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Resumen
Estos ltimos resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores
biolgicos de una reaccin.
De igual forma se pudo observar que la reaccin enzimtica tambin se ve influenciada por el
cambio del pH del medio hasta alcanzar un pH ptimo, el cual para la ptialina est alrededor de
6.7-6.8 cerca del pH neutro. Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima
ptialina as como muchas enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actan en pH
neutro. Este resultado puede ser ubicado en la punta de la campana.
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Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica
Introduccin
Los enzimas son macromolculas, especficamente protenas, que tienen la propiedad de catalizar
las reacciones bioqumicas. Pero las condiciones en las cuales se realice dicha catlisis afectarn la
eficiencia de la reaccin por lo tanto estas se deben de controlar en todo momento.
Por ejemplo son muy importantes los factores como la concentracin del enzima, la temperatura
y el pH. Por ejemplo si la temperatura es muy elevada, el enzima se desnaturaliza y queda inactiva;
si la temperatura es muy baja, el enzima no se desnaturaliza, pero igual queda inactiva. Mientras
que valores de pH extremos pueden desnaturalizar a los enzimas.
Los enzimas, tambin se caracterizan por tener un alto grados de especificidad, es decir slo
actan para un solo tipo de sustrato. Esto puede deberse a la relacin estereoqumica entre el
sustrato y el enzima, as como tambin al tipo de grupos funcionales que del sustrato. Por ejemplo
la ureasa contenida en la harina de soya slo acta sobre la urea descomponindola en amoniaco
y dixido de carbono. Pero este enzima no acta sobre la tiourea o acetamida a pesar de tener
una estructura muy parecida.
H2N
O + H2O ureasa NH3 + CO 2
H2N
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Marco terico
Cintica enzimtica
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por las
enzimas. El estudio de la cintica de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo
cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede
ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas.
Las enzimas son protenas (macromolculas) con la capacidad de manipular otras molculas,
denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro cataltico de la enzima que lo
reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados
mecanismo enzimtico. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar
diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una protena en dos polipptidos.
En otros casos, se produce la unin simultnea de dos sustratos, como en el caso de la ADN
polimerasa, que es capaz de incorporar un nucletido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato
2). Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, tambin suelen
presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reaccin. Esta etapa
limitante puede consistir en una reaccin qumica o en un cambio conformacional de la enzima o
del sustrato.
Fundamentos
La reaccin catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma
cantidad de producto que una reaccin no catalizada. Al igual que ocurre en otros tipos de
catlisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reaccin entre sustrato y producto.
Sin embargo, al contrario que las reacciones qumicas, las enzimas se saturan. Esto significa que a
mayor cantidad de sustrato, mayor nmero de centros catalticos estarn ocupados, lo que
incrementar la eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los sitios posibles estn
ocupados. En ese momento se habr alcanzado el punto de saturacin de la enzima y, aunque se
aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia.
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Las dos propiedades cinticas ms importantes de una enzima son: el tiempo que tarda en
saturarse con un sustrato en particular y la mxima velocidad de reaccin que pueda alcanzar. El
conocimiento de estas propiedades hace posible hipotetizar acerca del comportamiento de una
enzima en el ambiente celular y predecir cmo responder frente a un cambio de esas
condiciones.
Ensayos enzimticos
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Los ensayos enzimticos ms sensibles utilizan lseres dirigidos a travs de un microscopio para
observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando catalizan una reaccin. Estas
medidas pueden utilizar cambios producidos en la fluorescencia de cofactores que intervienen en
el mecanismo de catlisis o bien unir molculas fluorescentes en lugares especficos de la enzima,
que permitan detectar movimientos ocurridos durante la catlisis. Estos estudios estn dando una
nueva visin de la cintica y la dinmica de las molculas individuales, en oposicin a los estudios
de cintica enzimtica tradicionales, en los que se observa y se mide el comportamiento de una
poblacin de millones de molculas de enzima.
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Temperatura: las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse modificada su actividad
por este factor. Los rangos de temperaturas ptimos pueden llegar a variar sustancialmente de
unas enzimas a otras. Normalmente, a medida que aumente la temperatura, una enzima ver
incrementada su actividad hasta el momento en que comience la desnaturalizacin de la misma,
que dar lugar a una reduccin progresiva de dicha actividad.
pH: el rango de pH ptimo tambin es muy variable entre diferentes enzimas. Si el pH del medio
se aleja del ptimo de la enzima, esta ver modificada su carga elctrica al aceptar o donar
protones, lo que modificar la estructura de los aminocidos y por tanto la actividad enzimtica.
En fisiologa humana tanto la procedente de la saliva como la pancretica son -Amylasas. Puede
encontrarse en algunas plantas, hongos y bacterias.
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Cintica de Michaelis-Menten
Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catlisis no muestra
un comportamiento lineal en una grfica al aumentar la concentracin de sustrato. Si la velocidad
inicial de la reaccin se mide a una determinada concentracin de sustrato (representado como
[S]), la velocidad de la reaccin (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la
[S], como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la enzima se satura
de sustrato y alcanza su velocidad mxima (Vmax), que no sobrepasar en ningn caso,
independientemente de la [S].
El modelo de cintica micheliana para una reaccin de nico sustrato se puede ver en la figura de
la izquierda. Primeramente, tiene lugar una reaccin qumica bimolecular entre la enzima E y el
sustrato S, formndose el complejo enzima-sustrato ES. Aunque el mecanismo enzimtico para
una reaccin unimolecular puede ser bastante complejo, existe una etapa
enzimtica limitante que permite que el mecanismo sea simplificado como una etapa cintica
nica cuya constante es k2.
(Ecuacin 1)
k2 tambin llamado kcat o nmero de recambio, hace referencia al mximo nmero de reacciones
enzimticas catalizadas por segundo.
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La ecuacin de Michaelis-Menten7
describe como la velocidad de la
reaccin depende del equilibrio
entre la [S] y la constante k2.
Leonor Michaelis y Maud Menten
demostraron que si k2 es mucho
menor que k1 (aproximacin del
equilibrio) se puede deducir la
siguiente ecuacin:
(Ecua
Representacin grfica de la curva de saturacin de
cin 2) una enzima donde se puede observar como evoluciona
la relacin entre la concentracin de sustrato y la
Esta famosa ecuacin es la base de velocidad de la reaccin. (Standard RF,
la mayora de las cinticas MedicalRF.com/Corbis. 1999)
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sido sustituidos por mtodos ms fiables basados en anlisis de regresin no lineal. Para analizar
los datos es conveniente la normalizacin de los mismos, ya que esto puede ayudar disminuyendo
la cantidad de trabajo experimental a realizar e incrementando la fiabilidad del anlisis.
Especificidad
Las enzimas suelen ser muy especficas tanto del tipo de reaccin que catalizan como del sustrato
involucrado en la reaccin. La forma, la carga y las caractersticas hidroflicas/hidrofbicas de las
enzimas y los sustratos son los responsables de dicha especificidad. Las enzimas tambin pueden
mostrar un elevado grado de estereoespecificidad, regioselectividad y quimioselectividad.
Algunas de estas enzimas que muestran una elevada especificidad y precisin en su actividad son
aquellas involucradas en la replicacin y expresin del genoma. Estas enzimas tienen eficientes
sistemas de comprobacin y correccin de errores, como en el caso de la ADN polimerasa, que
cataliza una reaccin de replicacin en un primer paso, para comprobar posteriormente si el
producto obtenido es el correcto. Este proceso, que tiene lugar en dos pasos, da como resultado
una media de tasa de error increiblemente baja, en torno a 1 error cada 100 millones de
reacciones en determinadas polimerasas de mamferos. Este tipo de mecanismos de
comprobacin tambin han sido observados en la ARN polimerasa, en la ARNt aminoacil sintetasa
y en los ribosomas.
Aquellas enzimas que producen metabolitos secundarios son denominadas promiscuas, ya que
pueden actuar sobre una gran variedad de sustratos. Por ello, se ha sugerido que esta amplia
especificidad de sustrato podra ser clave en la evolucin y diseo de nuevas rutas biosintticas.
Ureasa
La ureasa (EC 3.5.1.5) es una enzima que cataliza la hidrlisis de urea a dixido de carbono y
amoniaco. La reaccin ocurre de la siguiente manera:
En 1926, James Batcheller Sumner demostr que la ureasa es una protena. Es producida por
bacteria, hongos y varias plantas superiores.
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Caractersticas
Diagnstico
Los organismos que producen ureasa tienden a ser patgenos del tracto gastrointestinal o
urinario, siendo que la ureasa les permite neutralizar el cido presente en estos medios acdicos.
Helicobacter pylori
Bacterias entricas incluyendo Proteus, Klebsiella y Serratia
Nocardia, una bacteria filamentosa
Ureaplasma urealyticum, relacionada con mycoplasma
Cryptococcus, un hongo oportunista
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Procedimiento Experimental
2. Se toma 4 tubos de ensayo y se coloca en cada uno de ellos 1mL de cada una de las
soluciones preparadas.
3. A cada uno de los 4 tubos se agrega 1mL de solucin de almidn y se coloca en un bao de
38C y se controla el tiempo inicial de la reaccin.
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4. Despus de unos 2 minutos toman 2 gotas del lquido de cada muestra y le agregan a ellas
1 gota de solucin de Lugol. Se registra el tiempo en que la reaccin ha terminado pues
primero se presenta una coloracin azul, luego rojo-violeta y por ultimo roja.
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2. Luego a cada uno de los tubos se le agr3go 5 gotas de saliva diluida 10 veces su volumen y
10 gotas de solucin de almidn y todo se coloca en un bao de agua a 38C.
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(Laboratorio N9)
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Reacciones Qumicas
El mtodo est basado en el estudio de la velocidad de hidrlisis del almidn revelado con
Lugol, en dependencia de la cantidad aadida del alfa-amilasa de la saliva. As mismo se
cumplen las reacciones al influir la temperatura y el pH.
La amilasa del almidn forma con el yodo un complejo de color azul, el glucgeno pardo
rojizo o amarillento.
El mtodo se bas en la determinacin del amonaco que se forma por la accin de la ureasa de
la harina de soya sobre la urea:
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Clculos Experimentales
pH 1/T (min)
5.6 0.070
6.4 0.170
6.8 0.330
7.2 0.200
8.0 0.125
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Discusin de resultados
Estos ltimos resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores
biolgicos de una reaccin.
Por otro lado se pudo corroborar cualitativamente la presencia de eritrodextrinas del almidn,
como consecuencia de la accin enzimtica de la ptialina sobre el sustrato (almidn).
Cabe destacar por ultimo, que se pudo observar que la reaccin enzimtica sigui una cintica de
Michaelis por tener un comportamiento lineal al ser graficada la velocidad versus la concentracin.
As mismo destacar que la reaccin enzimtica de la amilasa sobre el almidn es de naturaleza
especfica.
Los resultados del experimento demuestran que la temperatura tiene un efecto importante en la
velocidad enzimtica.
Como es el caso de la ptialina actuando sobre el almidn. As mismo se produce este resultado a
38C, que es una temperatura ideal de accin de la enzima. Finalmente la accin enzimtica no se
produce a 7C debido a que no es la temperatura de accin de la ptialina.
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Estos resultados pues indican, que la accin enzimtica es especfica no solamente a la estructura
del sustrato sino tambin a una temperatura adecuada, para que se puedan generar los enlaces de
naturaleza covalente y se pueda producir el fenmeno termodinmico y por ultimo la
transformacin de los reactantes en productos.
Los resultados demuestran que la reaccin enzimtica tambin se ve influenciada por el cambio
del pH del medio hasta alcanzar un pH ptimo, el cual para la ptialina est alrededor de 6.7-6.8
cerca del pH neutro.
Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima ptialina as como muchas
enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actan en pH neutro. Este resultado
puede ser ubicado en la punta de la campana.
El pH funciona de esta manera como un tercer factor adems de la temperatura y la composicin
del sistema.
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Conclusiones
Los resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores biolgicos
de una reaccin.
Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima ptialina as como
muchas enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actan en pH neutro.
Este resultado puede ser ubicado en la punta de la campana.
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Bibliografa
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