formacin de uno o varios
tubos de germinacin que pueden proliferar y formar un micelio que se extiende de
forma radial y errtica a travs del suelo en busca de una planta hospedadora
susceptible de ser colonizada (Giovannetti 2000; Giovannetti et al. 2002). La
formacin de los tubos de germinacin va acompaada de una activacin del
metabolismo de la espora, provocando cambios en la estructura nuclear y la
replicacin del ADN (Sward 1981; Bonfante-Falsolo 1984). Como consecuencia de
dicha replicacin, durante la germinacin el nmero de ncleos aumenta desde los
800-2000 que hay en una espora en reposo, hasta casi 30000. En cuanto a
aspectos metablicos, en los primeros das de su desarrollo, el tubo de germinacin
consume trehalosa (Becrd et al. 1991), pasando posteriormente a consumir
triglicridos (Beilby 1980). Tambin incrementa la actividad mitocondrial
16
Introduccin
(Tamasloukht et al. 2003) y la de sistemas enzimticos como la H+ATPasa que es la

principal responsable del transporte inico, y cuya actividad esta localizada
fundamentalmente en el pice del tubo de germinacin (Beilby & Kidby 1982).
Durante la germinacin se inducen otros genes, como por ejemplo, genes
involucrados en el metabolismo carbonado (fosfoglicerato kinasa) (Harrier et al.
1998), o genes implicados en el ciclo celular, como homlogos de TOR2 (Requena
et al. 2000) y GmGIN (Requena et al. 2002), genes todos ellos que podran estar
implicados en los procesos de sealizacin previos al establecimiento de la
simbiosis.
Espora en germinacin Espora quiescente
Formacin de apresorios Formacin- de BAS- espora
Apresorio
Formaci n de BAS
Formaci n de
hifas
intercelulares y
arbusculos Desarrollo de hifas
exploradoras
Formacin de ves culas

FASES
FASES INTRARRADICALES EXTRARRADICALES
Figura 3. Ciclo de vida de Glomus intraradices.
17
Introduccin
Si las hifas del hongo tras la germinacin no encuentran races de una planta
susceptible de ser colonizada, se produce un micelio muy reducido, manteniendo el
crecimiento tan slo unos cuantos das tras la produccin del tubo de germinacin
y, transcurrido este tiempo, el citoplasma de las nacientes hifas, se retrae hacia la
espora entrando sta de nuevo en reposo (Azcn-Aguilar et al. 1998; Bago et al.
1999). La espora tiene capacidad para iniciar el proceso de germinacin repetidas
veces antes de degenerar definitivamente, por lo que iniciar nuevamente el
proceso cuando las condiciones vuelvan a ser favorables (Bago et al. 1998; Azcn-
Aguilar et al. 1998).
La presencia de races de especies micotrficas, o de los exudados radicales
que stas producen, promueve un mayor desarrollo del micelio, aumentando
especialmente su grado de ramificacin (Gianinazzi-Pearson et al. 1989; Becard et
al. 2004). La estimulacin antes mencionada, no se produce cuando en las
inmediaciones del naciente micelio se encuentran races de plantas no
hospedadoras, o cuando los exudados proceden de plantas no micotrficas en cuyo
caso, algunas veces se han mostrado efectos inhibitorios (Giovanetti et al. 1994;
Vierheilig et al. 1996). Recientemente, se ha aislado un compuesto de exudados
radicales de Lotus japonicum que acta como factor de ramificacin de las hifas de
Gigaspora margarita, provocando una extensiva ramificacin de las mismas
(Akiyama et al. 2005). Dicho compuesto es un sesquiterpeno, concretamente la
estrigalactona 5-deoxi-estrigol. Hay bastantes evidencias que ponen de manifiesto
que los hongos micorricicos reciben seales de las plantas hospedadoras antes del
establecimiento de la simbiosis (revisado Harrison 2005).
Del mismo modo que el hongo reacciona ante la presencia de una planta
hospedadora, dicha planta tambin percibe seales del hongo micorrcico
arbuscular (revisado Harrison 2005). Recientemente por ejemplo, experimentos con
Medicago truncatula han mostrado la induccin del gen MtENOD11 en la simbiosis
(Chabaud et al. 2002; Journet et al. 2001), induccin que podra ser
desencadenada en la raz antes de tener sta un contacto directo con el hongo
(Kosuta et al. 2003), ya que se ha detectado expresin de este gen incluso cuando
el hongo esta separado de la raz de la planta por una membrana artificial. Estos
datos, junto con los que muestran la estimulacin de la ramificacin del hongo por
los exudados de las plantas, proporcionan evidencias directas de la existencia de
mecanismos de sealizacin antes de existir un contacto fsico entre los
simbiontes.
Una vez que el hongo encuentra una raz susceptible de ser colonizada, ste
experimenta una notable estimulacin que se manifiesta en una abundante
proliferacin del micelio, y sobre todo en un aumento de la ramificacin,
18
Introduccin
aumentando as sus posibilidades de contacto con la raz (Giovannetti et al. 1993).

Cuando ese contacto se produce, el hongo se adhiere a la raz y forma un apresorio
sobre la epidermis de la misma, formndose as la estructura de precolonizacin a
partir de la cual, dos o tres das despus, se iniciar la penetracin del hongo en la
raz de la planta (Giovannetti et al. 1993; Jolicoeur et al. 1998). Se acepta, que los
sitios ms habituales de penetracin coinciden con los lugares ms activos de la
raz, posiblemente porque la exudacin radical es ms abundante en estas zonas. El
hongo micorrcico no penetra por heridas ni coloniza races muertas.
En contraste con los elaborados y melanizados apresorios formados por
hongos patgenos sobre las hojas de las planta, los apresorios que forman los
hongos micorricicos arbusculares son simples, estructuras no melanizadas. Se ha
sugerido, que la produccin localizada de enzimas pectinolticos y celulolticos del
hongo que degradan la pared celular de la planta lo justo para desorganizarla y no
destruirla, junto al desarrollo de una presin fsica, podran ser los mecanismos
responsables de la entrada de las hifas en la raz (Garca-Romera et al. 1990;
Garca-Romera et al. 1991; Bonfante-Fasolo et al. 1992; Garca-Garrido et al.
2000).
Las seales que dirigen la formacin de apresorios en la simbiosis
micorrcico arbuscular son an desconocidas. Dichas seales deben estar basadas
en una activacin del programa gentico, tanto de la planta como del hongo,
existiendo un intercambio de seales entre ambos simbiontes. Como ejemplos de
dicho intercambio est, el aumento de la expresin de unas de las isoformas de la
H+ATPasa de G. mosseae (Requena et al. 2003), el de un ortlogo de la protena
14-3-3 implicada en rutas de sealizacin como respuesta a estreses biticos y
abiticos en otros organismos, as como de un nmero de genes implicados en el
uso del calcio como segundo mensajero (Ca2+-ATPasa, Ca- calmodulina y
homlogos a Ras activados por Ca) (Breuninger & Requena 2004). Estos datos
sugieren que el Ca2+ podra actuar como segundo mensajero en la transmisin de la
seal de la planta que da lugar a la formacin del apresorio. Y a nivel de la planta,
se ha observado la induccin de la expresin de protenas implicadas en el
metabolismo primario, transduccin de seales, sntesis proteica, y de otros genes
an con funcin desconocida (Brechenmacher et al. 2004; Weidmann et al. 2004).
Una vez que la hifa colonizadora ha superado las primeras capas de clulas
de la raz, el hongo micorrcico coloniza el crtex de la misma constituyendo un
micelio intrarradical que se ramifica intercelularmente, sin invadir endospermos ni
meristemos. La colonizacin del crtex, puede desarrollarse siguiendo dos patrones
distintos: tipo Arum o Paris, dependiendo de la estructura de la raz. Las micorrizas
de tipo Arum que son las ms descritas en la bibliografa, se caracterizan porque las
19
Introduccin
hifas del hongo se extienden por los espacios intercelulares del crtex, formando a
intervalos regulares, pequeas ramificaciones laterales que penetran las paredes
celulares y se ramifican dicotmicamente de forma repetida en hifas con un
dimetro cada vez menor, para dar lugar a las estructuras ms caractersticas de la
simbiosis, los arbsculos. Las micorrizas tipo Paris, estn presentes en especies
vegetales como Ginkgo (Bonfante-Falsolo & Fontana 1985), Taxus (Strullu 1978) y
otras especies con una caracterstica en comn, que apenas si tienen espacios
intercelulares, con lo que la formacin de hifas entre las clulas est muy limitada,
por lo que la colonizacin se extiende de clula a clula formando bucles, en los que
se producen pequeas ramificaciones a modo de arbsculos. Salvo que se indique
lo contrario, nos referiremos siempre a las micorrizas tipo Arum.
En cada clula slo puede formarse un arbsculo, que recibe este nombre
porque su estructura recuerda a la de un pequeo rbol con tronco y
ramificaciones. La formacin de los arbsculos lleva consigo una alteracin de la
clula vegetal manifestada principalmente por la deformacin y proliferacin del
plasmalema para acomodar al arbsculo (Alexander et al. 1988). Las hifas del
hongo no penetran en el plasmalema de la clula hospedadora, sino que se produce
una invaginacin de ste que rodea las ramas del arbsculo. As, la interfase entre
los dos simbiontes queda en esencia constituida por el plasmalema de la clula
hospedadora o membrana periarbuscular, una matriz interfacial, la pared celular del
hongo que es muy precaria a nivel de las hifas ms finas del arbsculo, y su
membrana plasmtica (Bonfante-Falsolo et al. 1986; Balestrini et al. 1996;
Gianinazzi-Pearson et al. 1996; Bonfante 2001). La barrera que suponen las
paredes entre ambos simbiontes, queda por lo tanto reducida al mnimo
(Gianinazzi-Pearson et al. 1991). Otras alteraciones que se producen en la clula
vegetal es por ejemplo, una reordenacin del citoesqueleto (Genre & Bonfante
1998; Matsubara et al. 1999), lo que conlleva que el ncleo cambie de posicin
migrando al centro de la clula, y que la vacuola se fragmente (Bonfante & Perotto
1995). Asimismo, se observa una disminucin en la heterocromaticidad del ncleo
de la clula, lo que es indicativo de una mayor actividad transcripcional y un
aumento del metabolismo (Smith & Gianinazzi-Pearson 1988; Balestrini et al.
1994).
El propio hongo, tambin experimenta cambios en su estructura cuando se
produce la colonizacin intraradical, siendo el ms sealado, la progresiva
reduccin antes mencionada, del grosor de la pared celular a medida que se
producen las ramificaciones dicotmicas ms finas, pasando de unos 500nm de
grosor en las hifas intercelulares, a los 50nm descritos en los pices de los
arbsculos (Bonfante-Falsolo et al. 1992). La observacin de que en la membrana
20
Introduccin
periarbuscular se localizan transportadores de fosfato especficos de la simbiosis

(Rausch et al. 2001), y una H+-ATPasa (Gianinazzi-Pearson et al. 2000), hace
pensar que es a nivel de los arbsculos donde se produce el intercambio de
nutrientes entre la planta y el hongo.
Los arbsculos tienen una vida media muy breve, aproximadamente 7 das
(Alexander et al. 1988), transcurridos los mismos, los arbsculos degeneran y la
clula cortical recupera su morfologa previa a la colonizacin, e incluso puede ser
colonizada de nuevo. El colapso arbuscular podra estar inducido por el
reconocimiento por parte de la planta del arbsculo como una estructura extraa
(Garca-Garrido & Ocampo 2002). De hecho, distintos estudios han puesto de
manifiesto la expresin de genes implicados en respuestas de defensa en clulas
colonizadas por arbsculos (Blee & Anderson 1996), las cuales podran desempear
un papel clave en la regulacin del desarrollo del hongo. Estas respuestas de
defensa durante los primeros estados del desarrollo de la simbiosis micorrcico
arbuscular, se ha descrito que declinan o se van reprimiendo durante el desarrollo
de la simbiosis (Harrison & Dixon 1993; Lambais & Medhy 1993; Volpin et al. 1995;
Gianinazzi-Pearson et al. 1996; Kapulnik et al. 1996; David et al. 1998). Sin
embargo, no hay que descartar, que el colapso arbuscular sea parte del programa
intrnseco de desarrollo de los hongos micorricicos, ocurriendo la degeneracin en
este caso por autolisis (Peterson & Bonfante 1994). Esta ltima explicacin, podra
explicar la acumulacin de Ca o de especies reactivas de oxgeno en el arbsculo
senescente (Ryan et al. 2003; Lanfranco et al. 2005), ya que estos iones podran
servir como detonantes de eventos apoptticos en el arbsculo.
Estudios realizados en plantas leguminosas afectadas en la nodulacin, han
revelado que parte de la ruta de transduccin de seales que permite dicho proceso
en la simbiosis Rhizobium-leguminosa, regula tambin la colonizacin por hongos
micorricicos (para una revisin detallada ver Parniske 2004 y Harrison 2005). La
regulacin gentica depende del estado de desarrollo de la simbiosis, activndose
los genes implicados en respuestas de defensa frente a patgenos y diferentes tipos
de estrs como hemos mencionado anteriormente, en los primeros estados del
desarrollo, mientras que en estados ms tardos se detecta la activacin de genes
implicados en rutas de transduccin de seales, procesos de transporte, y otros de
funcin desconocida.
Algunas especies de hongos pueden formar tambin otro tipo de estructuras
durante su colonizacin intrarradical, son las llamadas vesculas, estructuras
globosas con un alto contenido en lpidos y que parecen constituir un rgano de
reserva de nutrientes (Barea et al. 1991). Estas vesculas no son efmeras como los
arbsculos, sino que desde que aparecen van madurando pudiendo en algunas
21
Introduccin
ocasiones, llegar a convertirse en esporas del hongo. Esta transformacin de

vesculas en esporas, podra estar ligada a situaciones de estrs para la micorriza, o
a la muerte inminente de la planta.
Simultneamente al desarrollo del hongo en el interior de la raz, se
desarrolla en el suelo una red de micelio formando lo que se denomina micelio
externo o extrarradical, principal responsable de la absorcin de nutrientes
minerales del suelo, que posteriormente ceder a la planta. Por lo tanto, ste
micelio, funciona como un sistema radical complementario, con una funcin
fundamental en la adquisicin de nutrientes y agua para la planta (Barea 2000). Se
estima que por cada cm de raz micorrizada, se puede producir hasta 1 m de hifas.
Este micelio externo, aporta una ventaja muy importante a las plantas, y es la de
explorar microhbitats del suelo inaccesibles para las races. Sobre las hifas
extrarradicales, se puden formar esporas de resistencia, con lo que se cierra de
este modo el ciclo del hongo. Las hifas fngicas que forman este micelio externo,
pueden adems formar nuevos puntos de entrada sobre la superficie de la raz y
contribuir as a la generalizacin de la colonizacin micorrcica. Pero sin duda, el
estudio y observacin directa del micelio externo del hongo ha sido
extremadamente difcil (dado el carcter de simbionte estricto de los hongos
micorricicos) hasta el desarrollo de las tcnicas de cultivo monoxnico, que
permiten el establecimiento de la simbiosis entre races micotrficas y hongos
micorrcicos, en una placa de Petri con un medio sinttico (Bcard & Fortn 1988).
Con esta tcnica, se ha observado que el hongo desarrolla inicialmente unas hifas
relativamente gruesas denominadas hifas exploradoras, que crecen con una
marcada apicalidad, y que sufren peridicas ramificaciones (hifas secundarias), que
a su vez vuelven a ramificarse varias veces (hifas terciarias, cuaternarias, ...). Las
hifas exploradoras son las responsables del avance del micelio para la extensin de
la colonia fngica. A intervalos regulares, se forman estructuras muy ramificadas,
parecidas en cierta medida a loa arbsculos de la colonizacin intrarradical, y que
hoy en da se conocen como BAS (del ingls Branched Absorbing Structures,
Estructuras ramificadas de absorcin), cuya hipottica funcin sera la absorcin de
nutrientes del suelo (Bago et al. 1998a; Bago 2000). Esta hiptesis, est
respaldada por las modificaciones estructurales que ocurren a nivel del BAS:
disminucin progresiva del grosor de la pared hacia el pice de las hifas, lo que
facilitara la absorcin de nutrientes, y un aumento en el nmero de hifas, lo que
facilitara la absorcin de nutrientes. Tambin hay un aumento en el nmero de
mitocondrias en la base del BAS, lo que aumenta la disponibilidad de energa para
el transporte (Bago et al. 1998b). Los BAS son estructuras transitorias, por lo que
al cabo de pocos das pierden su contenido citoplasmtico a menos que desarrollen
22
Introduccin
esporas. Dichas esporas pueden desarrollarse de dos maneras diferentes en funcin

de la especie de hongo micorrcico que las produzca, libres como en G. intraradices,
o agrupadas en cuerpos fructferos conocidos como esporocarpos como en el caso
de G. mosseae. (Figura 3).
Dado que el micelio extrarradical se desarrolla directamente en el suelo, se
encuentra ms expuesto a las condiciones ambientales, y a la acccin de otros
microorganismos que el micelio intrarrradical, ya que este ltimo se encuentras
protegido por los tejidos de la raz. Es con los microorganismos del suelo, con los
que el micelio externo va a desarrollar interacciones de gran importancia para el
desarrollo de las plantas, el equilibrio de las poblaciones microbianas y para la
formacin de agregados estables en el suelo y el mantenimiento de su estructura
(Jeffries & Barea 2001).
2.4 Fisiologa de la simbiosis

Debido a las inherentes propiedades de los componentes simbiticos, todas
las interacciones mutualsticas planta-microorganismo, muestran esencialmente el
mismo patrn de intercambio y similares caractersticas estructurales. Aunque la
transferencia de nutrientes no es el nico beneficio para los componentes de la
simbiosis, s que es cierto que representa un importante factor de las interacciones
micorrcicas. La planta aporta carbohidratos a cambio de nutrientes minerales
aportados por el microsimbionte. Los nutrientes tienen que ser transportados a
travs de la membrana plasmtica de la planta y del hongo. Estos procesos en
combinacin con las protenas identificadas de formar parte en la simbiosis
micorrcico arbuscular, han sido resumidos por Hause & Fester (2005) (Figura 4).
La principal contribucin de las micorrizas arbusculares a la nutricin de la
planta se basa en una mejora de la absorcin de fosfato, aunque tambin mejoran
la absorcin de otros nutrientes de baja movilidad en el suelo, como amonio y zinc.
Es obvio que la formacin y actividad de las MA conlleva un drenaje de carbono
para satisfacer las necesidades del hongo. Normalmente, este hecho no tiene una
repercusin negativa en el desarrollo de la planta, lo que se debe a que las
micorrizas arbusculares ejercen la llamada compensacin fotosinttica. Esta
compensacin consiste, por un lado, en un incremento de la actividad fotosinttica
de la planta debido al efecto sumidero que ejerce el hongo y, de otro, por la mejora
en la nutricin fosforada de la planta. El papel regulador que ejerce el fsforo sobre
la actividad fotosinttia in vivo es bien conocido y justifica la inversin de la planta
en la simbiosis micorrcica. La relacin entre el peso de parte area y raz suele ser
mayor en plantas micorrizadas que en sus correspondientes controles no
micorrizados. Este efecto se ejerce disminuyendo el envo de nutrientes a la raz
23
Introduccin
derivado del incremento en el aporte de nutrientes a tallos y hojas; por tanto, la

cantidad de carbono retenido en la parte area es relativamente mayor en las
plantas micorrizadas. Este hecho es importante desde un punto de vista
bioenergtico, ya que favorece al sistema auttrofo (productor) de la planta en
relacin al hetertrofo (raz, consumidora de carbono).
Clula planta
Apoplasto
Clula hongo
Figura 4. Transferencia de nutrientes en las races micorrcico arbusculares. Se indican

las enzimas y los transportadores que se ha descrito que se inducen especficamente con la
simbiosis. El transportador de membrana de muchos metabolitos, es esperable que sea
dependiente del pH, y que sea activado por la actividad de las H+-ATPasas de la planta (1) y
del hongo (2). Las H+-ATPasas fngicas no estn restringidas a los arbsculos, lo que
sugiere un transporte activo tambin en las hifas intercelulares. La sacarosa que llega del
floema puede ser hidrolizada por invertasas apoplsticas y absorbida por la planta (3) por
los transportadores de hexosas fngicos, o bien, importada al interior de las clulas
corticales de la raz e hidrolizada all por una sacarosa sintasa citoplasmtica (4). El hongo
transforma rpidamente las hexosas en trealosa que es utilizada en la ruta de las pentosas
fosfato, se utiliza para la biosntesis de glucgeno y lpidos. Las clulas de la planta toman
fosfato del espacio periarbuscular usando transportadores especficos protn-dependientes
(5). Tambin se han encontrado transportadores de nitrato inducidos por la simbiosis (6),
que sugiere un mecanismo de transporte similar al del fosfato. Por otro lado, el aumento de
los niveles de transcripcin de una nitrato reductasa de origen fngico (7), sugiere la
transferencia del nitrgeno en forma reducida. AA= aminocidos. Esquema tomado de Hause
& Fester (2005).
2.4.1 Intercambio de nutrientes en micorrizas arbusculares

La aplicacin de tcnicas de biologa molecular al estudio de la simbiosis
permite dilucidar los mecanismos implicados en la absorcin de nutrientes de la
solucin edfica por las hifas del hongo y de aqullos que controlan el intercambio
bidireccional de nutrientes entre la planta y el hongo. A continuacin, se resumen
los aspectos fundamentales del funcionamiento de la simbiosis, refirindonos
principalmente en su papel en la absorcin e inmovilizacin de nutrientes, as como
al intercambio de esos nutrientes entre ambos simbiontes.
24
Introduccin
2.4.1.1 Absorcin de nutrientes minerales del suelo

Aunque como ya se ha mencionado anteriormente, las micorrizas existen
desde hace ms de 400 millones de aos, no es hasta mediados del siglo pasado
cuando empieza a cobrar inters su estudio como causa del mejor crecimiento que
aportan a las plantas. El primer trabajo, mostraba como el manzano micorizado
presentaba un mayor contenido en Fe y Cu que el no micorrizado cuando ambos
crecan en suelos deficientes en esos micronutrientes (Mosse 1957).
Posteriormente, tambin se puso de manifiesto como los hongos formadores de
micorrizas arbusculares mejoraban la absorcin de fosfato por parte de la planta
(Gerdemann 1964; Daft & Nicolson 1966; Baylis 1967), que eran capaces de
transferir N a la planta mediante la absorcin de NH4+ (Johansen et al. 1992; Frey
& Schepp 1993), o de la de NO3- (George et al. 1992; Tobar et al. 1994; Bago et
al. 1996) del suelo circundante, y su posterior transferencia. Las causas de esta
mejora de la nutricin mineral pueden ser mltiples:
a)- Las hifas del hongo son capaces de competir ms eficientemente que las
races con otros microorganismos del suelo por los nutrientes (Liderman 1992).
b)- Dichas hifas, pueden absorber fuentes de nutrientes no disponibles para la
planta (Swaminathan 1979).
c)- Como consecuencia de su tamao y distribucin, el micelio extrarradical es
capaz de explorar un mayor volumen de suelo que las propias races, por lo que
aumenta la capacidad de absorcin de nutrientes, especialmente de aquellos que
difunden con dificultad en la solucin del suelo, y que por tanto, dan lugar a la
formacin de zonas de deficiencia alrededor de la raz (Sanders & Tinker 1973).
d)- Se ha postulado con la idea de que los transportadores de los hongos
micorrcicos presenten una mayor afinidad por el sustrato mineral que los de la
planta (Cress et al. 1979).
2.4.1.1.A Nutricin fosforada
El fosfato es un nutriente mineral limitante para el crecimiento de las plantas
debido a su baja solubilidad en muchos de sus estados naturales. Los hongos
micorrcico arbusculares transportan fosfato desde reservorios a distancia hasta la
33
planta, lo que se ha podido mostrar usando compartimentos en el suelo con P solo
accesibles a las hifas del hongo y no a las races de la planta. En este sistema e
incluso bajo condiciones no limitantes de aporte de fosfato, las races colonizadas
reducen la actividad de su propio sistema de absorcin de fosfato y dependen
principalmente del simbionte fngico para su abastecimiento de fosfato (Smith et
al. 2003). Otros muchos estudios han puesto de manifiesto que la mayora de las
plantas aumentan la absorcin de fsforo al establecer asociaciones micorrcias
(Raghothama 1999; Rausch & Bucher 2002; Jia et al. 2004), pudiendo llegar a ser
25
Introduccin
responsables del 100% de la incorporacin de fosfato en algunas especies

vegetales (Smith et al. 2004). La informacin bibliogrfica al respecto es muy
numerosa (Sanders & Tinker 1973; Dunne & Fitter 1989; Merryweather & Fitter
1995; Jacobsen 1996; Bi et al. 2003).
La absorcin de fosfato es un mecanismo altamente eficiente, lo que se pone
de manifiesto por la rpida incorporacin de fsforo por las hifas del micelio
extrarradical, requirindose tan slo tres horas para alcanzar los niveles mximos
de incorporacin de polifosfato (Ezawa et al. 2004), velocidad comparable a la de
los organismos hiperacumuladores de fosfato. Se han clonado los transportadores
de fosfato involucrados en sa absorcin de fosfato desde el medio externo hasta
las hifas fngicas, de hongod como Glomus versiforme (Harrison & van Buuren
1995), G. intraradices (Malodonado-Mendoza et al. 2001) y Gigaspora margarita (L.
Lanfranco, comunicacin personal). Este transporte est asociado a un simporte de
protones, que es creado con distintas H+-ATPasas (Ferrol et al. 2002; Requena et
al. 2003). Para evitar la acumulacin de iones fosfato, que dificultaran el
funcionamiento normal del hongo mediante un aumento de la presin osmtica,
dichos iones se polimerizan formando cadenas de polifosfato (entorno a 17
unidades), que se acumulan fundamentalmente en las vacuolas (Rasmussen et al.
2000). Son concretamente unas vacuolas tubulares que se encuentran asociadas a
los microtbulos del citoesqueleto, quienes contienen esas cadenas de polifosfato
(Olsson et al. 2002; Uetake et al. 2002). El fosfato as acumulado en el interior de
las vacuolas, es transportado al micelio intrarradical.
Una vez que est en el micelio intrarradical, el polifosfato es hidrolizado,
liberndose el fosfato, mediante la actividad de ciertas fosfatasas alcalinas
presentes en la vacuola (Gianinazzi-Pearson & Gianinazzi 1978). Como avance en
este estudio, recientemente se han clonado, un gen de G. intraradices y otro de G.
margarita, que codifican foafatasas alcalinas (Aono et al. 2004), aunque no se ha
puesto de manifiesto su capacidad para hidrolizar polifosfatos y, aparentemente, no
estn regulados por fsforo.
De todos los procesos en relacin a la transferencia de fosfato, la liberacin de
fsforo por el hongo es el menos conocido y ms inusual en biologa, ya que el
fsforo es un nutriente escaso y los organismos generalmente no lo liberan al
medio externo. Actualmente se piensa que sta liberacin puede estar inducida por
la planta hospedadora mediante mecanismos desconocidos y que ocurren a travs
de algn canal inico no identificado. Sin embargo, s da un poco de luz a este
proceso, el hecho de que se hayan descrito transportadores de fosfato que se
expresan especficamente en races micorrizadas de plantas como Solanum
tuberosum (Rausch et al. 2001), Medicago truncatula (Harrison et al. 2002), y
26
Introduccin
Oryza sativa (Paszkowski et al. 2002). La inmunolocalizacin del transportador de

M. truncatula (MtPT4), sugiere que se localiza especficamente en la membrana
periarbuscular, y que usa el gradiente de pH establecido a traves de sta
membrana, para tomar el fosfato previamente liberado desde los arbsculos
fngicos hasta el espacio periarbuscular, siendo por lo tanto la transferencia de
fosfato un proceso activo que ocurre preferencialmente a nivel de las clulas
colonizadas por arbsculos. En la figura 5 se esquematiza el transporte de fosfato
en plantas micorrizadas.
Figura 5. Transporte del P en plantas micorrizadas. (a) La raz de la planta crea una
zona de agotamiento de P causada por la captacin de P y la baja tasa de difusin de P en el
suelo. El micelio extrarradical del hongo MA crece hacia la zona de agotamiento, alcanzando
un nuevo pool de P soluble. (b) La interfase implica la captacin de P en la simbiosis MA. Las
interfases suelo-planta, suelo-hongoMA y hongo MA-planta se puestran en rojo, verde y azul
respectivamente. La translocacin transmembrana del P est mediada por transportadores
de P que residen el la membrana de las clulas de la correspondiente interfase. (Adaptado de
Karandashov y Bucher, 2005).
2.4.1.1.B Nutricin nitrogenada

Los hongos micorrcicos son tambin capaces de transferir nitrgeno del suelo
circundante a la planta, bien mediante la absorcin de NH4+ (Johasen et al. 1992;
Frey & Schepp 1993; Johasen et al. 1993), o de NO3- (George et al. 1992; Tobar
et al. 1994; Bago et al. 1996). Asimismo hay indicios de cierta capacidad de
transporte de N orgnico (Hodge et al. 2001), especialmente aminocidos (Hawkins
et al. 2000). En apoyo a sta ltima forma del transporte de N, de ha aislado un
gen que codifica una permeasa de aminocidos de G. mosseae (L. Lanfranco,
comunicacin personal).
27
Introduccin
Sin embargo, los hongos micorrcicos prefieren cono fuente de N al amonio

frente al nitrato (Johansen et al. 1992). La incorporacin del amonio se lleva a cabo
mediante transportadores especficos, de los que actualmente tan solo se ha aislado
uno en G. intraradices (Lpez-Pedrosa et al. 2006). El amonio as absorbido, se
incorporara rpidamente el glutamato, para dar glutamina, lo que podra ocurrir
por distintos mecanismos, aunque el ms probable parece ser el ciclo de la
Glutamina sintasa/Glutamato sintasa, ya que estas actividades ha sido detectadas
en hongos micorrcicos (Johansen et al. 1996; Breuninger et al. 2004).
En la asimilacin de nitrato, parece estar implicada la enzima nitrato reductasa,
cuya actividad se ha detectado tanto en esporas (Ho & Trappe 1975), como en
extractos de races micorrizadas (Subramanian & Charest 1998). Molecularmente,
se ha aislado el gen codificante para una nitrato reductasa de G. intraradices, que
se expresa fundamentalmente en al arbsculo (Kaldorf et al. 1998). sa actividad
permitira la reduccin del nitrato para su posterior incorporacin a la glutamina en
forma de amonio.
La transferencia de N hasta su absorcin por la planta, ocurre por un proceso
asociado al ciclo de la urea y al transporte de polifosfato, propuesto ya por Bago et
al. (2001) y recientemente confirmado por Govindarajulu et al. (2005). El proceso
comienza con la entrada del amonio o nitrato a las hifas extrarradicales, donde el
nitrato ser transformado en amonio por la nitrato reductasa, y dicho amonio
mediante la accin de la glutamina sintetasa se transforma en glutamina, que
mediante el ciclo de la urea se convierte en arginina. Y as ya como arginina es
translocado al micelio intrarradical asociandose a la transferencia de polifosfato. Ya
una vez en la fase intrarradical del hongo, la arginina entrara ha formar parte de
nuevo del ciclo de la urea, liberndose ornitina y urea, que por accin de la ureasa
y la ornitina aminotransferasa liberaran el amonio que ser as transferido a la
planta. La posibilidad de una transferencia directa de arginina desde el hongo a la
planta, ha sido descartada debido a que no se detectan carbonos marcados en la
13
parte area de la planta cuando se aade C-acetato en el medio donde crece el
hongo (Fitter et al. 1998). Proceso resumido en la figura 6.
28
Introduccin
Figura 6. Mecanismo propuesto para el transporte de nitrgeno a la planta en

micorrizas arbusculares. El nitrgeno adquirido se transforma en amonio o se
adquiere como tal. Mediante el ciclo de la urea pasa a formar parte de la
arginina. La transferencia al micelio intrarradical se lleva a cabo en forma de
arginina, asociada a los polifosfatos. Una vez en el micelio intrarradical, se libera
el amonio de nuevo mediante el ciclo de la urea. Tomado de Bago et al (2001).
2.4.1.1.C Micronutrientes
El hongo micorrcico tambin es capaz de absorber y transferir a la planta
micronutrientes tales como el Zn y el Cu, confiriendo as una mayor eficiencia en la
absorcin de estos micronutrientes a las plantas micorrizadas respecto a las no
micorrizadas. La absorcin de estos elementos por las hifas, es independiente de la
nutricin fosforada (Weissenhorn et al. 1995; Chen et al. 2001). En repetidas
ocasiones se ha puesto de manifiesto una capacidad tamponadora de los hongos
micorricicos sobre el nivel de metales pesados en la planta hopedadora, efecto
amortiguador que se traduce en un aumento en el suministro de micronutrientes a
la planta cuando sta crece en suelos deficientes en esos micronutrientes. En la
situacin contraria, donde las plantas crecen en suelos con niveles elevados de
micronutrientes, los hongos micorricicos reducen la incorporacin de metales a los
tejidos vegetales (Diaz et al. 1996; Chen et al. 2004).
El efecto protector de las micorrizas sobre los tejidos de la parte area de la
planta se ha observado para Al (Cumming & Ning 2003), U (Rufyikiri et al. 2002),
Cs (Berreck & Hanselwandter 2001), As (Knudson et al. 2003), Sr (Entry et al.
1999), Cd (Rivera-Becerril et al. 2002), Mn (Malcov et al. 2003) y Cu (Griffioen et
al. 1994). Este efecto protector, es debido a la inmovilizacin del metal,
29
Introduccin
fundamentalmente en al micelio externo (Joner et al. 2000), aunque tambin en

estructuras intrarradicales como vesculas, o intracelularmente, en los grnulos de
polifosfato (Rauser & Ackerley 1987; Turnau et al. 1993; Weiersbye 1999).
2.4.1.2 Metabolismo del carbono en los hongos micorricicos
En lo referente al transporte de nutrientes, se piensa que la transferencia de
carbohidratos es el principal beneficio que obtiene el simbionte fngico en la
asociacin micorrcico arbuscular. Debido al carcter de biotrfos obligados de los
hongos micorrcico arbusculares, sus hifas extrarradicales son incapaces de
absorber carbohidratos del medio. se mismo carcter de simbiontes obligados,
junto con la dificultad de aislar las estructuras intrarradicales de estos hongos,
dificulta el estudio de los procesos por los cuales se produce la transferencia de
carbono en la simbiosis, y de las bases de la biotrofa obligada que presentan.
La primera evidencia experimental sobre la transferencia de compuestos
carbonados de la planta al hongo fue proporcionada por Ho y Trappe (1973),
14
quienes usando CO2 demostraron que, tras unas semanas, se detectaba C
marcado en el micelio del hongo. Ms tarde, Pfeffer et al. (1999) demostraron la
incapacidad de las hifas extrarradicales para tomar carbohidratos, mediante la
13
aplicacin de varios compuestos marcados con C en placas de petri
compartimentadas donde en uno de los compartimentos haba races de zanahoria
(Daucus carota) transformadas con Agrobacterium rhizogenes y colonizadas por G.
intraradices, y en el otro compartimento slo micelio extrarradical del hongo. Este
estudio, tambin document la absorcin de glucosa y fructosa por las estructuras
intarradicales del hongo. Otro estudio que apoya esta incapacidad del micelio
extrarradical para absorber hexosas del medio, es el realizado por Bago et al.
(2000). Por analoga con lo que ocurre en otras asociaciones simbiticas, se admite
que la clula hospedadora libera sacarosa a la matriz interfacial mediante
transporte pasivo, se hidroliza en glucosa y fructosa mediante la accin de una
invertasa apoplstica y, finalmente, la glucosa se absorbe por el hongo mediante un
proceso de transporte activo (Blee & Anderson 2002; Hohnjec et al. 2003). Sin
embargo, an es materia de debate, las estructuras fngicas exactas responsables
de esta absorcin (Douds et al. 2000).
Las H+-ATPasas fngicas, implicadas posiblemente en se transporte activo
de carbohidratos desde el apoplasto, estn localizadas fundamentalmente en el
tronco de los arbsculos y en las hifas intercelulares, apoyando la absorcin de
carbohidratos por estas estructuras (Gianinnazi-Pearson et al. 1991). Sin embargo,
en plantas mutantes de guisante donde los hongos micorrcicos son incapaces de
formar arbsculos, el micelio extrarradical tiene muy disminuido su crecimiento,
30
Introduccin
argumentando as a favor de un papel arbuscular en la absorcin de carbohidratos

(Kling et al. 1996).
El destino metablico de las hexosas tomadas por las estructuras fngicas
intrarradicales, fue determinado mediante experimentos de marcaje radiactivo
usando cultivo de races de D. carota en placas de petri compartimentadas. En
experimentos a corto plazo, la glucosa es transformada principalmente a trehalosa
o glucgeno (Douds et al. 2000), con el fin de disminuir la osmolaridad. Despus de
periodos de incubacin ms largos, la glucosa es usada en ambas formas,
directamente para la biosntesis de lpidos, o para entrar en la ruta de las pentosas
fosfato, suministrando as los equivalentes de reduccin necesarios para la
biosntesis de lpidos (Pefeffer et al. 1999). Los lpidos y el glucgeno, se
transfieren al micelio extrarradical (Bago et al. 2003), donde se puede observar in
vivo el movimiento bidireccional de los cuerpos lipdicos (Bago et al. 2002). Una vez
en el micelio extrarradical, los compuestos lipdicos se transformarn en
carbohidratos mediante gluconeognesis. El micelio extrarradical depende para su
desarrollo de este aporte de productos carbonados. En los hongos micorricicos
existe una compartimentacin del metabolismo, de forma que las capacidades de
sntesis lipdica slo residen en el micelio intrarradical, mientras que las
capacidades gluconeognicas se localizan nicamente en el micelio extrarradical. En
esta marcada compartimentacin del metabolismo del hongo, asociada a la
diferenciacin que experimenta el micelio al establecer la simbiosis, podra residir la
base de la incapacidad del hongo para crecer independientemente de la planta.
Como ya se ha mencionado anteriormente, la espora es capaz de un
desarrollo limitado en ausencia de la raz hospedadora, estando ste sustentado por
las reservas lipdicas de la espora, dado que el micelio producido es incapaz de
sintetizar cidos grasos (Bago et al. 1999). No obstante, en este micelio s se han
detectado otras rutas metablicas como son: gluconeognesis, gluclisis, ciclo de la
urea, ruta de las pentosas fosfato, ciclo del glioxilato y va de los cidos
tricarboxlicos (Macdonald & Lewis 1978; Saito 1995; Harrier et al. 1998; Bago et
al. 1999).
2.4.1.3 Metabolismo del carbono en las plantas micorrizadas
Referente a la planta, hay suficientes evidencias de que como consecuencia
del establecimiento de la simbiosis, se dirige hacia la raz una proporcin ms
elevada de fotoasimilados, y aumenta la proporcin neta de la fotosntesis de la
planta husped (Douds et al. 1988; Graham 2000; Tinker et al. 1994), debido a
que sta asociacin simbitica representa una demanda adicional de carbono para
los tejidos fotosintticos, lo que se aade a la demanda sumidero de la raz.
Medidas del flujo de carbono indican que las plantas micorrizadas dirigen de un 4 a
31
Introduccin
un 20% ms de fotoasimilados al sistema radical que las plantas no micorrizadas

(Jackobsen & Rosendahl 1990; Pearson & Jacobsen 1993; Graham 2000). La
sacarosa, que es la forma de transporte de los carbohidratos dentro de las plantas
superiores, debe jugar un papel importante en la transferencia de carbono en la
simbiosis micorrcico arbuscular. Por lo tanto, tienen que existir mecanismos que
aseguren que las races micorrizadas reciben un adecuado suministro de azcares
para la correcta formacin, mantenimiento y funcin de las estructuras micorrcicas.
En las plantas, los transportadores de mono- y disacridos tienen un papel
relevante en la distribucin los fotoasimilados desde los tejidos fuente a los
sumidero (para una revisin ver Bttner & Sauer 2000; Lemoine 2000; Williams et
al. 2000). Por lo tanto, es probable que estos transportadores de carbohidratos
estn regulados por el desarrollo de la simbiosis. De hecho, un gen codificate para
un transportador de hexosas de Medicago, que probablemente est involucrado en
la absorcin de azcares, se ha visto que aumenta su expresin en races
colonizadas por Glomus versiforme, y ms especficamente en las regiones de la
raz con una elevada colonizacin fngica (Harrison 1996).
La utilizacin de la sacarosa transportada a las races como fuente de
carbono y energa, tanto por parte del hongo como de la planta, depende de su
hidrlisis en hexosas mediante la accin de una sacarosa sintasa invertasa.
Ambas enzimas desempean un papel clave en los procesos que controlan la
distribucin y metabolismo de carbohidratos en plantas superiores. Estudios de
hibridacin in situ han mostrado una acumulacin de transcritos de los genes que
codifican la invertasa vacuolar y la sacarosa sintasa citoplasmtica de P. vulgaris en
clulas corticales colonizadas por arbsculos, mientras que dichos transcritos no se
detectaron en las clulas corticales de las races no micorrizadas (Blee & Anderson,
2002). Sin embargo, no se encontraron diferencias en las actividades soluble y
asociadas a pared entre races micorrizadas y no micorrizadas de soja, pero si un
incremento significativo en la actividad de la invertasa soluble alcalina (Schubert et
al., 2003). Ravnskov y colaboradores (2003) tambin encontraron un aumento de
la expression de dos genes que codifican la sacarosa sintasa de races de maz tras
la inoculacin con hongos micorrcico arbusculares. Recientemente, Hohnjec et al.
(2003) informaron que el gen de la sacarosa sintasa MtSucS1 de Medicago
truncatula est fuertemente inducido durante interacciones endosimbiticas con
Rhizobium y el hongo micorrcico arbuscular G. mosseae. Adems, estos autores
observaron que dicho gen se expresaba en clulas colonizadas por arbsculos as
como en las clulas corticales adyacentes. Estos resultados han llevado a proponer
que esta enzima puede estar implicada en la generacin de la fuerza sumidero de
las races micorrizadas. La correspondiente induccin de hidrlisis de sacarosa tanto
32
Introduccin
apoplstica como simplstica, refleja probablemente el aumento de las necesidades

de carbohidratos en las clulas corticales de la raz simbitica. Como se mencion
anteriormente, se asume que en la simbiosis micorrcico arbuscular, la sacarosa es
liberada en al apoplasto a la interfase planta-hongo, e hidrolizada por una invertasa
asociada a la pared celular de la planta. Sin embargo, los conocimientos actuales
sobre el papel de la invertasa asociada a pared son muy limitados. Blee y Anderson
(2002) encontraron un gen de una invertasa asociada a pared de zanahoria, que no
se expresaba en clulas corticales que contena arbsculos; pero eso no puede
excluir que otras isoformas de invertasas asociadas a la pared celular estn
inducidas por la simbiosis.
Dado que el efecto de las micorrizas arbusculares sobre la regulacin de
genes implicados en el metabolismo del carbono en la planta, es la base del estudio
de la presente tesis doctoral, este tema ser abordado de forma ms profunda ms
adelante.
3. REGULACIN DEL METABOLISMO CARBONADO EN PLANTAS

SUPERIORES
3.1. Sistemas de transporte de azcares en plantas superiores
Las clulas hetertrofas de races, estructuras reproductoras, de reserva y
rganos en desarrollo, dependen del abastecimiento de azcares para su nutricin;
por lo que son conocidas como sumidero de carbono. En las plantas superiores, la
fijacin del carbono se da principalmente en las clulas del mesfilo de las hojas
maduras y los azcares all sintetizados, son el principal producto fotosinttico
exportado a las partes sumidero de la planta. Deben existir mecanismos que
aseguren que esos tejidos sumidero reciban un adecuado suministro de azcares
para su desarrollo y crecimiento, y los transportadores de azcares tienen un papel
principal en el transporte de membrana de azcares y su distribucin a travs de la
planta.
El transporte a larga distancia de los carbohidratos entre las partes fuente y las
sumidero, ocurre en clulas especficas del sistema vascular, los elementos de los
tubos cribosos del floema (Lalonde et al. 1999) (Figura 7). Durante su desarrollo,
los elementos de los tubos cribosos se extienden longitudinalmente, y pierden la
mayora de sus orgnulos. Y paralelamente, se produce un gran incremento en la
densidad de orgnulos de las clulas acompaantes del floema. Ambos, elementos
de los tubos cribosos y clulas acompaantes estn conectados ntimamente por
plasmodesmos formando un complejo celular. Las clulas acompaantes tienen una
importante funcin, el abastecimiento de energa y protenas a los elementos de
los tubos cribosos. La sacarosa representa la principal forma de transporte del
33
Introduccin
carbono reducido en los elementos de los tubos cribosos, aunque algunas plantas
pueden tambin transportar otros compuestos como rafinosa, polioles etc...
Despus de su sntesis, la sacarosa puede realizar la ruta completa desde las
clulas del mesfilo hasta las clulas acompaantes de los tubos cribosos en el
simplasto transfirindose de clula a clula por medio de los plasmodesmos (carga
simplstica) (Figura 7). Sin embargo, a menudo, la sacarosa va desde las clulas
del mesfilo hasta el complejo clulas acompaantes-tubos cribosos, por va
apoplstica (carga apoplstica), la cual necesita de simporte se membrana
plasmtica sacarosa-H+. La ruta elegida depende de la especie (ambas rutas deben
darse en el mismo organismo), del rgano tejido, y del estado de desarrollo. Las
clulas sumidero pueden bien importar sacarosa desde el apoplasto directamente
por medio de transportadores de sacarosa, o, alternativamente, la sacarosa puede
ser hidrolizada a glucosa y fructosa por invertasas asociadas a la pared celular y
estas hexosas son absorbidas por medio de transportadores de monosacridos.
Clulas Elementos
Luz CO2 de los tubos
mesfilo acompaantes
cribosos
SACAROSA
FUENTE
Glucosa + fructosa sacarosa
invertasa
SUMIDERO
Figura 7. Transporte del carbono fijado a travs del floema. Desde su punto de
sntesis en el mesfilo, la sacarosa puede transferirse al complejo clulas
acompaantes/elementos cribosos, bien a travs de plasmodesmos, por va apoplstica. El
mecanismo apoplstico de carga del floema, requiere de la exportacin de sacarosa (1)
34
Introduccin
desde el mesfilo desde parnquima vascular y su reabsorcin (2) al complejo clulas

acompaantes/elementos cribosos. La reabsorcin (3) ocurre tambin a lo largo de la
trayectoria del floema. La descarga apoplsmica del floema o post-floema, necesita de un
exportador de sacarosa a los tejidos sumidero (4). La absorcin de sacarosa y otros solutos
en el interior de los tejidos sumidero, puede ocurrir a travs de plasmodesmos o de
transportadores de sacarosa (5). Pero las clulas en los tejidos sumidero pueden tambin
tomar la sacarosa despus de su hidrlisis por una invertasa apoplstica, y convertida as en
hexosas (6). Tomado de Lalonde et al. (1999).
Las plantas disponen de varios transportadores de monosacridos y

disacridos para coordinar el movimiento de azcares en los distintos tejidos a
diferentes estados de desarrollo y bajo distintas condiciones medioambientales
(para una revisin ver Bttner & Sauer 2000; Lemoine 2000; Williams et al. 2000).
stos transportadores son miembros de la superfamilia de los facilitadores
mayores, la cual se caracteriza por un motivo estructural comn de 12 dominios
transmembrana, y la presencia de otros motivos aminoacdicos conservados (Saier
et al. 1999). Mientras que los transportadores de disacridos parecen ser
especficos de plantas, si se han encontrado en bacterias, hongos y mamferos
numerosos genes homlogos a transportadores de monosacridos. As, se han
clonado transportadores de monosacridos de diferentes hongos tales como
levaduras (Heiland et al. 2000), Aspergillus (Yu et al. 2000), Neurospora (Madi et
al. 1997), el hongo ectomicorrcico Amanita muscaria (Nehls et al. 1998), y el
patgeno Uromyces fabae (Voegele et al. 2001).
3.2. Estudio de la regulacin del metabolismo de carbono de las

plantas mediante las interacciones planta-microorganismo
Las plantas superiores estn compuestas de diferentes tipos de clulas y
tejidos que llevan a cabo funciones especializadas y permiten el crecimiento
coordinado, el desarrollo y la reproduccin del organismo en su conjunto. Con
respecto al metabolismo, los rganos de las plantas pueden ser divididos en tejidos
fuente sumidero. Los tejidos fuente como las hojas maduras producen un exceso
de asimilados los cuales se transportan va floema a los distintos tejidos sumidero
que no son capaces de producir por s mismos suficiente cantidad de asimilados.
En una planta, hay distintos rganos sumidero como meristemos, hojas en
desarrollo, frutos, semillas tubrculos, que tienen funciones especficas y
compiten por los asimilados que se producen en las hojas fuente maduras. La
distribucin de carbohidratos entre los distintos rganos sumidero, se determina
por la fuerza sumidero relativa de los tejidos individuales. Por otro lado, la
distribucin del carbono est influenciada por factores biticos y abiticos. Una
compleja red de regulacin permite integrar cambios medioambientales,
metablicos y fisiolgicos, y ajustar la produccin de carbono a las respectivas
35
Introduccin
demandas. Por esto, la sutil coordinacin de la distribucin de carbono entre los

tejidos productores y los consumidores, es la responsable del crecimiento y
desarrollo normal de la planta y afecta en gran medida al rendimiento de las
cosechas. Como se expone en Biemelt & Sonnewald (2006), las interacciones
fuente-sumidero deben estar reguladas a tres niveles diferentes: (i) produccin de
asimilados, (ii) localizacin y (iii) utilizacin (Figura 8).
Durante las ltimas dcadas, gracias a los estudios bioqumicos y
moleculares, ha mejorado notablemente nuestro conocimiento sobre esos tres
procesos. En particular, las plantas transgnicas que tienen alterada la actividad de
una sola enzima, contribuyen a un mejor entendimiento del flujo de carbono,
revelando tambin la enorme flexibilidad del metabolismo de las plantas (revisado
en Frommer & Sonnewald 1995; Paul & Foyer 2001; Fernie et al. 2002). Varias
aproximaciones para mejorar el rendimiento de las cosechas mediante la
manipulacin de un solo paso, no mejoraron sustancialmente el rendimiento. Sin
embargo, hay algunos ejemplos de mejora de las cosechas interfiriendo slo una
enzima metablica. Por ejemplo, Regierer et al. (2002) pudieron incrementar el
rendimiento de la patata y su contenido en almidn en un 85% y un 60%
respectivamente, mediante la represin antisentido de una adenilato Kinasa
plastidial. Sin embargo, hay an bastantes cuestiones importantes sin resolver,
siendo las ms importantes: a) Cmo se adaptan las hojas fuente a las
necesidades de los rganos sumidero locales y los distantes?, b) Cmo se regula el
transporte de asimilados a larga distancia y clula a clula?, c) Qu determina la
fuerza sumidero?.
36
Introduccin
EC
Fuente
Clula del mesfilo
Metabolismo y desarrollo
Sumidero
Figura 8. Esquema de las relaciones fuente-sumidero.

Tomado de Biemelt & Sonnewald (2006).
De esta manera, elucidando las sofisticadas redes que unen las diferentes
rutas y la regulacin de las interacciones fuente-sumidero, se colocarn los
cimientos para una manipulacin con xito de las rutas bioqumicas y para llevar a
cabo la mejora de las cosechas.
El estudio de la interaccin planta-microbio, proporciona una nueva y
sencilla aproximacin para elucidar los mecanismos reguladores de la interaccin
sumidero-fuente en plantas (para una revisin ver Biemelt & Sonnewald 2006). Los
virus de plantas, han desarrollado estrategias sofisticadas para reconducir las rutas
de transporte de macromolculas intra- e intercelulares de las plantas. As,
estudiando cuales son las dianas de las protenas de transporte viral dentro del
husped, se podran identificar los componentes de la maquinaria de transporte
tanto de clula a clula como del transporte a larga distancia. Mientras que los virus
modulan el transporte intracelular de macromolculas, las bacterias fitopatgenas
inyectan protenas efectoras en el interior de las clulas del husped, modificando
as procesos metablicos centrales. Se han descrito un nmero de posibles y ya
probadas protenas efectoras, algunas de las cuales se ha propuesto que tengan
funcin en la regulacin del metabolismo de carbohidratos. Los hongos parecen
modular los procesos metablicos de forma similar a las bacterias; sin embargo, no
se ha demostrado el hecho de que inyecten efectores intracelulares en las clulas
vegetales. Por lo tanto, se puede concluir, que los hongos aumentan el control
metablico mediante la modificacin de protenas receptoras extracelulares.
37
Introduccin
3.3. Localizacin y regulacin de la actividad de las enzimas clave

en el metabolismo de la sacarosa
Desde el descubrimiento de la biosntesis de la sacarosa, se han hecho
avances considerables para entender su regulacin y el papel crucial que
desempea en la biologa funcional de las plantas. Sin embargo, aspectos
importantes de este metabolismo son an un enigma. Estudios en cianobacterias y
la publicacin de la secuenciacin de varios genomas completos, han significado un
avance en el conocimiento de la estructura de las protenas implicadas en el
metabolismo de la sacarosa, y han dado una nueva percepcin de sus orgenes y su
evolucin futura (Salerno & Curatti 2003).
La sacarosa tiene un papel central en el crecimiento y desarrollo de las
plantas. Su sntesis est restringida al citosol debido a la estricta
compartimentacin de las enzimas implicadas en su biosntesis. Es sintetizada en
las hojas como uno de los productos primarios finales de la fotosntesis y funciona
como transporte primario de azcares, y en algunos casos, como regulador directo
indirecto de la expresin gnica. La principal ruta de biosntesis de sacarosa
implica la accin secuencial de sacarosa-fosfato-sintasa (SPS; UDP-glucosa:D-
fructosa-6-fosfato 2--D-glucosiltransferasa, EC 2.4.1.14), y sacarosa-fosfato-
fosfatasa (SPP; sacarosa-6F-fosfato-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.24), liberando
sacarosa libre y fosfato inorgnico (Huber & Huber 1996) (Figura 9). Otra enzima,
la sacarosa sintasa (SuS SS; UDP-glucosa:D-fructosa 2--D-glucosiltransferasa,
EC 2.4.1.13), cataliza una reaccin reversible pudiendo estar implicada tanto en la
sntesis como en la degradacin de sacarosa. Sin embargo, a la SuS generalmente
se la asigna un papel en la degradacin de la sacarosa en la mayora de las
condiciones fisiolgicas en los tejidos que usan sacarosa, liberando nucletidos de
azcares, que son precursores en la formacin de polisacridos estructurales y de
reserva (Winter & Huber 2000). Como contraste, la hidrlisis irreversible de la
sacarosa en hexosas, es catalizada por invertasas (EC 3.2.1.26), de las cuales
existen varias isoformas, y tienen un papel importante cuando hay una demanda de
carbono y energa.
38
Introduccin
UDP-glucosa Fructosa-6-fosfato
SPS
Sacarosa-6-fosfato
SPP
Sacarosa
SS Invertasa
UDP-glucosa Fructosa Glucosa Fructosa
Figura 9. Metabolismo de la sacarosa en plantas superiores.
Durante el da, el sustrato para la biosntesis de sacarosa son las triosas

fosfato, procedentes del cloroplasto por un transportador de triosas fosfato y en
antiporte con fosfato inorgnico. Por la noche, la movilizacin del almidn
proporciona los sustratos para la biosntesis de sacarosa probablemente en forma
de glucosa, derivada de la rotura aminoltica del almidn (Schleucher et al. 1998).
As, la biosntesis de sacarosa durante periodos de activa fotosntesis, implica la
fructosa-1,6-bifosfatasa citoslica y un control asociado por el sistema fructosa-2,6-
bifosfatasa, mientras que este punto de control es eludido en la oscuridad. Las
39
Introduccin
caractersticas bsicas de la regulacin de la ruta de biosntesis de sacarosa, su

coordinacin con la tasa de asimilacin de CO2 y la produccin de almidn se han
revisado en varios trabajos (Stitt et al. 1987; Huber et al. 1993; Quick 1996).
A pesar de todo el azcar transportado, se acepta que la sntesis neta de
sacarosa puede darse en algunos tejidos sumidero en desarrollo (por ejemplo,
varios frutos, incluyendo el tomate y las cucurbitceas, y las races del azcar de
remolacha; ver Huber et al. 1993; Quick 1996), y tejidos fuente no fotosintticos
(por ejemplo semillas en germinacin). Parece ser que la sacarosa-fosfato sintasa
(SPS), es la enzima responsable de la sntesis de sacarosa en los tejidos no verdes,
aunque la procedencia del sustrato y las rutas implicadas, variarn dependiendo si
los azcares estn siendo consumidos (como en al desarrollo del fruto), o utilizados
como reserva (como en la germinacin de semillas). En la mayora de los tejidos
sumidero, lo que ocurre por supuesto, es la degradacin neta de la sacarosa.
La hidrlisis de la sacarosa es vital en plantas multicelulares, no slo por la
distribucin de los recursos de carbono, sino tambin por la existencia de seales
de azcares basadas en hexosas en las estructuras que importan el carbono. La
regulacin de las reacciones de hidrlisis de sacarosa y sus consecuencias, se ha
convertido por lo tanto, en una cuestin central en al metabolismo carbonado de las
plantas. Los mecanismos primarios de esta regulacin implican la capacidad de las
invertasas para alterar las seales de azcares ya que produce glucosa en lugar de
UDP-glucosa, y por lo tanto, produce dos veces ms hexosas que la sacarosa
sintasa (Fig. 10). Adems, los sitios de hidrlisis de sacarosa vacuolares por
invertasas podran permitir un control temporal via la comprtimentacin. Los
miembros de las familias gnicas que codifican para invertasas sacarosas
sintasas, responden a nivel transcripcional y postranscripcional a las distintas
seales medioambientales, incluyendo cambios endgenos que reflejan su propia
accin (por ejemplo, hexosas y sistemas hormonales que responden a hexosas
tales como la sealizacin por cido abscsico (ABA)). A nivel enzimtico, la
sacarosa sintasa puede ser regulada por cambios rpidos en la localizacin
subcelular, por fosforilacin, y sensiblemente modulada por la renovacin de
protenas. Adems del control transcripcional, la accin de las invertasas puede
estar regulada tambin a nivel enzimtico por protenas inhibidoras y por un
sistema que tiene el potencial de iniciar y terminar actividad invertasa en vacuolas.
40
Introduccin
Seales hexosas
Glucosa Seales
Invertasa Fructosa hexosas
Sacarosa
Sacarosa sintasa Fructosa
UDP-glucosa ?
Seales sacarosa
Figura 10. Respuesta de los genes que codifican para enzimas que degradan
sacarosa a sus propios productos enzimticos. Tomado de Koch 2004.
3.3.1. Enzimas implicadas en la sntesis de sacarosa

Como ya se ha mencionado, la sntesis de sacarosa est restringida al citosol
debido a la compartimentacin de las enzimas implicadas en el proceso. Durante el
periodo de luz, el almidn y la sacarosa son sintetizados como productos de la
asimilacin fotosinttica del carbono en las hojas fuente. La sacarosa se exporta a
las partes no fotosintticas de las plantas para su crecimiento y desarrollo, mientras
que el almidn es retenido en las hojas. Por la noche, el almidn es degradado para
suministrar sustratos para continuar la sntesis y la exportacin de sacarosa (Geiger
& Servaites 1994). Ms all de su papel en el metabolismo energtico, la sacarosa
se acumula a menudo como respuesta a estreses medioambientales tales como
fro, salinidad y sequa (Yang et al. 2001; Strand et al. 2003).
3.3.1.1 Sacarosa-fosfato-sintasa
Como se mencion anteriormente, la biosntesis de sacarosa est catalizada
por la accin secuencial de la sacarosa-fosfato-sintasa (SPS) y sacarosa-6-fosfato-
fosfatasa (SPP):
UDP-Glu +Fru-6-P Sac-6-P + UDP +H+

Sac-6-P + H2O Sac + Pi
La rpida retirada de Sac-6-P por una fosfatasa especfica y con alta actividad,
desplaza la reaccin reversible de la SPS in vivo (Stitt et al. 1987), por lo que se
piensa que la actividad de la SPS contribuye al control del flujo de carbono en
forma de sacarosa (Huber & Huber 1996). Mientras que la actividad de la SPP es
abundante en las hojas fuente, y no ejerce un control significante sobre la sntesis
41
Introduccin
de sacarosa en condiciones normales de crecimiento (Chen et al. 2005a), la SPS si

tiene una contribucin importante sobre el control del flujo de carbono en forma de
sacarosa. sta enzima, est regulada por una jerarqua de mecanismos que
implican modificacin postranscripcional via fosforilacin, control directo por medio
de efectores metablicos, tales como glucosa-6-fosfato y fosfato inorgnico (Huber
& Huber 1996; Winter & Huber 2000), y regulacin transcripcional durante la
transicin sumidero-fuente (Harn et al. 1993; Klein et al. 1993; Chvez-Brcenas
et al. 2000).
La regulacin de la actividad de la SPS en hojas de espinacas (Spinacia
oleracea), est bien caracterizada. La enzima tiene tres sitios de fosforilacin, Ser-
158, Ser-229, y Ser-424, los cuales estn implicados en la regulacin por
luz/oscuridad (Huber & Huber 1996; Toroser et al. 1999), unin a protenas 14-3-3
(Toroser et al. 1999), y activacin por estrs osmtico (Toroser & Huber 1997)
respectivamente. En oscuridad, la fosforilacin de la Ser-158 inactiva a la SPS. ste
efecto es revertido en presencia de luz por una fosfatasa tipo 2A, habiendo una
activacin de la SPS como consecuencia de un incremento en la afinidad hacia sus
sustratos, al regulador alostrico positivo Glc-6-P, y a un descenso en la
sensibilidad a Pi (Huber & Huber 1996).
Hay bastantes evidencias de que las plantas superiores contienen ms de un
gen codificante para SPS. Los anlisis filogenticos presentados por Langenkamper
et al. (2002), demuestran que hay tres familias de genes de SPS en plantas
superiores. sas tres familias han sido llamadas A, B y C, y tanto en Arabidopsis,
como en Citrus unshiu (Komatsu et al. 1996; Komatsu et al. 1999) y en arroz (Yu
et al. 2001) se ha visto que hay representantes de las tres familias. Por esto, se
supone que todas las plantas superiores tienen en su genoma al menos un
representante de cada familia, y que se expresa un miembro de cada una, aunque
debe predominar una isoforma (Lunn & McRae 2003). Recientemente se ha
mostrado que las especies monocotiledneas tienen una familia D adicional que
probablemente apareci despus de la divergencia de mono- y dicotiledneas
(Castlenden et al. 2004). Estudios comparativos de la expresin, revelan una
expresin espacial y temporal distinta aunque coincidente de cada una de las
familias gnicas (Komatsu et al. 1996; Castlenden et al. 2004). Chen et al.
(2005b) proporcionaron evidencias de que las familias gnicas A, B y C de
dicotiledneas son funcionalmente distintas, en tabaco al menos, se expresa un
representante de cada familia y los tres genes tienen distintos patrones de
expresin. Estudios de expresin tambin muestran que los genes de la familia A
estn expresados de manera ms abundante que los de otras familias.
42
Introduccin
La importancia de esta enzima en la biosntesis de sacarosa se ha

confirmado gracias a los esfuerzos para usar gentica molecular en la modificacin
de dicha enzima. La sobreexpresin de la SPS de maz en tomate, provoca un
aumento en la sntesis de sacarosa, incrementando la relacin sacarosa/almidn en
hojas y la capacidad fotosinttica, indicando que la SPS es un punto principal de
control de la fotosntesis bajo condiciones de elevado CO2 y saturacin de luz
(Galtier et al. 1993; Galtier et al. 1995; Micallef et al. 1995). Sin embargo, en
algunos casos, la sobreexpresin de SPS no tiene como resultado un incremento de
la actividad SPS debido a la regulacin postranscripcional del enzima.
3.3.2. Enzimas implicadas en la degradacin y utilizacin de la sacarosa
Las nicas rutas que se conocen para la hidrlisis de sacarosa en plantas,
estn catalizadas por invertasas (sacarosa + H2O glucosa + fructosa) sacarosa
sintasa (sacarosa + UDP fructosa + UDP-glucosa). En el citosol se dan ambas
rutas (Fernie et al. 2002).
metabolismo de la sacarosa
Contribucin relativa al
Invertasas Invertasas de Sacarosa

vacuolares pared celular sintasa
Progresin del desarrollo
Invertasas vacuolares:
Iniciacin y expansin tejidos sumidero
Generacin mxima de hexosas vacuolares
-Expansin Progresin del desarrollo
-Respiracin
-Sealizacin por azcares
(divisin celular e inicio de la diferenciacin)
Invertasas de pared celular:

Continuacin iniciacin y expansin tejidos
sumidero
Generacin mxima de hexosas de pared celular
-Reduccin de la inhibicin del transporte basado
en el turgor
-Reduccin del turgor en zonas de descarga del
floema (accin localizada a menudo en el
desarrollo)
-Respiracin
-Sealizacin por azcares
(divisin celular y expresin gnica relacionada)
Sacarosa sintasa:
Almacenamiento y maduracin
Generacin de UDPG en lugar de glucosa
- Enlace directo de UDPG para biosntesis
-Ruta respiratoria conservadora de ATP
-Minimizacin de la sealizacin basada en
hexosas (aumento de la expresin de genes
para almacenamiento y maduracin
Figura 11. Contribucin de las distintas enzimas del catabolismo de la sacarosa,

segn el estado de desarrollo de la planta. Tomado de Koch (2004).
43
Introduccin
Estas enzimas contribuyen de forma distinta en el metabolismo de la

sacarosa segn el estado de desarrollo en el que se encuentre la planta (revisado
en Koch 2004) (Figura 11). Las invertasas participan en la iniciacin y expansin de
las estructuras sumidero (Sonnewald et al. 1997; Sturm & Tang 1999; Koch &
Zeng 2002), y a menudo, la actividad de las invertasas vacuolares precede a las de
las invertasas asociadas a pared celular (Andersen et al. 2002; Wachter et al.
2003). La accin de la invertasa de pared celular coincide en algunos sistemas con
una expresin elevada de los transportadore se hexosas (Sherson et al.2003). Ms
tarde, la transicin a las fases de maduracin y almacanamiento, se facilita gracias
a cambios en la relacin hexosa/sacarosa (Wobus & Weber 1999; Borisjuk et al.
2002; Borisjuk et al. 2003; Weschke et al. 2003), y por cambios en las rutas de la
hidrlisis de sacarosa desde las que utilizan invertasas a las que estn catalizadas
por sacarosa sintasa. Aunque, en algunas regiones muy localizadas, durante la
maduracin, persisten elevados niveles de invertasas de pared celular. Del mismo
modo, la sacarosa sintasa puede estar activa en determinados emplazamientos
durante las fases iniciales del desarrollo (por ejemplo en el floema). Sin embargo,
diversas evidencias apoyan la idea de que el balance entre actividad invertasa y
sacarosa sintasa puede alterar el desarrollo de la planta a travs de diferentes
efectos sobre los sistemas de sealizacin por azcares.
3.3.2.1. Invertasas
La importancia de las invertasas solamente fue reconocida cuando se
iniciaron los estudios moleculares en los aos 90 (Sturm & Chrispeels 1990; von
Schaewen et al. 1990; Miller & Chourey 1992); despus de eso, las invertasas
atrajeron mucho la atencin y los datos muestran que hay ms de 300 secuencias
de invertasas en la base de datos, que representan a ms de 200 isoenzimas
diferentes de aproximadamente 50 especies de plantas.
Basndose en su solubilidad, localizacin subcelular, pH ptimo y punto
isoelctrico, se pueden distinguir tres tipos diferentes de isoenzimas de invertasas:
invertasas vacuolares (Inv-V), asociadas a pared celular (Inv-CW) y neutrales (Inv-
N) (revisin Roitsch & Gonzlez 2004).
44
Introduccin
Elementos
de los tubos
cribosos
Hexosas Metabolismo
Regulacin gnica
pH-ptimo pI Localizacin Funciones

Invertasa vacuolar cido Neutro Vacuola Control de la composicin de azcares en frutos y
rganos de reserva
Osmoregulacin y crecimiento celular
Respuesta a sequa, hipoxia y gravitropismo
Respuesta a heridas
Invertasa extracelular cido Bsico (neutro) Apoplasto Regulacin de la distribucin de sacarosa
Respuesta a heridas e infeccin por patgenos
Regulacin del desarrollo de semillas y polen
Invertasa neutra Neuto bsico Neutro Citoplasma Desconocida
Figura 12. Localizacin subcelular, propiedades y funciones de las distintas isoformas

de invertasas. Tomado de Roitsch & Gonzlez 2004.
Las invertasa vacuolares y las asociadas a pared celular, tienen propiedades

enzimticas y bioqumicas similares, y muestran un elevado grado de homologa en
sus secuencias as como dos motivos aminoacdicos muy conservados. Ambos tipos
de invertasas son -fructofuranosidasas, por lo que tienen un pH ptimo cido y
son capaces de aceptar como sustrato otros fructofuranosidos aunque con una
eficiencia de hidrlisis bastante reducida. Ambas son glicoprotenas, se ha
demostrado que la inhibicin de la glicosilacin tiene como consecuencia una rpida
degradacin de una Inv-CW (Pagny et al. 2003). La actividad invertasa se inhibe
por agentes bloqueantes de grupos sulfidrlo y la funcin principal de los residuos
conservados de cistena se ha demostrado por anlisis mutacionales (Goetz &
Roitsch 2000). Las isoenzimas de las invertasas son codificadas por una familia de
genes pequea que comprende ms de dos miembros de invertasas vacuolares y
ms de seis de las asociadas a pared celular. El ADNc clonado de invertasas cidas
de plantas revela que cada isoforma es codificada por un gen diferente (Sturm
1996; Tymowska-Lalanne & Kreis 1998). Los polipptidos que codifican para estos
genes, se pueden dividir en dos clases principales con diferentes propiedades. Una
de las clases incluye a polipptidos de invertasas de pared celular con un pI bsico,
y la otra comprende polipptidos de invertasa vacuolar con un pI cido.
45
Introduccin
La estructura genmica y la organizacin intrn-exn parece estar

conservada entre los genes de invertasas de mono- y dicotiledneas. Una
caracterstica especial es la presencia de un mini exn de tan solo nueve
nucletidos que se encontr en todas y cada uno de los genes de invertasas
(Lorenz et al. 1995; Simpson et al. 2000). Este mini exn codifica tres aminocidos
de la secuencia conservada N-DPN-G/A que abarca tres exones y que se
encuentra en invertasas de plantas, bacterias y levaduras. Las secuencias
genmicas en tandem de las Inv-CWs de patata y tomate parecen conservarse en
otras especies (Fridman & Zamir 2003; Proles et al. 2003), y la insercin de un
transposn se ha identificado en el primer intrn largo de una Inv-V de zanahoria
(Yau & Simon 2003) y de una Inv-CW (Lin5) de tomate (Proels & Roitsch 2006).
Las invertasas vacuolares son invertasas cidas solubles caracterizadas por
un pH ptimo cido (pH 5.0-5.5) y estn localizadas en la vacuola (Husain et al.
2001). Las Inv-Vs tienen extensiones N-terminales que no tienen las secuencias de
las Inv-CWs (Sturm & Tang 1999). Estas invertasas determinan el nivel de sacarosa
almacenado en la vacuola y la movilizacin de la sacarosa para los procesos
metablicos.
Las invertasas asociadas a pared celular, tambin llamadas extracelulares,
opoplsticas, periplsmicas invertasas del espacio libre, se caracterizan por un pH
ptimo bajo (pH 3.5-5.0), un alto punto isoelctrico y por estar inicamente unidas
a la pared celular. Como originalmente sugiri Eschrich (1980), las Inv-CWs
hidrolizan sacarosa que difunde que es transportada por un transportador de
sacarosa desde los elementos cribosos del floema hasta el apoplasto. Los productos
de la hidrlisis se transportan al interior de las clulas sumidero a travs de
transportadores de hexosas. La unin funcional de los transportadores de hexosas y
las Inv-CWs (Roitsch & Tanner 1996) se verifica por una co-expresin especfica de
tejido (Weber et al. 1997; Weschke et al. 2003) y por una regulacin coordinada
(Ehne & Roitsch 1997a; Fotopoulos et al. 2003). Mientras que se requiere una ruta
apoplstica para clulas que estn aisladas simplsticamente como polen y clulas
guarda, cada vez parece estar ms claro que las Inv-CWs tambin son importantes
en tejidos sumidero con conexiones simplsticas.
El otro motivo aminoacdico conservado es WECP/V, en el que todas las
invertasas vacuolares poseen un residuo de valina (V), mientras que todas las
invertasas extracelulares se caracterizan por un residuo de prolina (P). Ese nico
aminocido diferencial determina el pH ptimo ms cido de las Inv-CWs y su
especificidad de sustrato (Goetz & Roitsch 1999). Sin embargo, se han clonado
algunas Inv-CWs que se caracterizan por un punto isoelctrico cido, apoyando la
idea de un segundo tipo de invertasas de pared celular que no estn inicamente
46
Introduccin
unidas a la pared celular (Ehne & Roitsch 1997b; Kim et al. 2000; Hirose et al.
2002).
El tercer tipo de invertasas, las neutras, conocidas tambin como
citoplasmticas alcalinas por su pH ptimo de 6.8-8.0 y su localizacin subcelular
(el citosol). La informacin disponible sobre su funcin fisiolgica es muy limitada,
porque tiene baja actividad enzimtica que se pierde rpidamente, y solo se han
clonado y caracterizado muy pocas invertasas de este tipo como la del hipocotilo de
soja (Chen et al. 1992), la de los cotiledones de Vicia faba (Ross et al. 1996), en
las races de Cichorium (Van den Ende et al. 1996), la de zanahoria (Lee & Sturm
1996), y ms recientemente hay datos de este tipo de invertasas en azcar de caa
(Bosch et al. 2004). Su funcin especfica es no se conoce actualmente (Sturm
1999; Roitsch & Gonzlez 2004), se consideran enzimas de mantenimiento
implicadas en la degradacin de sacarosa cuando las actividades de la invertasa
cida y la sacarosa sintasa son bajas. A diferencia de las invertasas cidas, no
estn glicosiladas, y preferencialmente solamente hidrolizan sacarosa por lo que
no son fructofuranosidasas. Su actividad, se inhibe fuertemente por los productos
resultantes de la hidrlisis pero no se afecta por metales pesados, lo que sugiere un
sitio cataltico distinto. Las pocas secuencias disponibles de invertasas neutras son
altamente homlogas, con un elevado grado de conservacin en la parte C-
terminal, pero muestran poco homologa con las invertasas vacuolares y las de
pared celular. Las invertasas neutras slo se han encontrado en cianobacterias y
plantas, lo que sugiere que las Inv-Ns de las plantas modernas deben de haberse
originado a partir de un gen ortlogo procariota despus de la endosimbiosis
(Vargas et al. 2003).
Las invertasas de plantas, estn bajo el control de una variedad de
mecanismos reguladores. El principal mecanismo que determina los niveles de
invertasas es un mecanismo de regulacin transcripcional muy sensible. Esto se
aplica tanto para la expresin especfica segn el estado de desarrollo y el tejido,
como para la regulacin por diversos estmulos internos y externos. Los estmulos
internos incluyen los azcares que se generan directa indirectamente como
consecuencia de su propia expresin. Distintas Inv-CWs se inducen
metablicamente por glucosa, lo que se proporciona por un mecanismo de retro-
alimentacin positiva que es relevante incluso para la regulacin por otros
estmulos: la induccin de una Inv-Cw por alguna clase de estmulos puede ser
mantenida o amplificada debido a la seal que proporciona los azcares generados
por la elevada actividad invertasa, para ms tarde aumentar el flujo de asimilados
(Figura 12) (ver detalles en Roitsch et al. 2003). Diferentes miembros de la familia
muestran respuestas contrarias a estmulos particulares y la expresin del mismo
47
Introduccin
gen puede variar mucho en los distintos tejidos. Se han identificado muchos
mecanismos diferentes en la regulacin de la expresin y de la actividad de las
invertasas, incluyendo una formacin transcripcional diferencial (Cheng et al.
1999), reorganizacin de exones (Bournay et al. 1996), inhibicin por inhibidores
de protenas de plantas (Rausch & Greiner 2004), y un mecanismo nuevo que
controla la compartimentacin y la degradacin (Rojo et al. 2003). El amplio rango
de mecanismos reguladores confirma la idea de que las invertasas tienen un papel
principal en el metabolismo de las plantas.
El transporte a larga distancia de asimilados fotosintticos desde las hojas
fuente hasta los rganos sumidero, se da gracias a las diferencias en los
potenciales osmticos. Por lo tanto, la hidrlisis de sacarosa por la invertasa de
pared celular localizada en la descarga del floema y la metabolizacin de los
productos de la hidrlisis, controlan la fuerza sumidero para atraer la sacarosa
(Eschrich 1980). Se demuestra as, una funcin de las invertasas en la distribucin
de carbohidratos en la planta. El papel esencial de las Inv-CWs en la regulacin de
la descarga del floema y en la fuerza sumidero que ha sido analizada en plantas
transgnicas de zanahoria, demostrando la importante funcin de stas invertasa
en la distribucin de la sacarosa (Tang et al. 1999). Juegan tambin un papel muy
importante en el suministro de carbohidratos en el polen (Goetz et al. 2001).
Varios estudios recientes indican que las invertasas deben estar implicadas
en una gran variedad de procesos que incluyen la formacin de metabolitos
secundarios (Baumert et al. 2001; Arnold & Schultz 2002), interacciones planta-
herbvoros (Rehill & Schultz 2003), respuesta a estrs salino (Fukushida et al.
2001; Balibrea et al. 2003), funcin en las hojas fuente (Kingston-Smith et al.
1999), en las interacciones planta-patgeno (Roitsch et al. 2003), y en
interacciones simbiticas tales como micorrizas (Blee & Anderson 2002) e
interacciones planta-rhizobium (Chopra et al. 2003). Estos descubrimientos apoyan
la sugerencia de que las invertasas tienen un papel en aspectos adicionales del
metabolismo y desarrollo de las plantas, aunque son necesarios ms estudios para
elucidar el significado fisiolgico en estos sistemas.
3.3.2.2. Sacarosa sintasa
La sacarosa sintasa cataliza la otra posible ruta de hidrlisis de sacarosa del
citosol, convirtiendo la sacarosa en UDP-glucosa y fructosa. La UDP-glucosa
formada se convierte en glucosa-1-fosfato por la UDP-glucosa pirofosforilasa, que
son las hexosas-fosfato que toman preferencialmente los amiloplastos de los
tejidos no verdes para ser utilizadas en reacciones posteriores relacionadas con la
sntesis de almidn. En especies monocotiledneas, la sacarosa sintasa est
codificada por dos loci no allicos que se expresan diferencialmente (sus1 y sus2).
48
Introduccin
En arroz se ha identificado un tercer gen sus3 (Huang et al. 1996). La mayora de

las especies dicotiledneas tambin tienen dos genes no allicos de sacarosa
sintasa, que son funcionalmente anlogos a las dos clases de genes de las
monocotiledneas (Fu et al. 1995). Sin embargo, en legumbres slo se ha
identificado un solo gen sus.
Las distintas isoenzimas exhiben diferente expresin espacial y temporal en
la planta (Chen & Chourey 1989), y se regulan de forma diferente tanto a nivel de
la transcripcin como a nivel de la traduccin. A nivel transcripcional, los genes de
la sacarosa sintasa que se inducen por la escasez de carbohidratos, suelen ser los
que se inducen ms intensamente por la falta de oxgeno, confiriendo por su patrn
de expresin prioridad para el importe de sacarosa y la supervivencia a los tejidos
clave (Koch 1996; Zeng et al. 1998; Koch et al. 2000). Las protenas de la
sacarosa sintasa estn expuestas a una fosforilacin reversible de la protena
pasando de ser una protena asociada a membrana a ser una protena soluble que
puede interactuar con el citoesqueleto cuando se foforila. La sacarosa sintasa
tambin se regula por su localizacin subcelular como se resume en la figura 13, y
tambin se regula a nivel de la degradacin de la protena (Koch 2004). Tal
esfuerzo en la regulacin de la expresin gnica y en la localizacin de un enzima
sugiere un papel principal en el metabolismo de la planta. De hecho, la actividad de
la sacarosa sintasa se ha relacionado con la sntesis de almidn (Djardin et al.
1997), la sntesis de la pared celular (Chourey et al. 1998; Nakai et al. 1999), y la
fuerza sumidero (Sun et al. 1992; Zrenner et al. 1995).
Recientes avances indican que el papel de la sacarosa sintasa en el importe
de la sacarosa debe implicar una doble capacidad para dirigir el carbono tanto hacia
la biosntesis de polisacridos como hacia una ruta de respiracin (Koch 2004)
(Figura 13). La funcin de la sacarosa sintasa en los procesos de biosntesis, est
respaldada por pruebas que demuestran su contribucin en la formacin de la
pared celular en mutantes de maz (Winter & Huber 2000; Cheng et al. 1996), en
plantas de zanahoria (Sturm & Tang 1999), y en semillas de algodn (Ruan et al.
2003). Anlisis adicionales de plantas mutantes y anti-sentido que tenan reducida
su expresin de sacarosa sintasa (ver revisin en Koch & Zeng 2002), mostraban
que stas plantas tenan de forma notable menos almidn en sus rganos de
reserva (por ejemplo races de zanahoria y tubrculos de patata). El producto UDP-
glucosa de la sacarosa sintasa se ha implicado en la formacin del almidn (Asano
et al. 2002), en la sntesis de callos (Subbaiah & Sachs 2001; Salnikov et al. 2003),
y de diversos polisacridos de pared celular (Doblin et al. 2002; Albrecht &
Mustroph 2003). La actividad gnica de esta enzima se ha relacionado con la fuerza
sumidero ejercida en frutos de tomate (Wang et al. 1993), y la distribucin de los
49
Introduccin
ARNs mensajeros muestran por hibridacin in situ que est estrechamente

relacionada con la distribucin del almidn en frutos jvenes (Wang et al. 1994).
Adems, es el ms activo de los genes implicados en el metabolismo carbonado en
tubrculos de patata inmaduros (Li 2001).
Figura 13. Regulacin de la sacarosa

sintasa por su localizacin subcelular.
(a) Asociacin entre sacarosa sintasa
y el complejo celulosa sintasa de
membrana plasmtica. (b)
Caractersticas bioqumicas del
complejo. (c) Asociaciones de la
sacarosa sintasa con membranas y/o
la actina como: biosntesis de pared
celular (en la membrana plasmtica y
Golgi), biosntesis de almidn (en los
plastidios), canales metablicos (un
proceso relacionado con la actina), y
posiblemente compartimentacin y/o
movilizacin (implicando el tonoplasto
o la membrana plasmtica de los
tubos cribosos). El estatus celular de
azcar, el estado de desarrollo, y la
fosforilacin, parecen influir en el
paso de la sacarosa sintasa desde la
forma citoplasmtica a la forma unida
a la membrana. Tomado de Koch
2004.
50
Introduccin
Figura 14. Metabolismo de la sacarosa en los elementos de los tubos cribosos del
floema. (a) Localizacin de la sacarosa sintasa en los elementos de los tubos
cribosos. (b) Modelo de regulacin del uso de la sacarosa en el interior de los tubos cribosos,
integrando informacin reciente sobre la localizacin celular y subcelular de ste azcar
gracias a los resultados de los anlisis de los cambios metablicos en el flujo del floema
(Lerchl et al. 1995; Fernie et al. 2002) y en el medio ambiente interno (van Dongen et al.
2003). Tomado de Koch 2004.
Las sacarosas sintasas pueden ser centrales en la eficacia de algunas

simbiosis como por ejemplo en los ndulos fijadores de nitrgeno (Gordon et al.
1999; Xie et al. 2003), y se han implicado en el mantenimiento de otras como por
ejemplo las micorrizas. Una mutacin que reduce los niveles de sacarosa sintasa en
semillas de guisante, inhibe la fijacin de nitrgeno en los ndulos (Gordon et al.
1999); inversamente, en ndulos de soja incapaces de fijar nitrgeno no hay
induccin de sacarosa sintasa (Xie et al. 2003). La sacarosa sintasa y la invertasa
vacuolar se inducen especficamente en clulas de races que contienen arbsculos
51
Introduccin
(Blee & Anderson 2002), y algunas veces incluso en clulas adyacentes (Hohnjec et
al. 2003), y sta induccin ocurre en los estados iniciales del desarrollo de la
simbiosis (Ravnskov et al. 2003).
La sacarosa sintasa ha sido implicada en el desarrollo de la planta, as como
en el importe de sacarosa por diversos tejidos sumidero, e incluso ha sido
inmunolocalizada el los elementos de lo tubos cribosos y en las clulas
acompaantes, dndole a la hidrlisis de sacarosa una funcin ms directa en los
tubos cribosos que la que se le haba dado previamente (ver revisin Koch 2004).
3.3.2.3. Enzimas que degradan sacarosa y micorrizas
El efecto del desarrollo de la simbiosis micorrcico arbuscular sobre la
actividad y la expresin de las enzimas que degradan sacarosa no est demasiado
claro: no se han observado cambios en la actividad de la invertasa soluble cida en
maz, alubias rojas y habas, ni de la sacarosa sintasa en alubias rojas
(Schellenbaum et al. 1998; Blee & Anderson 2002), mientras que los transcritos de
invertasa cida soluble y sacarosa sintasa se concentran en clulas de alubia roja
colonizadas por arbsculos (Blee & Anderson 2002). Por el contrario, se observ un
incremento en las actividades de invertasas y sacarosa sintasa en las races de
trbol inoculado con una mezcla de hongos micorrcico arbusculares, aunque estas
races tambin tenan ndulos y la contribucin de cada simbionte a la alteracin de
las actividades de hidrlisis de la sacarosa no estaba bien definida (Wright et al.
1998). La expresin de genes que codifican para sacarosas sintasas se puede
tambin ver afectada de forma diferente por la inoculacin, como en el caso del
maz (Ravnskov et al. 2003). Eliminando el efecto de la nodulacin sobre la
hidrlisis de sacarosa en las races de leguminosas, Schubert et al. (2003),
mostraron que en soja (Glicine max), la colonizacin fngica de las races
incrementa la actividad invertasa alcalina, mientras que no haba diferencias en las
actividades de las invertasas solubles y las cidas asociadas a pared celular entre
plantas micorrizadas y no micorrizadas. Y la actividad de la sacarosa sintasa
comenz a ser significativamente mayor en plantas micorrizadas slo 40 das
despus de la germinacin.
3.4. Fructanos
Los fructanos son oligmeros o polmeros de fructosa que los sintetizan un
pequeo nmero de plantas y bacterias. La mayora de las plantas almacenan
almidn (almacenado de forma insoluble en el amiloplasto o temporalmente en el
cloroplasto) sacarosa (disuelta en grandes cantidades en la vacuola) como
carbohidratos de reserva, pero existen tambin los fructanos aunque son menos
conocidos. Son polisacridos no estructurales solubles en agua. Estn presentes en
52
Introduccin
el 15% de las especies de plantas con flores las cuales pertenecen principalmente a
las Asterceas, Campunalceas y Boraginceas (dicotiledneas), y a las Poceas y
Liliceas (monocotiledneas) (Hendry 1993). Los fructanos son polmeros de
fructosa lineares y ramificados, que se sintetizan aadiendo mediante enlaces
(2,1)- (2,6)- unidades de fructosa a tres trisacridos bsicos (1-kestosa, 6-
kestosa y neokestosa); stos trisacridos bsicos se producen por la unin de una
fructosa a uno de los tres grupos hidroxilo primarios de la sacarosa vacuolar (Figura
15). Las siguientes elongaciones ocurren por fructosil-tranferasas especficas. Los
fructanos lineares tipo (2,1) (inulinas, en especies dicotiledneas) y tipo (2,6)
(levanos, en monocotiledneas y bacterias), son los fructanos ms simples y los
ms estudiados (Edelman & Jefford 1968; Van Laere & Van den Ende 2002;
Ritsema & Smeekens 2003). Ya que los fructanos tienen como substrato para su
sntesis la sacarosa que se almacena en la vacuola, tambin ellos se almacenan en
se orgnulo celular. Pero a diferencia de la sacarosa que se sintetiza en el
citoplasma, los fructanos se sintetizan en la vacuola por la accin de enzimas
especficas (fructosiltransferasas) que transfieren fructosa desde la sacarosa para la
elongacin de la cadena de fructano.
53
Introduccin
Figura 15. Modelo de la enzimologa de la biosntesis y degradacin de fructanos en

plantas. Los tres fructanos bsicos que son los trisacridos: (a) 1-kestosa, (b) 6-kestosa y
(c) neokestosa, se producen por el enlace de una fructosa a uno de los tres grupos hidroxilos
primarios de la sacarosa. Tomado de Van den Ende et al. 2004.
La variabilidad entre especies e incluso la especificidad de tejidos en la

estructura de los fructanos y en su grado de polimerizacin, se puede atribuir
principalmente a las diferencias en las fructosil transferasas (Hellwege et al. 2000;
Pavis et al. 2001; Vergauwen et al. 2003). Los fructanos pueden ser considerados
como una extensin de la sacarosa vacuolar (Wiemken et al. 1995), lo que se
demostr cuando se sintetizaban fructanos en el azcar de remolacha que es una
especie que almacena sacarosa, tras la introduccin de fructosil transferasas
(Svenier et al. 1998; Weyens et al. 2004). En plantas, la sntesis de fructanos a
partir de sacarosa, necesitan la accin de dos o ms fructosiltransferasas diferentes
(ver proceso en Vijn & Smeekens 1999). El modelo clsico de Edelman & Jefford
(1968) implica a dos enzimas en la sntesis de la forma ms simple de fructanos, la
inulina. La primera enzima (1-SST) cataliza la transferencia de un residuo fructosil
de una molcula de sacarosa a otra molcula de sacarosa, formandose el
trisacrido 1-kestosa, y la segunda enzima (1-FFT) transfiere residuos de fructosa
desde una molcula de fructano con un grado de polimerizacin 3 a otra molcula
de fructano o a la sacarosa. La accin de estas dos enzimas da como resultado una
mezcla de fructanos con cadenas de distintas longitudes. ste modelo se ha
demostrado 30 aos ms tarde que es correcto (Koops & Jonker 1996; Lscher et
al. 1996: Van den Ende & Van Laere 1996).
Se han aislado los ADNc que codifican para 1-SST y 1-FFT de varias especies
de plantas (ver revisin Vijn & Smeekens 1999). Recientemente se ha descrito la
clonacin y el anlisis funcional de una 1-FFT de alto grado de polimerizacin de
Echinops ritro (una Astercea), mostrando que la enzima recombinante tiene
propiedades similares a la enzima nativa, y que produce fructanos tipo inulina de
elevado grado de polimerizacin in vitro parecidos a los producidos in vivo (Van den
Ende et al. 2006). Una pregunta a resolver desde hace mucho tiempo, es cmo se
determina la longitud de la cadena de los fructanos. Parece ser que el tamao de
los polmeros producidos por la planta, depende principalmente de la actividad
enzimtica de sus 1-FFTs (Vijn & Smeekens 1999), aunque no se puede excluir el
papel de las fructoexohidrolasas en la definicin del tamao final de la cadena
(Hellwege et al. 1998).
54
Introduccin
1-SST: G1-2F +G1-2F G1-2F1-2F +G

sacarosa +sacarosa 1-kestosa +glucosa
1-FFT: G1-2F(1-2F)m + G1-2F(1-2F)n G1-2F(1-2F)m-1 + G1-2F(1-2F)n+1

Elongacin de la cadena de fructano, m>0 y n0
6-SFT: G1-2F + G1-2F1-2F G1-2F1(6-2F)-2F +G

sacarosa + 1-kestosa bifurcosa +glucosa
G1-2F + G1-2F G1-2F6-2F +G

sacarosa + sacarosa 6-kestosa +glucosa
6G-FFT: G1-2F + G1-2F1-2F F2-6G1-2F +G1-2F

sacarosa + 1-kestosa neokestosa +sacarosa
FEH: G1-2F(1-2F)n G1-2F(1-2F)n -1 +F

Fructano, n >0 fructano +fructosa
Figura 16. Actividades enzimticas de las distintas fructosiltransferasas de planta

implicadas en la sntesis de fructanos, y de la fructoexohidrolasa, enzima implicado
en la degradacin de fructanos.
Los fructanos pueden suponer ms de 80% del peso seco de las plantas que
los sintetizan (Edelman & Jefford 1968). Los enlaces finales fructosil-fructosa
pueden ser degradados por fructano exohidrolasas (FEHs), que es lo que ocurre en
bacterias, hongos y plantas que contienen fructanos. Pero inesperadamente, se ha
encontrado, que plantas que no sintetizan fructanos como Beta vulgaris y
Arabidosis thaliana que aparentemente carecen de fructanos endgenos, tambin
tienen FEHs. La hidrlisis de todos los tipos de fructanos se lleva acabo por la
accin combinada de fructano-1-exohidrolasas inulinasa (1-FEH), y por fructano-
6-exohidrolasas levanasa (6-FEH). Ambas enzimas degradan fructosas
terminales. La mayora de las FEHs de plantas carecen de actividad invertasa
generando por tanto una molcula de sacarosa como producto final. Debido a que
degradan los fructanos endgenos, las FEHs de plantas que contienen fructanos,
desempean una gran variedad de funciones: (i) hidrolizan fructanos de reserva
siempre que sea necesaria energa (Morvan-Bertrand et al. 2001; Van den Ende et
al. 2001); (ii) aumentan rpidamente la presin osmtica (por ejemplo en la
apertura de la flor de Campanula) (Vergauwen et al. 2000); (iii) incrementan las
concentraciones de oligofructanos en condiciones de estrs (Van den Ende et al.
1996), con una posible contribucin a la tolerancia al fro a travs de la
estabilizacin de membranas (Hincha et al. 2000; Vereyken et al. 2003; Michiels et
55
Introduccin
al. 2004); y (iv) deben hidrolizar parcialmente sustratos de fructanos durante el

proceso de biosntesis de fructanos en trigo (proceso de ajuste) (Ven den Ende et
al. 2003). La mayora de estas FEHs se inhiben por sacarosa in vitro (Van den Ende
et al. 2001; Van den Ende et al. 2003) y por lo tanto, se deben inactivar en
condiciones de no estrs in vivo.
3.4.1. Relacin de las FEH y las fructosiltransferasas con las invertasas
Las primeras FEHs de plantas clonadas fueron las de la endibia (Van den
Ende et al. 2000; Van den Ende et al.2001) y la del trigo (Van den Ende et al.
2003). El retraso en la clonacin de FEH probablemente se ha debido a que los
bilogos moleculares estaban enfocando la idea de la bsqueda de candidatos para
FEH en genes como las invertasas vacuolares. De hecho, la clonacin de ADNc de
una fructosil transferasa demostr que estaba estrechamente relacionada con las
invertasas vacuolares (Ritsema & Smeekens 2003), y los experimentos de
aislamiento de vacuolas demostraron que los fructanos y las enzimas implicadas en
su metabolismo (fructosil transferasas y FEHs) estaban presentes en la vacuola
(Wiemken et al. 1986; Darwen & John 1989). Sorprendentemente, con la
purificacin nativa de las FEHs de endibia y su posterior clonacin, se encontr que
las secuencias aminoacdicas de las FEHs estaban muy relacionadas con las
invertasas de pared celular ms que con las invertasas vacuolares, en contraste con
su localizacin vacuolar (Wiemken et al. 1986; Darwen & John 1989). Esto pone de
manifiesto que no se puede confiar solo en la informacin de la secuencia para
predecir la localizacin de una protena. Filogenticamente, estn en un subgrupo
distinto entre los llamados invertasas del tipo de pared celular. El punto isoelctrico
caracterstico de las FEHs es bajo (Ven den Ende et al. 2003b), en contraste con las
invertasas de pared celular que tienen un punto isoelctrico alto para unirse a los
componentes cidos de la pared celular.
Anlisis bioqumicos de las fructosiltransferasas han mostrado que algunas
de estas enzimas tienen incluso actividad para hidrolizar sacarosa (actividad
invertasa) (por ejemplo la 6-sacarosa-fructosiltransferassa de cebada; Sprenger et
al. 1995). Tambin, a altas concentraciones de sacarosa, la mayoria de las
invertasas tienen actividad 1-sacarosa-sacarosa-transferasa (Obenland et al. 1993;
Vijn et al. 1998). Con estos datos, no sorprende que la comparacin de las
secuencias de amino cidos de fructosiltransferasas e invertasas de plantas revelen
un alto grado de identidad. La mayor homologa se da entre las
fructosiltransferasas y las invertasas cidas. El aminocido implicado en la hidrlisis
de la sacarosa es el Asp (D) de la secuencia de unin a la sacarosa NDPNG y el Glu
(E) en la secuencia WECP/VD. Estos aminocidos estn conservados en las
invertasas y en las fructosiltransferasas de plantas, lo que sugiere que tienen un
56
Introduccin
mecanismo anlogo para la hidrlisis de la sacarosa, aunque los aminocidos

implicados en la actividad fructosiltransferasa no se conocen todava. La estrecha
relacin entre invertasas y fructosiltrasferasas a nivel bioqumico y molecular, es
una fuerte evidencia de que las fructosiltransferasas evolucionaron a partir de las
invertasas por unas pocas mutaciones. Filogenticamente, los grupos de
fructosiltransferasas e invertasas vacuolares estn juntos, mientras que las
invertasas de pared celular forman un grupo separado.
3.4.2. FEHs en plantas que no sintetizan fructanos
La deteccin de elevados niveles de actividad FEH junto con la completa
ausencia de fructanos en hojas de endibia (planta que sintetiza fructanos)
etioladas (Van den Ende et al. 2001), sugera una funcin alternativa de estas
enzimas. stos datos inspiraron en la bsqueda de actividades FEH en plantas que
no contienen fructanos (Van den Ende et al. 2004). En esta lnea, recientemente se
ha demostrado que dos de los seis genes que posiblemente codificaban para
invertasas de pared celular de Arabidopsis thaliana (AtcwINV3 y 6) en realidad
tienen actividad FEH. La expresin heterloga en Pichia pastoris demuestra que
AtcwINV3 es una 6-FEH y AtcwINV6 es una FEH que puede degradar tanto
fructanos tipo inulina como los tipo levanos (De Coninck et al. 2005). Van den Ende
et al. (2003b) tambin describe la inesperada presencia de 6-FEHs en Beta vulgaris
(azcar de remolacha) que es una planta que no sintetiza fructanos mediante el
anlisis funcional de un gen que es como las invertasas de pared celular.
El papel de estas FEHs en las plantas que no sintetizan fructanos no est
claro. Los sustratos de este tipo de FEHs probablemente no sean endgenos, ya
que no hay evidencias de genes de fructosiltransferasa en el genoma de
Arabidopsis y no se han detectado tampoco fructanos ni en Arabidopsis ni en el
azcar de remolacha (Van den Ende et al. 2003b). La funcin ms convincente para
una FEH en estas condiciones, podra ser la de degradar fructanos de
microorganismos. Es posible que participen en la hidrlisis de los exudados que
contienen levanos que rodean a las bacterias endofticas o fitopatgenas como
Pseudomonas Erwinia (Hettwer et al. 1995; Bereswill et al. 1997). Un papel como
componente relacionado con la defensa parece convincente, ya que los levanos
forman una capa que separa a la bacteria y a los polmeros de la pared celular de la
planta durante las fases iniciales de la infeccin, lo que previene al patgeno de ser
reconocido por la planta. De esta manera, la planta prevendra la formacin de
levanos y haciendo esto, la infeccin. Se ha hipotetizado tambin que la FEHs
podran estar implicadas en el establecimiento de la simbiosis entre las plantas las
bacterias endofticas (Tallgren et al. 1999; Hernandez et al. 2000). Se ha
especulado que los derivados de la sacarosa u homlogos como la 6-kestosa y la
57
Introduccin
trealosa, actan como seales que son capturadas por sensores especficos, por lo
que esta seal tendra que ser destruida despus de ser recibida, y esta funcin la
podran llevar a cabo enzimas altamente especficas como la 6-FEH.
3.4.3. Fructosiltransferasas
3.4.3.1. En plantas
Las fructosiltransferasas al igual que las invertasas vacuolares, pertenecen a
la familia 32 de las glicosil hidrolasas. En las invertasas la secuencia llamada de
unin a la sacarosa est muy conservada: H-X-X-P-X-X-X-X-[LIVM]-N-D-P-N-[GA].
El motivo NDPNG/A de dicha secuencia, es llamado motivo -fructosidasa, que
contiene el residuo esencial de Asp que probablemente acta como nuclefilo. En
las fructosiltransferasas la secuencia de unin a la sacarosa est presente aunque
con algunas variaciones, especialmente en el motivo -fructosidasa, donde la
secuencia consenso es diferente: H-X-X-[PTV]-X-X-X-X-[LIVMA]- [NSCAYG]- [DE]-
P-[NDSC]- [GA] (Pons et al. 2000). Las secuencias de unin a la sacarosa de
enzimas procedentes de plantas diferentes pero codificando la misma especificidad
enzimtica, son a menudo ms homologas que las que pertenecen a la misma
planta pero codifican distintas actividades enzimticas (Ritsema & Smeekens 2003).
Ritsema et al. (2004) estudiaron la importancia del motivo -fructosidasa de la 6G-
FFT mediante el uso de mutantes, mostrando que dicho motivo es muy importante
en la determinacin del sustrato a utilizar y por lo tanto es especfico del tipo de
fructano que se sintetiza.
Recientemente, se han llevado a cabo muchos estudios con la clonacin
molecular de genes para investigar la evolucin y la funcin de las
fructosiltransferas en la biosntesis de fructanos, y para mejorar los potenciales
biolgicos de las plantas con enzimas como 1-SST (de Halleux & van Custsem
1997; Hellwege et al. 1997), 1-FFT (Hellwege et al. 1998; van der Meer et al.
1998), 6G-FFT (Vijn et al. 1997), y sacarosa:fructano 6-fructosiltransferasa (6-SFT;
Sprenger et al. 1995; Kawakami & Yoshida 2002). Un ADNc codificante para una
6G-FFT de cebolla se haba presentado como un gen de una 6G-FFT (Vijn et al.
1997). La enzima recombinante de cebolla tena actividad 1-FFT con actividad 6G-
FFT, lo que estaba de acuerdo con los resultados de la purificacin nativa de la 6G-
FFT de bulbos de cebolla (Fujishima et al. 2005). Sin embargo, la 6G-FFT purificada
de races de esprrago (Shiomi 1981) mostraba actividad 6G-FFT aunque no
mostraba actividad invertasa, 1-SST, ni 1-FFT. Ms tarde, la clonacin de un ADNc
que codifica para una 6G-FFT de hojas de esprrago, demuestra que el sistema
enzimtico en esprrago es diferente al de cebolla (Ueno et al. 2005).
58
Introduccin
3.4.3.2. En hongos
Poco se conoce sobre el significado fisiolgico de los fructanos en los hongos,
aunque se han identificado varias cepas de hongos que sintetizan tanto fructanos
de bajo como de elevado peso molecular. Se ha clonado una fructosiltransferasa de
Aspergillus foetidus (Rehm et al. 1998) que produce el trisacrido 1-kestosa, y se
ha puesto de manifiesto la produccin de fructooligosacridos por parte de
Aspergillus niger (Hirayama et al. 1989) y Fusarium oxysporum (Patel et al. 1997).
La sntesis de inulinas de elevado peso molecular fue demostrada para Penicillium
chrysogenum (Olah et al. 1993) y Aspergillus sydowi IAM 2544 (Kawai et al. 1973;
Harada et al. 1994).
La fructosiltransferasa de A. sydowi es particularmente interesante, ya que
se ha observado que sintetiza distintos productos bajo diferentes condiciones
experimentales. Heyer & Wenderburg (2001) demostraron tras la purificacin de
una fructosiltransferasa de las conidias de A. sydowi IAM 2455, la obtencin de la
secuencia peptdica y la correspondiente clonacin del ADNc, que la expresin en
varios sistemas heterlogos de se ADNc, depende en gran medida de las
condiciones experimentales.
3.4.4. Fructanos en micorrizas arbusculares
Un estudio del efecto de las micorrizas arbusculares sobre la acumulacin de
fructanos en cebada (Hordeum vulgare) muestra que las cantidades de estos
polisacridos de reserva se alteran de forma notable en las plantas micorrizadas
(Mller et al. 1999). En las races de plantas micorrizadas no fertilizadas, las
cantidades de fructanos eran significativamente mayores que en las
correspondientes plantas no micorrizadas. Por el contrario, la fertilizacin caus un
descenso general en las cantidades de fructanos en las races, mostrando que el
efecto de la micorriza no se debe a la mejora en la nutricin de las plantas
micorrizadas (Douds et al. 1988). El incremento de fructanos en races micorrizadas
se corresponde con un descenso de la actividad invertasa, y un incremento en la
cantidad de sacarosa, lo que indica que ese exceso de sacarosa podra ser utilizado
por tanto para la sntesis de fructanos. En las hojas de cebada en general, las
cantidades de fructanos son menores o no sufren cambios con la simbiosis
micorrcica, sin embargo, mientras que en las plantas no micorrizadas las hojas
jvenes tenan un mayor contenido en fructanos que las ms viejas como ya haban
mostrado Roth et al. (1997), este gradiente se altera en plantas micorrizadas que
tienen menos fructanos que las no micorrizadas, lo que indica efectos sistmicos de
la micorriza sobre la distribucin de asimilados en parte area. Sin embargo,
cuando la planta de cebada micorrizada es atacada por patgenos, tiene mayor
59
Introduccin
contenido en fructanos, lo que compensa el ataque del patgeno, minimizando sus

efectos sobre el rendimiento de la planta (Gernns et al. 2001)
La concentracin de fructanos tambin aumentan en races de plantas
micorrizadas con la fertilizacin inicial de fsforo aunque este aumento disminuye
cuando la fertilizacin es muy elevada (Amijee et al. 1993).
Tambin hay datos sobre el contenido de fructanos en plantas micorrizadas
que son incapaces de formar fructanos, como por ejemplo en tabaco (Schellenbaum
et al. 1999), que cuando es transformado con 6-Fructosiltransferasa acumula
fructanos tanto en hojas como en races. Pero en condiciones de sequa, la
acumulacin de fructanos se afecta independientemente de la micorrizacin. Por lo
tanto, la simbiosis no tiene un papel importante en la acumulacin de fructanos
cuando las plantas transgnicas son sometidas a estrs hdrico.
3.5. Transportadores de azcares

En las plantas superiores, la fijacin del CO2 se produce principalmente en
las clulas del mesfilo de las hojas maduras. Deben existir mecanismos que
aseguren que todos los tejidos sumidero reciben una cantidad adecuadaa de
azcares para su crecimiento y desarrollo, y los transportadores de azcares tienen
un papel principal en el transporte a travs de membrana de los azcares y en su
distribucin en la planta. Las protenas transportadoras de azcares tienen un
papel crucial en la distribucin de azcares en la planta tanto a larga distancia
como entre clula-clula. En la ltima dcada de han identificado genes que
codifican para transportadores de azcares, se han expresado en sistemas
heterlogos, y se han estudiado con respecto a su distribucin espacial y temporal
(ver revisin Williams et al. 2000).
La sacarosa representa la forma principal en que se transporta el carbono
reducido, aunque algunas plantas tambin pueden transportar rafinosa, polioloes,
solutos que estn menos sujetos al metabolismo que la sacarosa.
Las plantas superiores tienen dos familias distintas de transportadores de
azcares: los transportadores de disacridos que sobre todo catalizan el transporte
de sacarosa, y los transportadores de monosacridos que median en el transporte
de una gran variedad de monosacridos. stos transportadores tienen una gran
variedad de funciones, algunos tienen un papel puramente nutricional abasteciendo
a las clulas de azcares para su desarrollo y crecimiento, mientras que otros estn
involucrados en la generacin de gradientes osmticos necesarios para el flujo.
Algunos incluso deben estar implicados en sealizacin. Hay varios niveles que
regulan el control de estos transportadores de azcares durante el desarrollo de la
planta y cuando se perturba el ambiente (Williams et al. 2000). Estudios fisiolgicos
60
Introduccin
han puesto de manifiesto que el transporte de azcares en plantas y el

metabolismo estn muy regulados por los azcares, tanto a nivel transcripcional
como a nivel post-transcripcional (revisado por Lalonde et al. 1999).
3.5.1. Transportadores de sacarosa
Aunque la sacarosa se sintetiza en el citosol, es la vacuola de las clulas del
mesfilo donde se almacena principalmente durante el da en las especies que
acumulan sacarosa durante el fotoperiodo (Gerhardt et al. 1987; Winter et al.
1994; Lohaus et al. 1996). En condiciones fisiolgicas la sacarosa est excluida de
cloroplastos y mitocondrias (Heldt & Sauer 1971), por lo que resulta sorprendente
que la expresin heterloga de una fructosiltransferasa bacteriana en el cloroplasto,
tenga como consecuencia una acumulacin de fructanos, sugiriendo la presencia de
sacarosa en el cloroplasto aunque sea en bajas concentraciones (Smeekens 1998).
En la planta, la mayor concentracin de sacarosa se encuentra en los tubos
cribosos, a travs de los cuales la sacarosa se transporta desde los tejidos fuente a
los sumidero conducida por un gradiente osmtico. En los tubos cribosos, el rango
de la concentracin de sacarosa es de 200 a 1600 mM, mostrando incluso
concentraciones mayores durante el periodo de luz, y concentraciones menores
durante la noche (Kallarackal et al. 1989; Winzer et al. 1996). La
compartimentacin de la sacarosa necesita de su transporte a travs de las
membranas celulares tanto intra como extracelularmente, transporte que es llevado
a cabo por protenas transportadoras especficas.
El transporte a larga distancia de la sacarosa, depende de una familia de
protenas que actan como portadores de sacarosa. De acuerdo con los distintos
pasos a travs de membrana mediados en plantas, los transportadores de sacarosa
pueden ser de tres tipos: transportadores de influjo de membrana plasmtica
responsables de la entrada de sacarosa en el interior de las clulas y que son del
tipo simporte protn/sacarosa; transportadores del tonoplasto propuestos para
trabajar en el antiporte sacarosa/protn (Briskin et al. 1985) ya que la vacuola es
cida comparada con el citoplasma; y finalmente, transportadores de flujo de
membrana plasmtica como por ejemplo, para la descarga de la sacarosa en los
tejidos sumidero para la salida de la sacarosa desde el mesfilo de las clulas que
estn en las inmediaciones del floema.
Estudios recientes, han demostrado que las protenas transportadoras de
sacarosa especficas tiene un papel esencial en la descarga de la sacarosa en el
interior de los componentes del floema de las plantas vasculares (ver revisin
Truernit 2001). La existencia de varias secuencias relacionadas ya conocidas
como transportadores de sacarosa en la base de datos de Arabidopsis, indica que
en una planta hay una familia gnica de transportadores de sacarosa. El nmero
61
Introduccin
total de genes que la componen no se conoce todava ya que ir creciendo al

tiempo que se hallen nuevas secuencias. Como en el caso de los transportadores de
hexosas, el patrn de expresin de algunos transportadores est muy restringido a
ciertos tipos celulares fases de desarrollo, lo que hace ms difcil su localizacin.
Por todo esto, los estudios de estructura y funcin de los transportadores de
sacarosa estn an en sus inicios (ver revisin Lemoine 2000).
Todos los transportadores de sacarosa (SUT) identificados hasta ahora,
estan codificados por la familia gnica SUT (revisado en Lalonde et al. 1999), son
dependientes de energa y son sensibles a los protonforos, lo que indica que
funcionan en simporte con protones. Los genes SUT codifican protenas muy
hidrofbicas que contienen 12 dominios transmembrana, y estn relacionados
distantemente con la familia de transportadores de hexosas encontrada en muchos
organismos tales como levaduras y plantas (revisado en Ward et al. 1997; Rentsch
et al. 1998).
En hojas, la cintica de la absorcin de sacarosa, implica componentes de
alta y baja afinidad. Se ha identificado una familia de SUT con componentes de baja
y alta afinidad: SUT1, transportador de alta afinidad esencial para la carga del
floema y el transporte a larga distancia en solanceas (Riesmeier et al. 1994; Khn
et al. 1997); SUT4, transportador de baja afinidad con un patrn de expresin
similar a SUT1 (Weise et al. 2000) localizandose ambos en los elementos de los
tubos cribosos; y SUT2 recientemente descrito (Barker et al. 2000) en tomate y
Arabidopsis, y que debe estar implicado directamente en el control de la expresin,
de la actividad y del reciclaje de los otros dos transportadores SUT1 y SUT4,
contolando el flujo de sacarosa a travs de la membrana plasmtica de los
elementos de los tubos cribosos.
3.5.2. Transportadores de monosacridos
Se han identificado actividades de transporte de monosacridos en gran
variedad de especies plantas (Maynard & Lucas 1982; Getz et al. 1987; Gogarten &
Bentrup 1989; Tubbe & Buckhout 1992). Los sustratos que transportan
eficientemente son: D-glucosa, 3-O-metil D-glucosa, 2-deoxi D-glucosa, -D-
manosa, y D-fructosa, mientras que L-glucosa y D-ribosa son sustratos
pobres para el transporte (Gogarten & Bentrup 1989). Los primeros
transportadores de monosacriodos de plantas clonados, fueron los de Chlorella
kessleri, aprovechando que se inducan de forma rpida cuando se aadan hexosas
al medio en el que creca. En contraste con los transportadores de hexosas (HXTs)
de levadura, que funcionan como uniportadores, el de C. kesseri tiene un
mecanismo de transporte de simporte (Sauer et al. 1990; Aoshima et al. 1993). A
excepcin de esta diferencia en el mecanismo de transporte, los genes
62
Introduccin
transportadores de levadura y de C. kesseri son homlogos, codificando protenas

con 12 posibles dominios transmembrana.
La familia de los trasportadores de monosacridos en Arabidopsis, est
formada por 26 genes, y mltiples genes se han aislado de otras especies de
plantas (Lalonde et al. 1999). Los patrones de expresin de distintos
transportadores de monosacridos de plantas, sugieren que estas protenas de
membrana funcionan en la absorcin de hexosas en los tejidos sumidero (Sauer &
Stadler 1993). Los anlisis de expresin muestran que los transportadores de
monosacridos de plantas estn muy regulados, por ejemplo en respuesta a la
infeccin por patgenos por heridas (Truernit et al. 1996; Fotopoulos et al. 2003),
permitiendo as una relocalizacin flexible del carbono fijado. La expresin de los
transportadores de monosacridos en los tejidos sumidero tambin ayuda a un
mecanismo apoplsmico para la descarga del floema post-floema (Sauer &
Stadler 1993). En esta situacin, los tejidos sumidero se las plantas, deben adquirir
hexosas de una manera similar a cmo lo hacen las levaduras, que usan una
invertasa extracelular para hidrolizar la sacarosa externa. Un requerimiento para
este mecanismo en el caso de las plantas, es la expresin conjunta de invertasas y
transportadores de monosacridos (Ehness & Roitsch 1997).
3.6. Metabolismo de los carbohidratos en ectomicorrizas

En la simbiosis con ectomicorrizas, las plantas incrementan su capacidad
fotosinttica para responder a la demanda de carbohidratos del hongo. A parte del
aumento de la formacin de sacarosa en las hojas, se consideran tres puntos de
control que podran limitar el drenaje de carbohidratos desde la planta: la
exportacin de sacarosa desde el floema (que no es entendido an
completamente), la hidrlisis de la sacarosa en la interfase planta-hongo, y la
competicin entre las clulas de planta y el hongo por la absorcin de
monosacridos. De los datos obtenidos hasta ahora, se deduce que la competicin
por hexosas no ocurre en la interfase planta-hongo. Adems, la actividad de la
invertasa cida de la planta que es la que genera carbohidratos disponibles para el
hongo, no parece ser la razn limitante de las ectomicorrizas de Amanita muscaria.
As, el control del drenaje de carbohidratos de la planta implica a la sacarosa que se
transfiere directamente desde el floema (ver revisin Nehls et al. 2001b).
La generacin de una fuerte fuerza sumidero de carbohidratos por las hifas
del hongo, es un proceso crucial para sostener el aporte de hexosas al hongo en los
tejidos simbiticos. Se conocen datos de cmo se genera esa fuerza sumidero y
cmo se regula a nivel fisiolgico en la planta. Sin embargo, la regulacin y la
63
Introduccin
interaccin entre las rutas del metabolismo de carbohidratos en el hongo, son an

desconocidas (ver revisin Nehls et al. 2001b).
La disponibilidad y la distribucin de azcares, tiene un papel principal en la
regulacin de las actividades fngicas en los tejidos micorrizados. La expresin
tejido-dependiente de los genes regulados por hexosas AmMst1 y AmPAL en
ectomicorrizas (Nehls et al. 2001a), es probablemente slo un ejemplo de los
mecanismos moleculares que regulan el desarrollo de la simbiosis. La induccin en
races de lamo de uno de los cinco posibles transportadores de monosacridos
(PttMST3.1) por la formacin de micorrizas, sugiere que las clulas de las races
son capaces de competir con las hifas del hongo por las hexosas del apoplasto,
volviendo a dirigir el flujo de azcares hacia las clulas de la planta siempre que el
hongo no aporte suficientes nutrientes minerales (Grunze et al. 2004).
Respecto a la actividad invertasa, no se ha detectado en el micelio de
distintos hongos ectomicorrcicos (Salzer & Hager 1991; Schaeffer et al. 1995;
Wright et al. 2000), sin embargo si se detect una estimulacin de la actividad
invertasa asociada a pared en Betuna pendula Roth. (abedul) colonizado por el
hongo ectomicorrcico Paxillus involutus (Wright et al. 2000). En el otro estudio en
el que se ha medido la actividad invertasa (Schaeffer et al. 1995), se mostraba que
la invertasa cida era la principal enzima que hidroliza sacarosa en las races de
Picea abies, pero su actividad no aumentaba con la infeccin por ectomicorrizas.
Estos datos para ectomicorrizas contrastan con la estimulacin descrita para las
actividades de las invertasas citoplasmticas y las asociadas a pared as como de la
sacarosa sintasa en respuesta a la colonizacin micorrcico arbuscular (Wright et al.
1998).
Wrigth y colaboradores (2000), mostraron que los niveles de expresin de
dos transportadores de hexosas y uno de sacarosa de la planta Betuna pendula
disminuan en races micorrizadas respecto a las no micorrizadas. Esta disminucin
de la expresin, particularmente la del transportador de sacarosa, parece
incompatible con la estimulacin del flujo de carbono hacia las races que se
produce en respuesta al aumento de la fuerza sumidero cuando se produce la
colonizacin fngica. Posibles explicaciones para esta aparente discrepancia son
que estos transportadores no estn directamente implicados en el movimiento de
carbono a la interfase simbitica, que su expresin puede estar muy localizada en
respuesta a las alteraciones en la asignacin de carbono dentro de las races
micorrizadas, que se inducen otros transportadores.
64
Introduccin
3.7. Metabolismo de los carbohidratos en tomate

A partir de cebadores degenerados basados en los motivos de aminocidos
conservados en distintas plantas, Godt & Roitsch (1997) mostraron que las
isoenzimas de invertasas extracelulares en tomate (Solanum esculentum L.),
estaban codificadas por una familia multignica que estaba formada por cuatro
miembros que no se haban descrito hasta entonces: Lin5, Lin6, Lin7, y Lin8.
Previamente se haba clonado la invertasa vacuolar TIV1 (Klann et al. 1992; Elliott
et al. 1993). Las secuencias de aminocidos deducidas de las cuatro invertasas
clonadas (Lin5, Lin6, Lin7, y Lin8), muestran claramente una mayor relacin
filogentica con el grupo de las invertasas extracelulares (Godt & Roitsch 1997),
adems, se caracterizan porque en el dominio cataltico conservado en todas las
invertasas WEC(V/P)D, muestran una prolina al igual que otras invertasas
extracelulares. Sus puntos isoelctricos (entre 8.4 y 10.4) son tambin
caractersticos de isoenzimas extracelulares. El anlisis genmico por Southern,
demostr que la invertasa vacuolar TIV1 y las extracelulares Lin5, Lin6, Lin7 y Lin8,
estn codificadas por cinco genes distintos presentes en una o muy pocas copias en
el genoma haploide.
Mientras que el patrn de expresin de las invertasas extracelulares Lin5,
Lin6 y Lin7 sugiere funciones especficas para estas isoenzimas en el metabolismo
sumidero, el ARNm de Lin8 que fue clonado a partir de ADN genmico, no se pudo
detectar, con lo que hasta ese momento no se poda decidir si es que era un
pseudogen o bien que era inducido solo bajo condiciones que no se haban probado
hasta el momento. El anlisis de la distribucin de los ARNms de las invertasas en
los distintos tejidos revel, que Lin7 est presente a elevadas concentraciones en
flores y concretamente en estambres, los niveles ms elevados de TIV1 y Lin5 se
encontraron dentro de las flores en ptalos y gineceo respectivamente, el ARNm de
Lin6 est presente en tejidos sumidero de crecimiento activo como races de las
semillas en germinacin, tumores y brotes de la flor, se expresa especficamente
bajo condiciones en las que se requiere un elevado suministro de carbohidratos.
Esta distribucin tejido-especfica y la regulacin por estmulos internos y externos
suguiere que Lin6 tiene una importante funcin en la hidrlisis de sacarosa en el
apoplasto en la regulacin fuente-sumidero y en el aporte de carbohidratos a los
rganos sumidero. Se induce por la fitohormona promotora del crecimiento zeatina,
lo que apoya su elevada actividad en tejidos de crecimiento activo, ya que se sabe
que estos tejidos contienen elevadas concentraciones de citokininas. Su induccin
en respuesta a heridas (Ohyama et al. 1998) y tratamientos con elicitores, indica
que Lin6 es importante para inducir el metabolismo heterotrfico en respuesta a
estmulos relacionados con estrs, ya que el aumento de carbohidratos disponibles
65
Introduccin
proporcionar energa metablica para la activacin de reacciones de defensa. Los

niveles basales de Lin6 en las hojas de plantas de tomate son muy bajas,
aumentando sus niveles de ARNm tras la infeccin con distintos patgenos (Berger
et al. 2004). Su induccin por glucosa est de acuerdo con la induccin de un
nmero de enzimas sumidero-especficas (Koch & Nolte 1992) por este azcar, que
es el producto final de la reaccin de la invertasa.
En cuanto a la expresin en fruto, Miron y colaboradores (2002) mostraron
mediante estudios de expresin cuantitativa del gen TIV1 y de los genes de
invertasas apoplsticas (Lins), que slo la expresin gnica de TIV1 tena relacin
con las diferencias de actividad invertasa tanto soluble como insoluble en el
pericarpo de dos especies distintas de tomate. La expresin de los genes Lin que
codifican para invertasas de tomate apoplsticas no estaba relacionada con las
diferencias en la actividad enzimtica y no poda estar relacionada con el aumento
en la actividad invertasa asociada a pared celular del fruto maduro de S.
esculentum. Presentan pruebas de que esa actividad invertasa de tomate asociada
a pared es producto del gen TIV1, estando claro que dicho gen slo controla la
relacin de sacarosa y hexosas en frutos maduros de S. esculentum spp. (Chetelat
et al. 1993; Klann et al. 1993, 1996; Hadas et al. 1995; Ohyama et al. 1995).
Estos datos sobre TIV1 se confirmaron un poco ms tarde por Husain y
colaboradores (2003).
Respecto al otro tipo de enzimas que degradan sacarosa, el primer clon de
sacarosa sintasa de tomate se aisl de una librera de ADNc, y se le llam TOMSSF
(Wang et al. 1993). La expresin constitutiva de su ARN en antisentido, inhibe de
forma notable la actividad sacarosa sintasa en flores y fruto, de forma mnima en
el endospermo, y no se detect inhibicin en el embrin, peciolo, tejidos sumidero,
y tejidos de hojas (DAoust et al. 1999). La actividad de la sacarosa fosfato sintasa
decrece en paralelo con la de la sacarosa sintasa, pero la actividad invertasa cida
no aumenta en respuesta a esa disminucin de la actividad de la sacarosa sintasa.
As, el nico efecto sobre el contenido en carbohidratos de frutos jvenes, era una
ligera reduccin en la acumulacin de almidn, sin embargo, si se afecta la cantidad
de frutos que produce la planta, sugiriendo que TOMSSF participa en el control de
la capacidad para importar sacarosa a los frutos jvenes, lo que es determinante
para la cantidad de frutos y su desarrollo. Las principales caractersticas de la
regulacin del metabolismo de azcares en frutos de tomate, implica a cuatro ciclos
principales estrechamente conectados en los que intervienen invertasas y sacarosa
sintasa (revisin Nguyen-Quoc et al. 2001).
Por ltimo, los transportadores de azcares son tambin parte importante
del metabolismo carbonado de las plantas. De tomate se conocen un clon completo
66
Introduccin
(LeHT2), y dos clones parciales (LeHT1, LeHT3) que codifican para transportadores
de hexosas (Gear et al. 2000), aislados de librerias de ADNc de fruto y flor de S.
esculentum, y que tienen caracteristicas de la Superfamilia de los Facilitadotes
Mayores. Por anlisis de Southern blot se confirm la presencia de una familia
gnica de transportadores de hexosas en tomate que inclua al menos tres
miembros. Respecto a su expresin en distintos rganos, LeHT1 y LeHT3, se
expresan en tejidos sumidero predominantemente, mostrando la ms elevada
expresin en fruto joven y en los pices de las races. LeHT2 se expresa a niveles
relativamente elevados en hojas fuente y seguro en tejidos sumidero tales como las
flores, y es un transportador de hexosas de alta afinidad que probablemente acta
en el simporte H+/hexosa (Gear et al. 2000). Por otro lado, para el transporte de
sacarosa hasta ahora se han aislado tres genes que codifican para transportadores
de sacarosa en tomate, LeSUT1, LeSUT2, y LeSUT3 (Barker et al. 2000; Weise et
al. 2000). Las protenas de esos tres genes se ha demostrado que estn co-
localizadas en los elementos cribosos, mientras que el transcrito de SUT1 se
localiza en las clulas acompaantes (Barker et al. 2000; Khn et al. 1996; Weise
et al. 2000). Mientras que LeSUT1 se expresa principalmente en el exporte de
sacarosa en las hojas fuente, LeSUT2 se expresa predominantemente en rganos
sumidero (Barker et al. 2000), del mismo modo se expresan diferencialmente en el
fruto del tomate ambos genes (Hackel et al. 2006). Es ms, la inhibicin de la
expresin de ambos genes tiene efectos distintos sobre el desarrollo de la planta,
mientras que el bloqueo de la expresin de LeSUT1 tiene efectos fenotpicos sobre
la carga del floema, el de LeSUT2 afecta al desarrollo del fruto y de las semillas,
(Hackel et al. 2006).
En tomate, los cambios en los niveles de azcares en respuesta a la
infeccin por patgenos dependen fundamentalmente del patgeno implicado en la
infeccin. As por ejemplo en tomate, el contenido de azcares disminuye de forma
muy acusada tras la infeccin con Botrytis cinera (Berger et al. 2004), mientras que
en otros sistemas como en tabaco (Herbers et al. 2000), trigo (Wright et al. 1995),
y Arabidopsis (Chou et al. 2000), los niveles de hexosas y sacarosa aumentan tras
la infeccin con distintos patgenos.
Como se puede apreciar por la bibliografa, casi todos los estudios del
metabolismo de carbohidratos en tomate estn realizados en fruto, y sin embargo,
se conoce muy poco de su regulacin en rganos como la raz. Precisamente ste
rgano ser objeto principal de estudio de la presente Tesis Doctoral, por ser el
rgano en el que ocurre fsicamente la interaccin entre la planta y el hongo en la
simbiosis micorrcico arbuscular.
67
MATERIALES Y MTODOS
Materiales y mtodos
1. MATERIAL BIOLGICO Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO

1.1.Material vegetal
1.1.1. Planta utilizada
La planta utilizada para la realizacin del presente trabajo de Tesis Doctoral
ha sido tomate (Solanum esculentum Mill), cultivar 76R (Peto Seed Company, SA).
1.1.2. Cultivo de plantas

1.1.2.1. Substrato: composicin y esterilizacin
El substrato en todos los experimentos estaba compuesto por una mezcla
de arena:suelo en proporcin 1:1 (v/v) 1:2 (v/v).
El suelo utilizado proceda de la Estacin Experimental del Zaidn (Granada),
y presentaba las siguientes caractersticas: pH de 8.1 (agua); 1.81% materia
orgnica, unas concentraciones de nutrientes (mg kg-1) de 2.5 para el N; 6.2 para
el P (extrable con NaHCO3); y 132.0 para el K. La textura del este suelo, estaba
formada por 35.8% arena, 43.6% limo y 20.5% arcilla.
La arena utilizada era de cuarzo (< 2 mm), y previamente era lavada y
esterilizada en autoclave 20 minutos a 120 C. El suelo era tamizado (2 mm) y
esterilizado por tindalizacin en un autoclave a vapor fluente (100C durante 1 h,
3 das consecutivos). De esta forma, el suelo queda libre de propgulos de
micorrizas y otros organismos que puedan interferir en el experimento.
1.1.2.2. Esterilizacin, germinacin y siembra de las semillas

Las semillas de tomate fueron esterilizadas en superficie con una solucin de
leja al 10% durante 10 minutos. Luego, se lavaron varias veces con agua
destilada para eliminar cualquier resto que pudiera interferir en la germinacin.
Posteriormente, las semillas se germinaron en vermiculita estril a 28 C hasta que
los cotiledones estaban fuera, momento en el que se trasladaron a invernadero.
Cuando las plntulas desarrollaron la primera hoja verdadera, fueron
transplantadas a macetas que contenan 500 ml de una mezcla de suelo:arena
estril.
1.1.2.3. Solucin nutritiva para las plantas

Las plantas del experimento 1 recibieron tres veces por semana solucin
nutritiva Long Ashton (Hewitt) con un bajo contenido de fsforo (25%) (Hewitt
1952). La composicin de la solucin nutritiva con el 100% de fsforo, es la
siguiente:
71
Materiales y mtodos
Hewitt 100% de P
Compuestos Concentracin (uM) Solucin madre (g/l) Para 1 litro (ml)
KNO3 3 x103 30,3 10

Ca(NO3)2. 4H2O 9 x103 101,54 20
NaH2PO4. 2H2O 300 18,4 2,5
MgSO4. 7H2O 150 18,4 20
EDTA-Fe 67 2,45 10
MnSO4. 7H2O 13 1,35 1
CuSO4. 5H2O 1 2,4 0,1
ZnSO4. 2H2O 1 4,22 0,1
H3BO3 30 18,6 0,1
Na2Mo O4. 2H2O 0,15 0,35 0,1
Ajustar a pH 7
Las plantas del experimento 2 recibieron tres veces por semana solucin
nutritiva de Hoagland con la mitad de fuerza (0.5X) (Hoagland & Arnon 1950) y con
diferentes contenidos de fsforo. La composicin de la solucin nutritiva Hoagland
0.5x es la siguiente:
Hoagland 0.5x
Compuestos Concentracin (uM) Solucin madre (g/l) Para 1 litro (ml)
Macronutrientes
KH2PO4 20 136,1 0,02
100 136,1 0,1
500 136,1 0,5
KNO3 2500 101,11 2,5
Ca(NO3)2. 4H2O 2500 236,15 2,5
MgSO4. 7H2O 1000 246,48 1
Solucin Micronutrientes 05
Solucin micronutrientes Concentracin (uM) Para 1 litro (ml)

H3BO3 23,1 2,86
MnCl2. 4H2O 4,55 1,81
ZnSO4. 7H2O 0,38 0,22
CuSO4. 5H2O 0,16 0,08
Na2MoO4.. 2H2O 0,01 0,02
EDTA-Fe 2,24 1,645
1.1.2.4. Condiciones de crecimiento en invernadero

Todas las plantas crecieron en condiciones controladas en invernadero con
un 60% de humedad relativa, temperaturas da/noche de 25/18 C, y un
fotoperiodo de 16 horas.
72
Materiales y mtodos
1.1.2.5. Cosecha de distintos rganos

Se cosecharon muestras de distintos tejidos de plantas de tomate crecidas
durante 3 meses en las condiciones de invernadero anteriormente mencionadas, y
que haban sido regadas con agua durante todo el periodo de crecimiento. Los
tejidos cosechados fueron: flores, spalos, hojas jvenes, hojas adultas, tallo,
races, fruto verde y fruto maduro. Todas las muestras se congelaron en nitrgeno
lquido y se mantuvieron a -80 C hasta su anlisis.
1.1.2.6. Aplicacin de fitohormonas y azcares

Para este experimento, se crecieron durante 25 das semillas de tomate en
vermiculita estril segn se ha descrito anteriormente, y fueron regadas con
solucin nutritiva Hoagland a la mitad de fuerza (0.5x). Pasado este tiempo, las
plntulas se transfirieron a tubos falcon que contenan solucin nutritiva
suplementada con agua (control), 100 M de cido saliclico, 100 M de cido
abscsico (ABA), 40 mM de glucosa 20 mM de sacarosa. Las races se cosecharon
12 y 24 horas despus de la aplicacin los tratamientos, se congelaron en nitrgeno
lquido y se mantuvieron a -80 C hasta su anlisis.
1.1.3. Determinaciones fisiolgicas

1.1.3.1. Produccin de biomasa
En el momento de la cosecha, se determin el peso fresco de raz y parte
area. El peso seco de la parte area se midi despus de secarlo en un horno a 70
C durante 2 das.
1.2. Material fngico

1.2.1. Hongos micorrcicos utilizados
Las especies de hongos micorrcico arbusculares utilizados en los distintos
experimentos fueron: Glomus mosseae (Nicol. & Gerd.) Gerd y Trappe BEG 119
(Gm), Glomus intraradices (Schenck y Smith) BEG 121 y Glomus intraradices
(Schenck y Smith) BEG 123. El inculo de la micorriza de cada endosito, creci en
cultivos de Allium cepa L. o Zea mays. En todos los casos dicho inculo estaba
basado en suelo-arena que contena esporas, micelio y fragmentos de raz
infectados.
1.2.2. Determinacin de la micorrizacin

Una vez obtenidas en el momento de la cosecha, las races fueron teidas
empleando la tincin basada en el uso del azul tripn (Phillips & Hayman 1970). El
colorante azul tripn tie las estructuras que contienen quitina, principal
73
Materiales y mtodos
componente de las pareces celulares de algunos hongos, entre ellos los formadores
de micorrizas arbusculares (Bartinicki-Garca 1968). Se observan as los
componentes del hongo en el interior de la raz, sin que sta se coloree.
Procedimiento:
1. Las races se trocean y se sumergen en una solucin de KOH 10% (p/v) y se
mantienen durante 30 minutos al bao mara.
2. Se elimina el KOH y las races se lavan varias veces con agua.
3. Se les aade HCl 0,1 N durante 5 minutos a temperatura ambiente, con el
fin de preparar las races para la entrada del colorante.
4. De nuevo se ponen a hervir al bao mara en una solucin de 0.05% azul
tripn en cido lctico (v/v) durante 30 minutos.
Una vez teidas, se elimina el exceso de colorante y se conservan en una
solucin de cido lctico hasta su posterior observacin al microscopio ptico.
1.2.3. Estimacin de la colonizacin micorrcica

Para estimar el grado de colonizacin micorrcica, una vez teidas las races
se seleccionan fragmentos de aproximadamente 1 cm de longitud, los cuales se
montan sobre portaobjetos, se baan en cido lctico y se cubren con un
cubreobjetos. La cuantificacin de la colonizacin, se lleva a cabo con la ayuda de
un microscopio ptico. Para dicha cuantificacin, se asignan a cada trozo de raz
dos valores: el primero de ellos corresponde a la longitud de fragmento que est
colonizada, y el segundo, a la intensidad de dicha colonizacin. Estos nmeros
toman el valor 0 cuando no hay colonizacin y 10 cuando sta es mxima. La
multiplicacin de los dos valores da el porcentaje de micorrizacin presente en cada
fragmento de raz, y la media del porcentaje en todos los fragmentos, da una
estimacin de la colonizacin de la planta. De cada plntula de tomate se
examinaron un mnimo de 50 fragmentos de raz elegidos al azar.
1.2.4. Hongos patgenos utilizados, aplicacin y determinacin de la

infeccin.
Se ha utilizado el hongo patgeno de raz Phytoptora parasitica variedad
nicotianae (Phy).
Para la inoculacin con el patgeno, plantas controles crecidas durante 4
semanas, fueron regadas con una suspensin de micelio de P. parasitica como
previamente haba descrito Pozo et al. (1999).
La determinacin de la infeccin se estim evaluando las lesiones necrticas
producidas por el patgeno en las races pasadas dos semanas desde la inoculacin,
segn describe Pozo et al. (1999).
74
Materiales y mtodos
1.3. Experimentos
1.3.1. Experimento 1
Tras la esterilizacin y la germinacin de las semillas, las plntulas se
transplantaron a macetas que contenan una mezcla estril de arena y suelo 1:2
(v/v), y crecidas en invernadero segn se ha descrito anteriormente. En este caso,
las plantas se regaron tres veces por semana con solucin nutritiva de Hoagland al
50% y con distintas cantidades de fsforo.
Los tratamientos aplicados fueron: plantas controles no inoculadas (C) a las
que se les suministr solucin nutritiva que contena 20, 100 500 M de fsforo,
y plantas inoculadas con el hongo G. mosseae BEG119 (Gm) G. intraradices

BEG123 (Gi). Las plantas inoculadas con hongos formadores de micorrizas
arbusculares, se regaron con solucin nutritiva que contena 20 M de fsforo. La
inoculacin micorrzica se llev a cabo como est descrito por Benabdellah et al.
(1999), y se aplic en una proporcin del 5% en volumen. Las plantas control
recibieron un filtrado (<20M) del inculo fngico que contena las poblaciones
microbianas sin poseer propgulos de micorrizas arbusculares. Las plantas se
cosecharon a las 3, 4, 5 y 6 semanas despus de la inoculacin con el hongo MA. Y
tras la determinacin de los pesos frescos de parte area y raz, las muestras
fueron congeladas en nitrgeno lquido y mantenidas a 80 C.
1.3.2. Experimento 2
Las semillas de tomate fueron esterilizadas, germinadas y transplantadas
como se ha descrito previamente a macetas con una mezcla estril de arena:suelo
1:1 (v/v). Se aplicaron dos tratamientos distintos: plantas control no inoculadas (C)
y plantas inoculadas con el patgeno P. parasitica (Phy). La inoculacin con el
patgeno se llev a cabo como se describe en el apartado anterior. Las plantas
fueron crecidas en invernadero, y regadas tres veces por semana con solucin
nutritiva Long Ashton (Hewitt) con un contenido en fsforo del 25%.
El tiempo de cosecha fue, dos semanas despus de la inoculacin con P.
parasitica en plantas que ya tenan 4 semanas (tiempo total 6 semanas). Tras la
determinacin de los pesos frescos de parte area y raz, las muestras de hojas y
races fueron congeladas en nitrgeno lquido y conservadas a -80 C hasta su
anlisis.
1.4. Material bacteriano

1.4.1. Cepas de Escherichia coli utilizadas
Las cepas de E. coli utilizadas en el presente estudio fueron las siguientes:
75
Materiales y mtodos
- XL1-Blue (recA1endA gyrA96 thi-1hsdR17supE44relA1lac [F proAB

lacIqZ.M15Tn10(Tetr)]): Cepa que permite transformaciones altamente
eficientes de ADN metilado y no metilado y la seleccin de clones
recombinantes mediante deteccin de actividad -galactosidasa. El
hecho de que sea recA, minimiza el riesgo de recombinaciones
inespecficas. Fue utilizada para la preparacin de clulas
quimiocompetentes para la transformacin con plsmidos que contenan
insertos de genes de inters.
- TOP10F (F'{lacIq Tn10(TetR)} mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC)

phi80lacZM15 lacX74 deoR recA1 araD139 (ara-leu)7697 galU galK
rpsL (StrR) endA1 nupG): Cepa de similares caractersticas a XL1-Blue
usada para en las transformaciones con pYES2.1 TOPO TA (Clontech,
EE.UU).
Estas cepas se cultivaron en la oscuridad a 37C.
1.4.2. Medios de cultivo

1.4.2.1. Medio LB (Luria-Bertani)
Es el medio usado habitualmente para el cultivo de E. coli y tiene la

siguiente composicin:
1 % Triptona
0.5 % Extracto de levadura
1 % NaCl
Ajustar el pH a 7.0 con NaOH.
1.4.2.2. Medio SOC
Ha sido el medio de eleccin para optimizar el crecimiento de clulas

transformadas por electroporacin. Composicin:
2 % Triptona
0.5 % Extracto de levadura
0.05 % NaCl
2.5 mM KCl
10 mM MgCl2
76
Materiales y mtodos
20 mM Glucosa
Ajustar el pH a 7.5 con NaOH
Estos medios se esterilizaron en autoclave durante 20 min a 117 C, y se

gelificaron cuando result necesario con la adicin de agar al 1.5 %.
1.4.3. Marcadores de seleccin

La seleccin de transformantes en los medios de cultivo descritos se realiz
mediante la adicin de 0.1 mg/ml de ampicilina a los mismos.
Para discriminar entre aquellas colonias con actividad -galactosidasa y

aquellas que no la tienen, se utilizaron como marcadores de seleccin de las
colonias recombinantes, soluciones de IPTG y X-Gal, conservadas a 20 C.
IPTG: (isopropil-beta-D-tiogalactopiransido) se usa para inducir la expresin del
gen LacZ en E.coli.
La solucin de trabajo se prepara a una concentracin de 100 mM, se
esteriliza por filtracin y se conserva a 20 C. Se aaden 100 l a la placa unos 30
min antes de sembrar el cultivo.
X-gal: (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiransido) es un sustrato
cromognico para la -galactosidasa de modo que al ser hidrolizado forma
precipitados azules.
El X-gal se prepara en dimetilformamida a una concentracin de 50 mg/ml.
Se debe proteger de la luz debido a su fotosensibilidad y no es necesario filtrarlo.
Se aaden 35 l a la placa unos 30 min antes de sembrar.
Durante la siembra se usan tanto el IPTG como el X-gal para diferenciar las
colonias recombinantes (blancas) de las no recombinantes (azules).
1.4.4. Preparacin de clulas quimiocompetentes

La preparacin de clulas competentes de E.coli se realiz segn la tcnica
descrita por Hanahan (1983).
El procedimiento es el siguiente:
1. Inocular 2 ml de un precultivo de E.coli en 50 ml de medio LB suplementado
con 10 mM de MgSO4.
2. Incubar a 37 C hasta alcanzar una DO 550 de 0.5 (1-2 horas).
3. Transferir el cultivo a tubos de centrfuga SS-34 y enfriar en hielo 15 min.
4. Centrifugar los tubos a 800 g durante 12 min a 4 C.
5. Retirar sobrenadante suavemente y secar bien las paredes del tubo.
77
Materiales y mtodos
6. Resuspender las clulas en 16 ml de solucin RFI y mantener durante 15

min en hielo.
7. Centrifugar como en el paso 4 , resuspender las clulas en 2 ml de RFII e
incubar 15 min en hielo.
8. Hacer alcuotas de 100 l.
9. Enfriar los tubos eppendorf rpidamente en N2 lquido y congelar a 80 C.
Todo el material usado (puntas, tubos de centrfuga, eppendorf...) debe estar
estril y muy fro.
RFI: 100 mM RbCl, 50 mM MnCl2, 10 mM acetato potsico, 10 mM CaCl2, 11.9% Glicerol.

Ajustar a pH 5.8 con cido actico 0.2 M. Esterilizar por filtracin.
RFII: 10 mM MOPS, 1 mM RbCl, 100 mM CaCl2, 11.9% Glicerol. Ajustar a pH 6.8 con NaOH
0.5 M. Esterilizar por filtracin.
1.4.5. Preparacin de clulas electrocompetentes
Para la preparacin de clulas electrocompetentes de E. coli se ha adaptado

el orotocolo de Ausubel et al. (2005), siguendo el siguiente procedimiento:
1. Inocular 500 ml de LB a una DO.600 0.02 e incubar a 37 C hasta que

alcancen una DO.600 de 0.6 (aproximadamente 2.5 h).
2. Repartir entre tubos de centrfuga de 250 ml y centrifugar a 4000 xg

durante 10 min.
3. Eliminar el sobrenadante.
4. Lavar las clulas con 200 ml de agua estril y volver a centrifugar a 4000 xg
durante 10 min.
5. Lavar el sedimento con 100 ml de agua estril. Volver a cetrifugar (4000 xg,
10 min).
6. Lavar el sedimento con 50 ml de glicerol al 10 %. Volver a cetrifugar (4000

xg, 10 min).
7. Repetir el paso 6.
8. Retirar con cuidado el sobrenadante y aadir 2 ml de glicerol al 10 %.
9. Hacer alcuotas de 40 l por tubo y conservar a -80 C.
1.5. Cepas de levadura

1.5.1. Cepas de levadura utilizadas
Para el anlisis funcional de los genes de tomate aislados en el presente
estudio se han utilizado las siguientes cepas de levadura:
78
Materiales y mtodos
- EBY.VW4000 (hxt1-17, gal2, stl1, agt1, mph2, mph3) (Wieckzorke

at al. 1999): Cepa de Saccharomyces cerevisiae que tiene deleccionados
todos los genes que codifican para transportadores de azcares. No
puede crecer en medio mnimo cuando la fuente de carbono es glucosa.
Crece muy poco cuando la fuente de carbono es la galactosa, y si crece
bien cuando es maltosa.
- DBY746 (MAT, leu2, his3,ura3, trp1): Cepa silvestre de Saccharomyces
cerevisiae. Suministrada por el Dr. Scott D. Emr (Universidad de
California, Berkeley, EE.UU). Utilizada como control positivo en la
expresin heterloga de genes que codifican para posibles invertasas.
- SEY 2102 (MAT, leu 2-3, leu2-112, ura3-52, his4-519, gal2,
suc29) (Emr et al. 1983): Cepa de S. cerevisiae que tiene deleccionados
todos los genes que codifican para invertasas, lo que la incapacita para
crecer en medio mnimo cuando la fuente de carbono es sacarosa.
Suministrada por el Dr. Scott D. Emr (Universidad de California,
Berkeley, EE.UU). Utilizada en la expresin heterloga de genes que
codifican para posibles invertasas.
Todas las cepas se cultivaron en oscuridad a 30 C durante 3 das, en medio

slido, durante toda la noche si se utilizaba medio lquido.
1.5.2. Medios de cultivo para S. cerevisiae

1.5.2.1 Medio YPD (Yeast extract-Peptone-Dextrose)
ste es un medio no selectivo, usado para el crecimiento de cepas de S.

cerevisiae que no portan plsmidos (Sherman et al. 1986). Composicin:
1 % Extracto de levadura
2 % Peptona
2 % Glucosa
El medio se esteriliz en autoclave a 117 C durante 20 min.
1.5.2.2. Medio SD (Synthetic-Dextrose)
El SD es un medio selectivo que permite seleccionar en base a la auxotrofa

que presenta la cepa a cultivar (Sherman et al. 1986). Se usa siempre que la cepa
est transformada con algn plsmido.
0.67 % Difco Yeast Nitrogen Base sin aminocidos
79
Materiales y mtodos
2 % Glucosa
0.01 % Adenina, arginina, cistena, leucina, lisina, treonina,

triptfano y uracilo
0.005 % Del resto de aminocidos
El medio se esteriliz en autoclave a 117 C durante 20 min
La fuente de carbono, aminocidos y bases nitrogenadas se escogern en

funcin de las necesidades auxotrficas de la levadura.
1.6. Mantenimiento de las cepas

Las cepas de levadura y de E. coli descritas anteriormente se conservaron a
-80 C en glicerol al 20 %. Para ello se cultivan en medio lquido selectivo hasta el
final de la fase de crecimiento exponencial (cultivo de 16 h). A 800 l de estos
cultivos, se le aaden 200 l de glicerol al 80 % estril, se agita vigorosamente y se
almacenan a -80 C.
2. TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR

2.1. Plsmidos
Los plsmidos utilizados han sido los siguientes:
- pGEM-T Easy (Promega, EE.UU.): Vector de clonacin de E. coli por colas
de adenina tpicas de PCR resultantes de la actividad transferasa terminal
de la Taq polimerasa sin actividad correctora de prueba. El sitio de
clonacin se encuentra en el marco del gen LacZ, lo que permite la
seleccin de los plsmidos portadores del inserto mediante un escrutinio
de colonias blancas/azules cuando se cultivan en presencia de X-gal. La
seleccin se realiza por la tolerancia al antibitico ampicilina que confiere
este plsmido.
- pYES 2.1 TOPO TA (Invitrogen, EE.UU.): Vector de clonacin de S.

cerevisiae por colas de adenina tpicas de PCR con enzimas sin actividad
correctora de prueba. Es un vector de alto nmero de copias (origen de
replicacin del plsmido de 2) seleccionable en cepas auxotrficas para
uracilo. Asimismo presenta un origen de replicacin de E. coli, y confiere
resistencia a ampicilina
- pYES2 (Invitrogen, EE.UU.): Vector de expresin de alto nmero de

copias de S. cerevisiae. La transcripcin se logra al aadir galactosa
como fuente de carbono, ya que sta induce la transcripcin a partir del
promotor Gal1 que presenta el plsmido. Presenta el origen de
80
Materiales y mtodos
replicacin del plsmido de 2 y un origen de replicacin de E. coli. La

seleccin se hace en base a auxotrofa para uracilo, cuando est en S.
cerevisiae, y por resistencia a ampicilina, cuando se encuentra en E. coli.
- pFL61: Vector de expresin de S. cerevisiae de alto nmero de copia,

dado que posee el origen de replicacin del plsmido de 2. El inserto se
transcribe a partir de un promotor constitutivo de la fosfoglicerato kinasa
(Minet et al. 1992). La seleccin de los transformantes se realiza
mediante auxotrofa a uracilo. Este plsmido se puede replicar de forma
estable en E. coli, a la que confiere resistencia a ampicilina. Suministrado
por la Dra. M. Minet (Centre de Gnetique Molculaire, Gif sur Yvette,
Francia).
- pLin9: pFL61 que contiene la secuencia de la invertasa vacuolar de

tomate Lin9 completa bajo el control del promotor de la PGK.
- pGLin9: pFL61 que contiene la secuencia de la invertasa vacuolar de

tomate Lin9 con 75 pb menos bajo el control del promotor de la PGK.
- pLin10: pFL61 que contiene la secuencia de la fructoexohidrolasa de

tomate Lin10 bajo el control del promotor de la PGK.
- pFL61-LeST3: pFL61 que contiene la secuencia del posible transportador

de azcares de tomate LeST3 bajo el control del promotor de la PGK.
2.2. Aislamiento de ADN

2.2.1. Extraccin de ADN plasmdico de E. coli
Se us el kit QIAPREP Spin Miniprep kit de QIAGEN (EE.UU.) siguiendo las

instrucciones del fabricante.
2.2.2. Extraccin de ADN plasmdico de S. cerevisiae
Protocolo adaptado de Ausubel et al. (2005):
1. Crecer las clulas a 30 C en agitacin durante toda la noche en 10 ml de

medio selectivo.
2. Sedimentar las clulas centrifugando a 3000 xg durante 5 min y lavar el

sedimento con 0.5 ml de agua estril.
3. Transferir a un tubo de microcentrfuga y centrifugar 15 seg a 10000 xg.
81
Materiales y mtodos
4. Eliminar el sobrenadante y aadir 0.2 ml de tampn de extraccin, 0.2 ml

de una solucin de fenol:cloroformo:isoamlico (25:24:1) y 0.3 ml de bolitas
de vidrio de 425-600 m (SIGMA).
5. Agitar vigorosamente con el vortex durante 3-4 min.
6. Aadir 0.2 ml de tampn TE y centrifugar a 10000 xg durante 5 min.
7. Transferir la fase superior acuosa a un tubo nuevo de microcentrfuga y

aadir 1 ml de isopropanol. Incubar toda la noche a temperatura ambiente.
8. Centrifugar a 10000 xg durante 10 min y retirar el sobrenadante.
9. Lavar el sedimento con 1 ml de etanol al 70 %.
10. Retirar el etanol y dejar secar el sedimento a vaco durante 10 min.
Resuspender en 50 l de agua destilada
El rendimiento de este procedimiento es normalmente bajo, por lo que para

recuperar cantidad suficiente de ADN es necesario utilizar 1 l de esta solucin para
transformar clulas electrocompetentes de E. coli. Posteriormente, se extrae el ADN
plasmdico de las clulas transformadas de E. coli siguiendo el protocolo indicado en
el apartado anterior.
Tampn de extraccin: 2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM TrisHCl pH 8.0, 1

mM EDTA pH 8.0.
Tampn TE: 10 mM TrisHCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0.
2.2.3. Extraccin de ADN genmico de tomate
El ADN genmico de tomate se extrajo a partir de 2 g de tejido de hoja

previamente almacenado a -80 C, siguiendo el protocolo adaptado de Murray &
Thompson (1980). Procedimiento:
1. Triturar el tejido con nitrgeno lquido. Aadir 15 ml del tampn de

extraccin CTAB y dejar descongelar.
2. Aadir 1/6 volumen de 5% de sarkosil y mezclar invirtiendo el tubo.
3. Incubar 1 hora a 60 C mezclando de vez en cuando por inversin del

tubo.
4. Aadir 10 ml de cloroformo:isoamlico (24:1), mezclar unas 20-30 veces
por inversin del tubo, hasta que se forme una emulsin.
5. Centrifugar a 4000 rpm durante 5 min.
82
Materiales y mtodos
6. Transferir la fase acuosa (fase superior) a un tubo limpio. Aadir

cuidadosamente y poco a poco 3 ml de isopropanol fro. Mezclar
cuidadosamente de manera que se formen las interfases. Repetir el
proceso hasta aadir un total de 11.5 ml de isopropanol. El ADN debe
precipitar en la interfase. Una vez que se ha aadido todo el isopropanol,
mezclar invirtiendo el tubo.
7. Centrifugar a 4000 rpm durante 5 min. Eliminar el sobrenadante.
8. Aadir 5 ml etanol al 76% con 10 mM NH4OAc. Incubar a 4 C durante

toda la noche.
9. Centrifugar 15 min. A 4000 rpm. Eliminar el sobrenadante con una pipeta

y secar el precipitado a vaco.
10. Resuspender el ADN en 200 l de tampn TE y calentar a 65 C durante

30 min. Mezclando de vez en cuando.
Tampn de extraccin CTAB: 50 mM TrisHCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 0.7 M NaCl, 1%

CTAB (cetil trimethyl ammonium bromide), 1% -mercaptoetanol (aadir justo antes de
usar), 2% PVP (polyvinylpyrrolidone).
Tampn TE: 10 mM TrisHCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0.
2.2.3.1. Tratamiento con RNasa del ADN genmico de tomate
1. Aadir al ARN anteriormente resuspendido en tampn TE, 5 l de

RNasa libre de DNasa e incubar 2 horas a 37 C.
2. Centrifugar 5 min. a mxima velocidad y transferir el sobrenadante

a un tubo limpio.
2.2.4. Extraccin de ADN genmico Gomus mosseae
El ADN genmico de G. mosseae se extrajo a partir de 1000 esporas

usando el Kit DNeasy Plant Mini Extraction (QUIAGEN, Alemania) siguiendo las
instrucciones del fabricante, excepto que el paso de moler con nitrgeno lquido,
fue sustituido por aplastar las esporas en el buffer de lisis del kit, usando un
micropistilo.
2.3. Cuantificacin del ADN
El ADN extraido se cuantific con la ayuda de un espectrofotmetro. Para

ello se utilizaron cubetas de cuarzo. La absorbancia de una alicuota de 5 l de
muestra diluida en 995 l de agua milli-Q estril se midi a 230, 260 y 280 nm.
83
Materiales y mtodos
Cada unidad de absorbancia a 260 nm se consider como 50 g/ml de ADN.

Para poder conocer una posible contaminacin por carbohidratos se calcul la
relacin entre las absorbancias obtenidas a 260 y 230 nm, debiendo ser sta
superior a 2. Para considerar una muestra libre de protenas y/o fenol la
relacin entre las absorbancias a 260 y 280 nm deba tomar un valor superior a
1.8.
2.4. Visualizacin del ADN mediante electroforesis en geles de agarosa
La separacin electrofortica del ADN se realiz en geles de agarosa al

1.6% en tampn TBE. La electroforesis se realiz en tampn TBE a 100 V. Las
muestras se prepararon en tampn de carga 1x. La visualizacin del ADN en los
geles se realiz mediante tincin con bromuro de etidio y fotografa del gel
expuesto a luz UV (260 nm).
Tampn TBE: 89 mM Tris Base, 89 mM cido brico, 2 mM EDTA. Ajustar a pH 8.0 con HCl.
Tampn de carga (6x): 50% sacarosa, 0.3% azul de bromofenol.
2.5. Southern blot
2.5.1. Digestin del ADN genmico
Hay que digerir el ADN genmico a analizar con enzimas de restriccin

que no corten el fragmento de ADN que se va a utilizar como sonda. En el caso del
presente trabajo, se digirieron 15 g de ADN genmico de tomate durante toda la
noche con las enzimas de restriccin BamHI y XbaI, siguiendo el siguiente
protocolo:
1. Incubar los 15 g de ADN genmico durante 1 h a 65 C para

desnaturalizar el ADN.
2. Poner los tubos en hielo durante 5 min, dar una centrifugacin corta,
volver a poner los tubos en hielo y adicionar tampn y la enzima
correspondiente hasta tener un volumen final de 20 l.
3. Dar una centrifugacin corta e incubar durante 2 h a 37 C.
4. Transcurridas las 2 h aadir:
1 l 10x Tampn del enzima
1 l Enzima
84
Materiales y mtodos
8 l H2O
5. Dar una centrifugacin corta e incubar durante toda la noche a 37 C.
2.5.2. Electroforesis en gel de agarosa y transferencia a membrana
Procedimiento:
1. Las muestras de ADN digerido se cargan en un gel de agarosa al 0.8%

(p/v). La electroforesis se desarroll en tampn TBE 1x a un voltaje
constante de 40 V durante aproximadamente 4 h.
2. Para la visualizacin del gel, se tie con bromuro de etidio, y se expone a

luz ultravioleta.
3. Incubar el gel durante 15 minutos en 0.25 M HCl para depurinar el ADN.
4. Lavar el gel con H2O destilada un par de veces para eliminar los restos de
cido clorhdrico.
5. Incubar el gel en solucin de desnaturalizacin durante 15 min dos veces.
6. Lavar el gel con agua destilada un par de veces.
7. Incubar el gel en solucin de neutralizacin durante 15 minutos dos

veces.
8. Durante este ltimo lavado preparar la membrana de nylon cargada

positivamente (Hoffmann-La Roche Ltd, Suiza) a la que se va a transferir
el ADN:
Cortar la membrana del tamao del gel.
Lavar la membrana durante 5 minutos en agua destilada.
Lavar la membrana durante 30 minutos en 20 x SSC.
Transferencia:
- Poner 10 x SSC en una caja de plstico y poner una placa de vidrio en
la parte superior.
- Cortar una tira de papel Whatman n 3 y ponerla encima de la placa de
vidrio de manera que quede sumergida por los bordes en la caja que
contiene el SSC.
- Mojar el papel con 10 x SSC. Quitar las burbujas.
- Poner el gel encima del papel con cuidado de que no se formen
85
Materiales y mtodos
burbujas. En caso de que se formen, eliminarlas.
- Poner encima del gel la membrana previamente incubada en SSC.
- Eliminar las posibles burbujas que se formen entre la membrana y el gel.
- Rodear el gel con parafilm.
- Poner encima de la membrana dos trozos del papel Whatman del mismo
tamao que la membrana.
- Poner encima una torre de papel, una placa de vidrio y un peso.
- Dejar la transferencia toda la noche.
- Desmontar el sistema de transferencia y marcar los pocillos del gel en la
membrana.
- Lavar la membrana durante 5 minutos en 2 X SSC. Dejar secar al aire.

Poner la membrana entre dos trozos de papel Whatman y fijar el ADN a
la membrana a 120 C durante 30 minutos en vaco.
- Guardar la membrana en papel de aluminio en un lugar seco hasta que

se vaya a utilizar.
SSC 20x: NaCl 3M, citrato sdico 0.3M. Ajustar a pH 7 con NaOH 10N. Autoclavar a 120 C
durante 20 min.
Solucin desnaturalizante: 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl
Solucin neutralizante: 0.5 M Tris pH 7.5, 1.5 M NaCl
2.5.3. Sntesis de la sonda marcada radiactivamente mediante PCR
La mezcla de reaccin fue la siguiente:

2 l ADN (10 ng de plsmido conteniendo el inserto de ADN a marcar)
5 l Tampn de la Taq polimerasa (10x)
1.5 l MgCl2 50 mM
5 l dATP (100 M)
5 l dGTP (100 M)
5 l dTTP (100 M)
1.5 l dCTP (30 M)
32
5 l P -dCTP (10 Ci/l)
1 l Cebador 1 5 10 M
1 l Cebador 2 3 10 M
0.5 l Taq Polimerasa
86
Materiales y mtodos
17.5 l H2O destilada estril
El programa de PCR seguido fue el que se muestra a continuacin:

(95 C, 5 min) x 1 ciclo
(94 C, 30 seg; 55C, 30 seg; 72 C, 1 min) x 35 ciclos
(72 C, 7 min; 4 C, ) x 1 ciclo
2.5.4. Purificacin de las sondas marcadas radioactivamente

Para purificar las sondas marcadas se utiliz el kit comercial Mini Quick Spin
TM Columns, (Boehringer Manheim, Indianapolis, IN, USA) que retiene el exceso de
nucletidos no incorporados y purifica el ADN marcado.
2.5.5. Pre-hibridacin e hibridacin

El procedimiento que se sigui fue el siguiente:
1. La membrana se coloca en un tubo de hibridacin con el ADN hacia arriba y

se pre-hibrid durante al menos 2 h con la solucin de hibridacin a 65 C y
agitacin.
2. Paralelamente, la sonda se desnaturaliza calentando a 100 C durante 5 min
e incubndola inmediatamente en hielo durante 5 min.
3. La solucin de hibridacin se elimina del tubo y se aade nueva solucin de
hibridacin que contiene la sonda previamente desnaturalizada.
4. La membrana hibrida toda la noche a 65 C en agitacin.
5. La solucin de hibridacin se elimina y se llevan a cabo los siguientes
lavados para retirar los enlaces no especficos de la sonda:
2 lavados de 15 min con 6x SSC + 0.1% SDS a 65 C y agitacin.
2 lavados de 15 min con 0.1x SSC + 0.1% SDS a 65 C y
agitacin.
Solucin de hibridacin: SDS 7% (p/v), 500 mM NaH2PO4 pH 7.2, y 1 mM EDTA pH 8

(Church & Gilbert 1984).
2.5.6. Deteccin y revelado
Las seales de hibridacin se visualizaron usando un Phosphor imager (Bio-

Rad, Hercules, CA).
2.6. Reaccin en cadena de la polimerasa
En tubos de 0.2 ml se prepar la siguiente mezcla de reaccin:
87
Materiales y mtodos
ADN molde (10-100 ng)
2.5 l Tampn 10x de la Taq DNA polimerasa termostable
0.75 l MgCl2 50 mM
5 l dNTPs 1mM
0.5 l Cebador 5 (10 M)
0.5 l Cebador 3 (10 M)
0.5 l Taq DNA polimerasa termostable (5 U/ml)
Agua bidestilada estril hasta 25 l
Tambin se prepar un tubo de microcentrfuga sin ADN como control

negativo para poder descartar posibles artefactos o contaminaciones.
Los tubos se colocaron en un termociclador (Perkin-Elmer Mod 2400) y se

utiliz un programa estndar de 35 ciclos, consistiendo cada uno de ellos en una
desnaturalizacin a 94C durante 30 seg, una fase de hibridacin a 55 C durante
30 seg y una extensin a 72 C durante 45 seg/kb en caso de polimerasas
termostables sin actividad correctora de prueba y 90 seg/kb si presentan dicha
actividad. Al final se realiz una extensin a 72 C durante 7 min.
Los cebadores usados en las diferentes PCRs realizadas en este estudio se

recogen en la Tabla 1.
Tabla 1. Lista de cebadores usados. La temperatura de alineamiento usada para todos ellos
se indica entre parntesis.
Nombre Secuencia Uso

InvF YYTNTTYTAYCARTAYAAYCC Bsqueda de invertasas de tomate
(55 C)
InvR ARAARTCNRSRCAYTCCCA Bsqueda de invertasas de tomate
(55 C)
1Lin9 GGCCGACCCATCTGACCCTCTATT 3RACE de Lin9 (60 C)
2Lin9 CTGCCAGTGGATTAGGTCTCTTGA 5RACE (60 C), y PCR Cuantitativa

(58 C) de Lin9, y paseo
cromosmico
3Lin9 ATGTCGATCCCTAATTCAGAAACAAACA Clonacin de la secuencia completa
(65 C), y PCR Cuantitativa (58 C)
de Lin9
4Lin9 CAAAAAACATACTCTTCACTGATTTCTT Clonacin de la secuencia completa
de Lin9 (65 C)
5Lin9 AAAAATAACAAAAATGCCACCAGACCGG Paseo cromosmico
6Lin9 GGTCCGCTACCATAGCCACTGG PCR Cuantitativa GLin9 (58 C)
88
Materiales y mtodos
Tabla 1 (continuacin). Lista de cebadores usados. La temperatura de alineamiento usada

para todos ellos se indica entre parntesis.

7Lin9 TCATCAGTACCGTCGTTGTTA PCR Cuantitativa para los dos
transcritos de Lin9 (58 C)
1Lin10 GTTAGGGCCTGATGGGATTTGGAGAGT 3RACE de Lin10 (60 C)
2Lin10 CTGAAGGCAAAAGAGCGGGAGGATGAA 5RACE de Lin10 (60 C), y paseo

cromosmico
3Lin10 ATGGCTCAGCCTACAGAACTGCTTATC Clonacin de la secuencia completa
de Lin10 (65 C)
4Lin10 CTGCGTAAGAATGACAAGTAAAAAAGGG Clonacin de la secuencia completa
(65 C), y PCR Cuantitativa (58 C)
de Lin10
5Lin10 AATTATGGAGCCTTTTTGGACA PCR Cuantitativa de Lin10 (58 C)
6Lin10 TTCATCCTCCCGCTCTTTTGCCTTCAG Obtencin clon genmico de Lin10
Lin10G TTCATCCTCCCGCTCTTTTGCCTTCAG Bsqueda clon genmico de Lin10
NS31 TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC Control interno del ARNr 18S en

levadura (52 C)
NS41 CCCGTGTTGAGTCAAATTA Control interno del ARNr 18S en
levadura (52 C)
PTOMSSF CATTCAGTTTGTCTTTGTCATCTTGG Paseo Cromosmico
FTOMSSF GGATTGAAAGCCACGGAAAAGG PCR Cuantitativa de TOMSSF (58 C)
RTOMSSF ACCAGGCCTCAAACGAATAGCA PCR Cuantitativa de TOMSSF (58 C)
Tiv1F TCCGCCTCTCGTTACACATTACTC PCR Cuantitativa de TIV1 (58 C)
Tiv1R CGGTGACTGGTTGTTGAGGATAGG PCR Cuantitativa de TIV1(58 C)
Lin6F AGCACATTTATTCGCCTTCAACAA PCR Cuantitativa de Lin6 (58 C)
Lin6R TTTGTGACGTGGCATAATAAGAT PCR Cuantitativa de Lin6 (58 C)
Lin5F GGTACTTGGTCTGGATCATCAACT PCR Cuantitativa de Lin5 (58 C)
Lin5R TCTCAATCCCTTCCAACCATCAATT PCR Cuantitativa de Lin5 (58 C)
Lin7F GAACCTGCAATTTACCCATCAAAGCC PCR Cuantitativa de Lin7 (58 C)
Lin7R AAGTCTCAACCCCTTCCAACCATCGA PCR Cuantitativa de Lin7 (58 C)
Lin8F CAAAACTATGCAATCCCAGCG PCR Cuantitativa de Lin8 (58 C)
Lin8R CAATGACCATCCTGACCCAAC PCR Cuantitativa de Lin8 (58 C)
SPSF GGTGGTCTACGCAAGGCTGTCAT PCR Cuantitativa de SPS (58 C)
SPSR CGGTGCTGCTACATTCCTCGTCT PCR Cuantitativa de SPS (58 C)
RBCF TTGCACCCTTCACTGGACTCA PCR Cuantitativa de RuBisCo (58 C)
RBCR ACTGACTCTTCCACCGTTGCT PCR Cuantitativa de RuBisCo (58 C)
R1 AAAAGGTCGACGCGGGCT Control interno del ARNr 18S de

tomate para PCR Cuantitativa (58 C)
89
Materiales y mtodos
Tabla 1 (continuacin). Lista de cebadores usados. La temperatura de alineamiento usada

para todos ellos se indica entre parntesis.

R2 CGACAGAAGGGACGAGAC Control interno del ARNr 18S de
tomate para PCR Cuantitativa (58 C)
SUG1 CCIGARWCHCCIM Bsqueda de transportadores de
hexosas (40 C)
SUG2 ARICCYTTIGTYTGIGG Bsqueda de transportadores de
hexosas (40 C)
SUG4 TGCAGCATACAGAACGAACGT 5RACE de LeST3 (55 C), sonda en
Southern y PCR Cuantitativa (58C)
SUG5 GGTCTATATCGGTTCCTTTTCA 3RACE de LeST3 (55 C), sonda en
Southern y PCR Cuantitativa (58C)
2.7. Digestin de ADN con endonucleasas de restriccin
Las digestiones del ADN con enzimas de restriccin se realizaron en las

condiciones ptimas de tampn y temperatura, siguiendo las indicaciones
recomendadas por el proveedor (New England Biolabs, EE.UU.).
2.8. Desfosforilacin de vectores de clonacin
Para evitar la ligacin entre dos molculas del vector y su posible

circularizacin, los vectores digeridos con endonucleasas de restriccin se
desfosforilaron mediante tratamiento con fosfatasa alcalina de intestino de ternero
(Roche, EE.UU.). Para ello se incub a 37 C durante 30 min la siguiente mezcla de
reaccin:
10 l Vector digerido (1 g/l)
2 l Tampn de fosfatasa alcalina (10x)
1 l Fosfatasa alcalina (1 U/ l)
17 l Agua miliQ
Tras la desfosforilacin se purific el ADN usando el protocolo de

CleanUp del kit QiaexII Gel Extraction kit de Qiagen (EE.UU.), siguiendo las
instrucciones del fabricante.
2.9. Purificacin de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa
Para ello, se emple el kit QiaexII Gel Extraction kit de Qiagen (EE.UU.)
siguiendo las instrucciones del fabricante.
90
Materiales y mtodos
2.10. Ligacin en vectores de clonacin
La ligacin entre un fragmento de ADN y el vector de clonacin adecuado se

realiz usando una relacin molar inserto:vector de 3:1 y teniendo en cuenta los ng
de vector que se necesitan en cada caso.
2.10.1. Ligacin de productos de PCR
2.10.1.1. Ligacin en pGEM-T Easy
En un tubo de microcentrfuga se incub durante toda una noche a 4C la

siguiente mezcla de reaccin:
X l Inserto
1 l Ligasa
1 l Vector (50ng/l)
X+2 l Tampn (2x)
2.10.1.2. Ligacin en pYES 2.1 TOPO TA
La razn de elegir este vector es su promotor gal4 eucaritico, de modo que

al transformar una bacteria no se corre el peligro de que el fragmento del gen
resulte txico. Es especialmente indicado para la clonacin de genes que codifican
protenas transportadoras. Para ello se incub durante 30 min a temperatura
ambiente la siguiente mezcla de reaccin:
0.5-4 l producto de PCR
1 l Solucin salina
1 l Vector (10 ng/l)
Completar hasta 6 l con agua miliQ
2.10.2. Ligacin de fragmentos de restriccin
Los productos de una digestin con extremos compatibles se incubaron en

un tubo de microcentrfuga durante toda una noche a 4C con la siguiente mezcla
de reaccin:
X l Inserto
50 ng Vector
91
Materiales y mtodos
1 l Tampn ligasa T4
1 l T4 DNA ligasa 1 U/l (Roche, EE.UU.)
Completar hasta 10 l con agua miliQ.
2.11. Transformacin
2.11.1. Transformacin de clulas de E. coli
Tiene por objeto introducir plsmidos con el inserto deseado en cepas de E.

coli.
2.11.1.1. Transformacin de clulas quimiocompetentes
Para transformar las clulas quimiocompetentes se utiliz la metodologa

descrita por Rodrguez y Tait (1983), siguiendo el protocolo que se indica a
continuacin:
1. Mantener una alcuota de 100l de clulas competentes 15 min en hielo.
2. Aadir 25 ng de plsmido, agitar suavemente e incubar en hielo durante 30

min.
3. Incubar durante 90 seg a 42 C.
4. Enfriar en hielo 5 min.
5. Aadir 1 ml de LB e incubar 1 h 30 min en agitacin a 37 C.
6. Sembrar las clulas en placas de medio selectivo que contiene el antibitico

de seleccin segn el vector utilizado, e incubar las placas toda la noche a
37 C.
2.11.1.2. Transformacin de clulas electrocompetentes
Las clulas electrocompetentes se transformaron usando un electroporador

EC-100 (Krakeler Scientic Inc.), siguiendo las intrucciones del fabricante. El proceso
se llev acabo segn describe el siguiente protocolo:
1. Colocar las clulas electrocompetentes y las cubetas en hielo.
2. Encender el generador de corriente y cargar a 1500 V.
3. Mezclar 40 l de clulas con el ADN y pasar a la cubeta sin dejar burbujas.

Secar la cubeta y poner en la cmara de descarga.
4. Realizar la descarga.
92
Materiales y mtodos
5. Colocar las clulas inmediatamente en hielo y aadir 900 l de medio SOC.
6. Transferir las clulas a un tubo de microcentrfuga e incubar 1 h a 37C en

agitacin.
7. Sembrar en medio selectivo e incubar las placas toda la noche a 37 C.
2.11.2. Transformacin de S. cerevisiae
En este caso se utiliz la metodologa siguiente descrita por Schiestl y Gietz

(1989):
1. Inocular 10 ml de medio YPD con clulas en fase estacionaria, de modo que

la D.O.600 sea prxima a 0.1. Incubar a 30 C en agitacin hasta que alcance
una D.O.600 de 0.4 (unas 4 h).
2. Sedimentar las clulas mediante centrifugacin a 3000 xg durante 5 min.

Eliminar el sobrenadante y resuspender las clulas en 5 ml de Solucin de
litio.
3. Centrifugar de nuevo (3000 xg, 5 min), eliminar el sobrenadante y

resuspender las clulas en 100 l de Solucin de litio.
4. Mientras se centrifugan las clulas, hervir el esperma de salmn (10 mg/ml)

durante 10 min y poner en hielo inmediatamente.
5. Aadir a un tubo de microcentrfuga ADN plasmdico (0.1-1 g), 60 l de las

clulas resuspendidas en el paso 3, y 7 l de esperma de salmn. Agitar
vigorosamente.
6. Aadir 0.45 ml de Solucin PEG. Agitar vigorosamente.
7. Incubar las clulas a 30 C durante 30 min.
8. Dar un choque de calor de 42 C durante 15 min.
9. Sembrar 200 l en placas de medio selectivo. Incubar a 30 C durante 2-3

das.
Solucin de litio: 10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA pH 8.0, 0.1 M Acetato de litio.

Solucin PEG: 10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA pH 8.0, 0.1 M Acetato de litio, 40% PEG
(4000 o 3350).
2.12. Purificacin del ADN plasmdico

La purificacin del ADN del plsmido se llev a cabo usando el kit QIAprep
Spin Miniprep kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
93
Materiales y mtodos
2.13. Paseo cromosmico
Se emple el kit Universal GenomeWalker de Clontech siguiendo las

instrucciones del fabricante, y partiendo de 2.5 g de ADN genmico de tomate.
Para el paseo cromosmico, consistente en una PCR, se emplearon 6.6 ng de ADN
digerido por reaccin. El procedimiento se esquematiza a continuacin.
2.14. Extraccin de ARN
2.14.1. Extraccin de ARN de tomate
94
Materiales y mtodos
La extraccin de ARN se hizo tanto en raz como en hoja partiendo de 1 g de

peso fresco de tejido congelado a 80 C.
El procedimiento fue el siguiente:
1. Homogeneizamos en un mortero con nitrgeno lquido el material de

partida.
2. Aadir 1800 l de tampn REB y seguir homogeneizando.
3. Dejar descongelar y aadir rpidamente 1800 l de
fenol:cloroformo:isoamlico en proporcin 50:24:1.
4. Traspasar el material a tubos estriles de 2 ml, agitar varias veces de forma
no agresiva. Mantener en hielo.
5. Centrifugar 10 min a 12 000 rmp a 4C. Recoger la fase acuosa y reextraer
con 900 l de fenol:cloroformo:isoamlico en proporcin 25:24:1.
6. Centrifugar 10 min a 12 000 rmp a 4C. Recoger la fase acuosa y reextraer
con 900 l de cloroformo:isoamlico (24:1).
7. Recoger la fase acuosa y pasarla a un nuevo tubo. Medir el volumen y
adicionar 1/3 del volumen de la muestra de LiCl 8M, poco a poco en el
vrtex a baja velocidad para ir adquiriendo la concentracin final de 2 M.
8. Incubar en hielo durante toda una noche.
9. Centrifugar a mxima velocidad en una microcentrfuga durante 30 min a
4C.
10. Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado con 300 l de LiCl 2M fro.
Centrifugar de nuevo durante 10 min en las mismas condiciones.
11. Recoger el precipitado en 200 l de tampn TE y precipitar de nuevo con 2.5
volmenes de etanol 100% y 0.1 volumen de acetato sdico 3M pH 5.2
(preparado en agua-DEPC).
12. Incubar toda una noche a 20 C.
13. Recoger por centrifugacin a mxima velocidad durante 30 min a 4 C.
14. Lavar el precipitado con 300 l de etanol 75% y volver a centrifugar 5 min
en las mismas condiciones.
15. Secar el tubo con mucho cuidado y resuspender el precipitado en 50-60 l
de agua-DEPC.
Agua-DEPC: Aadir 1 ml de dietil-pirocarbonato por cada litro de agua destilada. Agitar

durante toda una noche. Se autoclava y se agita con el tapn abierto dentro de una campana
extractora para eliminar gases txicos durante 30 min.
Tampn REB: Tris-HCl 25 mM, EDTA 25 mM, NaCl 75 mM, SDS 1%, -mercaptoetanol 1M.
Preparar en agua-DEPC.
Tampn TE: Tris 10 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8.0. Preparar en agua-DEPC.
95
Materiales y mtodos
Notas: Usar guantes durante todo el proceso para evitar el contacto del ARN con RNasas que
puedan degradarlo. Todo el material utilizado ha de estar completamente estril. Los
reactivos tienen que estar fros. Autoclavar todos los reactivos salvo el tampn REB que se
autoclava antes de aadir -mercaptoetanol
2.14.2. Extraccin de ARN de Sacharomices cerevisiae

Se emple el kit RNeasy Mini (Quiagen) siguiendo las instrucciones del
fabricante para la extraccin de ARN total de levadura mediante lisis enzimtica,
partiendo de 5 x 107 clulas de levadura en cada cultivo.
2.14.3. Cuantificacin del ARN
La cuantificacin del ARN se realiz espectrofotomtricamente siguiendo la

metodologa descrita por Sambrook et al. (1989). Para ello se utilizaron cubetas de
cuarzo. La absorbancia de una alcuota de 5 l de muestra diluida en 745 l de
agua DEPC fue medida a 230, 260 y 280 nm. Cada unidad de absorbancia a 260
nm fue considerada como 40 g/ml de ARN. Para poder conocer una posible
contaminacin por carbohidratos se calcul la relacin entre las absorbancias
obtenidas a 260 y 230 nm, debiendo ser sta superior a 2. Para considerar una
muestra libre de protenas y/o fenol la relacin entre las absorbancias a 260 y 280
nm deba ser superior a 1.8.
2.14.4. Visualizacin del ARN mediante electroforesis en geles de agarosa
Para determinar la calidad del ARN extrado se procedi a la separacin

electrofortica de 1 g de ARN en geles desnaturalizantes de agarosa conteniendo
formaldehido. Para ello se diluy la muestra en tampn de muestra 1x y tampn
de carga 1x. A continuacin, se desnaturaliz el ARN incubando esta solucin a 65
C durante 15 min. La separacin se realiz en geles de agarosa al 0.6% en tampn
1x MOPS estril que contena un 1.85% de formaldehdo. La electroforesis se
desarroll en tampn 1x MOPS a un voltaje constante de 80V. Para visualizar el
ARN se expuso el gel a luz ultravioleta.
Tampn de muestra: 50 % Formamida desionizada, 14% Formaldehdo. Esta solucin se

prepara en tampn MOPS 1x.
Tampn de carga (10x): 50% Sacarosa, 0.3% Azul de bromofenol, 1g/ml Bromuro de
etidio. Esta solucin se prepara en tampn MOPS 1x.
Tampn MOPS (10x): 200 mM MOPS pH 7.0, 50 mM Acetato sdico, 10 mM EDTA.
96
Materiales y mtodos
2.14.5. Tratamiento del ARN con DNasa
Se tratan 20g de ARN en un volumen final de 40l, para lo que en un tubo

de microcentrfuga, se aaden los siguientes componentes:
Xl de ARN (20g)
33-X l de H2O DEPC
4 l buffer 10X
1 l Inhibidor de la RNasa (40 U/l)
2 l DNasa
Vf = 40 l
1. Incubar la mezcla a 37C durante 30 min
2. Aadir 210 l de H2O DEPC (Vf = 250 l)
3. Aadir un volumen (250 l) de Fenol:Cloroformo:isoamlico en proporcin

25:24:1.
4. Centrifugar 1min a 13400 g.
5. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio. Repetir la extraccin con

Fenol:Cloroformo:isoamlico.
6. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio midiendo el volumen.
7. Precipitar el ARN con 0.1vol de 3M NaAc pH 5.2 y 2.5vol de EtOH 100%.
8. Incubar overnight a 20C.
9. Centrifugar 30min a 15700 g a 4 C.
10. Eliminar el sobrenadante y lavar el prcipitado con 500l de EtOH al 80%.
11. Centrifugar durante 10min a 13400 g a 4 C.
12. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente y secar el pellet en un

desecador.
13. Resuspender el precipitado en 30l de H2O-DEPC. Conservar el ARN a -

80 C.
97
Materiales y mtodos
2.15. Tcnicas de RACE
Para la obtencin de la secuencia completa de aqullos genes de los que slo

se conoca una parte del mismo, se utilizaron tcnicas de RACE (Rapid Amplification
of cDNA ends). Con este fin, se ha empleado el kit SMART RACE (Clontech, EE.UU.),
siguiendo las instrucciones del fabricante con las dos modificaciones que se detallan
a continuacin:
- La sntesis de ADNc se realiz a partir de 1 g de ARN total previamente

tratado con DNasa.
- La temperatura a la que se realiz el paso de hibridacin fue de 62 C, y

los ciclos de la PCR fueron 35.
2.16. Anlisis de la expresin gnica mediante tcnicas de PCR

cuantitativa a tiempo real.
2.16.1. Retrotranscripcin in vitro: sntesis de ADNc
La sntesis del ADNc se realiz a partir de 1 g de ARN total usando la

reversotranscriptasa SuperscriptII (Invitrogen, EE.UU.) por el mtodo de los
cebadores aleatorios, usando las condiciones que recomienda el fabricante y que se
detallan a continuacin:
1. Se mezclan en un tubo de microcentrfuga:
1 g de ARN total
1 l dNTPs 10 mM
1 l de cebadores aleatorios (100 ng/ l, Boehringer, Alemania)
hasta 12 l H2O-DEPC.
2. Mezclar por pipeteo e incubar la mezcla a 65 C durante 5 min.
3. Pasar al hielo inmediatamente y aadir:
4 l Tampn de primera cadena (5x)
2 l DTT 0.1 M
1 l Inhibidor de RNasa RNaseOUT (Invitrogen, 40U/ l)
4. Mezclar suavemente e incubar a 42 C durante 2 min.
5. Aadir 1 l del enzima SuperScript II RT (200U/ l) y mezclar pipeteando

suavemente.
6. Incubar a 25 C durante 10 min.
98
Materiales y mtodos
7. Incubar a 42 C durante 50 min.
8. Inactivar la reaccin incubando a 70C durante 15 min.
9. El tubo de microcentrfuga con al ADNc se mantiene a -20 C.
2.16.2. PCR cuantitativa a tiempo real
Las PCRs cuantitativas a tiempo real se realizaron en el termociclador iCycler

(Biorad).
Cada reaccin contena lo siguiente:
1 l de una dilucin 1:10, 1:100, o sin diluir de ADNc (dependiendo del gen
objeto de estudio)
2.5 l de Tampn 10x sin Mg
1.5 l MgCl2 50mM
5 l dNTPs 10 mM
0.5 l Cebador 5 10 M
0.5 l Cebador 3 10 M
2.5 l Solucin SyBr Green 1x en agua Milli-Q
0.1 l Taq Platinum (Invitrogen, 5U/ l)
Completar con agua hasta alcanzar los 25 l
Solucin de SyBr Green (500x): 18 l DMSO, 1 l Fluorescena (Molecular Probes), 1 l SyBr

Green (Molecular Probes). Guardar en la oscuridad y desechar tras 7-10 das.
El programa de PCR consisti en 5 min de incubacin a 95C para activar la

Taq de arranque caliente (Hot Start), seguido de 35 ciclos de 30 seg a 95C, 45
seg a 58C y 45 seg a 70C. La fluorescencia emitida por el SyBr Green se midi al
final de la extensin de cada ciclo.
La eficiencia de la PCR se determin mediante una curva patrn de PCRs a

tiempo real, para lo que se emple como molde diluciones (normalmente entre
1:100 y 1:100000) de ADN plasmdico que contena el amplicn a estudiar. Se
consideraron vlidas aquellas parejas de cebadores cuya eficiencia estuviera entre
el 90 y el 100%.
La especificidad de la amplificacin por PCR se comprob mediante la

realizacin de una curva de desnaturalizacin del amplicn una vez finalizada la
PCR. Para ello se efectu un calentamiento desde 70C a 100C incrementando la
temperatura 1C cada minuto.
99
Materiales y mtodos
Las cuantificaciones se realizaron a partir de tres reacciones de PCR

independientes por cada muestra biolgica, analizndose la expresin de los genes
de inters al menos en dos muestras biolgicas independientes. En cada una de
estas reacciones de PCR, cada muestra se determin por triplicado. El ciclo umbral
(Ct) es calculado por el software que acompaa al equipo de la PCR cuantitativa en
tiempo real, y es el ciclo en el que comienza a detectarse el amplicn. Los
resultados obtenidos se estandarizaron a los niveles del ARNr 18S (cebadores R1 y
R2 de la Tabla 1). Los niveles relativos de transcrito se calcularon usando el mtodo
del 2Ct (Livak & Schmittgen 2001), que se resume en la siguiente expresin
algebraica:
Induccin=2[Ct(muestra)-Ct(control)]
Ct(muestra)= Ct(R)m- Ct(C)m
Ct(control)= Ct(R)c- Ct(C)c
Donde Ct(R)m y Ct(R)c son el valor de Ct para los genes ribosmicos (u otro
gen tomado como estndar) en el tratamiento analizado y en el que se considera
como control, respectivamente. De modo anlogo, Ct(P)m y Ct(P)c son el valor de Ct
del gen estudiado (problema) en el tratamiento analizado y en el que se considera
como control, respectivamente.
2.17. Secuenciacin
Las reacciones de secuenciacin se realizaron en el Servicio de

Secuenciacin del Instituto de Parasitologa Lpez Neyra (CSIC, Granada). Las
secuencias se determinaron mediante secuenciacin de cadena nica, usando un
secuenciador automtico Perkin-Elmer ABI Prism 373. Cada reaccin consista de
100-200 ng de ADN molde y 6.4 pmoles de cebador.
3. TCNICAS BIOQUMICAS Y DETERMINACIONES ENZIMTICAS
3.1 Tcnicas bioqumicas
3.1.1. Extraccin de protenas totales de levadura
Se emple el Kit RNasy de Quiagen, siguiendo el protocolo de extraccin de

ARN de levadura con alguna modificacin.
Procedimiento:
1. Centrifugar un mximo de 5x107 clulas de un precultivo crecido en

medio selectivo a 1000 g durante 5 min a 4 C.
100
Materiales y mtodos
2. Retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 400l dde

tampn Y1.
3. Incubar 30 min a 30 C en agitacin (se forman esferoplastos).
4. Directamente se utilizan esos extractos como pretenas totales.
Tampn Y1: 1 M Sorbitol, 0.1 M EDTA pH 7.4, 0.1% -Mecrcaptoetanol, 50 U de liticasa por
cada 1x107 clulas de partida.
3.1.2. Cuantificacin de protenas
La cuantificacin de protenas totales se llev a cabo mediante el mtodo de

Bradford (1976) que permite determinar espectrofotomtricamente el contenido de
protenas mediante la medida del complejo que stas forman con un colorante. Se
emple un reactivo comercial de Bio-Rad Dye Reagent Protein Assay, y albmina
de suero bovina (BSA) como protena de referencia para preparar la curva patrn
de protenas (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20 g BSA ml-1). Se adicionaron
200 l de reactivo Bio-Rad a 800 l de un volumen compuesto por la muestra o
BSA, convenientemente diluidas, y agua destilada, y se midi la absorbancia a 595
nm, de 5 min a 1 h tras la adicin del reactivo (perodo de estabilidad del
complejo). Conocidos los valores de absorbancia, se elabor una recta de regresin
lineal con los datos de la curva patrn de albmina y se calcul la concentracin de
protenas interpolando los valores de absorbancia de las muestras.
3.2 Determinaciones enzimticas
3.2.1. Determinacin de la actividad invertasa en extractos proteicos de

levadura
El mtodo utilizado para determinar la actividad invertasa consisti en poner

en contacto los extractos de protenas totales de levadura con el substrato
(sacarosa), de manera que si haba actividad invertasa, la sacarosa se hidrolizara
en glucosa y fructosa. A continuacin la glucosa y la fructosa formadas se
cuantificaron con un sistema enzimtico de reacciones acopladas, usando el Kit
Sucrose/D-Glucose/D-Fructose de Boehringer (Mannheim, Alemania) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Este kit puede ser utilizado para medir cualquiera de
los tres azcares, sacarosa, glucosa y fructosa.
Procedimiento:
1. Se utilizaron 5 g de protenas totales para la determinacin. Para eliminar

interferencias con la actividad invertasa de la propia levadura,
101
Materiales y mtodos
independiente de la que le aporta el gen con el que se ha transformado, se

utilizaron como controles internos las muestras hervidas durante 1 min a
100 C para inactivar todas las enzimas. Se realizaron al menos tres
repeticiones por muestra (hervida y sin hervir).
2. Aadir a los 5 g de protenas tampn acetato potsico 0.1M pH 4.5, hasta

un volumen final de 80 l.
3. Aadir 20 l de sacarosa 0.5 M en tampn acetato potsico 0.1M pH 4.5.

Incubar 20 min a 30 C.
4. Medir la glucosa liberada con el kit anteriormente mencionado con la

modificacin de que se ajust el volumen final de reaccin a 1 ml.
3.2.2. Determinacin de la actividad fructoexohidrolasa en extractos

proteicos de levadura
Esta determinacin se basa en la liberacin de fructosa cuando existe

actividad froctoexohidrolasa (FEH) en presencia de fructanos como substrato. En
este estudio se han utilizado como substratos un fructano con enlaces -(2-1)
(inulina de chicory, SIGMA), y un fructano con enlaces -(2-6) (levano de Erwinia
herbicola, SIGMA).
Procedimiento:
1. Se utilizaron 5 g de protenas totales para la determinacin. Para corregir

la fructosa presente en la propia levadura antes de poner en contacto las
protenas con los substratos, se utilizaron como controles internos las
muestras hervidas durante 1 min a 100 C para inactivar todas las enzimas.
La fructosa presente en esas muestras inactivadas se rest a la fructosa
liberada en las muestras. Se realizaron al menos tres repeticiones por
muestra (hervida y sin hervir).
2. Completar los 5 g de protenas hasta un volumen de 20 l con tampn

acetato sdico.
3. Aadir 80 l de tampn acetato sdico con 3% (p/v) de inulina 5 mM de

levano.
4. Incubar a 30 C durante 15, 30 y 45 min.
5. Medir la fructosa liberada con el Kit Sucrose/D-Glucose/D-Fructose de

Boehringer (Mannheim, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante,
con la modificacin de que se ajust el volumen final de reaccin a 1 ml.
102
Materiales y mtodos
Tampn acetato sdico: 50 mM acetato sdico pH 5.0, 0.2% (p/v) azida sdica.
4. DETERMINACIONES ANALTICAS
4.1. Determinacin de azcares solubles totales
Los azcares totales fueron obtenidos a partir de 1 g de peso fresco de

muestra congelada a -80 C (hoja y raz) siguiendo el siguiente procedimiento
descrito por Bligh y Dyer (1959):
1. Triturar la muestra con N2 lquido y transferirla a un tubo falcon.

2. Homogenizar la muestra con 3.75 ml de metanol mediante vrtex durante 1
min.
3. Repetir la homogenizacin durante 1 min con 3.75 ml de metanol.
4. Aadir 7.5 ml de cloroformo y homogenizar durante 1 min con vrtex.
5. Homogenizar con 3.75 ml de una solucin de H2O salada al 0.88% (p/v).
6. Centrifugar a 5000 rpm durante 10 min a 0C en una centrfuga refrigerada.
7. Usar el extracto metanlico (superior) para la determinacin de azcares.
La determinacin de los azcares totales se llev a cabo segn el mtodo

propuesto por Irigoyen et al. (1992). Se hicieron reaccionar 100 l de la muestra
obtenida como se ha mencionado anteriormente con 3 ml de reactivo de antrona.
Se hierve 10 min a 100 C. Dejar enfriar y medir absorbancia a 620 nm en un
espectrofotmetro Shimadzu UV-1603 (Shimadzu, Tokio, Japn) usando como
curva patrn glucosa a unas concentraciones 20-400 g/ml y como blanco agua
destilada.
El resultado se expresa como mg TSS g-1 pf
Reactivo de antrona: 200 mg antrona + 100 ml H2SO4 al 72% (v/v). Es un reactivo

extemporneo. Tener mucha precaucin con los vapores txicos.
4.2. Determinacin de sacarosa, glucosa y fructosa.
La medida de estos tres azcares se hizo a partir de los mismos extractos

metanlicos obtenidos para la medida de azcares solubles totales.
Procedimiento:
1. Evaporar hasta sequedad un volumen de extracto metanlico fijo para

todas las muestras (1.5 ml) con ayuda de una bomba de vaco.
103
Materiales y mtodos
2. Resuspender el precipitado en 300 l de agua Milli-Q estril.
3. Determinar la sacarosa, glucosa y fructosa presentes utilizando el Kit

Sucrose/D-Glucose/D-Fructose de Boehringer (Mannheim, Alemania)
siguiendo las instrucciones del fabricante, pero ajustando el volumen
final de reaccin a 1 ml.
El resultado se expresa como mg gluc/fruc/sac g-1 pf
5. MTODOS BIOINFORMTICOS
5.1. Identificacin de secuencias de inters en las bases de datos
Con el fin de encontrar genes implicados en el metabolismo del carbono en

plantas micorrizadas, se analizaron las bases de datos pblicas de ESTs o de ADN
genmico disponibles en la red (http://srs.ebi.ac.uk). Las secuencias all
encontradas se compararon con las secuencias aminoacdicas de genes de otros
organismos disponibles en las bases de datos usando el algoritmo Blastx (Altschul
et al. 1990).
5.2. Diseo de cebadores
Los cebadores se disearon empleando el programa Oligo Primer Analysis

(Molecular Biology Insights, Inc).
5.3. Comparacin de secuencias
El grado de homologa de las secuencias obtenidas en este estudio con las

de otros organismos presentes en las bases de datos se determin usando el
programa BESTFIT del Genetics Computer Group (Wisconsin, EE.UU.). Los
alineamientos mltiples se llevaron a cabo con el programa CLUSTALW (Thompson
et al. 1994).
5.4 Anlisis de promotores
Para estudiar la presencia de posibles motivos de unin de factores de

transcripcin en las regiones no codificantes del extremo 5 del gen, se emplearon
los programas PLACE (Higo et al. 1999) y PlantCARE (Lescot et al. 2002). Estos
programas permite la bsqueda en una determinada secuencia de motivos de
regulacin registrados en numerosas bases de datos de factores de transcripcin.
104
Materiales y mtodos
Se aceptaron como ms probables los motivos que se obtuvieron a partir de ambas

bases de datos.
5.5. Obtencin de la secuencia aminoacdica
La determinacin de la secuencia aminoacdica a partir de la secuencia

nucleotdica se realiz con la herramienta Translate de Expasy (http://expasy.org).
5.6. Prediccin de la topologa de protenas transmembrana
La identificacin de dominios transmembrana se hizo mediante SOSUI

(http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.htmlhttp://sosui.proteome.bio.tu
at.ac.jp/sosuiframe0.html) (Hirokawa et al. 1998).
6. ANLISIS ESTADSTICO
Los resultados de todas las grficas y tablas presentadas en esta Tesis

Doctoral se sometieron a un ANOVA. Cuando se detectaron diferencias significativas
como consecuencia de los tratamientos aplicados, se procedi a calcular estas
mediante el test de la Mnima Diferencia Significativa (LSD) Protegida de Fisher a
un nivel de significacin P 0.05.
En los experimentos de regulacin de la expresin gnica, la cuantificacin

de la expresin se llev a cabo mediante PCR cuantitativa a tiempo real. Los
experimentos se repitieron tres veces y el valor del Ct de cada muestra se
determin por triplicado. Se calcul la media de los tres experimentos y el error
estndar de la misma.
105
Materiales y mtodos
106
RESULTADOS
Resultados
1. DETERMINACIN DE LOS CAMBIOS INDUCIDOS POR EL DESARROLLO

DE LA SIMBIOSIS EN LA CONCENTRACIN DE CARBOHIDRATOS DE LA
PLANTA HOSPEDADORA.
Como se ha explicado anteriormente, el desarrollo de la simbiosis MA implica

una transferencia de carbohidratos desde la planta al hongo, con lo que
previsiblemente, los niveles de carbohidratos en las plantas micorrizadas deben de
estar alterados respecto a las no micorrizadas debido a la demanda adicional que
supone la presencia del hongo durante la simbiosis. Para obtener datos a este
respecto, se midi la cantidad de azcares solubles totales, as como los niveles de
sacarosa, glucosa y fructosa en plantas control regadas con 500 M de P (C),
inoculadas con G. intraradices (Gi) e inoculadas con G. mosseae (Gm) (20 de P
para ambos hongos), tanto en races como en hojas de plantas de tomate despus
de 4 y 6 semanas desde la inoculacin con el hongo MA donde la colonizacin
micorrcica era de alrededor del 10% a las 4 semanas y del 30% a las 6 semanas.
Se analizaron los tres azcares sacarosa, glucosa y fructosa por separado, ya que
son los carbohidratos implicados en las reacciones de hidrlisis de la sacarosa, paso
indispensable para la utilizacin de la misma como fuente de carbono y energa
tanto para la planta como para el hongo.
1.1 Efecto de la colonizacin micorrcica sobre el contenido de azcares

solubles totales.
En races, la concentracin de azcares solubles totales, es menor en las
plantas micorrizadas respecto a las no micorrizadas, siendo esta disminucin ms
acusada en plantas de 4 semanas. Sin embargo, en las hojas, a las seis semanas
despus de la inoculacin con los hongos MA, no haba prcticamente diferencias en
la concentracin de azcares solubles totales entre plantas control y plantas
inoculadas con ambos hongos G. mosseae y G. intraradices, mientras que a las
cuatro semanas despus la inoculacin, la concentracin de azcares solubles
totales es similar en las plantas control y en las inoculadas con G. mosseae, y
mayor en las plantas inoculadas con G. intraradices (Fig. 17).
109
Resultados
de pf
mg de azcares solubles totales g-1 de
16 A)
14
12
10
8
6
4
2
0
C Gi Gm C Gi Gm
4 semanas 6 semanas
mg de azcares solubles totales g-1 de pf
B) 18
16
14
12
10
8
6
4
2
0 C Gi Gm C Gi Gm
4 semanas 6 semanas
Figura 17. Contenido en azcares solubles totales en races (A) y hojas (B) de
plantas micorrizadas y no micorrizadas. Los carbohidratos se extrajeron de races y hojas de
plantas de tomate regadas con 500 M de P (C), plantas mocorrizadas con G. intraradices
(Gi) y G. mosseae (Gm) cosechadas a cuatro y seis semanas despus de la inoculacin con
el hongo MA. Los datos que se representan son media de tres rplicas biolgicas
independientes. Barras de error, DS (desviacin estndar).
1.2 Efecto de la colonizacin micorrcica sobre el contenido de sacarosa,

glucosa y fructosa.
Cuatro semanas despus de la inoculacin, la concentracin de sacarosa en
las races era menor en las plantas micorrizadas (con ambos hongos G. mosseae y
G. intraradices) que en las plantas control. Sin embargo, no se encontraron
diferencias estadsticamente significativas en los niveles de sacarosa entre las
plantas colonizadas por G. mosseae y las plantas no micorrizadas dos semanas ms
tarde (Fig. 18). En los dos tiempos analizados, tanto las concentraciones de glucosa
110
Resultados
como las de fructosa fueron significativamente menores en las races colonizadas

por ambos hongos, respecto a las correspondientes plantas no micorrrizadas.
3
C Gi Gm
g-11 pf
2
mg g-
4s 6s 4s 6s 4s 6s T(semanas)
Sacarosa Glucosa Fructosa
Figura 18. Contenido en sacarosa, glucosa y fructosa en races de plantas

micorrizadas y no micorrizadas. Los carbohidratos se extrajeron de races de plantas de
tomate regadas con 500 M de P (C), plantas mocorrizadas con G. intraradices (Gi) y G.
mosseae (Gm) cosechadas a cuatro y seis semanas despus de la inoculacin con el hongo
MA. Los datos que se representan son media de tres rplicas biolgicas independientes.
Barras de error, DS (desviacin estndar).
En hojas, cuatro semanas despus de la inoculacin, la concentracin de

sacarosa es mayor en las plantas inoculadas con G. intraradices, y no se
encontraron diferencias significativas entre las plantas control y las inoculadas con
G. mosseae. Dos semanas ms tardes, sin embargo, no se detecta contenido de
sacarosa en las plantas inoculadas con ambos hongos (Fig. 19). Las
concentraciones de los otros dos azcares, glucosa y fructosa, siguen el mismo
patrn, a las cuatro semanas, las concentraciones son un poco mayores en las
plantas micorrizadas (con ambos hongos G. mosseae y G. intraradices) que en las
plantas controles, y a las seis semanas, la concentracin de ambos azcares es
menor en las plantas inoculadas con G. intraradices, y es muy parecida en las
plantas no inoculadas y en las inoculadas con G. mosseae.
111
Resultados
3
C Gi Gm
2
mg g-1 pf
0
4s 6s 4s 6s 4s 6s T(semanas)
Sacarosa Glucosa Fructosa
Figura 19. Contenido en sacarosa, glucosa y fructosa en hojas de plantas

micorrizadas y no micorrizadas. Los carbohidratos se extrajeron de hojas de plantas de
tomate regadas con 500 M de P (C), plantas mocorrizadas con G. intraradices (Gi) y G.
mosseae (Gm) cosechadas a cuatro y seis semanas despus de la inoculacin con el hongo
MA. Los datos que se representan son media de tres rplicas biolgicas independientes.
1.3 Efecto de la colonizacin micorrcica sobre las enzimas implicadas en

la fijacin de carbono.
Puesto que la simbiosis micorrcico arbuscular supone una demanda
adicional de compuestos carbonados a la planta, es lgico pensar, que tanto la
fotosntesis como forma de fijar CO2 de la atmsfera para formar compuestos
carbonados, como la sntesis de sacarosa que es la forma principal de transporte de
ese carbono fijado en las plantas superiores, puedan alterarse en mayor o menor
medida por el establecimiento de la simbiosis. Para obtener datos de cmo se
alteran estos dos procesos, se analiz la expresin de una enzima clave para cada
uno. Para estudiar la fijacin del CO2 se analiz la expresin del gen que codifica la
enzima clave de este proceso que es la ribulosa bisfosfato carboxilasa-oxigenasa
(RuBisCo) (N acceso X05985), responsable del primer paso de fijacin de CO2
hasta triosa fosfato en el Ciclo de Calvin. Y para el estudio de la sntesis de
sacarosa, se analiz la expresin del gen que codifica para la sacarosa-fosfato-
sintasa (SPS) (N acceso AF071786), que cataliza la primera reaccin responsable
de la formacin de sacarosa a partir de fructosa-6-P y UDP-glucosa. El anlisis de
estas dos enzimas se llev a cabo en hojas de plantas de tomate control regadas
con 500 M de P (C), inoculadas con G. intraradices (Gi) e inoculadas con G.
mosseae (Gm) (con alrededor del 30% de micorrizacin en ambos casos), 6
112
Resultados
semanas despus de la inoculacin con el hongo MA, mediante PCR Cuantitativa en

Tiempo Real.
Como se puede apreciar en la figura 20, hay una induccin de los niveles de
transcripcin de ambos genes (SPS y RuBisCo) en las plantas micorrizadas con
ambos hongos, con respecto a las plantas control no inoculadas. Estos datos,
sugieren una activacin de la produccin de productos carbonados como
consecuencia del aumento de la demanda de dichos productos hacia la raz de la
planta cuando se establece la simbiosis.
expressin
4
less de expre
de RuBisCo
3
mbio en los nivele
1
Camb
0
Ca
C Gi Gm
Cambio en los niveles de expresin
2
de SPS
C Gi Gm
Figura 20. Efecto de la colonizacin por micorrizas sobre la expresin gnica de
RuBisCo y SPS en hojas de tomate. El ARN se extrajo de hojas de plantas de tomate control
(C), inoculadas con G. intraradices (Gi), e inoculadas con G. mosseae (Gm). Los ARNs fueron
reverso transcritos y la expresin se ensay mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real
usando cebadores gen-especfico para RuBisCo (RBCF y RBCR) y SPS (SPSF y SPSR) y los
del ARNr 18S (R1 y R2). El cambio inducido en la expresin gnica de ambos genes por la
colonizacin micorrzica se calcul usando el mtodo de 2Ct. Los datos que se representan
son media de tres rplicas biolgicas independientes. Barras de error, DS (desviacin
estndar).
113
Resultados

ENZIMAS IMPLICADAS EN LA HIDRLISIS DE SACAROSA (invertasa y
sacarosa sintasa).
Como ya se ha mencionado, debido al carcter de simbiontes obligados de

los hongos micorrcico arbusculares, dependen del carbono proporcionado por la
planta para su crecimiento. Como la sacarosa es la principal forma en que se
transporta el carbono fijado en la planta, su utilizacin como fuente de energa por
los tejidos sumidero depende de su hidrlisis en hexosas por sacarosa sintasa
invertasa. Estudios in vivo usando resonancia magntica nuclear asociada con
marcaje isotpico en races colonizadas por hongos MA (Shachar-Hill et al. 1995), y
medidas de radiorespirometra sobre hifas intraradicales aisladas (Solaiman &
Saito 1997), mostraron que la fase interna del hongo micorrcico arbuscular solo
puede tomar hexosas, principalmente glucosa. Por tanto, la sacarosa debe
hidrolizarse en la interfase planta-hongo para que ste pueda tomar las hexosas
liberadas. Para conseguir un mejor entendimiento sobre la regulacin del
metabolismo carbonado en la planta husped por la simbiosis, y habiendo mostrado
en el apartado anterior que en dicha planta husped se produce una alteracin de
los niveles de azcares as como de las enzimas responsables de la formacin de
sacarosa, en esta seccin, se analizar la regulacin transcripcional y la
caracterizacin de los genes que codifican para enzimas implicadas en la hidrlisis
de la sacarosa en plantas de tomate colonizadas por Glomus mosseae Glomus
intraradices. Dicho anlisis, se ha realizado, tanto en genes presentes en la base de
datos como en genes clonados por primera vez para esta Memoria de Tesis
Doctoral.
2.1 Clonacin de genes que codifican invertasas en races micorrizadas.

Para la bsqueda de nuevos genes que codificaran invertasas en tomate, se
disearon dos cebadores degenerados en base a dos motivos conservados de
aminocidos presentes en la mayora de las invertasas de planta: H(L/F)FYQYN
(modificado de Roitsch et al. 1995), y WEC(P/V)DF (modificado de Ohyama et al.

1998) respectivamente (Fig. 21). Ambos cebadores, InvF e InvR, se usaron para la
amplificacin por PCR de la primera cadena de ADNc procedente de races de S.
esculentum inoculadas con G. intraradices (BEG123).Tras sa amplificacin por PCR,
se obtuvo una banda del tamao esperado de aproximadamente 500 pb.
114
Resultados
A. sativum ------------------------------------------------------------
Lin5 ------------------------------------------------------------
Lin7 ------------------------------------------------------------
S. tuberosum MATQYHSSYDPENSASHYTFLPDQPDSGHRKSLKIISGIFLSSFLFTLLSVAFFPILNNQ
Inv1-1 MGGRDLESSTP--------LLHHEPYSPRKTITTIVSSIVAAALLLSLITLLNFTTKHEA
B.vulgaris ------------------------------------------------------------
C.rubrus ------------------------------------------------MASYKLPKQVIL
C.intybus ------------------------------------------------------------
A. sativum ------------------------------------------------------------
Lin5 ------------------------------------------------------------
Lin7 ------------------------------------------------------------
S. tuberosum SPDLQSNSRSPAPPSRGVSQGVSDKTFRDVVNASHVSYAWSNAMLSFTWQRTAYHFQPQK
Inv1-1 D---HHPPDVAFPMSRGVFEGVSEKSTASLIG-SAARFPWTDAML--EWQRTGFHFQPEK
B.vulgaris ------------------------------------------------------------
C.rubrus LLVSLLFFCYGVVELQAAQSPPSNQPYR-----------------------TAYHFFTQP
C.intybus -------MSNSSNASESLFPATSEQPYR-----------------------TAFHFQ--P
A. sativum -------------------LHLFYQYNPKGS-VWGNIIWAHSVSKDLINW--IHLEPAIY
Lin5 -------------------LHLFYQYNPKGS-VWGNIIWAHSVSKDLINW--IHLEPAIY
Lin7 -------------------LHLFYQYNPNGS-VWGNIVWAHSVSKDLINW--INLEPAIY
S. tuberosum --NWMNDPNGPLYHKG--WYHLFYQYNPDSA-IWGNITWGHAVSKDLIHWLYFTLPFAMV
Inv1-1 FTNWMNDPDGPMFYKG--WYHIFYQYNPVSA-VWGNITWGHAVSRNLIHW--FHLPIAFV
B.vulgaris -------------------LHLFYQYNPNGV-IWGPPVWGHSTSKDLVNW--VPQPLTME
C.rubrus RKNWINDPNGPMLFKG--IYHLFYQYNPNGVKLRGPPVWGHSTSKDLVNW--MPQPLTME
C.intybus PQNWMNDPNGPMCYNGVFTYHLFYQYNPFGPLWNLRMYWAHSVSHDLINW--IHLDLAFA
*:****** . *.*:.*::*::* . ::
A. sativum P--SKKFDKFTYGTWSGSSTILPN--NKPVIIYTGVVDSYNNQVQNYAIPANLSDPFLR-
Lin5 P--SKKFDKFTYGTWSGSSTILPN--NKPVIIYTGVVDSYNNQVQNYAIPANLSDPFLR-
Lin7 P--SKPFDQFTFGTWSGSATILPG--NKPVILYTGIIDANQTQVQNYAIPANLSDPYLR-
S. tuberosum P--DQWYDI--NGVWTGSATILPD--GQIMMLYTGDTDDY-VQVQNLAYPTNLSDPLLLD
Inv1-1 P--DQWYDFTANGALTGSATFLPD--GRIAMLYTGITTEF-VQVQCQVYPEDVDDPLLL-
B.vulgaris P--EMAANIFTNGSWSGSATILPG--NKPAILFTGLDPKY-EQVQVLAYPKDTSDPNLK-
C.rubrus PFTEMAANI--NGSWSGSATILPG--NKPAILFTGLDPNY-EQVQVLAYPKDLNDPYLK-
C.intybus P----TEPFDINGCLSGSATVLPGFTNKPIMLYTGIDTEN-RQVQNLAVPKDLSDPYLR-
* * :**:*.**. .: :::** *** . * : .** *
A. sativum -KWIKPNNN--PLIVPF--TDNSINRTEFRDPT--TAWMG-QDGLWRILIASMRKH-RGM
Lin5 -KWIKPNNN--PLIVPF--TDNSINRTEFRDPT--TAWMG-QDGLWRILIASMRKH-RGM
Lin7 -EWIKPDNN--PLIIAF--TDESINKTKFRDPT--TAWMG-KDGHWRIVMGSLRKHSRGL
S. tuberosum FTWVKYKGN--PVLVP----PPGIGVKDFRDPT--TAWTGPQNGQWLLTIGSKIG-KTGI
Inv1-1 -KWFKSDAN--PILVPF--TPPGIGSKDFRDPT--TAWYDVAEASWKLAIGSKDEQHNGI
B.vulgaris -EWFLAPQN--PVMFPTFTPQNQINATSFRXPT--TAWRL-PDGVWRLLIG-SKRGQRGL
C.rubrus -EWFLAPKNFTPVMFP--TPQNQINATSYRDPT--TAWML-PDGNWRVLIGKSKRRQRGL
C.intybus -EWVKHTGN------PIISLPEEIQPDDFRDPTTFTTWLE-EDGTWRLLVG-SQKDKTGI
*. * . * .:* ** *:* :. * : :. *:
A. sativum ALLYRS--RDFMKWIKA--QHPLHSSTFTN-TGNWECPDFFPVL--FNSTNGLDVS-YR-
Lin5 ALLYRS--RDFMKWIKA--QHPLHSSTFTN-TGNWECPDFFPVL--FNSTNGLDVS-YR-
Lin7 AIMYRS--KDFMKWVKA--KHPLHS-TFTNGTGNWECPDFYPVS--SKGTDGLDQ---Y-
S. tuberosum ALVYETSNFTFTSFKLL--DEVLHA--VPG-TGMWECVDFYPVS--TEKTNGLDTS-YN-
Inv1-1 SLIYRT--YDFVSYELL--PILLHAFTVEG-TGMWECVDFYPVL--TNSTVGLDTS-VPP
B.vulgaris SLLFRS--RDFVHWVQA--KHPLYSDFTKL-SGMWECPDFFPVYANGD-QMGVDTSIIGS
C.rubrus SLLYRS--RDFVHWVKAFTKHPLYS--YER-SGMWECPDFFPVYKNGN-TMGIDTSVIGP
C.intybus AFLYHS--GDFVNWTKS--DSPLHK--VSG-TGMWECVDFFPVWFTVDSTNGVDTSIINP
::::.: * : *: :* ***.**:** . *:*
A. sativum GKNVKYVLKNSLDVARFDYY--TIGMYHTKIDRYIFTPNNNSIDGWKGLRIDYGNF----
Lin5 GKNVKYVLKNSLDVARFDYY--TIGMYHTKIDRYIFTPNNNSIDGWKGLRIDYGNF----
Lin7 GEEHKYVLKNSMDLTRFEYY--TLGKYDTKKDRYVPFTDPDSVDSLKGLRLDYGNFYASK
S. tuberosum GPGVKHVLKASLDDNKQDHYFTAIGTYDLTK--NKCTPDNPELDCGIGLKLDYGKYYASK
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B.vulgaris --HVKHVLKNSLDITKHDIY--TIGDYNIKKDAFTYTPDIGYMNDSS-LRYDYGKYYATK
C.rubrus --NIKHVLKVSLDVSKHDVY--TIGGFTYDTKKDAYTPDVGFMNDSS-LRYDYGKYYASK
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115
Resultados
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C.intybus TVDPQLICSENDASKKGKFGPFGLLALASSDLREQ---TAIFFR-VFRK-NGRYVVLMCS
Figura 21. Alineamiento de las secuencias aminoacdicas de distintas invertasas de

plantas.
El producto de PCR fue subclonado en el vector pGEMT-Easy, y la

secuenciacin de varios clones permiti la identificacin de dos clones parciales que
codificaban una posible invertasa vacuolar (Lin9) y una posible invertasa asociada a
pared celular (Lin10) de tomate. Los extremos 3y 5de ambos genes se
obtuvieron mediante tcnica de RACE usando cebadores especficos de cada gen:
1Lin9 y 2Lin9 para la posible invertasa vacuolar, y 1Lin10 y 2Lin10 para la posible
invertasa asociada a pared celular.
El ADNc completo de Lin9 mostr un polipptido de 652 aminocidos con 73
kDa de peso molecular predicho y un punto isoelctrico de 6.34. La protena
tambin contiene cinco sitios potenciales de glicosilacin, y el extremo N-terminal
muestra la caracterstica tpica de una secuencia seal de corte con un posible sitio
de corte en la posicin 57 (Fig. 22).
116
Resultados
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Resultados
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Figura 22. Secuencia nucleotdica y deducida de aminocidos de Lin9. Las secuencias

diana para una potencial glicosilacin estn en rojo. Las zonas 3y 5no traducidas estn
subrayadas, y los motivos conservados de las invertasas cidas de plantas estn en azul.
La comparacin de la secuencia aminoacdica deducida de Lin9 con la base

de datos GenBank, descubre una similaridad determinante con conocidas invertasa
vacuolares cidas de distintas plantas, presentando la identidad ms elevada (63%)
con una invertasa vacuolar de Cichorium intybus (Van Den Ende et al. 2002), la
isoforma II de una beta-fructosidasa soluble de Daucus carota (64%) (Sturm A
1996), otras invertasas vacuolares de Citrus unshiu (63%), Beta bulgaris (61%), y
al precursor de invertasa vacuolar de Lycopersicon esculentum (57%) (Elliot et al.
1993). Como se muestra en la figura 22, Lin9 posee la secuencia de los dos
motivos conservados presentes en todas las invertasas cidas de plantas: (i) el
motivo -fructosidasa NDPNG, y (ii) el sitio cataltico de cistena WECXDF, donde X
es una valina en Lin9 como ocurre en las secuencias de las invertasas vacuolares,
mientras que en las secuencias de las invertasas extracelulares se encuentra una
prolina en esa misma posicin. Todos estos datos sugieren que Lin9 codifica una
posible invertasa vacuolar. El anlisis mediante Southern blot de ADN genmico de
tomate, indica que Lin9 es un gen de bajo nmero de copia, probablemente con
una muy pocas copias en el genoma (Fig. 23).
Bam HI
Xba I
KpnI
Kb
21
Figura 23. Anlisis mediante 5

Southern blot de Lin9 en el
genoma de tomate. Membrana 3.5
lavada tras la hibridacin bajo
condiciones de alta astringencia.
1.9
118
Resultados
En el caso del otro gen identificado, Lin10, su ADNc completo mostr un

polipptido de 531 aminocidos con un peso molecular terico de 59,7 kDa, y un
punto isoelctrico de 4.96 (Fig. 24). La protena tambin tiene cinco secuencias
susceptibles de ser glicosiladas comunes con las descritas por Van den Ende et al.
(2005) en una fructoexohidrolasa de trigo, y el extremo N-terminal muestra la
caracterstica tpica de una secuencia seal de corte con un posible sitio de corte
entre la posicin 64 y la 65. La comparacin de la secuencia aminoacdica deducida
de Lin10 con la base de datos, muestra una similaridad con invertasas asociadas a
pared clelular, beta-fructosidasas, y fructan-exohidrolasas de distintas plantas. La
identidad ms elevada (57%) es con una invertasa asociada a pared celular II de
Vicia faba (Weber et al. 1995), con beta-fructofuranosidasas de Glicine max (58%)
y Arabidopsis thaliana (57%), con invertasas de Lycopersicon esculentum en un
55% (Fridman & Zamir 2003), y un 54% de identidad con Lin6 (Ohyama et al.
1998), pero lo ms sorprendente fue la elevada identidad (57%) mostrada con la
fructan-exohidrolasa de Beta vulagaris (Van den Ende et al. 2003), mostrando una
identidad incluso mayor que con invertasas. Como en el caso de Lin9, la secuencia
aminoacdica de Lin10 posee, como se puede observar en la Fig. 24, los dos
motivos conservados en todas las invertasas cidas de plantas: el motivo NDPNG, y
el motivo WECXDF, donde X en este caso es una prolina, que como ya se ha
mencionado, es caracterstica de las secuencias de invertasas extracelulares.
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M A Q P Y
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Resultados
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Figura 24. Secuencia nucleotdica y deducida de aminocidos de Lin10. Las

secuencias diana para una potencial glicosilacin estn en rojo, y las zonas 3y 5no
traducidas estn subrayadas.
El anlisis por Southern blot del ADN genmico de tomate hace pensar que Lin10
es un gen de bajo nmero de copia, probablemente dos (por las dos bandas
observadas en la digestin del ADNg con XbaI) pocas copias por genoma (Fig.
25).
120
Resultados
Bam HI
Xba I
KpnI
Kb
21
5 Figura 25. Anlisis mediante

3.5 Southern blot de Lin10 en el
genoma de tomate. Membrana
lavada tras la hibridacin bajo
condiciones de alta astringencia.
1.9
2.1.1. Clon genmico de Lin10

Las estructuras de los genes de invertasas son bastante similares,
conteniendo cada uno entre seis y ocho exones (Tymowska-Lalanne & Kreis 1998).
Muchos de los genes como ya se ha mencionado anteriormente, contienen un exn
extremadamente pequeo (exon II) que codifica el triplete altamente conservado
DNP, siendo uno de los exones ms pequeos publicados hasta ahora. Burnay y
colaboradores (1996) demostraron el splicing alternativo de este mini-exn en
genes de invertasas de patata durante la induccin por fro, y propusieron un papel
fisiolgico para la deleccin del motivo -fructofuranosidasa DNP.
Dado que Lin10 muestra homologa tanto con invertasas asociadas a pared
celular, como con fructan-exohidrolasas, y que curiosamente, en contra de lo
esperado por la localizacin vacuolar de los fructanos de que los ADNc de 1-FEHs
de plantas estuviesen ms estrechamente relacionados con las invertasas
vacuolares se demostrase inesperadamente, que basndose en los alineamientos
de secuencias, la 1-FEH es ms similar a las invertasas asociadas a pared celular
que a invertasas vacuolares (Van den Ende et al. 2000, 2001), se decidi estudiar
su estructura gnica, para comprobar si coincida con la anteriormente descrita.
Para ello, se utilizaron los cebadores 6Lin10 y Lin10G en ADN genmico de tomate
digerido para el paseo cromosmico siguiendo las instrucciones del fabricante (kit
Universal GenomeWalker de Clontech). Como resultado, se obtuvo un fragmento
genmico de 2617 nucletidos (Fig. 26). Lin10 est organizado en ocho exones y
121
Resultados
siete intrones, conteniendo adems un mini-exn de 9 nucletidos (exn II) que

codifica el tripptido DPN de la regin WINDPNG de la figura 24. Este mini-exn,
est conservado en muchas invertasas de plantas, excepto en la invertasa asociada
a pared InvDC1 de zanahoria que tiene la regin DPN incorporada en el exn
principal (Sturm 1995). Tiene particular inters el hecho de que en los genes de
invertasas asociadas a pared celular, el mini exn est seguido de un corto intrn
, como en el caso de InvDC1 no exista tal intrn. En contraposicin, las invertasas
vacuolares tienen segundos intrones mucho ms largos (mayores de 1000 pb)
cmo es el caso de InvLe31 (Elliott et al. 1993), e incluso de algunas fructan-
exohidrolasas como FEHIIa de endibia (Michiels et al. 2004). Lin10 es ms similar a
las invertasas asociadas a pared celular ya que posee un segundo intrn corto de
slo 187 nt.
ATGGCTCAGCCTTACAGAACTGCTTATCATTTCCAACCTCCCAAGAATTGGA
TAAATGGTACATTCTTAACACACTCATTCTTCTTCAGAAATATAATTAATTTT
GTGTAATCTAGTCGAAGTTAATTCTTTTTAATTGATTTATGTTCCGATGAATC
GTGTGATTGACTTGTAATGCTGATGAACTGGGAATACATGGCATGTCGTTGA
ATTTACAGATCCTAATGGTAAGTTTTCCAGTCTAATCATCAATGTTCTGTTT
AGAGAACTTACAATTTTATTACATTGATCTACCTTTTAAATAGCAATATAAT
GTCAAGTAATAGTAGTAGCAAATTGTTTTGCCAATTTTACCCTCCGTGTTTG
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AATGATCTACAAGGGAATTTACCATTTATTTTACCAGTACAATCCTGAAAGT
GCAGAATGGGGAAACATAGCATGGGGCCATTCTACTTCAACTGATCTTGTC
AACTGGACTATTCATCCTCCCGCTCTTTTGCCTTCAGACGCATATGATATCA
ACGGTTGTTGGTCAGGTTGTTACGATTTTTGTGAAAATATTTTGTTTATTATT
TCAGGAGATAGATCGATATCATTATATCAAGTATAAATAAAAAATTCATTTC
TTCACAGGTTCTGCGACGATCCTCCAAGATGGCACACCAGCTATACTCTATA
CCGGAGGCAATTCACAAAAAGTTCAACTTCAAAATCTAGCTGTGCCTAAAG
ATCCATCCGACCCTTACCTTGTCGAGTGGGTTAAATCTCCTGATAATCCAAT
CATGATACCGAATGAAGATGAGAAAGAATCGTTTAGAGACCCAACCACCGC
GTGGTTAGGGCCTGATGGGATTTGGAGAGTTGTTATAGGAAATGAAAGAGA
AAACAGAGGAACTGCTGTTTTATATAAGAGTGAAGATTTTATTCGTTGGACT
GAAGCAGAGCGGCCTCTGCATTCGTCCAGTGAAACTACAATGTGGGAATGC
CCTGATTTTTTCCCTGTCTTAGTTGACGGGGAAAATGGACTTGACATTTCAG
AGATTTTTTCAGGGATAAAACACGTGCTTAAAAATAGCGTGGCTCGTTCATT
TGTTGATTATTATACTGTTGGAGCGTATGACCATCACAACGATGTGTATACA
CCAGATGAGGGATCGGTAGACAATGAATCAGGATTACGATTGGATTATGGA
AGGTATTACGCTTCCAAATCTTTTTTTGATAGTGAGAAGAAGAGGAGAATCT
TCATTGCTTGGGTTAATGAGTCTACAAGTAAGGAAATCGATTTAATTAAAGG
ATGGTCTGGTCTTCAGGTAATAATTCGTTTAGGTGACCATTTATTTTTATCCC
AAAGACAAATTTAATTTTGAACTTCTCATTTTTCCGTCAAAACTAAAGTTCA
ATATCCTTGTACTATTACAGTCGTTTCCTAGGAAAATTTGGCTGGATAAAGG
TGGAAAGCAATTGGTTCAATGGCCTGTTGAAGAAATCGAAATGCTGAGGAC
AAACAAAGTTGATTTACAAAATATAACACTCGAAGCTGGTTTAAAACGTGA
GATTTGTGGTGTCACTGCTGCACAGGTATAATTCTTCCTATGCAAAAGCTTG
TCAATTTCTTTTGTTGATATTATTCGTCCAAATCCAAAACAACTTGCTAATTT
122
Resultados
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GGTTGCTAGTTTTGGCCTCAAATAAAATTGAAGAATATACAGCAATATTCTT
TAGAATTTTCAAAAAGAATGACAAGTTTGTTGTGTTAATGGGCTGTGACCAA
AAAAGGTACAAAAATCACCCTGGATTTGGTTTTACATTGATAACCAATAAA
TTTTTGTTTTCTACTTGTAGATTTATAGATTGAGAGTAAATTTTTTGAAATGC
AGGTCATCTGTGGGCCTTGAATATGATAAAACCAATTATGGAGCCTTTTTGG
ACATTGATCCTCTTACAGAAAAATTATCACTAAGAACTTTGGTAAGTTTCAC
TATCGAATTAATTATACATATCAGCGAGAGAGAAATAAAGTGAGAGCTCCT
GGGGAGGAGTCTAATAAAAAGGATCTATTTTTTCAGATTGATCATTCGATTG
TAGAAAGCTTTGGCGGAGGTGGAAAAGCTTGCATCACAACAAGAGCTTATC
CAACTTTGGCCATCAATGATAATGCCCATATTTTTGTTTTCAACAATGGATC
CCAACATGTTGACATCTCCACTTTGAGTGCTTGGAGCCTAAACCAGGCTCAC
ATCAATTGAATCATTAATTCAAAATGTAATTTTTAAAATTTTCAACCACCAA
AACATTTGGAGAAGTCTTTGCCATTTTGTTCATTTTAAAGTTTGTTTGAATCG
TTTACTGCTCTTGCATTTATGTAACTACAACTACATACTTGCCCTTTTTTACT
TGTCATTCTTACGCAGA PoliA
Figura 26. Estructura genmica de Lin10. Los exones estn en rojo y los
intrones en negro. El mini-exn DPN est subrayado.
2.2 Anlisis funcional de los genes clonados Lin9 y Lin10.

2.2.1. Expresin heterloga de Lin9 y Lin10 en Saccharomyces
cerevisiae.
Para la caracterizacin de los productos gnicos de Lin9 y Lin10, se
obtuvieron las secuencias completas de Lin9 y Lin10 mediante PCR, usando ADNc
de tomate como ADN molde, y juegos de cebadores que flanqueaban la pauta
abierta de lectura completa (cebadores 3Lin9/4Lin9 y 3Lin10/4Lin10
respectivamente). Para Lin10 se obtuvo la secuencia esperada segn se haba
obtenido mediante la tcnica de RACE, pero para Lin9, se obtuvieron dos
secuencias: una que corresponda con la obtenida mediante RACE, y otra que tena
75 pb menos que la anterior (ver secuencia en negrita en la fig. 22), sin que por
ello se vea alterada la pauta de lectura. A sta nueva isoforma de Lin9 se la llam
GLin9, y ambas isoformas del gen se utilizaron para el anlisis funcional mediante
expresin heterloga.
Las secuencias completas de ambos genes Lin9, Lin10 y GLin9, se clonaron en el
sitio NotI del vector pFL61, puente entre E. coli/S. cerevisiae (Minet et al. 1992),
obteniendo as los vectores pLin9, pGLin9 y pLin10 que contenan respectivamente
el ADNc de Lin9, GLin9 y Lin10 aguas abajo del promotor constitutivo de S.
cerevisiae de la fosfoglicerato kinasa. La cepa de levadura mutante deficiente en
actividad invertasa SEY 2102 (Emr et al. 1983), y la cepa control positivo DBY746,
fueron transformadas con los plsmidos pLin9, pGLin9, pLin10 y slo con pFL61
123
Resultados
(vector vaco) usando el mtodo del Cloruro de Litio, para comprobar si las
protenas codificadas por los tres genes funcionaba como invertasas. Los
transformantes Ura+ fueron identificados mediante su crecimiento a 30C sobre
placas de medio selectivo SD con glucosa como fuente de carbono, y
suplementadas con leucina e histidina en el caso de SEY 2102, y con leucina y
adenina en el caso de DBY746. Los transformantes seleccionados, se sembraron
sobre placas que contenan sacarosa como fuente de carbono para comprobar la
funcionalidad de los genes Lin9, GLin9 y Lin10. Sin embargo, dichos
transformantes, no fueron capaces de crecer en presencia de sacarosa. Para
determinar si las construcciones gnicas eran aceptadas por la maquinaria
transcripcional de S. cerevisiae, se aisl ARN de dos de las levaduras transformadas
con cada uno de los tres genes y se ensay la expresin de los transcritos de Lin9,
GLin9 y Lin10 mediante RT-PCR, usando cebadores especficos de cada gen. En la
figura 27 se puede ver como Lin9, GLin9, y Lin10 se expresaban intensamente en la
levadura mutante transformada con el vector pFL61 que contena dichos genes,
mientras que no se detectaba seal en la levadura mutante transformada con el
vector vaco.
1 2 3 4 5 6 7 8
ARNr
Figura 27. Anlisis de la expresin de Lin9, GLin9, y Lin10 en S. cerevisisae. La

expresin gnica se analiz por RT-PCR. El ARN aislado de dos de los transformantes de
levadura con pFL61 (calles 1 y 2), y sus derivados pLin10 (calles 3 y 4), pLin9 (calles 5 y 6),
y pGLin9 (calles 7 y 8), fueron reverso transcritos y amplificados mediante PCR con
cebadores especficos de cada uno de los genes: para Lin9, 2Lin9 y 3Lin9; para GLin9, 3Lin9
y 6Lin9; y para Lin10, 4Lin10 y 5Lin10. El ARN ribosmico 18S se us como control de la
expresin gnica utilizando los cebadores NS31 y NS41.
El hecho de que los genes no sean funcionales en la levadura, puede

deberse a distintos factores, pero el principal sera que la estructura nativa de las
protenas sea distinta en las clulas de levadura que el las de tomate, anulando as
su funcionalidad en la levadura viva.
124
Resultados
2.2.2. Determinacin de la actividad invertasa en extractos proteicos

de levadura.
Para comprobar si las protenas codificadas por Lin9, GLin9 y Lin10 tenan
actividad invertasa, se determin actividad invertasa a partir de extractos proteicos
obtenidos de las levaduras transformadas. Para ello, se extrajeron protenas totales
de cada una de las ocho colonias de levadura donde previamente se haba
analizado la expresin de los transcritos de cada uno de los genes, y tambin se
obtuvieron protenas de la cepa control DBY746 que s tiene actividad invertasa.
Para las determinaciones, se utilizaron 5 g de protenas totales que se incubaron
con sacarosa en un pH cido que es el ptimo para las invertasas vacuolares y
asociadas a pared celular. Por ltimo, se determin glucosa liberada segn se
describe en material y mtodos. Segn mostraron las determinaciones, ni las
protenas codificadas por GLin9, ni por Lin10 fueron capaces de degradar sacarosa
ya que no haba liberacin de glucosa tras la incubacin, lo mismo que ocurra con
las protenas de las levaduras transformas con el vector vaco. Sin embargo, los
extractos proteicos de las levaduras transformadas con pLin9, si mostraron
actividad invertasa mostrando valores de degradacin de sacarosa que se
aproximan a los de la cepa control DBY746 como se puede apreciar en la Figura 28.
1,4
1,2
g gluc/g prot
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
n9
0
9
1
02
in
6
+
Li
in
FL
C
L
21
/p
/p
Y
/p
/p
Y
Y
SE
SE
SE
SE
SE
Figura 28. Determinacin de la actividad invertasa en extractos proteicos de

levadura. Barras de error, DS (desviacin estndar).
El hecho de que la isoforma de Lin9 a la que le faltan 75pb no tenga

actividad invertasa, y la isoforma inicial obtenida que tiene esos 75pb ms si
125
Resultados
muestre actividad invertasa, hace pensar en algn fenmeno de regulacin

mediante splicing alternativo para regular la funcionalidad del gen Lin9.
Como Lin10 no mostraba actividad invertasa, y debido a que muestra
homologa tanto con invertasas asociadas a pared celular, como con fructan-
exohidrolasas, se llev a cabo la determinacin de la actividad fructoexohidrolasa
en los extractos proteicos de levadura transformada con pLin10, ya que como ya se
ha mencionado, el los ltimos tiempos ha habido algunos descubrimientos de
enzimas que se haban descrito como invertasas asociadas a pared celular y
recientemente se ha demostrado que en realidad son fructo-exohidrolasas, y de
esta manera, poder comprobar si Lin10 es uno de estos casos.
2.2.3. Determinacin de la actividad fructo-exohidrolasa en extractos

proteicos de levadura transformada con pLin10.
Para sta determinacin, se utilizaron los extractos de protenas totales de la
levadura mutante SEY2102 sola, transformada con el vector de expresin pFL61
vaco, y con la construccin pLin10 (pFL61-Lin10). Al igual que para la actividad
invertasa, se utilizaron 5 g de protenas en cada medicin, los cuales se incubaron
en presencia de los dos principales tipos de fructanos: inulina y levanos, que
difieren en los tipos de enlaces por los que se une las unidades de fructosa que los
componen. En este caso, se midi fructosa liberada a varios tiempos de incubacin.
Como resultado se obtuvo, que en presencia de levanos, Lin10 no presentaba
actividad fructoexohidrolasa, ya que no se detect fructosa liberada en presencia de
este sustrato, lo que era similar a lo que ocurra cuando las protenas procedan de
la cepa de levadura mutante sola, o transformada con el vector vaco. Sin embargo,
cuando el sustrato presente en la reaccin fue inulina, ni en el caso de la cepa
mutante sola, ni cuando estaba transformada con el vector vaco se detect
fructosa liberada, pero cuando la cepa de levadura SEY2102 estaba transformada
con pLin10 se detect fructosa liberada en todos los tiempos ensayados, lo que se
ilustra en la figura 29. La cantidad de fructosa liberada aumenta con el tiempo de
incubacin hasta los 45min donde alcanza un valor que se mantiene en tiempos
mayores (datos no mostrados en la figura). En vista de estos resultados, se
confirma que Lin10, an a pesar de tener la mayor homologa con invertasas
asociadas a pared celular no tiene tal actividad enzimtica, sino que en lugar de
degradar sacarosa directamente, degrada fructanos (otro tipo de carbohidratos de
reserva), y concretamente, fructanos tipo inulina (con enlaces -(2-1)), necesitando
posteriormente la actuacin de una invertasa para degradar completamente el
compuesto de reserva.
126
Resultados
g fruc/g prot
4
0
15min 30min 45min
Figura 29. Actividad fructoexohidrolasa de Lin10. Fructosa liberada tras 15,

30 y 45 min de incubacin de los extractos de protenas totales de la levadura SEY2102
transformada con pLin10 con 3% (p/v) de inulina. Barras de error, DS (desviacin estndar).
2.3 Regulacin por el desarrollo de la simbiosis de la expresin de los genes

aislados y de otras isoformas presentes en la base de datos.
Dado que se asume que la sacarosa sintetizada en la parte area de la
planta debe de ser hidrolizada en la raz antes de poder ser utilizada por el hongo
micorrcico arbuscular como fuente de carbono, la simbiosis debe alterar el patrn
de expresin de las enzimas implicadas en dicha degradacin, siendo unas de ellas
las invertasas. Por esta razn, se estudi la expresin de dichas enzimas, tanto la
aislada y caracterizada (Lin9) durante esta Memoria de Tesis Doctoral, como otras
isoformas presentes ya en la base de datos. Al mismo tiempo, se analiz la
regulacin por la simbiosis del gen Lin10, que aunque como se ha mostrado
anteriormente, no posee actividad invertasa, presenta una actividad muy
relacionada con ella, ya que con su actuacin se liberan azcares que podran ser
tomados por el hongo y sacarosa, que es el sustrato de las invertasas. Adems y
ms importante, se ha hipotetizado con diversas funciones de las
fructoexohidrolasas en las interacciones planta-microorganismo, por lo que se
plante elucidar si son importantes en la simbiosis planta-hongoMA.
La regulacin de la expresin gnica en todos los casos se analiz mediante
PCR Cuantitativa a tiempo real en ARN aislado de plantas micorrizadas y no-
micorrizadas. Con ste fin se realiz el experimento 1 descrito en material y
mtodos (apartado 1.3.1), en el cual tenamos plantas control regadas con distintas
cantidades de fsforo, para comprobar si la regulacin de los distintos genes, se
deba realmente a la simbiosis de la planta con el hongo, era consecuencia
solamente de la mejor nutricin fosforada que suelen tener las plantas micorrizadas
respecto a los no micorrizadas. Las plantas controles a las que se le aportaba igual
cantidad de fsforo que a las plantas micorrizadas (20 M), fueron incapaces de
127
Resultados
crecer durante el desarrollo del experimento. En la figura 30 se muestran los datos

de crecimiento de las distintas cosechas en peso fresco, as como la micorrizacin
de las plantas en los distintos tiempos de cosecha.
A)
40 b
Gi Micorrizacin (%)
a
30 Gm a
a
20
a
a
10
a
b
0
3 4 5 6 T(semanas)
B)
20 c
C100 Peso parte area (g) b b
15 C500 f
Gi
10 Gm de
c
de de
5 c c
a b b ab ab
0
3 4 5 6 T(semanas)
C)
8 b
C100 Peso Raz (g)
6 C500 b b
Gi d
4 bcd
Gm d bc
bc
2 c b
a
abb b a
0
3 4
2
4 35 46 T(semanas)
Figura 30. A) Datos del porcentaje de micorrizacin de las plantas. B) Pesos

frescos de la parte area de las plantas expresado en gramos. C) Peso fresco de las races de
128
Resultados
las plantas expresados en gramos. Las letras iguales dentro de cada tiempo, significa que los
valores no difieren significativamente (P0.05) segn el test de Ficher LSD. Gi corresponde
al las plantas inoculadas con Glomus intraradices y Gm a las inoculadas con Glomus
mosseae.
En nuestros estudios, nos interesaba comparar los cambios inducidos por el

desarrollo de la simbiosis en el metabolismo carbonado de las races hospedadoras,
ms an, si podamos distinguir entre los cambios producidos en un estadio inicial
de la colonizacin, con los inducidos cuando la simbiosis ya est bien establecida.
En base a esto, se eligi el tiempo de 4 semanas como representativo de una fase
inicial de la colonizacin donde haba un 14% para G. intraradices (Gi) y un 9%
para G. mosseae (Gm) de la longitud de la raz micorrizada, y el tiempo de 6
semanas para el estudio en un estado de la simbiosis bien establecida donde se
encontr una media de un 38% y un 30% de longitud de raz micorrizada para
plantas inoculadas con Gi y Gm respectivamente. Y como plantas controles se
seleccionaron para los estudios de expresin, el tratamiento C500 M de fsforo, ya
que como se puede apreciar en las figuras anteriores, es el que tiene un estado
fisiolgico ms parecido a las plantas micorrizadas, con lo que se minimizaban as
factores de variacin en la expresin gnica. Las plantas controles a las que se le
aportaron una cantidad de fsforo ms parecida a la de las plantas micorrizadas
(100 M), tenan un desarrollo mucho menor que las inoculadas, por lo que la
comparacin entre estas dos plantas no era adecuada, ya que el distinto estado
fisiolgico tambin influye en la expresin gnica.
Los genes de tomate analizados fueron: las invertasas vacuolares Lin9
(descrita en la presente Tesis Doctoral, N acceso AM050394) y TIV1 (Lin4) (N
acceso AF4656131), las invertasas asociadas a pared celular Lin5 (N acceso
X91389), Lin6 (N acceso AB004583), Lin7 (N acceso X91391), la invertasa Lin8
(N acceso X91392), y la froctoexohidrolasa Lin10 (descrita en la presente Tesis
Doctoral).
2.3.1. Regulacin de la expresin gnica en races.

La expresin gnica de las invertasas vacuolares Lin9 (ambas isoformas)
y TIV1, una invertasa vacuolar de tomate previamente clonada (Klann et al. 1992),
se ensay mediante PCR Cuantitativa en Tiempo Real en ARN aislado de races
micorrizadas y no-micorrizadas. Como se muestra en la Fig. 31A), la colonizacin
por ambos hongos no afect a los niveles de transcritos de Lin9 (isoforma
funcional) en ninguno de los dos tiempos analizados, obtenindose idnticos
resultados cuando se utilizaron cebadores (3Lin10 y 7Lin10) que cuantificaban la
expresin de ambas isoformas (funcional y no funcional), pero no se detectaron
trancritos de GLin10 cuando se utilizaban cebadores especficos de la isoforma no
129
Resultados
funcional (3Lin10 y 6Lin10). De esta manera, dado que la isoforma funcional de

Lin9 es la nica que se expresa en nuestro sistema experimental, todos los anlisis
posteriores se hicieron ya solo sobre dicha isoforma. Sin embargo, si se observ
una induccin de TIV1 en las races colonizadas tanto por G. mosseae (Gm) como
por G. intraradices (Gi) que mostraban alrededor de un 30% de colonizacin
micorrcica. El incremento de los niveles de expresin gnica de TIV1 fue mayor en
las races colonizadas por G. mosseae (una induccin de 4.4 veces), que en las
colonizadas por G. intraradices (una induccin de 2.2 veces) (Figura 31B).
5 A)
4
3
de Lin9
0
C Gi Gm C Gi Gm
4 semanas 6 semanas
B) 6
5
4
de TIV1
3
2
1
0
C Gi Gm C Gi Gm
4 semanas 6 semanas
Figura 31. Efecto de la colonizacin por micorrizas sobre la expresin gnica de Lin9
(A) y TIV1 (B) en races de tomate. El ARN se extrajo de races de plantas de tomate control
(C), inoculadas con G. intraradices (Gi), e inoculadas con G. mosseae (Gm). Los ARNs fueron
usando cebadores gen-especfico para Lin9 (2Lin9 y 3Lin9 3Lin10 y 7Lin10) y TIV1 (TIV1F
y TIV1R) y los del ARNr 18S (R1 y R2). El cambio inducido en la expresin gnica de ambos
genes por la colonizacin micorrzica se calcul usando el mtodo de 2Ct. Los datos que se
representan son media de tres rplicas biolgicas independientes. Barras de error, DS
(desviacin estndar).
130
Resultados
Respecto a las invertasas asociadas a pared celular estudiadas, solo Lin6,

que es la nica invertasa asociada a pared celular que se expresa en races de
tomate (Godt & Roitsch 1997), fue detectada en las races de nuestro sistema
experimental. Los niveles de ARNm de Lin6 fueron ms elevados en las plantas
micorrizadas que en las plantas control (Fig. 32). La expresin de Lin6 fue la misma
en las races colonizadas por Gm y por Gi y no se afect por el nivel de colonizacin
micorrzica de la raz.
2
de Lin6
0
C Gi Gm C Gi Gm
4 semanas 6 semanas
en races de tomate. El ARN se extrajo de races de plantas de tomate control (C), inoculadas
con G. intraradices (Gi), e inoculadas con G. mosseae (Gm) recogidas cuatro y seis semanas
despus de la inoculacin. Los ARNs fueron reverso transcritos y la expresin se ensay
mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real usando cebadores gen-especfico para Lin6
(Lin6F y Lin6R) y los del ARNr 18S (R1 y R2). El cambio inducido en la expresin gnica de
este gen por la colonizacin micorrzica se calcul usando el mtodo de 2Ct. Los datos que
se representan son media de tres rplicas biolgicas independientes. Barras de error, DS
El estudio de la regulacin por el desarrollo de la simbiosis de la fructo-

exohidrolasa Lin10, mostr que los niveles de expresin de Lin10 eran mucho
ms elevados en plantas micorrizadas que en plantas control a los dos tiempos
analizados (Fig. 33). A las cuatro semanas despus de la inoculacin, el incremento
de los niveles de expresin gnica de Lin10 eran similares en las races colonizadas
por Gm y Gi (una induccin de alrededor de 4 veces), sin embargo, dos semanas
ms tarde, los niveles de ARNm de Lin10 eran mucho ms elevados en las plantas
micorrizadas con Gi (una induccin de 30.9 veces) que en las micorrizadas con Gm
donde los niveles se mantienen prcticamente igual que dos semanas antes (una
induccin de 4.3 veces).
131
Resultados

35
30
25
de Lin10
20
15
10
5
0
C Gi Gm C Gi Gm
4 semanas 6 semanas
en races de tomate. El ARN se extrajo de races de plantas de tomate control (C), inoculadas
con G. intraradices (Gi), e inoculadas con G. mosseae (Gm) recogidas cuatro y seis semanas
despus de la inoculacin. Los ARNs fueron reverso transcritos y la expresin se ensay
mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real usando cebadores gen-especfico para Lin10
(4Lin10 y 5Lin10) y los del ARNr 18S (R1 y R2). El cambio inducido en la expresin gnica de
este gen por la colonizacin micorrzica se calcul usando el mtodo de 2Ct. Los datos que
se representan son media de tres rplicas biolgicas independientes. Barras de error, DS
2.3.2. Regulacin de la expresin gnica por el fsforo suministrado.

Para determinar si la regulacin de los genes estudiados era debido a un
efecto directo de la colonizacin de las races por los hongos MA, o a un efecto
secundario por el aumento de la nutricin fosforada, se determinaron los niveles de
expresin de los genes en races de plantas no micorrizadas con 4 y 6 semanas que
haban crecido en presencia de 100 y 500 M de fsforo. Como muestra la figura
34, TIV1 y Lin6 no manifestaron cambios significantes en respuesta al fosfato. Esto
indica, que las alteraciones que ocurren en los niveles de transcritos de ARN de las
races micorrizadas en estos experimentos, se deben directamente al hongo y no a
un efecto indirecto por un aumento del fosfato disponible. Sin embargo, la
expresin de Lin9, un gen que no estaba regulado por el desarrollo de la simbiosis,
disminuy en las races de plantas con 6 semanas cuando la nutricin fosforada era
mayor. Respecto a Lin10, sus niveles de ARNm disminuyen significativamente tanto
en races de 4 como de 6 semanas, cuando hay una mejor nutricin fosforada, lo
que significa que la fuerte induccin de la expresin gnica en presencia de hongos
MA se debe al establecimiento de la simbiosis, ya que por el efecto de la mejor
nutricin fosforada debera ocurrir todo lo contrario (inhibicin de la expresin).
132
Resultados

A) 3
de Lin9
1
0
C100 C500 C100 C500
4 semanas 6 semanas
3
B)
2
de TIV1
0
C100 C500 C100 C500
4 semanas 6 semanas
C) 3
2
de Lin6
0
C100 C500 C100 C500
4 semanas 6 semanas
133
Resultados

D) 3
de Lin10
2
0
C100 C500 C100 C500
4 semanas 6 semanas
Figura 34. Efecto de la fertilizacin con fosfato sobre la expresin gnica de Lin9 (A),
TIV1 (B), Lin6 (C) y Lin10 (D) en races de tomate. El ARN se extrajo de races de plantas
control regadas con solucin nutritiva de Hoagland a la mitad de fuerza que contena 100
500 M de P. Los ARNs fueron reverso transcritos y la expresin se ensay mediante RT-PCR
cuantitativa a tiempo real usando cebadores gen-especfico para cada uno de los genes y los
del ARNr 18S. El cambio inducido en la expresin gnica por la fertilizacin con P en cada
uno de los tiempos de cosecha, se calcul usando el mtodo de 2Ct. Los datos que se

de raz Phytoptora parasitica (Phy).
Para determinar si el efecto observado en algunas invertasas de tomate
(Lin9, TIV1 y Lin6) y en la FEH Lin10, era una respuesta especfica de la simbiosis
MA, la expresin de estos genes se analiz tambin en plantas inoculadas con el
patgeno de raz P. parasitica (experimento 2 descrito en el punto 1.3.2. de
material y mtodos). Las plantas tenan cuatro semanas cuando fueron inoculadas
con el patgeno no inoculadas (control), y se cosecharon dos semanas despus
(6 semanas en total). Las races de las plantas inoculadas con P. parasitica,
mostraban claramente reas necrticas (un promedio de nivel 2, que es un nivel
medio de sntomas). Como se muestra en la figuras 35 y 36, los niveles de Lin9,
Lin6 y Lin10 se inducen en las races de las plantas infectadas con P. parasitica,
mientras que los niveles de expresin de TIV1 no se afectan.
134
Resultados

4
3
de Lin9
2
C Phy
Cambio en los niveles de expresin 2

de TIV1
C Phy
Figura 35. Efecto de P. parasitica sobre la expresin gnica de las invertasas

vacuolares Lin9 y TIV1. El ARN se extrajo de races de plantas de tomate control (C), y
plantas inoculadas con P. parasitica (Phy). Los ARNs fueron reverso transcritos y la expresin
se ensay mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real usando cebadores gen-especfico para
cada gen y los del ARNr 18S. El cambio inducido en la expresin gnica de ambos genes en
la races por P. parasitica, se calcul usando el mtodo de 2Ct. Los datos que se
4
de Lin6
0
C Phy
135
Resultados

4
de Lin10
2
0
C Phy
Figura 36. Efecto de P. parasitica sobre la expresin gnica de la invertasa asociasa a

pared celular Lin6 y la fructo-exohidrolasa Lin10. El ARN se extrajo races de plantas de
tomate control (C), y plantas inoculadas con P. parasitica (Phy). Los ARNs fueron reverso
transcritos y la expresin se ensay mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real usando
cebadores gen-especfico para cada gen y los del ARNr 18S. El cambio inducido en la
expresin gnica de ambos genes en las races por P. parasitica, se calcul usando el mtodo
de 2Ct. Los datos que se representan son media de tres rplicas biolgicas independientes.
2.4 Bsqueda y anlisis de los promotores de los genes que se regulan por
la simbiosis.
Para comprender mejor las causas de la activacin transcripcional en las
plantas micorrizadas de Lin6, TIV1 y Lin10, se decidi analizar la secuencia de sus
promotores en busca de elementos reguladores similares a elementos ya conocidos
mediante el alineamiento de secuencias. Con este propsito, se recuperaron las
secuencias de los promotores de Lin6 (N acceso AF506004) y TIV1 (N acceso
Z12027) de la base de datos Genebank, y se aisl el posible promotor de Lin10
mediante amplificacin por PCR a partir de una genoteca de ADN genmico de
tomate utilizando el cebador 2Lin10. Mediante paseo cromosmico se lograron
aislar 3594 pb aguas arriba del codn de inicio de la transcripcin de Lin10. La
comparacin de esa secuencia genmica obtenida como posible promotor de Lin10
con la base de datos, revel que la zona perteneciente a la secuencia promotora de
Lin10 era de 989 pb. El anlisis informtico de esta secuencia nos ha permitido
identificar entre otros, varios dominios de respuesta a micorrizas arbusculares
(Karandashov et al. 2004), el dominio GAAAAA implicado en la respuesta frente a
patgenos (Park et al. 2004), y secuencias comunes con el promotor de FEH IIa
(Michiels et al. 2004) (Fig. 37).
136
Resultados
+ TGATCTGCTTG ACCTTTTTGA GAGGAGTGTC GCTTGCTTAA TTTTTTGCAT TATCTGGTTT TAGCCCTTTT

- ACTAGACGAAC TGGAAAAACT CTCCTCACAG CGAACGAATT AAAAAACGTA ATAGACCAAA ATCGGGAAAA
+ ATCTTGAAAC ATTCAGCTGT TTACAATTTT GAACAACTAG TTTTGTATTT GAAGTATCCA TGTTCTTGCT

- TAGAACTTTG TAAGTCGACA AATGTTAAAA CTTGTTGATC AAAACATAAA CTTCATAGGT ACAAGAACGA
+ GAACGAGTCT CTTGAACTTA AAACAATAGT TTCTAGTAAA ATTTTGTGTT GAAAGTATAC ATTTCCTTGC

- CTTGCTCAGA GAACTTGAAT TTTGTTATCA AAGATCATTT TAAAACACAA CTTTCATATG TAAAGGAACG
+ AGTGATCGAG TTTCTTGAAT CTCAAACAAA TAAAATTCTA GTAGATTGTG TTGAAGTATC CCTTTTCATG

- TCACTAGCTC AAAGAACTTA GAGTTTGTTT ATTTTAAGAT CATCTAACAC AACTTCATAG GGAAAAGTAC
+ CAGAGATGGG GTTGCGTTCG AACTCAAGCA ATAGATGTTG GATGTTACAT GAAACTTGGA ACCAAGGTTC

- GTCTCTACCC CAACGCAAGC TTGAGTTCGT TATCTACAAC CTACAATGTA CTTTGAACCT TGGTTCCAAG
+ AATACATTGA TATGAGGTGT CCGGTAACGT AACAAATTTA AAAAGTATCCAA TAACTATGT TAAAGTGAAC

- TTATGTAACT ATACTCCACA GGCCATTGCA TTGTTTAAAT TTTTCATAGGTT ATTGATACA ATTTCACTTG
+ AAAACCATCC TAAGTTTAAT AATTTTCACC CCTCTTAATA ATTTGCTACA TATACTTGTT AAATAAATGA

- TTTTGGTAGG ATTCAAATTA TTAAAAGTGG GGAGAATTAT TAAACGATGT ATATGAACAA TTTATTTACT
+ AGAATCAAAA TGTGTTATGA AATTAACATT TTTATCTCAT ATAATATGTG AACAAATTTT ATTTTTAAAG

- TCTTAGTTTT ACACAATACT TTAATTGTAA AAATAGAGTA TATTATACAC TTGTTTAAAA TAAAAATTTC
+ AATAGTTAGG GATGTGAATG ACTTCTACTC GTTGAATATA TACAAACAAG TTGGAGTATA ATATTTTGCC

- TTATCAATCC CTACACTTAC TGAAGATGAG CAACTTATAT ATGTTTGTTC AACCTCATAT TATAAAACGG
+ CCGTGAATAT AATATTTTGA CTTGTACACG ATAAATGGAA GTCTGAATAT ATTATTATGA CCGGTGAATA

- GGCACTTATA TTATAAAACT GAACATGTGC TATTTACCTT CAGACTTATA TAATAATACT GGCCACTTAT
+ TAATATTTTA ACTTGTACAC GATAAATGAA AGTCTGAATA TATTATTATG ACCACTGAAT ATAATAGATA

- ATTATAAAAT TGAACATGTG CTATTTACTT TCAGACTTAT ATAATAATAC TGGTGACTTA TATTATCTAT
+ AAGGGAAGAC TTAGCCGTCT TGGTTTGGTT TGGATCATAT TCTATGGAAT TAATTAGAAT GTATTATTTT

- TTCCCTTCTG AATCGGCAGA ACCAAACCAA ACCTAGTATA AGATACCTTA ATTAATCTTA CATAATAAAA
+ GGATTAATTG GAATATATTA TGACTTACTT GTAAATAAAA TATTTTGACC TGTACAAGAG AGAGTATGAT

- CCTAATTAAC CTTATATAAT ACTGAATGAA CATTTATTTT ATAAAACTGG ACATGTTCTC TCTCATACTA
+ GGGAAATTAA TATATACACC TCTTCAGTTG TATGCAATAT ATCATATACA AAAGAAAAAG AAAGTAAAAC

- CCCTTTAATT ATATATGTGG AGAAGTCAAC ATACGTTATA TAGTATATGT TTTCTTTTTC TTTCATTTTG
+ TCTCCTCATG
- AGAGGAGTAC
Figura 37. Secuencia nucleotdica del promotor de Lin10. El codn de inicio de la

transcripcin est marcado rojo, mientras que la zona 5 que es transcrita pero no traducida
est en amarillo. En turquesa estn los dominios de respuesta a MA, y en verde la secuencia
comn con el promotor de FEH IIa.
El anlisis informtico de las secuencias promotoras de los genes Lin6, TIV1

y Lin10, mostr que contenan varios elementos idnticos al elemento especfico de
raz ATATT (Elmayan & Tepfer 1995), los motivos de la secuencia consenso de los
elementos rgano-especfico OSE1 (AAAGAT) y OSE2 (CTCTT) en Lin6 y TIV1,
caractersticos de los promotores que se activan en las clulas infectadas de los
ndulos de raz (Stougaard et al. 1987), y varios motivos con similitud a elementos
de respuesta a hormonas. El motivo Wbox (TTGAC) encontrado en los promotores
de genes que responden a cido saliclico (Yu et al. 2001), se identific en las
regiones promotoras de los tres genes. Los elementos de respuesta a cido
abscsico (ABA) tambin se encontraron en las secuencias promotoras de Lin6 y
Lin10. Mientras que el elemento de respuesta a ABA MYCR (CACATG) se encontr
137
Resultados
en ambos promotores (Abe et al. 2003), el motivo ABRE (ACGTG) slo se identific
en el de Lin10 (Hattori et al. 1995). Los promotores de Lin6 y Lin10 tambin
contenan el elemento de respuesta a sacarosa SURE1 (AATAGAAAA), reconocido
como un motivo conservado en un nmero de genes que responden a sacarosa
(Grierson et al. 1994).
2.4.1. Regulacin de los genes de invertasas y fructo-exohidrolasa de

tomate por azcares y hormonas.
Para validar el anlisis in silico de los promotores de Lin6, TIV1 y Lin10, se
analiz la expresin de estos genes y tambin la de Lin9, en races de plntulas de
tomate expuestas durante 12 y 24 horas a glucosa, sacarosa, ABA cido saliclico
(SA), sustancias que estn involucradas en las rutas de transduccin de seales en
plantas y en la formacin de micorrizas. La aplicacin de 100 M de ABA tuvo como
resultado un aumento en los niveles de ARNm para la invertasa vacuolar TIV1. En
contraste, los niveles de ARNm de Lin6 no se afectaron, y los de Lin10 y Lin9
disminuyeron sobre todo tras 24h de la aplicacin de la hormona (Figura 38). La
aplicacin externa de cido saliclico, aument los niveles de expresin de Lin6,
TIV1, y sobre todo de Lin10 donde hay un aumento de casi 50 veces a las 24h. Los
niveles de expresin de Lin9 sin embargo, se vieron disminuidos en presencia de
cido saliclico a las 12h para no verse afectados al siguiente tiempo de estudio (24
h). La aplicacin de glucosa aument los niveles de expresin de todos los genes
excepto de Lin9. El aporte de sacarosa aumento los niveles de expresin de Lin6 y
Lin10, para no afectar a los de TIV1, y disminuir los niveles de ARNm de Lin9.
Todos estos datos vienen a confirmar el anlisis informtico de las regiones
promotoras de los genes.
(a)
3
de Lin6
0
C ABA SA Glu Sac C ABA SA Glu Sac
12 h 24 h
138
Resultados
Cambio en los niveles de expresin (b)

8
6
de TIV1
0
C ABA SA Glu Suc C ABA SA Glu Suc
12 h 24 h
(c)
1,5
de Lin9
0,5
0
12 h 24 h
(d)
4
50
3 40
de Lin10
30
2
20
1
10
0 0
C ABA Glu Suc C ABA Glu Suc C SA C SA
12 h 24 h 12 h 24 h
Figura 38. Efecto de glucosa, sacarosa. cido saliclico (SA) y cido abscsico (ABA)
sobre la expresin gnica de Lin6 (a), TIV1 (b), Lin9 (c) y Lin10 (d). El ARN se extrajo de
races de plntulas de tomate expuestas durante 12 y 24 h a agua (control), 100 M de cido
abscsico, 100 M de cido saliclico, 40 mM de glucosa 20 mM de sacarosa. Los ARNs
fueron reverso transcritos y los niveles de expresin analizados mediante RT-PCR
cuantitativa a tiempo real usando cebadores gen-especfico para cada gen y los del ARNr
18S. El cambio inducido en la expresin gnica se calcul usando el mtodo de 2Ct. Los
139
Resultados
datos que se representan son media de tres rplicas biolgicas independientes. Barras de
error, DS (desviacin estndar).
2.5 Anlisis de la regulacin de la expresin de genes que codifican la

sacarosa sintasa de tomate durante la simbiosis micorrcica.
La sacarosa sintasa (EC 2.4.1.13) es la otra enzima que puede hidrolizar la
sacarosa en hexosas, de lo que depende se utilizacin como fuente de energa en
los tejidos sumidero como las races. La acumulacin de transcritos de sacarosa
sintasa en clulas colonizadas por arbsculos y en las que las rodean, ha permitido
hipotetizar que estas enzimas suministran metabolitos y generan fuerza sumidero
durante la fase activa de la simbiosis micorrzica (Blee & Anderson 2002, Hohnjec
et al. 2003). Debido a este papel activo de la sacarosa sintasa en la simbiosis, se
decidi analizar la regulacin transcripcional del gen de sacarosa sintasa TOMSSF
(N acceso L19762) presente en la base de datos, en las races de las plantas
donde anteriormente se ha estudiado la regulacin de invertasas y de la fructo-
exohidrolasa Lin10.

La abundancia relativa de los transcritos del gen de la sacarosa sintasa de
tomate TOMSSF (Wang et al. 1993), se analiz en races de plantas micorrizadas y
no micorrizadas. Con respecto a las races no micorrizadas, los niveles de
transcripcin de TOMSSF fueron ligera pero consistentemente inducidos en races
colonizadas por ambos hongos G. mosseae y G. intraradices en el primer tiempo (4
semanas despus de la inoculacin). Dos semanas ms tarde, se detect una
induccin de TOMSSF de 5.7 veces en las races colonizadas por G. intraradices, y
una induccin de 4.5 veces en las colonizadas por G. mosseae (Fig. 39).
2.5.2. Regulacin de la expresin gnica de TOMSSF por el fsforo

suministrado.
Como se muestra en la Figura 39, los niveles de ARNm de TOMSSF no
sufrieron cambios significantes en respuesta al fosfato, lo que indica, que el
incremento observado de los niveles de ARNm de TOMSSF en las races de las
plantas micorrizadas, no se debe a la mejora de la nutricin fosforada.
140
Resultados

7
6
de TOMSSF
5
4
3
2
1
0
C Gi Gm C Gi Gm
4 semanas 6 semanas

3
de TOMSSF
0
C100 C500 C100 C500
4 semanas 6 semanas
Figura 39. Efecto de la colonizacin micorrcica y de la fertilizacin con P sobre la

expresin gnica de la sacarosa sintasa (TOMSSF) en races de tomate. Los ARNs se
extrajeron de races de plantas de tomate no micorrizadas nutridas con 100 (C100) 500 M
de P (C y C500), plantas micorrizadas con G. intraradices (Gi) G. mosseae (Gm),
cosechadas cuatro y seis semans despus de la inoculacin con el hongo MA. Los ARNs
fueron reverso transcritos y los niveles de expresin se determinaron mediante RT-PCR
cuantitativa a tiempo real usando cebadores gen-especfico para TOMSSF (FTOMSSF y
RTOMSSF) y los del ARNr 18S. El cambio inducido en la expresin gnica de TOMSSF a cada
uno de los tiempos de cosecha por la colonizacin micorrcica por, se calcul usando el
mtodo de 2Ct usando las plantas regadas con 500 M de P como referencia. Los datos
representados son promedio de tres rplicas biolgicas independientes. Barras de error, DS

de raz Phytoptora parastica (Phy).
Los niveles de expresin de TOMSSF no se vieron afectados en las races de
las plantas inoculadas con P. parasitica (Fig. 40), lo que demuestra que la induccin
de este gen es especfica de la simbiosis MA, al no verse afectada sus niveles de
ARMm en la interaccin con otro microorganismo.
141
Resultados

2
de TOMSSF
1
C Phy
Figura 40. Efecto de P. parasitica sobre la expresin gnica de la sacarosa sintasa

TOMSSF. El ARN se extrajo de races de plantas de tomate control (C), y plantas inoculadas
con P. parasitica (Phy). Los ARNs fueron reverso transcritos y la expresin se ensay
mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real usando los cebadores gen-especfico FTOMSSF y
RTOMSSF y los del ARNr 18S. El cambio inducido en la expresin gnica en las races por P.
parasitica, se calcul usando el mtodo de 2Ct. Los datos que se representan son media de
tres rplicas biolgicas independientes. Barras de error, DS (desviacin estndar).
2.5.4. Bsqueda y anlisis del promotor de TOMSSF.

Para aislar la secuencia 5 no codificante de TOMSSF, al igual que se hizo en
el caso de Lin10, se recurri a una librera de ADN genmico de tomate utilizando el
cebador PTOMSSF para una amplificacin por PCR de dicha librera. De este modo
se obtuvo una secuencia genmica de 3395 pb para el posible promotor de TOMSSF
(AM408346) (Fig. 41), aguas arriba del codn de inicio de la transcripcin ATG. La
comparacin de dicha secuencia genmica con el ADNc de TOMSSF, revel la
presencia de un lider intrn de 1573 pb en la regin 5no traducida, lo que es una
caracterstica tpica de los genes de las sacarosas sintasas (Fu et al. 1995).
142
Resultados
+ CTGCCAATTG TAATAGGGAT CAGAGTGAAG CTTTTCTTTT TTTTTTTTTA ACTTTGAATA TTCATATGA

- GACGGTTAAC ATTATCCCTA GTCTCACTTC GAAAAGAAAA AAAAAAAAAT TGAAACTTAT AAGTATACT
+ AAAATCCGAT TAAATATGAA TTTATAGAAA AAGTTTAACT AAATTTTTTTT GATAAAAA TAGAAAATAT

- TTTTAGGCTA ATTTATACTT AAATATCTTT TTCAAATTGA TTTAAAAAAAA CTATTTTT ATCTTTTATA
+ TTATATTAGT TATTTTTTTA TACTAATTTA TGTGAGGGAG GTTTATGGA AAAATTATAT AAACAAATAC

- AATATAATCA ATAAAAAAAT ATGATTAAAT ACACTCCCTC CAAATACCT TTTTAATATA TTTGTTTATG
+ ATTTAAAAAT AATTACTGAT TTTAGCGATA TTTTTTGTT TATTACCACT TATAGTAATA TTATGATAAA

- TAAATTTTTA TTAATGACTA AAATCGCTAT AAAAAACAA ATAATGGTGA ATATCATTAT AATACTATTT
+ TCTGTAATAT ATATTAAAAG TGAATTATG TATGCAATAT ATTTGAATTA TAATTGTTTT TGAAATATAT

- AGACATTATA TATAATTTTC ACTTAATAC ATACGTTATA TAAACTTAAT ATTAACAAAA ACTTTATATA
+ AATGTTTGTT TGGTAAAAA ATTGTCTTGT ATTATAAGTG TATTAAAATG TGTGATAAAT GTATTATCAA

- TTACAAACAA ACCATTTTT TAACAGAACA TAATATTCAC ATAATTTTAC ACACTATTTA CATAATAGTT
+ TCATTA AAA CTTGTATTAT ATTTGAATAA TAAATTTATC TTTGTAATAT ATATTAAATT TGTATTATA

- AGTAAT TTT GAACATAATA TAAACTTATT ATTTAAATAG AAACATTATA TATAATTTAA ACATAATAT
+ AATGAATTAA AAATGGTCAA GTGAAAAAAA ATGTTATTGC TATAAATGAT AAATATTTC TTTATTATAG

- TTACTTAATT TTTACCAGTT CACTTTTTTT TACAATAACG ATATTTACTA TTTATAAAG AAATAATATC
+ TATATTTATG TAAATTTTCC AAAAATAAAA GTCTCAATTT TGAGCAAGA AATACTAAAT TTCTTTATTT

- ATATAAATAC ATTTAAAAGG TTTTTATTTT CAGAGTTAAA ACTCGTTCT TTATGATTTA AAGAAATAAA
+ TTATCCCTTT TTTTTATTAT GATCATAATG TTCGGATTAA TTTACATAT TTCAATTAAA ATAAATAATA

- AATAGGGAAA AAAAATAATA CTAGTATTAC AAGCCTAATT AAATGTATA AAGTTAATTT TATTTATTAT
+ ATGAATAAAC CTATACAATG GAGTATTTAT AATTTATTG ATCAAAATTT TAAAATTCAC TTATTTTAAA

- TACTTATTTG GATATGTTAC CTCATAAATA TTAAATAAC TAGTTTTAAA ATTTTAAGTG AATAAAATTT
+ AATGCTTTTT AGAAGTTTCT AAAAATTAG CGATTTGATG TTTGATTAAT TTATCACTGA CACAACAACT

- TTACGAAAAA TCTTCAAAGA TTTTTAATC GCTAAACTAC AAACTAATTA AATAGTGACT GTGTTGTTGA
+ TAATCTTTAA ATTATTTTT TAAAAATATA TACTTATGAC TTTAAAAAAG CTTGATTTAA CCACCTAATT

- ATTAGAAATT TAATAAAAA ATTTTTATAT ATGAATACTG AAATTTTTTC GAACTAAATT GGTGGATTAA
+ ATATAATCA AAATTCTTAC CATTGTATCA AATAATGTTT GTATAATTGA AAAAAAATTG ACCAGTCAT

- TATATTAGT TTTAAGAATG GTAACATAGT TTATTACAAA CATATTAACT TTTTTTTAAC TGGTCAGTA
+ TGACTGTTAC ACACTTTAAC TTATCCAAAT TAATAGTTAG ATATTTCAAT TTTGTAAAA TACAAATATA

- ACTGACAATG TGTGAAATTG AATAGGTTTA ATTATCAATC TATAAAGTTA AAACATTTT ATGTTTATAT
+ AATATTTCAA TTTGTTTTTA CTATCTTTAA ATAATTTGAT TTATAAAAG AAAAAAATAA TAAATATATT

- TTATAAAGTT AAACAAAAAT GATAGAAATT TATTAAACTA AATATTTTC TTTTTTTATT ATTTATATAA
+ TCGAATTATC GTAAATGATT TGTAGATATA TACTTTTGA CAATGGATCA CGTTGTCCAA AAATTAGAGT

- AGCTTAATAG CATTTACTAA ACATCTATAT ATGAAAACT GTTACCTAGT GCAACAGGTT TTTAATCTCA
+ ATATATATCG TTCACTCTTA CTGAAGGAT AAGTAGAAAA ATCTTATTCG TTGATCCGAT ATTTAATAAA

- TATATATAGC AAGTGAGAAT GACTTCCTA TTCATCTTTT TAGAATAAGC AACTAGGCTA TAAATTATTT
+ TGTCGCCTAG GCGAATAAGA CTATATCAT GTGTTTATCT GTTAGTATAT AGGTAGTTTT TGAACGGTAG

- ACAGCGGATC CGCTTATTCT GATATAGTA CACAAATAGA CAATCATATA TCCATCAAAA ACTTGCCATC
+ AGACACCAAT GTCCAAGAA TGATAGGGGT ATCTACATAT CATTTATGAT ATTCAAAGAT ATATTATCCT

- TCTGTGGTTA CAGGTTCTT ACTATCCCCA TAGATGTATA GTAAATACTA TAAGTTTCTA TATAATAGGA
+ TTTTTTCTT AAAATAATAA TTATTTAGAC ATTTTCAAAA ATTTACGTGT AACAATAAGA ATGATTTAA

- AAAAAAGAA TTTTATTATT AATAAATCTG TAAAAGTTTT TAAATGCACA TTGTTATTCT TACTAAATT
+ TATGTTTACA TATGTATTTT AAAAATTGAC TTCGTCCAAT TGTCAACTGA GATC AAGTT AATAGGTTCA

- ATACAAATGT ATACATAAAA TTTTTAACTG AAGCAGGTTA ACAGTTGACT CTAG TTCAA TTATCCAAGT
+ ACTAGATATT GATTTTTTTT TCTTACTCAC TAAACCAAAA GCCATCATT AGCATATAGT TTATGATTAA

- TGATCTATAA CTAAAAAAAA AGAATGAGTG ATTTGGTTTT CGGTAGTAA TCGTATATCA AATACTAATT
+ TTAAGATCCT TCACCTAATT AATTAACACT TGCCACAAT TTCCACTTTT TTTTTGGCTA TAAAAAGGCG

- AATTCTAGGA AGTGGATTAA TTAATTGTGA ACGGTGTTA AAGGTGAAAA AAAAACCGAT ATTTTTCCGC
+ TCCTCTAGCT TTGCTTTCTT CACCATTCA CAAGCAAAAC TCTTTCATTT GCTTCTTTCA TTCATACACT

- AGGAGATCGA AACGAAAGAA GTGGTAAGT GTTCGTTTTG AGAAAGTAAA CGAAGAAAGT AAGTATGTGA
143
Resultados
+ CATTTCAACA TTTTCTCCA TTTTTTCTTT TTTCATTTCT TTCCTCTCAA AGGTAAAGCT ACAATTTTTT

- GTAAAGTTGT AAAAGAGGT AAAAAAGAAA AAAGTAAAGA AAGGAGAGTT TCCATTTCGA TGTTAAAAAA
+ TTTAATTTT TTTTATATGC TAGTTAATTT CCACATGCAA AAATAGTCTT TTTTTTGGTG TTTGGTTCAA

- AAATTAAAA AAAATATACG ATCAATTAAA GGTGTACGTT TTTATCAGAA AAAAAACCAC AAACCAAGTT
+ ATTTAGTTC AAAGTTTTGA TCTTGGGGGA AAATGTTGAT CTTATCTTTA AAGGGTGTTA AAGATCTTG

- TAAATCAAG TTTCAAAACT AGAACCCCCT TTTACAACTA GAATAGAAAT TTCCCACAAT TTCTAGAAC
+ AATTTTTCTT ACAGAAATTT CCATTTTAAG TTGAGCTCAT TTACTCTAAAAC CCAGAAA AAAGAAGTTA

- TTAAAAAGAA TGTCTTTAAA GGTAAAATTC AACTCGAGTA AATGAGATTTTG GGTCTTT TTTCTTCAAT
+ TTTTTTGATA TTTTAGCTAA AGATTCCAAC TTTTTTAGTA GTAGAAAGT GATTTAAGAA CAAACAAGAA

- AAAAAACTAT AAAATCGATT TCTAAGGTTG AAAAAATCAT CATCTTTCA CTAAATTCTT GTTTGTTCTT
+ GTAATCTTTC TGGAAAAAGT TTTGTTCTTG ATCACCCCC AAGAGGTGTG AAGTGTTAAA GATGACATTT

- CATTAGAAAG ACCTTTTTCA AAACAAGAAC TAGTGGGGG TTCTCCACAC TTCACAATTT CTACTGTAAA
+ TTGTGGTTTT TTTTTTTTGA ATTTGTAGA AAGTGATCAA GAACAAAGTA GAAGTAATCT TTCTTGAAAA

- AACACCAAAA AAAAAAAACT TAAACATCT TTCACTAGTT CTTGTTTCAT CTTCATTAGA AAGAACTTTT
+ AGTTTTGTTC TTGAATCTT GATCATGATC ATAATCACCC CAAGAGGTGT AAAGATTACA TTTTGAGGTT

- TCAAAACAAG AACTTAGAA CTAGTACTAG TATTAGTGGG GTTCTCCACA TTTCTAATGT AAAACTCCAA
+ TGTTTTTGT GTTCACATAG TTTTTGTCAC CTTTGTCTCA AAACTGTTTT TGTTCTGTTC TGTTCTCAT

- ACAAAAACA CAAGTGTATC AAAAACAGTG GAAACAGAGT TTTGACAAAA ACAAGACAAG ACAAGAGTA
+ TTGTTTGTGG GGGTGGGGGT GGGGTGGTCT TGTTTGTTGG TGTCAAAATT CTTAGTTTT TAAGTATACC

- AACAAACACC CCCACCCCCA CCCCACCAGA ACAAACAACC ACAGTTTTAA GAATCAAAA ATTCATATGG
+ TTCATTTTAA GACAAATCTA TCTTCATGAC ATAGCTGAAG TAGTTCATGT TTGCTTTAG TCATCAATTC

- AAGTAAAATT CTGTTTAGAT AGAAGTACTG TATCGACTTC ATCAAGTACA AACGAAATC AGTAGTTAAG
+ TTGTTTTGTT TTTTCATAGT ACATTTGCTA TTTTTCTAAT GAAAAACTT ACTTGGGGTT TTCTTAAAGA

- AACAAAACAA AAAAGTATCA TGTAAACGAT AAAAAGATTA CTTTTTGAA TGAACCCCAA AAGAATTTCT
+ TCTTGTTTTG TTAAGTTTTT AACTAAGATT TGATGTTTT GATTAAATCA AGATTGAGAA ATGTAGTCCA

- AGAACAAAAC AATTCAAAAA TTGATTCTAA ACTACAAAA CTAATTTAGT TCTAACTCTT TACATCAGGT
+ TTTTGTAACA GAAAGTTTAC TGTAGATTC TTGTTGTGGG GTCTTCATTG AGTTATTTTT TTATATATAT

- AAAACATTGT CTTTCAAATG ACATCTAAG AACAACACCC CAGAAGTAAC TCAATAAAAA AATATATATA
+ ATTTTGTAGT TTAGTCTTT GTTGTAGTCT TGGTTGTAAC GCATAGGCGT TGTGCTTTTG CCTCAAACGT

- TAAAACATCA AATCAGAAA CAACATCAGA ACCAACATTG CGTATCCGCA ACACGAAAAC GGAGTTTGCA
+ ATTTGAGTA AGAAATGTAA CTAATGTCAT CCTCTTTGGT TGGTTTTGGT TTTATTAGTA CTATAGTAT

- TAAACTCAT TCTTTACATT GATTACAGTA GGAGAAACCA ACCAAAACCA AAATAATCAT GATATCATA
+ TATACTCAGT AGCGGAGCCA GAATTTTTAG TTAATGAATT TTGGGTCTAG ATTCCGGAT ACATTAAAAA

- ATATGAGTCA TCGCCTCGGT CTTAAAAATC AATTACTTAA AACCCAGATC TAAGGCCTA TGTAATTTTT
+ AAGAAAACAC CCTTTAGACG TATTACAGTA GAAGCTTTGT AGGTAGTA GAGTGTTCAGA ATGCTTTGTT

- TTCTTTTGTG GGAAATCTGC ATAATGTCAT CTTCGAAACA TCCATCAT CTCACAAGTCT TACGAAACAA
+ ATGTATTTTT TCATGGCTCC TTTCACTGTC TTTATTTCT TTTTTGAACT GTTTTCCTTG AGCCGAGGGT

- TACATAAAAA AGTACCGAGG AAAGTGACAG AAATAAAGA AAAAACTTGA CAAAAGGAAC TCGGCTCCCA
+ CTATTGGACG CAACTTCTCT ACCTTCAAGG TAGAGGTAA GGTTTGTGGA CATTCTACCC TCCCCGACTT

- GATAACCTGC GTTGAAGAGA TGGAAGTTCC ATCTCCATT CCAAACACCT GTAAGATGGG AGGGGCTGAA
+ CACTTTGGTG AGACTACACG GGGTATGTT GTTGGCTCCG CCCTTGACTA TATTAGGTGA AAGGTATGAA

- GTGAAACCAC TCTGATGTGC CCCATACAA CAACCGAGGC GGGAACTGAT ATAATCCACT TTCCATACTT
+ AATTTGAAGT GGTAACATT GTGGATGTTG AAAATTTAAG TGATTCAGTG AGTTTTTTAG TTTGTCATTT

- TTAAACTTCA CCATTGTAA CACCTACAAC TTTTAAATTC ACTAAGTCAC TCAAAAAATC AAACAGTAAA
+ TCAATTTTT CAGTGGTTGT ACTAATGTAA TGCTATATAA AATTTTGTTT GGTATTCGGA TAAG CTGAG

- AGTTAAAAA GTCACCAACA TGATTACATT ACGATATATT TTAAAACAAA CCATAAGCCT ATTC GACTC
+ GTGGGCTCTT CTACTAACTG CACCAGTGTA TGTTTTGGTT GTTTACAGTT GAACTTTGT CTGAGGATTT

- CACCCGAGAA GATGATTGAC GTGGTCACAT ACAAAACCAA CAAATGTCAA CTTGAAACA GACTCCTAAA
+ CCCATCTGCT GAATCAACTA TAATG

- GGGTAGACGA CTTAGTTGAT ATTAC
144
Resultados
Figura 41. Secuencia nucleotdica del promotor de Lin10. El codn de inicio de la

transcripcin est marcado rojo, mientras que la zona 5 que es transcrita pero no traducida
est en amarillo, y el leader intrn est marcado en verde.
Al igual que se hizo con las secuencias promotoras de Lin6, TIV1 y Lin10, la
secuencia promotora de TOMSSF se analiz en bsqueda de elementos reguladores.
Este anlisis, revel que la secuencia promotora de TOMSSF tambin contena
elementos ATATT especficos de raz, los elementos caractersticos de los
promotores activados en clulas infectadas de ndulos de raz OSE1 y OSE2, y
varios motivos de elementos hormona-especficos. Se identific el motivo Wbox de
respuesta a cido saliclico, as como elementos de respuesta a cido abscsico
como MYCR y ABRE, y tambin el elemento de respuesta a sacarosa SURE1.
Para validar el anlisis in silito, se analiz la expresin gnica de TOMSSF en
el mismo sistema experimental que previamente se ha utilizado para el anlisis de
los promotores de Lin6, TIV1 y Lin10 (apartado 2.4.1.). Los niveles de ARNm de
TOMSSF aumentaron con la aplicacin de todos los tratamientos, cido saliclico,
cido abscsico, glucosa y sacarosa (Fig. 42).
8
de TOMSSF
0
12 h 24 h
Figura 42. Efecto de glucosa, sacarosa, cido saliclico (SA) y cido abscsico (ABA)
sobre la expresin gnica de TOMSSF. El ARN se extrajo de races de plntulas de tomate
expuestas durante 12 y 24 h a agua (control), 100 M de cido abscsico, 100 M de cido
saliclico, 40 mM de glucosa 20 mM de sacarosa. Los ARNs fueron reverso transcritos y los
niveles de expresin analizados mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real usando
cebadores gen-especfico y los del ARNr 18S. El cambio inducido en la expresin gnica se
calcul usando el mtodo de 2Ct. Los datos que se representan son media de tres rplicas
biolgicas independientes. Barras de error, DS (desviacin estndar).
2.6 Anlisis de la expresin de los genes Lin9 y Lin10 en los distintos

rganos de la planta de tomate.
Para obtener ms informacin sobre los dos genes de tomate clonados por
primera vez durante la presente Memoria de Tesis Doctoral, la invertasa vacuolar
Lin9 y la fructo-exohidrolasa Lin10, se analiz la expresin de ambos genes en los
distintos rganos de la planta de tomate. De este modo, se ha obtenido informacin
145
Resultados
sobre el patrn de expresin de Lin9 y Lin10. Los rganos en los que se ha

analizado la mencionada expresin gnica (descritos en el punto 1.1.2.5 de
material y mtodos) son: flores, spalos, hoja joven, hoja adulta, tallo, raz, fruto
inmaduro (verde) y fruto maduro (rojo). Como se muestra en la figura 43, Lin9 se
expresa principalmente en flores, siendo los spalos y el fruto inmaduro los
siguientes rganos donde se expresa mayoritariamente, y es de destacar la
ausencia de ARNm de Lin9 en el fruto maduro. Lin10, sin embargo, tiene sus
niveles de expresin ms elevados en tallo y raz, y no se expresa en hojas
jvenes.
Niveles de expresin de Lin9
30
800
25
20 600
15 400
10
200
5
0 0
uro
Flores
s
ro
alo
l lo
HA
du
ad
HJ
Ra
Ta
p
ma
inm
S
F.
F.
Niveles de expresin de Lin10
50
40
30
20
10
0
uro
los
ro
res
l lo
z
HJ
HA
du
ad
Ra
pa
Ta
F lo
ma
inm
S
F.
F.
Figura 43. Niveles de expresin de Lin9 y Lin10 en los distintos rganos de la planta
de tomate: flores, spalos, hoja joven (HJ), hoja adulta (HA), raz, tallo, fruto inmaduro y
fruto maduro. Los ARNs se extrajo de los distintos rganos, fueron reverso transcritos y los
niveles de expresin analizados mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real usando
cebadores gen-especfico y los del ARNr 18S. El cambio inducido en la expresin gnica se
calcul usando el mtodo de 2Ct. Los datos que se representan son media de tres rplicas
biolgicas independientes. Barras de error, DS (desviacin estndar).
146
Resultados
2.7 Anlisis de la expresin de los genes analizados en hojas.

Aunque ya se han analizado los cambios de expresin como consecuencia de
la formacin de la simbiosis micorrcico arbuscular de los distintos genes de
invertasas, sacarosa sintasa, y la fructo-exohidrolasa Lin10 en races, que es el
rgano de la planta donde se establece la simbiosis MA, tambin se decidi analizar
si esos cambios se reflejaban en la parte area de la planta. Para ello, se analiz la
expresin de los genes previamente analizados en races en las muestras de hojas
en las que previamente se analizo la expresin de sacarosa-fosfato-sintasa y
RuBisCo, hojas de plantas de tomate control regadas con 500 M de P (C),
inoculadas con G. intraradices (Gi) e inoculadas con G. mosseae (Gm) 6 semanas
despus de la inoculacin con el hongo MA. Anlisis que se realiz tambin
mediante PCR Cuantitativa en Tiempo Real.
De las invertasas analizadas, slo Lin6 se detect en hojas de plantas
minorizadas y no micorrizadas. Los niveles de ARNm de Lin6 fueron ms elevados
en las plantas micorrizadas con ambos hongos G. mosseae y G. intraradices que en
las plantas control (Fig. 44).
6
5
4
de Lin6
3
2
1
0
C Gi Gm
en hojas de tomate. El ARN se extrajo de hojas de plantas de tomate control (C), inoculadas
con G. intraradices (Gi), e inoculadas con G. mosseae (Gm). Los ARNs fueron reverso
transcritos y la expresin se ensay mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real usando
cebadores gen-especfico para Lin6 y los del ARNr 18S. El cambio inducido en la expresin
gnica de este gen por la colonizacin micorrzica, se calcul usando el mtodo de 2Ct. Los
Con respecto a los dos genes nuevos identificados en la presente Memoria

de Tesis Doctoral, Lin9 y Lin10, ninguno se expres en la parte area de las plantas
de nuestro sistema experimental.
La abundancia relativa de transcritos del gen de la sacarosa sintasa TOMSSF
se analiz en las hojas de plantas micorrizadas y no micorrizadas. Los niveles de
147
Resultados
ARNm de TOMSSF fueron inducidos consistentemente en hojas colonizadas por

ambos hongos G. mossseae (2 veces) y G. intraradices (aproximadamente 3 veces)
(Fig. 45).

4
3
de TOMSSF
0
C Gi Gm

TOMSSF en hojas de tomate. El ARN se extrajo de hojas de plantas de tomate control (C),
inoculadas con G. intraradices (Gi), e inoculadas con G. mosseae (Gm). Los ARNs fueron
usando cebadores gen-especfico para TOMSSF y los del ARNr 18S. El cambio inducido en la
expresin gnica de este gen por la colonizacin micorrzica, se calcul usando el mtodo de
2Ct. Los datos que se representan son media de tres rplicas biolgicas independientes.

TRANSPORTADORES DE AZCARES EN PLANTAS MICORRIZADAS.
Dado que los transportadores de azcares juegan un papel fundamental en

la distribucin de azcares a travs de la planta, es lgico pensar que esos
transportadores estn regulados por el desarrollo de la simbiosis MA. Ms an,
habiendo comprobado que la concentracin de azcares se altera por la simbiosis,
esto debe reflejarse en los transportadores de dichos azcares. Para obtener ms
datos en este sentido, se sigui una aproximacin basada en la tcnica de PCR para
la identificacin de genes que codificaran para transportadores de azcares y que
aumentaran su expresin se activaran especficamente en plantas micorrizadas.
Se identific un gen que codificaba un posible transportador de azcares en tomate,
que aumenta su expresin en hojas pero no en races de plantas micorrizadas.
Tambin se determin la regulacin de este gen en plantas infectadas con el
patgeno de raz Phytophthora parasitica, para determinar si la expresin de este
gen se regulaba especficamente por la simbiosis micorrcico abuscular.
148
Resultados
3.1 Clonacin de genes que codifican transportadores de hexosas en

races micorrizadas.
En base a los dominios de aminocidos conservados PESPR y PETKG,
presentes en todos los transportadores de azcares de la base de datos, se
disearon el par de cebadores degenerados SUG1 y SUG2. La amplificacin
mediante PCR de ADNc de cadena simple procedente de races micorrizadas con los
cebadores degenerados, tuvo como resultado una banda de aproximadamente 850
pb. La clonacin del ADN amplificado y la secuenciacin de varios clones, permiti
la identificacin de un clon parcial que codifica para un posible transportadoe de
azcares de tomate. El resto de la secuencia codificante se obtuvo mediante las
tcnicas de 5y 3RACE usando los cebadores SUG4 y SUG5 respectivamente. De
este modo, se obtuvo un gen completo de 1699 pb llamado LeST3 (Nmero de
acceso AJ278765), con unos pocos nucletidos en la zona 5 por encima del posible
codn de inicio ATG, y una cola de 210 pb (Fig. 46). El origen vegetal del gen
clonado, se demostr mediante la amplificacin por PCR de ADN genmico de
tomate y de Glomus mosseae con los cebadores especficos del gen SUG4 y SUG5
(Fig. 47), y por el anlisis mediante Southern blot del ADN genmico de tomate
(Fig. 48). Adems, la existencia de un gen que muestra un 99.79% de identidad
con LeST3 en el fichero de genes de tomate TIGR (TC nmero 164118),
proporciona ms evidencias del origen vegetal del gen identificado. El anlisis
mediante Southern blot revel incluso, que la sonda de LeST3 hibrid en una sola
banda en cada uno de los ADNs genmicos digeridos, lo cual sugiere la presencia
de una sola copia de LeST3 en el genoma del tomate.
149
Resultados
ggcctaagaagaaaaaaaattatgaaggaagatatagagcacagtgagaacagagtaaat
M K E D I E H S E N R V N
gaagaaataacaactcctcttataattcaaacaaataaaagagtaaaagaagaaaatgga
E E I T T P L I I Q T N K R V K E E N G
tgttatgagaagaaacaagataggtgcatggtttaccttagcacattagtggctgttagg
C Y E K K Q D R C M V Y L S T L V A V R
ggttcatattcattgggatcttgtgctggatattcatcaccaacacaatccgccatcaga
G S Y S L G S C A G Y S S P T Q S A I R
gaggatcttaacttatctatagcacagatctcgctctttggttcaatatggacatttggt
E D L N L S I A Q I S L F G S I W T F G
gcaatgattggagcaatcacaagtggtccaatcgctgattatattggtcgcaaaggggca
A M I G A I T S G P I A D Y I G R K G A
atgagaatgtcaagtggtttctgtgttgctggatggttagctattttcttcgctcaggga
M R M S S G F C V A G W L A I F F A Q G
gcacttgctctggacattggaagattggcaacaggatatggaatgggagttttctcttat
A L A L D I G R L A T G Y G M G V F S Y
gtggtgccggtatttatagctgaaattgcacctaaagatttacgaggagctttgacaacc
V V P V F I A E I A P K D L R G A L T T
ataaaccagctgatgatatgttgtggagtctcagtttccttcattataggaactatgatg
I N Q L M I C C G V S V S F I I G T M M
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T W R T L A L T G L I P C A I L L F G L
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F I I P E S P R W L A K I G H Q K E F E
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L A L R K L R G K D A D I S E E A A E I
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K D Y I E T L E K L P K V N L F D L F Q
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R R Y S S S L I V G V G L M V F Q Q F G
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G I N G I C F Y T G S I F E S S G F S S
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D I G T I I Y A I I Q V P I T A L G A A
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L I D R T G R K P L L L V S G T G L V I
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G C I L T G I S F Y M K G H E M A I K A
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A P I L A V T G I L V Y I G S F S V G M
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G A V P W V V M S E I Y P I N I K G A A
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G S L A T L V N W F G A W A C S Y T F N
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F L M T W N S F G T F V L Y A A V N A L
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S I L F V I K I V P E T K G R T L E Q I
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Q A A I N A S -
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tctgattctcatcctcaaatttaagacatttgagtgtttgttgtatcatggatcacatat
tttcatttgtactcattgattcatctcacttaaaaaaggagaattttaaagtttaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaa
150
Resultados
Figura 46. Secuencia nucleotdica y deducida de aminocidos de LeST3, y topologa

predicha de LeST3 mediante SOSUI.
La pauta de lectura abierta de LeST3 codifica un polipptido de 480 aminocidos

con un peso molecular calculado de 52 kDa. El anlisis hidrofbico usando el
algoritmo de Kyte-Doolitle (Kyte & Doolitle 1982), revel que la protena codificada
por el gen clonado, posee 12 posibles dominios transmembrana ordenados en dos
grupos de seis dominios cada uno separados por un lazo hidroflico de 62
aminocidos (Fig. 46). Este perfil hidrofbico es caracterstico de protenas que
pertenecen a la superfamilia de los facilitadores mayores. La comparacin de la
secuencia de LeST3 con las que hay en el GenBank, revel una similaridad
definitiva con un ADNc de un fragmento AFLP de un gen de tabaco inducido por
perxido de hidrgeno (92%), y a un nmero de transportadores de azcares
conocidos de diferentes organismos, con los niveles ms elevados de identidad a
posibles transportadores de azcares no publicados de Arabidopsis (81-68%), al
gen inducido por deshidratacin y fro ERD6 de Arabidopsis (60%), y al posible
transportador de azcar localizado en la vacuola de la remolacha (59%). La
secuencia aminoacdica predicha de LeST3 es ms similar a transportadores de
azcares de otras plantas y a transportadores de glucosa de mamferos que a
transportadores de azcar de tomate. Todos estos genes pertenecen a la familia de
transportadores de monosacridos de la familia de portadores de azcares de la
superfamilia de los facilitadores mayores.
151
Resultados
1 2 3 4
Figura 47. Gel teido con Bromuro de Etidio de los

productos de PCR obtenidos despus de la
amplificacin del ADN genmico de tomate (calle 1)
y G. mosseae (calle 2) con los cebadores
especficos SUG4 y SUG5. Las calles 3 y 4 son el
control negativo de la PCR y el marcador de ADN
respectivamente.
Figura 48. Anlisis genmico por Southern blot de

LeST3. 10 g de ADN genmico de tomate se
digirieron con las enzimas de restriccin que se
indican, se separaron por electroforesis, y
posteriormente transferidos a una membrana de
nylon. La membrana se hibrid con la regin SUG4-
SUG5 del ADNc de LeST3 marcada con 32P, y se
lav bajo condiciones de alta astringencia.
La secuencia aminoacdica deducida de LeST3 fue alineada con otras de

distintos transportadores de monosacridos de plantas superiores, y con esos daros
se construy un rbol filogentico (Fig. 49). Este anlisis, mostr la existencia de
tres subfamilias gnicas principales dentro de los transportadores de monosacridos
de plantas: los transportadores de membrana plasmtica, los transportadores
152
Resultados
cloroplastidiales, y una tercera subfamilia que incluye al gen LeST3, al

transportador de la remolacha localizado en la vacuola, y a algunos transportadores
de Arabidopsis sin caracterizar.
Transportadores de
membrana plasmtica V. faba
(STP1) M. truncatula
(Mst1)
Petunia
(MT1) A. thaliana A. thaliana (STP1)
(STP4) V. vinifera (HT)
A. thaliana
Saccharum (STP3)
(SGT2) N. tabacum (MST1)
L. esculentum (HT)
L. esculentum (HT2)
A. thaliana (pGlcT) Transportadores

P. armeniaca (pGlcT) vacuolares y otros no
caracterizados
S. oleracea (pGlcT)
S. tuberosum (pGlcT) Z. mays

O. europaea(pGlcT) A. thaliana (At5)
N. tabacum (pGlcT)
(pGlcT) A. thaliana (At3)
L. esculentum (LeST3)
Transportadores de B. vulgaris O. sativa
A. thaliana (At2)
glucosa plastidiales A. thaliana (ERD6)
A. thaliana (SFP2)
A. thaliana (SFP1)
Figura 49. rbol filogentico sin raz que muestra las relaciones a lo largo de la
evolucin de los transportadores de hexosas de plantas. Los transportadores que pertenecen
a las familias de la membrana plasmtica y la plastidial, y la vacuolar y otros transportadores
de hexosas no caracterizados estn rodeados por un crculo. Las secuencias se obtuvieron de
la base de datos GenBank con los siguientes nmeros de acceso: Arabidopsis thaliana (At2:
NM_130369, At5: NM_121889, At3: NM_111387; ERD6: D89051, pGlcT: AF215855, SFP1:
NM_122617; SFP2: NM_122618, STP1: X55350, STP3: AJ002399, STP4: X66857), B.
vulgaris (U43629), S. esculentum (HT2: AJ132224, HT: AJ010942; ST3: AJ278765), M.
truncatula (MST1: U38651), N. tabacum (pGlcT: AF215852, MST1: X66856), O. europaea
(pGlcT: AY036055), O. sativa (pGlcT: AC007858), P. armeniaca (AF215853), Petunia x
hybrida (MT1: AF061106), Saccharum hybrida (SGT2: L21753), S. oleracea (pGlcT:
AF215851), S. tuberosum (pGlcT: AF215853), V. faba (STP1: Z93775), V. vinifera (HT:
AJ001061), Z. mays (pGlcT: AF215854).
153
Resultados
3.2 Expresin heterloga de LeST3 en levadura.

Para la caracterizacin del producto gnico de LeST3, se utiliz el mutante
de S. cerevisiae deficiente en el importe de hexosas EBY.VW4000 (Wieczorke et al.
1999), el cual se transform con el vector de expresin pFL61 vaco y con su
derivado pFL61-LeST3 que contena el ADNc de LeST3 aguas abajo del promotor
constitutivo de la fosfoglicereto kinasa de S. cerevisiae para comprobar si la
protena codificada por el gen LeST3 funcionaba como un transportador de
monosacridos. Los transformantes Ura+ se identificaron mediante su crecimiento
en placas de medio SD donde la fuente de carbono era maltosa. Y para comprobar
la funcionalidad del gen objeto de estudio, dos de los transformantes seleccionados,
se sembraron sobre placas que como fuentes de carbono contenan glucosa,
fructosa, manosa o galactosa. Sin embargo, los transformantes seleccionados, no
fueron capaces de crecer en la presencia de esos azcares como fuentes de
carbono. Para determinar si la construccin gnica era aceptada por la maquinaria
transcripcional de S. cerevisiae, se aisl ARN de dos de las levaduras transformadas
y se ensay la expresin del transcrito de LeST3 mediante RT-PCR, usando
cebadores especficos del gen. Como se puede apreciar en la figura 50, el gen
LeST3 se expresaba intensamente en el mutante de levadura transformado con el
vector pFL61 que contena el gen de LeST3; sin embargo, no se detect seal en el
mutante de levadura transformado con el vector vaco.
1 2 3 4
LeST3
rRNA
Figura 50. Anlisis de la expresin de LeST3 en S. cerevisisae. La expresin gnica se

analiz por RT-PCR. El ARN aislado de dos de los transformantes de levadura con pFL61
(calles 1 y 2), y sus derivados pFL61- LeST3 (calles 3 y 4), fueron reverso transcritos y
amplificados mediante PCR con los cebadores especficos de LeST3 SUG4 y SUG5. El ARN
ribosmico 18S se us como control de la expresin gnica.
3.3 Anlisis de la regulacin por la simbiosis del gen identificado.

El anlisis de la expresin de LeST3 se ensay en races que procedan del
experimento 1 descrito previamente en material y mtodos (punto 1.3.1.) y en el
154
Resultados
que anteriormente se ha analizado la expresin de invertasas y otros genes de

tomate. La colonizacin micorrcica no afect a los niveles transcripcionales de
LeST3 en las races a ninguno de los dos tiempos analizados (Fig. 51).
3.3.2. Regulacin de la expresin gnica en races por el fsforo

suministrado.
LeST3 no mostr cambios en sus niveles de ARNm cuando la nutricin
fosforada aumenta desde 100 hasta 500 M de fosfato. (Fig. 51)
2
de LeST3
0
C Gi Gm C Gi Gm
4 semanas 6 semanas
2
de LeST3
0
C100 C500 C100 C500
4 semanas 6 semanas
Figura 51. Efecto de la colonizacin por micorrizas y de la nutricin fosforada sobre la

expresin gnica de LeST3 en races de tomate. El ARN se extrajo de races de plantas de
tomate control con 100 M de P (C100), control con 500 M de P (C500 C) inoculadas con
G. intraradices (Gi), e inoculadas con G. mosseae (Gm). Los ARNs fueron reverso transcritos
y la expresin se ensay mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real usando cebadores gen-
especfico para LeST3 (SUG4 y SUG5) y los del ARNr 18S. El cambio inducido en la expresin
gnica de LeST3 por la colonizacin micorrzica, se calcul usando el mtodo de 2Ct. Los
155
Resultados
3.3.3. Regulacin de la expresin gnica en hojas.

Ya que la expresin de LeST3 no se regulaba en races, se decidi mirar su
expresin en hojas de plantas de seis semanas de las mismas plantas en las que se
mir la expresin en hojas de los genes en el apartado 2. En este caso, s se
observ una clara induccin de los niveles de ARNm de LeST3 en las hojas
colonizadas tanto por G. mosseae (4 veces) como por G. intraradices (casi 5 veces)
(Fig. 52).
6
5
4
de LeST3
3
2
1
0
C Gi Gm

LeST3 en hojas de tomate. El ARN se extrajo de hojas de plantas de tomate control con 500
M de P (C) inoculadas con G. intraradices (Gi), e inoculadas con G. mosseae (Gm). Los
ARNs fueron reverso transcritos y la expresin se ensay mediante RT-PCR cuantitativa a
tiempo real usando cebadores gen-especfico para LeST3 y los del ARNr 18S. El cambio
inducido en la expresin gnica de LeST3 por la colonizacin micorrzica, se calcul usando el
mtodo de 2Ct. Los datos que se representan son media de tres rplicas biolgicas
independientes. Barras de error, DS (desviacin estndar).
3.3.4. Regulacin de la expresin gnica por el patgeno de raz

Phytoptora parasitica.
Para determinar si los efectos observados en la expresin de LeST3 eran una
respuesta especfica de la simbiosis, se analiz la expresin de LeST3 en plantas
inoculadas con el patgeno de raz P. parasitica (experimento 3 decscrito en el
punto 1.3.2. de material y mtodos). Las plantas tenan cuatro semanas cuando
fueron inoculadas con el patgeno no inoculadas (control), y se cosecharon dos
semanas despus (6 semanas en total). Las races de las plantas inoculadas con P.
parasitica, mostraban claramente reas necrticas (un promedio de nivel 2, que es
un nivel medio de sntomas). Como se muestra en la figura 53, los niveles del
transcrito de LeST3, se inducen tambin en las hojas de las plantas infectadas con
P. parasitica, mientras que en las races no se afectan.
156
Resultados
A)

2,5
2
de LeST3
1,5
0,5
C Phy
B) 6
5
4
de LeST3
3
2
1
0
C Phy
Figura 53. Efecto de P. parasitica sobre la expresin gnica de LeST3. El ARN se

extrajo de races (A) y hojas (B) de plantas de tomate control (C), y plantas inoculadas con
P. parasitica (Phy). Los ARNs fueron reverso transcritos y la expresin se ensay mediante
RT-PCR cuantitativa a tiempo real usando cebadores gen-especfico para LeST3 y los del
ARNr 18S. El cambio inducido en la expresin gnica de LeST3 en cada tejido por P.
parasitica se calcul usando el mtodo de 2Ct. Los datos que se representan son media de
tres rplicas biolgicas independientes. Barras de error, DS (desviacin estndar).
157
DISCUSIN
Discusin
El trabajo que se resume en la presente Memoria de Tesis Doctoral, ha

tenido como objetivo principal profundizar en el estudio de los cambios inducidos
por el desarrollo de la simbiosis en el metabolismo carbonado de las races
hospedadoras, con el fin de obtener evidencias sobre los mecanismos que controlan
la transferencia de nutrientes de la planta al hongo. Para esta investigacin, se ha
utilizado el tomate como planta modelo, ya que es una planta que se ha usado
como modelo en distintos campos de la biologa de plantas y de la que se dispone
un elevado nivel de informacin. Adems, presenta numerosas ventajas al tener un
ciclo de vida corto, ser fcil de crecer y de micorrizar. Por otra parte, es una planta
con un inters agronmico muy importante, ya que es la hortaliza ms extendida
en el mundo, su demanda aumenta continuamente y con ello su cultivo, produccin
y comercio.
La demanda extra de carbohidratos que supone la presencia del

hongo a la planta durante la simbiosis, se refleja en las concentraciones de
azcares medidas en plantas control y plantas micorrizadas. En races, en las
plantas micorrizadas de 4 semanas, los azcares solubles totales son mucho
menores que en las plantas control lo que se refleja en los menores niveles tanto
de sacarosa, glucosa y fructosa que se detectan en dichas races. Dos semanas ms
tarde, los niveles de azcares solubles totales, aunque siguen siendo menores en
las plantas micorrizadas han aumentado respecto a las races de 4 semanas, a lo
que contribuye el aumento del contenido en sacarosa hasta igualarse a las plantas
control que se aprecia en las races de 6 semanas. Estos datos, sugieren que en el
segundo tiempo de cosecha, se transporta ms sacarosa a las races de las plantas
micorrizadas, para compensar el coste extra debido a la presencia del hongo.
Adems, las menores concentraciones encontradas de glucosa y fructosa en las
races micorrizadas en los dos tiempos de cosecha, indican el mayor consumo de
los productos derivados de la hidrlisis de la sacarosa en dichas races
micorrizadas. Al encontrarse que en el primer tiempo de cosecha, tanto el
contenido en sacarosa como la relacin raz/parte area disminuyen en las plantas
micorrizadas, se sugiere, que en ese estado de desarrollo, el aporte de carbono
hacia el hongo ocurre a expensas de la produccin de raz, mientras se conserva un
efecto global neutro sobre la distribucin del carbono en el interior de la planta. La
disminucin de los contenidos de glucosa y fructosa en las races micorrizadas, se
pueden interpretar como un resultado de su conversin en componentes hongo-
especficos tales como trehalosa y lpidos. Como los hongos MA toman de forma
preferente glucosa (Shachar-Hill et al. 1995), la fructosa debe ser metabolizada por
161
Discusin
las clulas husped. Ya en las clulas corticales de la raz, la fructosa sera

fosforilada inmediatamente por la hexokinasa y posteriormente metabolizada. Las
hexosas liberadas por la accin de las enzimas que hidrolizan sacarosa, se podran
usar no solo como fuente de carbono y energa, sino que tambin pueden jugar un
papel importante en sealizacin. Azcares simples como sacarosa y glucosa, son
eficientes moduladores de la expresin gnica (Sinha et al. 2002).
En hojas, la ausencia de sacarosa en las plantas micorrizadas a las seis
semanas, se corresponde con su aumento en races debido a la mayor demanda por
la presencia del hongo, por lo que la sacarosa ser transportada desde las hojas
hasta las races de las plantas micorrizadas. Los niveles de glucosa y fructosa no
sufren grandes cambios, ya que el azcar principal que se transporta a travs de la
planta, y por tanto el que mayoritariamente responde a demanda de los distintos
tejidos, es la sacarosa.
La induccin de los niveles transcripcionales de las primeras enzimas
implicadas en la fijacin de carbono (RuBisCo), y en la sntesis de sacarosa (SPS)
en las plantas micorrizadas, es una muestra ms del aumento de la demanda de
carbohidratos que supone el establecimiento de la simbiosis. Demanda que se
refleja en el aumento de la tasa fotosinttica. Estudios previos en pepino, atribuyen
el incremento de la tasa fotosinttica en las hojas de plantas micorrizadas, a un
incremento en el estatus de fsforo que proporciona la micorriza a la planta, ms
que al aumento de la demanda de asimilados (Black et al. 2000). Sin embargo, los
datos obtenidos en esta Memoria muestran, que an a pesar de que las plantas
control recibieron bastante ms fsforo (500M) que las micorrizadas (20M),
segua habiendo induccin de la tasa fotosinttica y de la sntesis de sacarosa, por
lo que dicha induccin no se puede atribuir solo a la mejora del estatus de fsforo,
sino que debe deberse al aumento de la demanda de carbono en las races
micorrizadas.
Como conclusin, se puede decir que el establecimiento de la simbiosis MA
altera el contenido de carbohidratos de la planta hospedadora para hacer frente al
aumento de la demanda de los mismos en las races micorrizadas. La sacarosa se
transporta en mayor proporcin a las races donde las hexosas resultantes de su
hidrlisis, son rpidamente utilizadas como fuente de energa en las races
micorrizadas. Tanto la enzima responsable de la fijacin de CO2, como la
responsable de la sntesis de sacarosa, se inducen en las hojas de las plantas
micorrizadas, para poder responder a la mayor demanda de carbohidratos de la raz
micorrizada.
162
Discusin
Una vez comprobada la alteracin de las concentraciones de azcares, as

como de la sntesis de sacarosa en las plantas micorrizadas, el siguiente paso era
ver cmo se modificaba la expresin de las enzimas responsables de la hidrlisis de
sacarosa (invertasa y sacarosa sintasa), paso necesario para la utilizacin de las
hexosas resultantes como fuente de energa por parte del hongo en las races
micorrizadas. En este sentido, basndonos en motivos conservados de aminocidos
presentes en la mayora de invertasas de plantas, se clonaron dos cDNAs nuevos
(Lin9 y Lin10). Tomando como referencia la similitud de las secuencias y los
motivos conservados, Lin9 y Lin10 se han clasificado miembros de la familia gnica
de las invertasas cidas. Ambos genes, contienen los dominios conservados de
invertasas DPNG y WEC(X)D (Roitsch et al. 1995), donde se conoce que el
aminocido Asp (D) del primero y el Glu (E) del segundo, estn involucrados en la
hidrlisis de la sacarosa (Reddy & Maley 1996). En concordancia con todas las
invertasas de plantas, Lin9 y Lin10 tiene un pptido seal predicho y un pro-
pptido N-terminal el cual es susceptible de ser hidrolizado durante el transporte y
la maduracin (Yiallouros et al. 2002). Los anlisis de las secuencias muestran que
Lin9 codifica una invertasa vacuolar ms que una inverasa de pared celular,
mientras que Lin10 tiene mayor similaridad con invertasas de pared celular y con
fructan-exohidrolasas. Mientras que Lin9 contiene una valina en el motivo WECXD
presente en todas las invertasas vacuolares, Lin10 posee en la misma posicin una
prolina, al igual que todas las isoenzimas de pared celular (Roitsch et al. 1995). Por
otra parte, tanto Lin9 como Lin10 se predice que codifiquen para pptidos con
puntos isoelctricos (pI) cidos, caracterstica de las invertasas vacuolares, porque
las invertasas de pared celular tienen puntos isoelctricos ms elevados para unirse
a los componentes cidos de la pared celular. Los datos proporcionados por el
anlisis del clon genmico de Lin10, muestran una estructura tpica de los genes de
invertasas (Tymowska-Lalanne & Kreis 1998) y de fructan-exohidrolasas (Michiels
et al. 2004), incluyendo el mini exn que codifica el tripptido DPN seguido de un
intrn corto, a diferencia de algunas de las enzimas con las que da homologa
(fructan-exohidrolasas), en las que el mini exn est seguido de un intrn ms
largo.
En el intento de estudiar la funcin de Lin9 y Lin10 in vivo mediante
expresin heterloga en un mutante de S. cerevisiae deficiente en actividad
invertasa, se utilizaron dos isoformas de Lin9 identificadas (Lin9 y GLin9), que se
diferencian en 75pb. La expresin heterloga, en ninguno de los casos tuvo xito,
lo que puede deberse a distintos factores, pero el principal sera el cambio de la
estructura de las protenas en las clulas de levadura viva con respecto a la que
tienen en las clulas de tomate. Sin embargo, cuando se ensaya la actividad
163
Discusin
invertasa en extractos de protenas aisladas de levadura, slo se detecta actividad

invertasa en los extractos de protenas aislados de la levadura transformada con la
isoforma de Lin9 de mayor nmero de nucletidos (Lin9), lo que significa que el
DNAc de GLin9 codifica una protena no funcional.
Debido a la alta homologa de Lin10 adems de con invertasas con fructo-
exohidrolasas, el siguiente paso, fue la medida de esa actividad enzimtica en los
extractos proteicos de levadura. Como resultado se obtuvo que Lin10 posee
actividad -(2-1)-fructoexohidrolasa. Estos datos coinciden con descubrimientos
recientes, en los que genes clasificados por homologa de secuencia con invertasas
asociadas a pared, se ha mostrado que funcionalmente son fructo-exohidrolasas
(Van den Ende et al. 2003b; De Coninck et al. 2005), a pesar de tener como
sustrato compuestos de reserva que se almacenan en la vacuola (fructanos), por lo
que sera lgico pensar que por su localizacin tuviesen ms homologa con
invertasas vacuolares (Wiemken et al. 1986; Darwin & John 1989).
Se ha aislado y caracterizado por primera vez un gen de tomate que codifica
para una fructan-exohidrolasa (FEH) y que est regulado por la simbiosis MA
(Lin10). La planta de tomate no sintetiza fructanos, pero hay informacin reciente
de la presencia de FEHs en este tipo de plantas (Van den Ende et al. 2003b; Van
den Ende et al. 2004; De Coninck et al. 2005). El papel de las FEHs en estas
plantas no sintetizadoras de fructanos no est del todo claro, pero una posibilidad,
es que los sustratos de este tipo de enzimas no sean endgenos, sino que
degradaran fructanos procedentes de otros microorganismos, siendo un ejemplo
los exudados que contienen fructanos de bacterias andofticas y fitopatgenas
(Hettwer et al. 1995; Bereswill et al. 1997). Dichos fructanos de los exudados,
prevendran al patgeno de ser reconocido por la planta, con lo que la actividad
FEH de la planta, prevendra la infeccin. Otra hiptesis, es que las FEHs podran
estar implicadas en el establecimiento de la simbiosis entre las plantas y las
bacterias endofticas (Tallgren et al. 1999; Hernandez et al. 2000), por lo que se
puede pensar, que la gran induccin de Lin10 en las plantas micorrizadas, se podra
deber a que los hongos micorrzicos tuviesen entre sus componentes de la pared
fructanos, y la planta mediante la actuacin de Lin10, sera responsable de la
respuesta de defensa (aunque ms dbil) que se da en el establecimiento de la
simbiosis MA. S hay datos sobre la alteracin de las cantidades de estos
polisacridos de reserva en plantas micorrizadas (Mller et al. 1999), siendo
mayores en las plantas micorrizadas que en las no micorrizadas. Por el contrario, la
fertilizacin caus un descenso general en las cantidades de fructanos en las races,
mostrando que el efecto de la micorriza no se debe a la mejora en la nutricin de
164
Discusin
las plantas micorrizadas (Douds et al. 1988). Por todo esto, se podra concluir que
el establecimiento de la simbiosis induce la produccin de fructanos.
Aunque est por determinar si los hongos MA producen fructanos, s hay
datos sobre varias cepas de hongos que los sintetizan, aunque no se conozca el
papel fisiolgico que desempean. Se ha puesto de manifiesto la sntesis de
fructanos en hongos como Aspergillus foetidus (Rehm et al. 1998), Aspergillus
niger (Hirayama et al. 1989) y Fusarium oxysporum (Patel et al. 1997). La sntesis
de inulinas de elevado peso molecular fue demostrada para Penicillium
chrysogenum (Olah et al. 1993) y Aspergillus sydowi IAM 2544 (Kawai et al. 1973;
Harada et al. 1994). Con todos estos datos se podra pensar que los hongos
formadores de micorrizas tambin formasen este tipo de compuestos de reserva.
Otra posibilidad con la que se especula, es que los derivados de la sacarosa
u homlogos como la 6-kestosa y la trehalosa formados en la hidrlisis de
fructanos, acten como seales que son capturadas por sensores especficos, por lo
que esta seal tendra que ser destruida despus de ser recibida, y esta funcin la
podran llevar a cabo enzimas altamente especficas como las FEHs. Por lo tanto, si
los hongos MA produjesen fructanos, otra posible funcin de Lin10 sera la de
mediar en los posibles procesos de sealizacin mediados por las sustancias
derivadas de su actuacin enzimtica.
Las plantas tienen una familia de genes de invertasas cidas, cuyos
miembros se expresan independientemente en tiempos y en tejidos especficos
durante el desarrollo de la planta (Sturm 1999). Se ha analizado la regulacin de
los genes aislados (Lin9 y Lin10) as como de otras isoformas de invertasas de
tomate presentes en la base de datos (TIV1, Lin5, Lin6, Lin7 y Lin8) por el
desarrollo de la simbiosis con dos hongos MA. En dicho anlisis, se ha encontrado
que de los cuatro genes que codifican invertasas de pared celular, slo Lin6 se
detect en races micorrizadas, indicando que el desarrollo de la simbiosis no
induce la sntesis de novo de las isoformas de invertasas de pared celular de
tomate de las que se tenan noticias (Godt & Roitsch 1997). La estimulacin de la
expresin de un gen que codifica para una invertasa de pared celular por la
colonizacin MA en races de tomate, esta de acuerdo con los resultados de Wright
y colaboradores (1998), quien inform de la mayor actividad de la invertasa de
pared celular en plantas de trbol micorrizadas, en comparacin con las plantas no
micorrizadas. En un estudio previo, Blee & Anderson (2002), no detectaron
aumento de los niveles transcripcionales de una invertasa de pared celular en las
races micorrizadas de zanahoria. Sin embargo, es necesario tener en cuenta que
las invertasas de pared celular, estn codificadas por familias multignicas, cuyos
165
Discusin
miembros presentan una regulacin rgano-, desarrollo-, y medio ambiente-

especfica.
La induccin de los niveles de Lin6 en las races micorrizadas en ambos
tiempos de cosecha, sugiere que la protena codificada por este gen, tiene una
funcin importante en la hidrlisis de la sacarosa en el apoplasto durante la
asociacin MA. La distribucin tejido-especfica de Lin6 y su regulacin por
estmulos internos y externos, ha permitido proponer una funcin importante para
esta invertasa apoplstica en la regulacin fuente-sumidero, y en el suministro de
carbohidratos a los tejidos sumidero (Goetz et al. 2000). La activacin de la
expresin gnica de Lin6 en las races micorrizadas, podra representar un
mecanismo que contribuira al aumento de la fuerza sumidero que se produce en la
colonizacin micorrcica (Graham 2000). Como las estructuras intraradicales de los
hongos MA no pueden tomar sacarosa (Shachar-Hill et al. 1995; Solaiman & Saito
1997), Lin6 podra ser responsable de la hidrlisis de la sacarosa liberada en el
apoplasto de la interfase simbitica, para liberar hexosas que tomara el hongo
para su crecimiento y metabolismo. Alternativamente, las hexosas liberadas de la
hidrlisis de la sacarosa, tambin las podran absorber las clulas de las races
husped para hacer frente al aumento de su actividad metablica. Esta hiptesis,
es apoyada por la observacin de Harrison (1996), donde la formacin de la
simbiosis MA se acompaa de una induccin de un transportador de hexosas, que
potencialmente funciona para suministrar azcares a las clulas de la raz
involucradas en la asociacin simbitica. En esta Memoria, se ha demostrado por
primera vez, la induccin de una invertasa de pared celular en una asociacin MA,
lo que apoya el supuesto generalizado de que la transferencia de carbono a travs
de la interfase simbitica, requiere la hidrlisis de la sacarosa del husped mediante
una invertasa de pared celular (Ferrol et al. 2002a). La importancia de la invertasa
de pared celular del husped para proporcionar hexosas al compaero fngico se ha
demostrado en ectomicorrizas. La expresin heterloga de una invertasa de
levadura altamente activa en hbridos de lamo, tuvo un profundo efecto sobre la
disponibilidad de hexosas y como consecuencia, sobre el metabolismo y el
desarrollo fngico despus de la formacin de la micorriza (Guttenberger 1998).
Las invertasas vacuolares determinan el nivel de la sacarosa almacenada en
la vacuola, y juegan un papel importante en la movilizacin de la sacarosa para los
procesos metablicos (Roitsch & Gonzlez 2004). El anlisis de expresin de las dos
invertasas vacuolares (Lin9 y TIV1), revel que estos genes se regulaban de forma
diferente durante la simbiosis. Mientras que Lin9 no se regulaba por el desarrollo de
la simbiosis, TIV1 estaba inducido en races de tomate donde la simbiosis estaba
bien establecida. La induccin de los niveles de ARNm de la isoenzma de invertasa
166
Discusin
vacuolar TIV1 en las races de tomate micorrizadas, est de acuerdo con las
observaciones previas de Blee & Anderson (2002), quienes encontraron una
acumulacin de transcritos de la invertasa vacuolar en clulas corticales de
Phaseolus vulgaris que contenan arbsculos. Estos datos, sugieren que TIV1 podra
suministrar hexosas para hacer frente a la elevada actividad metablica y tasa de
respiracin de los tejidos colonizados en una raz micorrizada (Gianinizzi-Pearson
1996). La diferente regulacin de TIV1 en las races colonizadas por G. mosseae
G. intraradices, evocan que la utilizacin del carbono en las races de tomate
depende probablemente de la especie de hongo MA que est implicado en la
simbiosis.
La activacin del gen de una sacarosa sintasa (TOMSSF) durante la simbiosis
MA en races de tomate, est de acuerdo con observaciones previas en otras
especies de plantas como P. vulgaris (Blee & Anderson 2002), Medicago truncatula
(Hohnjec et al. 2003) y Zea mays (Ravnskov et al. 2003), y con el aumento de
actividad invertasa encontrada en races micorrizadas de trbol y soja (Wright et al.
1998; Schubert et al. 2003). Experimentos de hibridacin in situ en P. vulgaris,
mostraron que los transcritos para la sacarosa sintasa, estaban localizados en los
tejidos del floema y en las clulas corticales que contenan arbsculos fluorescentes
(Blee & Anderson 2002). En M. truncatula, de los cinco genes de sacarosa sintasa
analizados, slo MtSucS1 estaba inducido en las races micorrizadas, y una fuerte
expresin GusA impulsada por el promotor de MtSucS1 se detectaba en el cilindro
central de la raz, as como en las clulas corticales que contenan arbsculos y en
las clulas corticales circundantes, sin consideracin de un contacto directo con las
estructuras fngicas (Hohnjec et al. 2003). Basndonos en estas observaciones, se
propone, que la sacarosa sintasa genera fuerza sumidero durante la fase activa de
la simbiosis, lo que est apoyado porque la induccin del gen TOMSSF en tomate,
aumenta con los niveles de colonizacin del sistema radical por ambos hongos G.
mosseae G. intraradices. Como la sacarosa sintasa se localiza en el citosol, es
ms probable que esta enzima participe suministrando hexosas para hacer frente al
aumento de actividad metablica de las clulas de la raz, ms que en el suministro
de compuestos carbonados al hongo.
La induccin transcripcional de las enzimas que hidrolizan sacarosa en las
races de plantas micorrizadas de cuatro semanas, coincide con la disminucin de
los niveles de sacarosa detectados en esas races. En el segundo tiempo de cosecha
como se mencion anteriormente, el contenido de sacarosa en las races
micorrizadas aumenta, sugiriendo que se est digiriendo ms sacarosa a las races
de las plantas micorrizadas, probablemente para compensar el coste extra debido a
la presencia del hongo. En las plantas de tomate, se produce la induccin de la
167
Discusin
invertasa de pared celular sumidero-especfica Lin6 y de genes de defensa, en

respuesta a la infeccin por el patgeno Pseudomonas syringae (Berger et al.
2004). Se ha propuesto, que una elevada actividad invertasa en interacciones
planta-patgeno, podra satisfacer tanto el aumento de la demanda de
carbohidratos como fuente de energa para los tejidos invadidos, como para
generar una seal que induzca la expresin de los genes de defensa (Roitsch et al.
2003). Nuestros datos sugieren que los genes Lin6, TOMSSF y TIV1, podran ser
incluso un componente de la ruta de transduccin de seales que modula las
respuestas de defensa inducidas por los hongos MA (Pozo et al. 2002).
Los datos de regulacin de la expresin gnica en races por el fsforo
suministrado, muestran, que ninguna de las inducciones observadas por el
desarrollo de la simbiosis de los genes TIV1, Lin6, Lin10 y TOMSSF se debe a la
mejora de la nutricin fosforada que proporciona la formacin de la simbiosis a la
planta (Raghotama 1999, Smith et al. 2004). Los genes TIV1, Lin6 y TOMSSF no se
regulan por la cantidad de fosfato suministrada a las plantas, y Lin10 se inhibe
cuando la nutricin fosforada es mayor, lo que indica que la fuerte induccin de su
expresin gnica en plantas micorrizadas, se debe la establecimiento de la
simbiosis, ya que si slo tuviese efecto la mejor nutricin fosfora proporcionada por
los hongos MA, la expresin gnica de Lin10 debera inhibirse respecto a las plantas
control. Sin embargo, la expresin de la invertasa vacuolar Lin9 no regulada por la
simbiosis MA, s se regula por fsforo a las seis semanas, donde se inhibe su
expresin cuando el aporte de fsforo aumenta. Como conclusin, se puede decir,
que los genes estudiados que estn regulados por la simbiosis MA y presentan una
induccin de la expresin gnica, dicha induccin es consecuencia directa del
establecimiento de la simbiosis y no de efectos de nutricin de dicha simbiosis
sobre la planta hospedadora.
La induccin de Lin6 y Lin10 en las races de las plantas infectadas con P.
parasitica, indica que la regulacin de estos genes podra ser una respuesta
generalizada en interacciones planta-microorganismo. TIV1 y TOMSSF sin embargo,
no alteran sus niveles de ARNm cuando las plantas se infectan con el hongo
patgeno de raz, por lo que su regulacin es especfica de las interacciones planta-
hongo micorrcico arbuscular. Y en nuestro estudio, tambin encontramos el gen
Lin9, que no se regula por la simbiosis MA, y s por la interaccin planta-patgeno.
Las invertasas de las plantas, se inducen con la infeccin de hongos biotrfos (Chou
et al. 2000; Fotopoulos et al. 2003), lo que es indicativo de que el patgeno acta
como un sumidero adicional que compite en cierto modo con los rganos sumidero
de la propia planta. La observacin de que la expresin de una isoforma de
invertasa vacuolar disminuye mientras que la de una invertasa asociada a pared
168
Discusin
aumenta en races de V. faba cuando se infecta con el patgeno Uromyces fabae

(Voegele et al. 2006), est de acuerdo con nuestros resultados donde se induce la
expresin de la invertasa asociada a pared celular Lin6, mientras que la invertasa
vacuolar TIV1 no altera su expresin cuando est presente el patgeno. En arroz,
tambin se inducen algunas de las isoformas de invertasas de pared celular en
presencia de patgenos (Cho et al. 2005), lo que sugiere que dichos genes pueden
participar en el encendido metablico para resistir la invasin del patgeno. La
induccin mediada por patgeno y no por micorrizas de la otra isoforma estudiada
de invertasa vacuolar (Lin9), es un dato ms de que dentro de las familias
multignicas como es el caso de las invertasas, cada isoforma puede tener un
patrn de expresin diferente frente el mismo estmulo, por lo que se le podra
asignar a Lin9 una funcin en el encendido metablico para resistir a la invasin
por P. parasitica en la planta de tomate. Sin embargo, no hay datos de lo que
ocurre con la expresin de sacarosa sintasa y fructan-exohidrolasa en plantas
infectadas con patgenos. La sacarosa sintasa TOMSSF al no regularse en presencia
de patgeno, indica que su respuesta es planta-hongo MA especfica, mientras que
Lin10 si da una respuesta generalizada en las interacciones planta-microorganismo.
Como conclusin, dado que Lin10 es una enzima que tambin libera
hexosas, contribuira junto con Lin6, a cubrir la demanda de carbohidratos por
parte de las races colonizadas por G. mosseae, G. intraradices, infectadas con P.
parasitica, para cubrir el aumento de la actividad metablica de las clulas
colonizadas infectadas, as como para proporcionar carbohidratos al hongo MA.
Sin embargo, TIV1 y TOMSSF, solo contribuiran a cubrir la demanda de
carbohidratos y el aumento de la actividad metablica de las clulas colonizadas por
los hongos MA, y Lin9 participara en el abastecimiento de carbohidratos slo de las
clulas infectadas con el patgeno y no de las colonizadas con los hongos
micorrcicos.
El anlisis de la abundancia relativa de los transcritos de todos los genes
analizados previamente en races, se llevo a cabo tambin en hojas, donde solo se
detect expresin de Lin6 y TOMSSF, teniendo ambos genes inducida su expresin
por la presencia de ambos hongos MA, Gi y Gm. En estudios anteriores, se ha
puesto de manifiesto, que ni la invertasa apoplstica Lin6 ni la sacarosa sintasa
TOMSSF, se expresa en hojas de tomate (Godt & Roitsch 1997) en condiciones
normales, por lo que el aumento de expresin encontrado en esta Memoria en
hojas de plantas micorrizadas, es una consecuencia directa de la formacin de la
simbiosis. Ambos genes proporcionaran hexosas a partir de la sacarosa acumulada
en las hojas, para hacer frente al aumento de la demanda de carbohidratos de los
tejidos sumidero. La induccin de Lin6 y TOMSSF en respuesta a heridas y
169
Discusin
tratamientos con elicitores (Godt & Roitsch 1997; Ohyama et al. 1998) en hojas,
indica que estos genes son importantes en el metabolismo de respuesta frente a
estmulos relacionados con el estrs, ya que el aumento de carbohidratos
resultantes de su accin, proporcionan energa metablica para la activacin de una
cascada de respuestas de defensa. Incluso en zanahoria se ha mostrado la
induccin de la invertasa vacuolar como respuesta a situaciones de estrs como
heridas e infeccin con patgenos (Sturm & Chrispeels 1990). Por lo tanto, es
lgico que frente al establecimiento de la simbiosis MA, que no deja de ser una
situacin de estrs, se de tambin la induccin de estos genes.
El anlisis del ARNm de la invertasa vacuolar Lin9 y la fructan-exohidrolasa
Lin10, indica, que ambos genes se expresan de forma diferencial en los distintos
tejidos de la planta. El ARNm de Lin9 est presente fundamentalmente en flores,
mientras que la otra isoforma conocida de invertasa vacuolar de tomate (TIV1) se
expresa fundamentalmente en los ptalos dentro de ese rgano. TIV1 se expresa
intensa y preferencialmente en fruto maduro (Godt & Roitsch 1997), donde esta
ausente Lin9, que sin embargo, a diferencia de TIV1 si se expresa en fruto
inmaduro. Tambin es de destacar la expresin de Lin9 en spalos, donde esta
ausente el ARNm de TIV1. La distribucin tejido-especfica de las dos isoformas de
invertasa vacuolar de tomate (TIV1 y Lin9), muestra que tienen un patrn de
expresin distinto en los distintos tejidos, lo que suele ocurrir dentro de los genes
que estn compuestos por familias multignicas. La expresin gnica preferencial
de Lin9 en flores, coincide con Lin7 (invertasa extracelular), que se expresa
exclusivamente en flores y spalos (Godt & Roitsch 1997), lo que sugiere una
funcin especfica de ambos genes en el metabolismo de los tejidos sumidero,
suministrando carbohidratos a los rganos florales. No hay datos sobre la
distribucin tejido-especfica de las FEH. Los niveles ms altos de Lin10 se
detectaron en tallo y raz, lo que confirma la funcin de este gen en los tejidos
sumidero, no se detectan niveles de ARNm de este gen en hojas jvenes, y la
expresin es muy baja en flores, spalos y fruto maduro.
La regulacin de los genes Lin6, Lin9, Lin10, TIV1 y TOMSSF por azcares,
est de acuerdo con observaciones previas que dan un papel central a las hexosas
o la sacarosa en el control de las enzimas metablicas en las plantas superiores
(Rolland et al. 2002). La induccin de estos genes, excepto en el caso de Lin9, en
races de plntulas de tomate expuestas a glucosa, sugiere que la concentracin
ms elevada de hexosas resultante de la hidrlisis de la sacarosa, induce sus
expresiones mediante una regulacin de retroalimentacin positiva. La induccin
por glucosa est de acuerdo con la induccin de un nmero de enzimas sumidero-
especficas (Koch & Nolte 1995) por este azcar. Adems, ya haba datos de la
170
Discusin
induccin de la expresin gnica de alguno de los genes estudiados como Lin6, por
la adicin de glucosa en cultivos celulares en suspensin tras 12h (Godt & Roitsch
1997), mientras que el ARNm de la sacarosa sintasa no se afectaba, lo que puede
deberse a los distintos sistemas experimentales utilizados y a la variacin de las
concentraciones utilizadas (20mM frente a los 40mM que utilizamos en nuestro
estudio). Sin embargo, las concentraciones ms bajas de glucosa y fructosa que se
han encontrado en las races micorrizadas, apoyan la existencia de un mecanismo
alternativo para la regulacin de estos genes en las races en simbiosis. Se tienen
noticias de la acumulacin del componente de sealizacin cido saliclico (Blilou et
al. 1999), y de la fitohormona cido abscsico (ABA) en races micorrizadas
(Dannenger et al. 1992; Meixner et al. 2005). Por lo tanto, la induccin de la
expresin de Lin6, Lin10, TOMSSF y TIV1 por cido saliclico, y la de TOMSSF y
TIV1 por cido abscsico, sugiere que estos compuestos deben estimular la
induccin de la expresin de esos genes en las races micorrizadas. Recientemente,
se ha puesto de manifiesto de forma evidente, la estrecha relacin entre ABA y el
control del metabolismo de carbohidratos, basada en resultados de aproximaciones
genticas para identificar componentes de las rutas de respuesta a azcares
(revisado en Rook & Bevan 2003).
En conclusin, todos estos datos indican que el desarrollo de la simbiosis
micorrcico arbuscular, induce genes del metabolismo de la sacarosa, reflejando un
aumento del catabolismo y de la utilizacin de la sacarosa en las races de tomate
micorrizadas. Futuros detalles del anlisis de los promotores usando fusiones GUS,
y el anlisis de plantas knock out para Lin6, Lin10, TIV1 y TOMSSF mediante ARN
de interferencia, proporcionaran datos sobre sus funciones especficas en la
simbiosis, as como cuales son los elementos reguladores que son necesarios para
sus activaciones transcripcionales en las races micorrizadas.
Dando un paso ms en el estudio de los mecanismos que subyacen en la

transferencia de carbono en las micorrizas arbusculares, se ha identificado un gen
que codifica para un posible transportador de azcares (LeST3), que aumenta su
expresin en hojas, aunque no en races, de plantas micorrizadas. Basndonos en
la similitud de su secuencia, los motivos conservados que presenta y su topologa
de membrana predicha, el gen de tomate LeST3 se ha clasificado como un posible
transportador de monosacridos, de la familia de los portadores de azcares,
incluida en la superfamilia de los facilitadotes mayores (Saier et al. 1999). Sin
embargo, el anlisis filogentico sugiere que aunque son homlogos, LeST3 es
claramente diferente de los transportadores de monosacridos de membrana
plasmtica que se han caracterizado funcionalmente.
171
Discusin
El intento de estudiar su funcin in vivo mediante expresin heterloga en

un mutante de S. cerevisiae deficiente en el transporte de hexosas no tuvo xito.
En este caso, es interesante apuntar, que la protena LeST3 est estrechamente
relacionada con la protena ERD6 de Arabidopsis y con un posible transportador de
azcares del azcar de la remolacha cuya actividad tampoco se detect en clulas
de levadura (Chiou & Bush 1996; Kiyosue et al. 1998). Se pueden argumentar
diferentes posibilidades para explicar estos hechos: (1) que la estructura nativa de
la protena LeST3 en las clulas de levadura sea diferente de la que posee en
tomate, (2) que la protena codificada por el gen LeST3 est involucrada en la
salida de azcares ms que en el importe (3) que la protena se dirija a una
membrana intracelular. Aunque en la secuencia de aminocidos deducida de LeST3
no se han encontrado seales para la direccin intracelular de la protena, se ha
observado que este gen tiene mayor homologa con los transportadores de
azcares localizados en el tonoplasto del azcar de la remolacha y con los
transportadores intracelulares de glucosa de mamferos que con los
transportadores de membrana plasmtica de plantas, lo que sugiere que la protena
codificada por LeST3 podra estar localizada en el tonoplasto. Los sistemas de
transporte para la entrada y salida de azcares en las vacuolas de las clulas de las
plantas estn an a la espera de ser identificados y caracterizados (Lalonde et al.
2004). Se ha propuesto que la sacarosa almacenada en la vacuola es hidrolizada
por una invertasa vacuolar para generar hexosas, las cuales se liberan lentamente
al citosol donde constituyen una fuente de carbono fcilmente accesible (Sturm &
Tang 1999). Por tanto, el papel de un transportador de hexosas del tonoplasto,
podra ser el de suministrar la cantidad adecuada de carbono al citosol cuando hay
un incremento de la demanda de carbohidratos por parte de las clulas. Si la
protena codificada por LeST3 est localizada en el tonoplasto, como sugiere su
anlisis filogentico, podra estar implicada en la salida de glucosa desde la vacuola.
Se necesitaran futuros experimentos para localizar la protena codificada.
El anlisis de la regulacin de LeST3 durante la colonizacin por dos hongos
MA diferentes, ha mostrado que el desarrollo de la simbiosis aumenta los niveles de
expresin de LeST3 en hojas pero no en races de las plantas de tomate. Los
hongos MA, como simbiontes obligados, dependen para su crecimiento y para su
actividad, de los componentes carbonados suministrado por el compaero
fotosinttico (Jennings 1995), y previamente se ha observado que la distribucin de
carbono aumenta en las races durante la asociacin micorrzica (Douds et al. 1988;
Wrigth et al. 1998). Por tanto, la induccin de LeST3 por el desarrollo de la
simbiosis, puede estar relacionada con el incremento de la distribucin del carbono
que ocurre en las asociaciones micorrcicas. En un trabajo previo, la induccin de
172
Discusin
dos isoformas de H+-ATPasa en hojas de plantas micorrizadas, se asoci con el

incremento en la actividad de distribucin de asimilados (Ferrol et al. 2002c).
Anterior al trabajo de esta Memoria, Harrison (1996) ya observ, que la
colonizacin de races de Medicago truncatula por el hongo micorrcico G.
vermiforme, induca la expresin del gen transportador de monosacridos MtST1
en las zonas del crtex de la raz que se encontraban colonizadas en un alto grado
por el hongo micorrcico. En este caso, se propuso que dicha induccin podra ser
una consecuencia de la necesidad por parte de las clulas huspedes colonizadas de
adquirir ms hexosas para hacer frente a su incrementado metabolismo. Que LeST3
no se regule en las races por la simbiosis no es sorprendente, ya que los
transportadores de azcares se presentan como familias multignicas en las plantas
superiores, y hay evidencias de que las distintas isoformas se expresan de forma
especfica segn la clula, el tejido, y el estado de desarrollo de la planta, lo que
proporciona mecanismos potenciales para la regulacin local de los transportadores
de azcares (Barrer et al. 2000; Gear et al. 2000).
La induccin de LeST3 en las hojas de las plantas infectadas con P.
parasitica, indica que la regulacin de este gen podra ser una respuesta
generalizada en las interacciones planta-microorganismo. Cuando las plantas son
sometidas a la infeccin por patgenos, normalmente, el metabolismo de la planta
responde aumentando la respiracin, sintetizando componentes reparadores de
heridas, reforzando la pared celular, y produciendo compuestos de defensa (Baker
et al. 2000; Moershbacher & Mendgen 2000). Esa actividad metablica
incrementada, se alimenta probablemente por un aumento del flujo de azcares
hacia los sitios de infeccin. Se ha informado que en hojas de Arabidopsis
infectadas con el patgeno Erysiphe cichoracearum, la absorcin de glucosa en los
tejidos husped aumenta tras la infeccin fngica, y esto coincide con la induccin
de la expresin del gen del transportador de monosacridos AtSTP4 (Fotopoulus et
al. 2003). El transportador de monosacridos AtSTP4 inducido por heridas y
sumidero-especfico, se induce tambin (aproximadamente cuatro veces) en
plntulas de Arabidopsis infectadas con Alternaria brassicicola, Fusarium
axyxporum y en suspensin de cultivo clulas de Arabidopsis tratadas con elicitores
bacterianos fngicos, por lo que se ha propuesto que este transportador regula el
importe de monosacridos al interior de los tejidos sumidero para hacer frente al
aumento de la demanda de las clulas que responden a los estreses
medioambientales (Truernit et al. 1996). Nuestros datos sugieren que LeST3
responde al aumento de la demanda de carbohidratos por parte de las races
colonizadas por G. mosseae, G. intraradices, infectadas con P. parasitica, para
173
Discusin
cubrir el aumento de actividad metablica de las clulas colonizadas/infectadas,

para proporcionar carbohidratos al hongo MA.
Se ha descrito que los azcares juegan un papel importante en sealizacin
(Koch 2004). Una hiptesis alternativa sera considerar a LeST3 como un
componente de la ruta de transduccin de seales que desencadena la respuesta de
defensa en una asociacin micorrcica con xito (Pozo et al. 1998), y en una
interaccin planta-patgeno (Herbers et al. 1996). Aunque los hongos MA son
capaces de inducir respuestas de defensa en las races de sus plantas husped, se
acepta que estas reacciones son transitorias, localizadas y ms dbiles que las
inducidas por los hongos patgenos (Pozo et al. 2002). La induccin de LeST3 por
la simbiosis se detect en la parte area seis semanas despus de la inoculacin
micorrcica, pero no se conoce todava el papel de la simbiosis en la induccin de
resistencia en la parte area del tomate.
Como conclusin, se puede decir que el gen LeST3 codifica un posible
transportador de azcares, cuya expresin aumenta en hojas de una planta bien
colonizada por un hongo MA por uno patgeno de raz. La regulacin de este gen
por la interaccin entre la raz de la planta y ambos tipos de hongos en las hojas de
la planta, sugiere que dicho gen podra estar implicado en la distribucin de los
compuestos carbonados desde los tejidos fuente a los sumidero. Para el
entendimiento del papel preciso de este gen, es necesaria la localizacin de este
transportador y el anlisis de su expresin en otras interacciones planta-microbio.
174
CONCLUSIONES
Conclusiones
1. Se ha aislado y caracterizado un gen que codifica para una invertasa

vacuolar, Lin9, cuya expresin no se regula por el establecimiento de la
micorriza. Se expresa principalmente en flores, pero no se detecta
expresin en fruto maduro. La expresin de este gen aumenta en races
infectadas con el patgeno de raz P. parasitica.
2. Se ha aislado y caracterizado por primera vez un gen de tomate (Lin10)
que codifica para una fructan-exohidrolasa, cuya expresin est
fuertemente inducida en las races micorrizadas y, en menor grado, en las
infectadas con P. parasitica, por lo que podra ejercer un papel importante
en el abastecimiento de carbohidratos en las interacciones planta-
microorganismo. Sus niveles de expresin ms elevados se producen en
en tallo y raz.
3. La invertasa de pared celular Lin6, aumenta sus niveles de expresin en
plantas micorrizadas infectadas con P. parasitica, lo que sugiere que la
protena codificada por este gen tiene una funcin importante en la
hidrlisis de la sacarosa en el apoplasto para el funcionamiento de la
micorriza y para hacer frente al sumidero adicional que supone el
patgeno para la planta.
4. La expresin de la invertasa vacuolar de tomate TIV1 aumenta
exclusivamente en races de tomate con un determinado nivel de
micorrizacin y su expresin no se regula en la interaccin planta-
patgeno. La diferente regulacin de TIV1 en las races colonizadas por G.
mosseae G. intraradices, sugiere que la utilizacin del carbono en las
races de tomate depende de la especie de hongo micorrcico implicado en
la simbiosis.
5. La activacin del gen de una sacarosa sintasa (TOMSSF) durante la
simbiosis micorrcica aumenta con los niveles de colonizacin del sistema
radical por G. mosseae y G. intraradices, mientras que no se regula por la
presencia del patgeno P. parasitica. Este gen proporciona metabolitos y
genera fuerza sumidero durante la fase activa de la simbiosis.
6. Las inducciones observadas por el desarrollo de la simbiosis en los genes
TIV1, Lin6, Lin10 y TOMSS) se deben directamente al establecimiento de
la simbiosis y no a la mejora de la nutricin fosforada de la planta como
consecuencia de la formacin de la micorriza.
7. De todos los genes estudiados slo se expresan en hojas Lin6 y TOMSSF.
La induccin de su expresin en plantas micorrizadas es consecuencia
directa de la formacin de la simbiosis.
177
Conclusiones
8. La expresin de Lin6, Lin9, Lin10, TIV1 y TOMSSF es regulada por

glucosa, cido abscsico y cido saliclico.
9. Se ha aislado el gen de tomate LeST3, que codifica un posible
transportador de azcares cuya expresin aumenta en hojas de una
planta bien colonizada por hongos micorrcicos por un patgeno de raz.
La regulacin de este gen por la interaccin de la planta con ambos tipos
de hongos sugiere que pudiera estar implicado en la distribucin de los
compuestos carbonados desde los tejidos fuente a los sumidero.
En resumen se puede concluir que el establecimiento de micorrizas

arbusculares regula el metabolismo carbonado de la planta hospedadora para
hacer frente al aumento en la demanda de carbohidratos en races
micorrizadas. Aumenta el transporte de sacarosa a las races micorrizadas y
la hidrlisis de la misma, lo que est apoyado por la induccin transcripcional
de las enzimas responsables de dicha hidrlisis. Las hexosas resultantes son
rpidamente utilizadas como fuente de energa. Tanto la enzima responsable
de la fijacin de CO2 (RuBisCo), como la responsable de la sntesis de
sacarosa (SPS), se inducen en las hojas de las plantas micorrizadas para
poder responder a la mayor demanda de carbohidratos de la raz micorrizada.
178
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Zhrenner R, Salanoubat M, Willmitzer L, Sonnewald U (1995) Evidence of the

crucial role of sucrose synthase for sink strength using transgenic potato plants
(Solanum tuberosum). Plant J 7:97-107
222

Efecto de Las Micorrizas Arbusculares Sobre La Regulación de Genes ...

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Universidad de Granada

Consejo Superior de Investigaciones Cientficas

Efecto de las micorrizas arbusculares

Sonia Garca Rodrguez

Efecto de las micorrizas arbusculares sobre la

SONIA GARCA RODRGUEZ

Memoria que presenta la Licenciada en

Fdo. Sonia Garca Rodrguez

Fdo. D. Concepcin Azcn Gonzlez de Aguilar Fdo. D. Nuria Ferrol Gonzlez

2.3. Cuantificacin de ADN 83

ABA cido abscsico

En trminos de Agricultura Sostenible, se recomienda un uso mnimo de

se discutirn en el contexto de su relevancia en la integracin funcional de ambos

1.-Determinar los cambios inducidos por el desarrollo de la simbiosis en la

Los resultados de la investigacin supondrn un avance en los conocimientos

puedan utilizarse como indicadores de eficiencia simbitica de una determinada

1.1 Tipos de asociaciones micorrcicas

elevado contenido en materia orgnica (Pearson & Read 1975; St-

Figura 1. Tipos de micorrizas y simbiontes implicados en su formacin. Se representa

2. LAS MICORRIZAS ARBUSCULARES

2.1 Generalidades de los hongos que forman micorrizas arbusculares

2001). Sin embargo, debido a la estructura multinucleada de las esporas de los

2.2 Taxonoma de las micorrizas arbusculares

anlisis de la subunidad pequea del ARNr 18S, agrupndose as en el nuevo

Figura 2. (A) Filogenia propuesta para los hongos formadores de micorrizas

Cada vez hay ms evidencias de que la identificacin basada en criterios

Prosser 2002). Todos estos avances en el anlisis de la diversidad gentica de los

2.3 Ciclo de vida de los hongos formadores de micorrizas arbusculares

(Tamasloukht et al. 2003) y la de sistemas enzimticos como la H+ATPasa que es la

Espora en germinacin Espora quiescente

Formacin de apresorios Formacin- de BAS- espora

Formacin de ves culas

Figura 3. Ciclo de vida de Glomus intraradices.

aumentando as sus posibilidades de contacto con la raz (Giovannetti et al. 1993).

periarbuscular se localizan transportadores de fosfato especficos de la simbiosis

ocasiones, llegar a convertirse en esporas del hongo. Esta transformacin de

esporas. Dichas esporas pueden desarrollarse de dos maneras diferentes en funcin

2.4 Fisiologa de la simbiosis

derivado del incremento en el aporte de nutrientes a tallos y hojas; por tanto, la

Figura 4. Transferencia de nutrientes en las races micorrcico arbusculares. Se indican

2.4.1 Intercambio de nutrientes en micorrizas arbusculares

2.4.1.1 Absorcin de nutrientes minerales del suelo

responsables del 100% de la incorporacin de fosfato en algunas especies

Oryza sativa (Paszkowski et al. 2002). La inmunolocalizacin del transportador de

2.4.1.1.B Nutricin nitrogenada

Sin embargo, los hongos micorrcicos prefieren cono fuente de N al amonio

Figura 6. Mecanismo propuesto para el transporte de nitrgeno a la planta en

fundamentalmente en al micelio externo (Joner et al. 2000), aunque tambin en

argumentando as a favor de un papel arbuscular en la absorcin de carbohidratos

un 20% ms de fotoasimilados al sistema radical que las plantas no micorrizadas

apoplstica como simplstica, refleja probablemente el aumento de las necesidades

3. REGULACIN DEL METABOLISMO CARBONADO EN PLANTAS

Glucosa + fructosa sacarosa

desde el mesfilo desde parnquima vascular y su reabsorcin (2) al complejo clulas

Las plantas disponen de varios transportadores de monosacridos y

3.2. Estudio de la regulacin del metabolismo de carbono de las

demandas. Por esto, la sutil coordinacin de la distribucin de carbono entre los

Clula del mesfilo

Figura 8. Esquema de las relaciones fuente-sumidero.

3.3. Localizacin y regulacin de la actividad de las enzimas clave

UDP-glucosa Fructosa Glucosa Fructosa

Figura 9. Metabolismo de la sacarosa en plantas superiores.

Durante el da, el sustrato para la biosntesis de sacarosa son las triosas

caractersticas bsicas de la regulacin de la ruta de biosntesis de sacarosa, su