ESTUDIO DE LA

CINTICA
ENZIMTICA
MEDIANTE EL USO DE
CATALASA
PROCEDENTE DE
HGADO DE TERNERA
Prctica 2

Laura Vanessa Garzn Romero y Thais Brito Armas

01/04/2014
Las enzimas son protenas que catalizan reacciones qumicas en las clulas. Cada
enzima es altamente especfica para la reaccin que cataliza, acta sobre una sustancia
especfica (sustrato) y lo convierte en un producto especfico. Esto implica dos pasos:
primero, que el sustrato debe adherirse a la enzima y segundo, que la enzima altera al
sustrato para convertirlo en producto. El lugar en la enzima donde el sustrato es alterado
se conoce como el sitio activo. Las dos reacciones bsicas que llevan un sustrato a un
producto son:

k1, k -1 y k2 son las constantes cinticas individuales de cada proceso. Segn esto,
podemos afirmar que:
v1 = k1 [E] [S]
v-1 = k-1 [ES]
v2 = k2 [ES] (velocidad inicial de la reaccin)

Mientras haya enzima disponible k1 (constante cintica de formacin de ES) ir

aumentando hasta que las molculas de enzima se saturen. Si las constantes de reaccin
y disociacin son iguales, la formacin del complejo ES se mantiene estable al igual que
la velocidad de reaccin. Esto se definira como

[ ][ ]
[ ]
[ ]

Si definimos KM como (k2 + k -1) / k1 y Vmax como k2 [Et], obtenemos que

[ ]
[ ]

KM = constante de Michaelis Menten (Concentracin de sustrato necesaria para

alcanzar la mitad de la velocidad de reaccin mxima Vmax)
v = actividad enzimtica
Vmax = actividad a [ ]

En un estudio de cintica de enzimas se mide la actividad enzimtica en trminos de

producto formado por minuto, a distintas concentraciones de sustrato. Si se representa la
velocidad de reaccin frente a la concentracin del sustrato, la curva generada es una
hiprbole rectangular.
Estos ltimos dos parmetros son importantes, porque nos dan informacin directa
sobre cun bien la enzima se une al sustrato (KM) y sobre cun bien la enzima convierte
el sustrato en producto una vez se une (Vmax). De hecho, KM es la constante de
disociacin dinmica de la enzima con el sustrato, y Vmax es la concentracin molar de
la enzima por la constante cataltica (Kcat).

Determinar estos parmetros de una grfica de v vs [S] es difcil porque es imposible

medir v a [ ] . Sin embargo, un mtodo menos complicado consiste en emplear
la ecuacin Lineweaver-Burk. As se transforma la curva en una recta donde se pueden
hallar ms fcilmente los parmetros cinticos.

[ ]

Se representa el inverso de la velocidad (tiempo de reaccin) frente al inverso de

la concentracin de sustrato ([ ]). Se obtiene una recta de cuya pendiente se
halla , con el objetivo de calcular la constante , y a su vez, de la
ordenada del origen se averigua .
 Primero preparamos las disoluciones de agua oxigenada a partir de la disolucin
preparada al 2% contenida en 1 litro. Se pasa a un matraz de 500 ml y el resto de la
disolucin dada se traspasa a otro matraz de 1 litro y se enrasa diluyendo con agua
destilada, obteniendo la disolucin al 1%. Este proceso se repite consiguiendo las
sucesivas disoluciones: 0,5%, 0,25%, 0,125%, 0,062%, 0,031%, 0,015% y 0,007%.

Al mismo tiempo, se toman dos placas de Petri, en una de ellas cortaremos el hgado,
y en la otra realizaremos su pesada (3,9 g). A su vez, dibujamos 9 crculos en papel de
filtro utilizando como molde un vaso de precipitado pequeo, los cortamos y
colocamos cada uno en una placa de Petri, con el fin de impregnarlos con la
disolucin enzimtica, es decir, la mezcla de hgado y buffer fosfato, que se preparar
en el siguiente paso.

A continuacin, medimos 250 ml de buffer fosfato (enfriado con hielo) en una

probeta, y lo introducimos junto con el hgado a un vaso de precipitado 500 ml, para
posteriormente batirlo y as obtener una disolucin homognea. Luego tomamos 25
ml de dicha mezcla y se diluyen en un matraz de 250 ml con buffer fosfato, como en
el primer paso.

Despus, se extraen 9 tomas de 3 ml de esta disolucin, con una pipeta, con la

finalidad de verterlos en las placas de Petri.

Una vez que el papel ha absorbido la disolucin, transferimos las disoluciones de agua
oxigenada del matraz a sus respectivos reactores discontinuos, es decir, vasos de
precipitado donde se producir la reaccin.

Seguidamente con la ayuda de unas pinzas y de una varilla introducimos el papel de

filtro hasta el fondo del reactor y lo dejamos en libertad (tomndolo como tiempo
cero). Por ltimo, se cronometra el tiempo que tarda en subir el papel de filtro hasta la
superficie (algunas de ellas no llegarn a la superficie, y se tomar como tiempo la
altura mxima que alcance).
Los datos obtenidos han sido los siguientes:

% (ml) Tiempo(min)
2 0,06 Llegaron a la
superficie
1 0,06
0,5 0,08
0,25 0,14
0,125 0,25
0,062 0,53
0,031 1,51 Subi un poco
0,015 2,21
0,007 7,11

A continuacin se realiza la representacin de Lineweaver-Burk (t vs. 1/[ ]), tal y

como se ha indicado en la introduccin.

Peso del hgado: 3,9 g

Peso placa de petri: 39 g
Densidad de =1,45 g/ml
Mm =18 g/mol
Con los datos de densidad, masa molecular y el porcentaje de disolucin se hallan las
concentraciones.

[ ] 1/[ ]
1,61111111 0,62068966
0,80555556 1,24137931
0,40277778 2,48275862
0,20138889 4,96551724 [ ]
0,10069444 9,93103448
0,04994444 20,0222469
0,02497222 40,0444939
0,01208333 82,7586207
0,00563889 177,339901

El valor 82,7586207 se desecha de la grfica, ya que provoca que la recta quede mal
ajustada.
 Representacin de Lineweaver-Burk
8
7 y = 0,0404x - 0,077
6 R = 0,9983
5
4
t
3
2
1
0
-1 0 50 100 150 200
1/[22]