CITOGENETICA CURSO PRCTICO

PRACTICA Nro 1
HERENCIA POLIGENICA DERMATOGLIFIA

1. Introduccin:
El estudio los dermatoglifos se utilizaron durante mucho tiempo, antes de la aplicacin de las
modernas tcnicas de gentica molecular, para el diagnstico de la gemeralidad. Ms
recientemente, los dermatoglifos y los pliegues de flexin palmar han sido recuperados
como variables de inters en el estudio de los trastornos congnitos de origen desconocido.

Asimismo, las caractersticas de los pliegues de flexin palmar han sido durante aos
herramientas complementarias para el diagnstico de distintos sndromes originados por
cromosomopatas, especialmente en el caso del sndrome de Down.

2. Competencias:
Contribuir a mejorar sus conocimientos, sentando las bases para su formacin
docente e investigadora.
Los alumnos adquirirn conocimientos sobre el manejo de tcnicas citogenticas.
Capacidad de aplicar los conocimientos en la prctica.
Capacidad de resolucin de problemas.
Capacidad de anlisis y sntesis.

3. Materiales:
Tampn de sellos (preferentemente color rojo y/o azul)
Hojas bond
Transportador

4. Definicin de trminos:

Trirradio: Es el punto de confluencia de tres campos de lneas cada una a menos

de 900 (punto de unin de 3 lneas drmicas). El centro del trirradio puede ser
cualquiera de los puntos de encuentro de los tres radiales o en el centro o se forma
un pequeo triangulo por los 3 radiales

Patrn Dactilar: Patrones propios de las yemas de los dedos y estos se clasifican
en:

1
 Arcos:

Asa, Presilla o Bucles

Torbellino, Espiral o Vorticiclo

Regiones Palmares: Regiones propias de las palmas de las manos.

2
 Lneas de Flexin:

5. TECNICA DE ESTUDIO DE LA DERMATOGLIFIA

a. Obtener la impresin de ambas palmas de las manos y de cada uno de los dedos por
separado, utilizando el tampn de sellos.
b. Describir los siguientes CARACTERES: Numero de dedos, trirradios digitales,
presencia de patrones palmares, presencia o ausencia de Lnea Simeana o Sydney.
c. Determinar los siguientes VALORES PALMARES: Distancia a b, Angulo ATD,
TFRC (Total Found Rigde Count.

Trirradio digital b

Trirradio digital a

Trirradio axial t
3
 d. Una vez obtenidos los valores descritos hacer un anlisis comparativo y descriptivo
de la prctica.

HOMBRE MUJER
TFCR 93.3 - 192.5 68.1 - 172.7
DISTANCIA a - b 74.2 - 93.8 70.8 - 92.0
VALOR ANGULO ATD 71.8 - 98.8 70.7 - 104.5

6. Cuestionario:
a. Cules son las Caractersticas dermatoglificas en las siguientes enfermedades:
Trisomia 21, 13, 18, Sndrome de Turner, Sndrome de Klinefelter?
b. En Enfermedades como la Esquizofrenia, Enfermedad Alzheimer u otras
enfermedades neurodegenerativas existe evidencia de patrones dermatoglificos?
c. Procesar la Dermatoglifia de un Paciente con Sndrome de Down?
d. Cul es la media TFRC, Distancia a b, Angulo ATD para la clase? Existen
diferencias en las TFRC medias para los varones y mujeres?

4
 CITOGENETICA CURSO PRCTICO
PRACTICA Nro 2
ESTUDIO DE LA CROMATINA SEXUAL

1. Introduccin:
Es bien sabido que las mujeres poseen dos cromosomas X y los hombres solo tienen
uno. Durante la mayor parte de este siglo sabemos que el cromosoma X contiene muchos
genes codificadores de protenas importantes. As, las mujeres tienen dos copias de cada
gen ligado al cromosoma X, mientras que los hombres nicamente poseen una copia.

Se sabe desde los comienzos de este siglo que las clulas masculinas difieren de las
femeninas normales por su complemento de cromosomas sexuales, pero no se verific
hasta 1921 con el descubrimiento de una diferencia entre las clulas masculinas y
femeninas, visibles en la interface. El Dr. Barr de la universidad de Westeer Ontario y su
alumno E. G. Bertram, observaron la existencia de una pequea masa de cromatina,
reconocida ya previamente, pero mal interpretada, que se situaba en el ncleo de algunas
clulas nerviosas; esta masa era muy frecuente en las mujeres y en cambio, muy rara en
los hombres; se conoce en la actualidad con el nombre de Cuerpo de Barr.

2. Competencias:
Contribuir a mejorar sus conocimientos en el contexto del mbito cientfico, sentando
las bases para su formacin docente e investigadora.
Los alumnos adquirirn conocimientos sobre el manejo de tcnicas citogenticas que
los pueden servir para integrarse en grupos de investigacin de Servicios de
Gentica de Hospitales, institutos de investigacin, salud pblica, etc.
Capacidad de aplicar los conocimientos en la prctica.
Capacidad de resolucin de problemas.
Trabajar en equipo

3. Contenidos:
Inactivacin del Cromosoma X.
Hiptesis de Lyon.
Mecanismos de Inactivacin

4. Metodologa:
La metodologa a usar ser de tipos: La primera parte audiovisual, dirigida y la Segunda
parte netamente prctica donde los alumnos podrn identificar los Corpsculos de Barr y
adems debern resolver un cuestionario al trmino de la prctica.

5. Materiales Reactivos:

a. Materiales:
Balanza
Matraz 250ml
Probeta 100ml
Pipetas Volumtricas de 5ml y 10ml
b. Reactivos:

ALCOHOL ETER (FIJADOR)

Alcohol etlico absoluto volumen
ter etlico volumen

CIDO CLORHDRICO 5N (SOL. HIDROLIS)

5
Acido Clorhdrico qp 35ml
Agua Destilada csp 100ml

COLORANTE CARBOL FUCSINA Solucin

Stock
Fucsina bsica 3g
Alcohol etlico 70% 100ml
Solucin de trabajo
Solucin stock 10ml
cido fenico 5% 90ml
cido Actico glacial 5ml
Formol 40% 5ml

Mezclar con cuidado, filtrar el colorante 2 veces y guardar en frasco oscuro y en

refrigeracin. De preferencia utilizar el colorante luego de 5 das de preparado para
as evitar precipitados de colorante.

6. Tcnica del Carbol Fucsina :

6.1 Toma de Muestra :

Se recomienda que se haga un enjuague bucal, o se haga una higiene bucal
utilizando una gasa, previa al momento de toma de muestra.
Utilizando una lmina portaobjetos limpia se hace un raspado de la mucosa oral, y
luego se hace un frotis sobre una lmina portaobjetos, evitando retornar la lamina
por el mismo lugar del extendido

6.2 Fijacin:
Una vez tomada, la muestra colocar la lmina en un frasco (Koplins) que contenga al
fijador durante 15 minutos como tiempo mnimo, aunque lo podemos dejar por ms
tiempo (1 semana) sin que la muestra se deteriore.

6.3 Hidrlisis:
Dejar secar, y luego colocarlo en un frasco (Koplins) que contenga el HCl 5N por un
tiempo de 10 segundos o ms, dependiendo del tiempo de fijacin.

6.4 Lavado:
Una vez retirada la muestra de la Solucin de Hidrlisis, pasar al frasco (Koplins) que
contenga Agua Destilada o Agua simple para detener la accin del HCL.

6.5 Coloracin:
Luego del lavado, la lmina es cubierta por el colorante Carbol Fucsina. El tiempo de
coloracin depender fundamentalmente del grado de madurez y/ o tiempo de preparado
el colorante. Tiempo promedio 5 a 10 minutos.

6.6 Decoloracin:
Luego la lamina deber ser pasada sucesivamente en dos frascos (Koplins) que
contenga Alcohol Etlico 70% y Alcohol Etlico 100%, a manera de lavados rpidos.
6.7 Observacin al Microscopio:
Una vez seca la lmina se procede a observar en el microscopio primero con objetivo de
10X para seleccionar el campo a estudiar y luego se pasa a objetivo de 100X para
realizar el recuento de corpsculos de Barr siguiendo un criterio el conteo
preestablecido.

6
CRITERIOS PARA EL RECUENTO DE CORPSCULOS DE BARR
Se considera como cromatina X (Corpsculo de Barr) solamente el corpsculo
Heteropicntico que se encuentra situada perifricamente y pegado a la cara interna
de la membrana nuclear (carioteca).
Se debe contar solo los ncleos que tengan membrana nuclear completa y cuya
cromatina este finalmente distribuida as presente o no el corpsculo de Barr, para
luego sacar el porcentaje de CB observados en a muestra. Para esto se deber
contar no menos de 100 ncleos.
No entran en el recuento los ncleos que estn superpuestos o plegados.
No entran en el recuento los ncleos cuya cromatina sea heteropicntica y distribuida
de forma irregular.
No entran en el recuento los ncleos vacuolizados, ni ncleos que estn
contaminados por grmenes.

NOTA: En el recuento de los CORPSCULOS DE BARR no solo se deber tener en cuenta

el numero de corpsculos presentes si no tambin se deber poner especial inters en la
morfologa y el tamao del corpsculo. Las formas de corpsculo pueden ser redondeados,
triangulares, trapezoidales, barra, etc. Pero siempre pegados a la membrana nuclear. Se
pondr atencin tambin al tamao, si es demasiado pequeo o demasiado grande ya que
en estos casos se asocian con una delecin o isocromosoma del X, que deber ser
necesariamente confirmado con el estudio de cariotipo.

VALORES NORMALES
Mujeres: 20 40%
Varones: 0%

7. Cuestionario:
Existen Metodologas alternas para la observacin del CB, mencione las ventajas y cual es
el tipo de muestra a utilizar?
Cuales son los genes y las proteinas que participaran en la Inactivacin del Cromosoma
X?

CITOGENETICA CURSO PRCTICO

PRACTICA Nro 3

7
 CROMATINA SEXUAL

1. Introduccin:
En 1949 Barr y Bertram descubrieron una masa de cromatina sexual en clulas en
interfase femenina y no masculina que inicialmente las mal denominaron SATELITES DE
NUCLEOLO. A esta observacin le sigui el desarrollo de una tcnica sencilla que
permita detectar los Cuerpos de Barr en clulas de mucosa oral. Lo que llevo a la
conclusin que las mujeres son CB positivas y los varones CB negativos en condiciones
normales.

Actualmente se sabe que el corpsculo de Barr representa uno de los cromosomas X de

las clulas de las hembras, el X que contempla su replica, mas tarde que su homlogo y
queda condensado e inactivo genticamente a lo largo de las interfaces.

En 1959 Ohno, Kaplan y Kinosita demostraron que la cromatina X corresponde a la

condensacin de uno solo de los cromosomas X en la mujer. Cuando un cromosoma o
parte de este difiere de la mayora en un ciclo de condensacin, se dice que exhibe
heteropicnosis, por lo tanto, el cuerpo de Barr es el resultado de la heteropicnosis
positiva de un cromosoma X durante la interfase.

2. Competencias:
Los alumnos adquirirn conocimientos sobre el manejo de tcnicas citogenticas que
los pueden servir para integrarse en grupos de investigacin de Servicios de Gentica
de Hospitales, institutos de investigacin, salud pblica, etc.
Observar la evidencia citolgica del cromosoma X inactivo
Capacidad de resolucin de problemas y Trabajar en equipo.

3. Metodologa:
La metodologa a usar ser prctica donde los alumnos podrn identificar los Corpsculos
de Barr y adems debern resolver un cuestionario al trmino de la prctica.

4. Marco Terico:
La INACTIVACION EL CROMOSOMA X fue explicada en 1961 por Mary Lyon quien
detalla lo que se denomina en general "LA HIPTESIS DE LYON", basa su hiptesis en
parte sobre observaciones genticas de los genes ligados al cromosoma X que
determinan el color de la piel del ratn y en parte sobre datos citolgicos.

En las clulas somticas de las hembras de los mamferos, solo un cromosoma X es

activo. El segundo cromosoma X esta condensado e inactivo y aparece en las clulas en
la interfase como cromatina sexual.
La inactivacin se origina al comienzo de la vida embrionaria (14avo da).
El cromosoma X INACTIVO puede ser indistintamente un X paterno o materno (Xp y
Xm) en clulas diferentes del mismo individuo; pero una vez inactivado un cromosoma X
en una clula, este permanecer inactivo en todos los descendientes de dicha clula. En
otros trminos, la inactivacin es ALEATORIA, pero FIJA.
Como consecuencia de la inactivacin del cromosoma X, todas las mujeres tienen dos
poblaciones distintas de clulas: una poblacin posee un cromosoma X activo procedente
del padre y la otra posee un cromosoma X activo de la madre. Al tener dos poblaciones de
clulas, las mujeres son mosaicos para el cromosoma X.

8
Aunque la inactivacin es aleatoria entre las clulas que constituyen el embrin, en las
clulas que formaran el tejido extraembrionario slo se inactiva el cromosoma X procedente
del padre. Aunque la inactivacin del cromosoma X es permanente en todas las clulas
somticas de la mujer, el cromosoma X inactivo debe reactivarse en la lnea germinal de las
mujeres, de modo que cada vulo recibir una copia activa del cromosoma.

XIST codifica para un RNA de 17kb poliadenilado que no se traduce y es inestable (200 a
1000 / clula). Tambin se transcribe Tsix.
XIST es un gen localizado dentro de una regin denominada XIC (Xq13.2). Unos pocos
genes del cromosoma X inactivo, 15% permanecen activos, incluyendo el gen XIST.

9
4. Observacin al Microscopio:
Una vez seca la lmina se procede a observar en el microscopio primero con objetivo de
10X para seleccionar el campo a estudiar y luego se pasa a objetivo de 100X para
realizar el recuento de corpsculos de Barr siguiendo un criterio el conteo
preestablecido.

10
Podemos observar en el PMN, el de la derecha presenta el corpsculo CB en la forma de
Palillo de Tambor, mientras que el de la izquierda no.

5. Cuestionario:
a. Paciente con fenotipo femenino con corpsculo barr positivo 12%. Escriba usted el o
los probables cariotipos. As como su Dx. citogentico.
b. Paciente con fenotipo femenino con corpsculo barr nicos 25% y corpsculos barr
dobles 15%. Escriba usted el los probables cariotipos. As como su Dx. citogentico.
c. Paciente con fenotipo femenino con corpsculo barr positivo 10%, pero estos
corpsculos son pequeos. Escriba usted el o los cariotipos probables, as como su
diagnstico citogentico.
d. Paciente con fenotipo femenino con corpsculo de barr positivo 28%, pero estos
corpsculos son grandes. Escriba usted el o los cariotipos probables, as como su Dx.
citogentico.
e. Paciente con fenotipo femenino con corpsculo barr doble 25% y corpsculo barr
triple 22%. Escriba usted el o los cariotipos probables, as como su Dx citogentico.
f. Recin nacido con genitales ambiguos con corpsculo barr positivo 30%. Escriba
usted el o los probables cariotipos, as como sus Dx citogentico.
g. Recin nacido con genitales externos femeninos, con ecografa que evidencian
testculos, presenta corpsculo barr positivo 25%. Escriba usted el o los probables
cariotipos, as como los Dx. citogenticos.
h. Recin nacido con genitales externos masculinos, con ecografa que evidencian
ovarios, presenta corpsculo barr negativo. Escriba usted el o los probables cariotipos,
as como los Dx. citogenticos.
i. Paciente con fenotipo masculino presenta corpsculo barr nico positivo 26% pero
adems presenta doble corpsculo Y. Escriba usted el o los probables cariotipos, as
como los Dx citogenticos.

11
 CITOGENETICA CURSO PRCTICO
PRACTICA Nro 4
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

1. Introduccin:
Para el estudio Citogentico (Estudio Cromosmico) es necesario que las clulas estn en
divisin celular (Mitosis) ya que los cromosomas slo podrn ser analizados, de acuerdo a
su morfologa y patrn de bandas, cuando las clulas estn en el estadio de metafase.

Algunas clulas de nuestro organismo normalmente pueden estar en un proceso de

proliferacin y diferenciacin por lo que no es necesario estimularlos para que entren en
divisin celular; pero otras clulas como los linfocitos de sangre perifrica como son clulas
ya diferenciadas requieren de un estimulante mitgeno para que entren en mitosis.

2. Competencias:
Los alumnos adquirirn conocimientos sobre el manejo de tcnicas citogenticas que
los pueden servir para integrarse en grupos de investigacin de Servicios de
Gentica de Hospitales, institutos de investigacin, salud pblica, etc.
Capacidad de aplicar los conocimientos en la prctica.
Capacidad de resolucin de problemas.

3. Contenidos:
Normas de Bioseguridad.
Preparacin de Medios de Cultivo

4. Metodologa:
La metodologa a usar ser nicamente prctica, cada alumno procesara su propia
muestra y al final de la prctica observara sus propios cromosomas.

5. Definiciones:

5.1. MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo celular son compuestos que contienen: Aminocidos, vitaminas y
cofactores, enzimas y coenzimas, sales, iones, indicadores de pH. Todo lo necesario
para que la clula pueda dividirse in vitro.

Existen distintos medios de cultivo los cuales se seleccionaran dependiendo del tipo de
muestra o tipo de clula a cultivar y lograr que estos respondan adecuadamente con un
crecimiento celular, as tenemos:

a. MEDIO McCoy's 5 MODIFIED: Utilizado con ms frecuencia para

Sangre perifrica (Linfocitos).
Cultivo de Mdula sea
b. MEDIO Tc 199: Utilizado en condiciones especiales
Deficiencia de cido flico.
Para el estudio de Cromosoma X frgil.
Utilizado tambin para el cultivo de sangre perifrica (Linfocitos).

c. MEDIO Ham F10 o Ham F12: Utilizado con ms frecuencia para:

Cultivo de piel.
Cultivo inicial de lquido amnitico (clulas fetales)
Cultivo de tumores (clulas neoplsicas)
d. MEDIO RPMI 1640: Utilizado para:
Sangre perifrica (Linfocitos)
12
 Cultivo de tumores (clulas neoplsicas)
e. MEDIO DE CULTIVO CHANG B + CHANG C: Utilizado para:
Cultivo de vellosidades coriales.
Cultivo de liquido amnitico (clulas fetales)
Cultivo de tumores (clulas neoplsicas)
f. MEDIO AMNIOMAX: Utilizado para:
Cultivo de vellosidades coriales.
Cultivo de liquido amnitico (clulas fetales)

5.2. SUPLEMENTOS:
Adems del medio de cultivo base las clulas requieren para su crecimiento y divisin
celular de suplementos, los cuales sern utilizados dependiendo del tipo de clulas que
se desea cultivar. As tenemos:

a. SUERO BOVINO FETAL (SBF): Se utiliza a diferentes concentraciones:

Para el estudio de X frgil al 5%
Para Cultivo de Sangre Perifrica y cultivo de Medula sea al 20%.
Para Cultivo de Liquido Amnitico (clulas fetales) al 30%.
b. PENICILINA + ESTREPTOMICINA: utilizado como antibitico para impedir la
contaminacin bacteriana.
c. FUNGIZONA: Utilizado como antimictico en caso que fuera necesario.
d. L - GLUTAMINA: Utilizado para mejorar el crecimiento celular.
e. FITOHEMAGLUTININA (PHA): Utilizado solo en caso de cultivo de sangre
perifrica (linfocitos) como un estimulante mitognico.

5.3. PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

Este procedimiento se sigue cuando el Medio de Cultivo base (McCOY'S 5A Modified, RPMI
1640, F1O, F12, etc.) est en polvo.

a. Pesar la cantidad de gramos de medio a preparar. Ejemplo: Preparacin del

Medio McCOY's 5A Modified. Pesar 12gr Para un volumen de 1000ml.
b. Disolver lo pesado en el volumen respectivo de agua bidestilada y agitar en un
vortex por 10 minutos o agitar manualmente.
c. Se pesa Bicarbonato de Sodio CO3HNa. Cada medio de cultivo requiere una
cantidad adecuada de CO3HNa. Ver lista de preparacin de reactivos.
d. Se adiciona el CO3HNa al frasco y seguir con la agitacin.
e. Se adiciona el Suero Bovino Fetal al medio en la concentracin necesaria para
cada cultivo. Ej.: Para 1000ml McCOY's se le adiciona 250ml (SBF 20%).
f. Adicionar al medio 2cc de Penicilina + Estreptomicina por cada 100ml de medio a
preparar y continuar con la agitacin por 5 minutos.
g. Ajustar el pH del medio a 7.0 0.2 utilizando HCl 1N o OHNa 1N. Generalmente
se utilizan los medios a este pH, pero en algunos casos como cultivo de clulas
fetales (LA) se usa pH cido 6.0 0.2.
h. Para el caso de cultivo de Sangre (linfocitos) se adicionar la PHA tipo M en
proporcin de 2cc/100ml de medio preparado. Se recomienda adicionar la
PHA despus de esterilizado el medio y en el momento de su uso.
i. La esterilizacin del Medio de Cultivo: Se realiza solamente por filtracin al vaco
utilizando Filtros Millipore de 0.22m.
j. Control de Esterilidad: Una vez filtrado todo el medio se recomienda alicuotar en
frascos de 50ml o 100ml y se controla la esterilidad colocando los frascos en estufa a
37C por 24 a 48hrs. NOTA: Si el Medio cambia de color (amarillo) o se observa una
turbidez o flculos es mejor desechar los frascos porque probablemente estn
contaminados.
k. Finalmente, los medios de cultivo se guardan en congelacin a -4.0 o -20.0 hasta
su uso.

13
 Los medios de cultivo, reactivos y colorantes debern prepararse de acuerdo a
como est indicado para cada tipo de cultivo.
Se deber realizar la siembra con la mayor esterilidad posible.
No debern ser modificados los tiempos o rangos de centrifugacin ni las
temperaturas incubacin inadecuadamente.
Deber tenerse en cuenta que son muchas las causas que interfieren con el
normal desarrollo de la mitosis y que incluso producen alteraciones
cromosmicas. Estos agentes interferentes pueden ser de naturaleza fsica como
los rayos X, la Luz Ultravioleta, cambios bruscos de temperatura, campo
magntico u ondas sonoras.

6. CUESTIONARIO:

14
 CITOGENETICA CURSO PRCTICO
PRACTICA Nro 5 y 6
CULTIVO DE LINFOCITOS

1. Introduccin:
Para el estudio Citogentico es necesario que las clulas estn en divisin celular (Mitosis)
ya que los cromosomas slo podrn ser analizados, de acuerdo a su morfologa y patrn de
bandas, cuando las clulas estn en el estadio de metafase.

Por ello aprenderemos la metodologa para la obtencin de metafases a partir de un Cultivo

de Sangre Perifrica (Linfocitos), para luego hacer la observacin directa de los
cromosomas

2. Competencias:
Los alumnos adquirirn conocimientos sobre el manejo de tcnicas citogenticas que
los pueden servir para integrarse en grupos de investigacin de Servicios de
Gentica de Hospitales, institutos de investigacin, salud pblica, etc.
Capacidad de identificacin y diferenciacin cromosmica.
Capacidad de aplicacin e implementacin en un Laboratorio

3. Contenidos:
Toma de muestra y Normas de Bioseguridad.
Medios de Cultivo
Ciclo Celular.

4. Metodologa:
La metodologa a usar ser nicamente prctica, cada alumno procesara su propia
muestra y al final de la prctica observara sus propios cromosomas.

5. Procedimiento:

5.1 TOMA DE LA MUESTRA:

Se obtiene 5ml de sangre venosa teniendo en cuenta todas las medidas de
bioseguridad, con una jeringa previamente cargada con 0.1 ml de heparina sdica

Tomada la muestra se deja la jeringa en posicin vertical con la aguja hacia abajo el
tiempo necesario para que sedimente el paquete globular

5.2 SIEMBRA DE LA MUESTRA:

Se elimina el paquete globular de la jeringa, dejndose la interfase entre el paquete
globular y el plasma, donde se encuentra la mayor cantidad de glbulos blancos que
se utilizaran para la siembra.

Se adiciona al frasco de cultivo 1 a 1.5ml de la muestra (plasma + elementos

celulares). Mezclar suavemente y cerrar hermticamente el frasco de cultivo. Se deja
en incubacin en una estufa a 37oC por 72 horas. Todo el procedimiento de la
siembra se debe realizar en absoluta esterilidad, diariamente se debe de mezclar el
frasco de cultivo y observar si hay cambios de color del medio o turbidez que nos
indicara una probable contaminacin.

15
5.3 COSECHA DE LA MUESTRA :

Cumplida las 72 horas se saca el frasco de cultivo de la estufa y se agregar 100 l de

Colchicina al 0.1gr/ml. Mezclar suavemente e incubar en estufa a 37C por 50
minutos.

Centrifugar a 1000rpm por 10min. Luego utilizando una pipeta Pasteur, decantar
o eliminar el sobrenadante y homogenizar el sedimento o Pellet..

Luego agregar 6ml de Cloruro de Potasio 0.075M (solucin Hipotnica) y agitar bien
el Pellet usando la pipeta Pasteur por 2 3 minutos. Se colocar el tubo en la estufa
a 37oC durante 10 minutos.

NOTA: El tiempo de exposicin en la solucin Hipotnica no deber exceder en

ningn caso ms de 15minutos.

Sacar el tubo de la estufa y agregar de 5 a 8 gotas de fijador Carnoy (recin

preparado), para detener la accin de la solucin Hipotnica. Mezclar suavemente
usando una pipeta Pasteur.

Luego se centrifuga a 1000rpm por 10min. Utilizando una pipeta Pasteur eliminar
el sobrenadante y resuspender el Pellet. Agregar 5ml de fijador Carnoy, el 1er ml
agregarlo gota a gota, el resto puede hacerse ms rpido.

Utilizando una pipeta Pasteur agite y deje fijndolo por 30 minutos a To ambiente.

NOTA: En este paso puede dejarse fijando el cultivo por 24h (o ms tiempo si fuera
necesario) a To de refrigeracin. Luego se centrifuga a 1000rpm por 10min y se
procede con los siguientes pasos.

Eliminar el sobrenadante y resuspender el Pellet usando una pipeta Pasteur. Se

adicionar 5ml de fijador y nuevamente centrifugar a 1000 RPM. Se repite este paso
3 veces a manera de lavados con fijador.

El Pellet obtenido finalmente se debe resuspender con 1 a 2 ml. de fijador (esta

cantidad puede variar dependiendo de la cantidad de Pellet) hasta obtener una
suspensin opalescente.

5.4 PREPARACION DE LAMINAS :

Las lminas portaobjetos son limpiadas previamente con una mezcla de alcohol y
acetona, se almacenaran en la nevera hasta el momento de su empleo.

La preparacin de las lminas se obtiene aadiendo 3 4 gotas de la suspensin

final sobre las laminas portaobjetos a una distancia de 20 a 30cm de altura y soplar
para obtener un extendido homogneo. Secar la lmina usando un mechero de
alcohol.

5.5. COLORACIN Y OBSERVACIN DE LAMINAS:

Se prepara la solucin colorante de Giemsa al 4% en un Koplyns.

16
 Se introducen las lminas y dejarlo por espacio de 6 minutos.
Enjuagar con agua destilada y secarlo usando papel filtro.
La metafase seleccionada deber ser una metafase aislada y que presente los
cromosomas separados, no sobrepuestos, para lograr una fcil visualizacin

6. CUESTIONARIO:
6.1 Que suceder si nuestra muestra es incubada por mas de 15 minutos con la
Solucin Hipotnica?
6.2 Que suceder si nuestra muestra es incubada por mas o menos tiempos con la
colchicina?

17
 CITOGENETICA CURSO PRCTICO
PRACTICA Nro 7
COLORACION CONVENCIONAL

1. Introduccin:
Las primeras observaciones de cromosomas humanos se remontan a 1956, en que Tjio y
Levin por primera vez determinaron que el nmero de cromosomas humanos era de 46 y no
48. Poco tiempo despus Lejeune describi la primera anomala citogentica: trisoma 21.
Para ponerse de acuerdo respecto a cmo nombrar cada cromosoma, etc, se realizaron
sucesivas Conferencias en los aos 1960 (Denver), 66 (Chicago), 71 (Pars) y 75 y 78 y
posteriormente varios Complementos de la de Pars, conforme aparecen nuevas tcnicas,
que han dejado determinado un sistema universal de nomenclatura de los cromosomas y
sus regiones.

La clasificacin de los cromosomas por grupos no permite identificar cada cromosoma

individualmente; por eso, en la literatura de hace algunos aos se encuentran referencias a
trisomas o monosomas etc. del grupo tal. A partir de la dcada del 70 se desarrollaron
tcnicas que coloreaban a los cromosomas de una manera especial, en bandas.

2. Competencias:
Los alumnos adquirirn conocimientos sobre el manejo de tcnicas citogenticas que
los pueden servir para integrarse en grupos de investigacin de Servicios de
Gentica de Hospitales, institutos de investigacin, salud pblica, etc.
Capacidad para identificar cromosomas

3. Contenidos:
Ciclo celular
Medios de Cultivo

4. Metodologa:
La metodologa a usar ser nicamente prctica, cada alumno procesara su propia
muestra y al final de la prctica observara sus propios cromosomas.

5. Procedimiento:
Una vez preparadas las lminas se proceder a colorear, para la observacin de
cromosomas de modo convencional.

5.1. Colocar en un Koplins Colorante Giemsa al 4% por 10 minutos

5.2. Enguadar con Agua Destilada y dejar secar
5.3. Observa al microscopio primero a 10X, 40Xy finalmente a 100X

6. Cuestionario:

6.1 Revisin de Sistema Internacional de Nomenclatura de Cromosomas

18
 CITOGENETICA CURSO PRCTICO
PRACTICA Nro 8 y 9
TCNICA DE BANDAS

1. Introduccin:
Hasta antes del ao de 1970 no era posible estudiar los cromosomas bandeados sino solo
de manera convencional. Pero en la actualidad se conocen varias tcnicas de bandeo
cromosmico que permiten identificar individualmente los cromosomas, lo cual facilita
la identificacin de una alteracin cromosmica numrica y especialmente demostrar la
presencia de alteraciones cromosmicas estructurales.

2. Competencias:
Los alumnos adquirirn conocimientos sobre el manejo de tcnicas citogenticas que
les sirve para la identificacin de cromosomas.
Capacidad de identificacin y diferenciacin cromosomica.
Capacidad de aplicacin e implementacin en el laboratorio.
Capacidad de trabajar en equipo.

3. Contenidos:
Ciclo Celular.
Sistema Internacional de nomenclatura cromosomica.

4. Metodologa:
La metodologa a usar ser nicamente prctica, cada alumno procesara su propia
muestra y al final de la prctica observara sus propios cromosomas.

5. Procedimiento:

5.1 TECNICA DE BANDAS Q:

Primera metodologa utilizada, desarrollada por Casperson, en 1970 quien utilizo

mostaza de quinacrina para luego observar la distinta emisin de fluorescencia cuando
eran observados en el microscopio de fluorescencia (utilizando luz ultravioleta). Este
mtodo fue posteriormente denominado como las tcnicas de bandas Q (Paris,
Conferencia de 1971).

Esta metodologa tiene como principal desventaja que la fluorescencia desaparece

progresivamente por lo que la observacin y anlisis cromosmico as como la toma de
microfotografa debe ser lo ms rpido posible.

Las bandas obtenidas con esta tcnica son caractersticas para cada cromosoma; pero
tienen mayor utilidad para demostrar la porcin distal del brazo largo del cromosoma
Y, que se tie ms intensamente que los dems cromosomas. Las regiones
pericentromericas de los cromosomas 3 y 4, y las regiones satlites y
pericentromericas de los cromosomas acrocntricos muestran variaciones significativas
conocidos como Polimorfismos o Heteromorfismos, que pueden ser demostrados
con esta tcnica.

Soluciones :
1. Buffer Sorensens a pH 5.6
2. Colorante Dihidrocloruro de Quinacrina al 1%
19
Procedimientos:
1. Se tien las lminas con el Colorante de Quinacrina por 15 - 20 minutos en
oscuridad.
2. Se lavan las lminas con el Buffer Sorensen's.
3. Se monta con una laminilla cubreobjetos con el Buffer.
Examinar al microscopio de fluorescencia utilizando una luz de longitud de onda de 450
550nm

5.2 TECNICA DE BANDAS G:

Es la ms utilizada en el Laboratorios de Citogentica para el anlisis rutinario de los

cromosomas, esta tcnica es descrita o conocida como GTG (Bandas G por tripsina
usando Giemsa).

Un rol directo de la tincin con Giemsa es producir bandas G (Mc Kay, 1973; Shuh et al,
1975). Clark y sus colegas (Clark y Felsenfeld, 1975) sugirieron que las Histonas ricas
en argininas estn involucradas en las bandas GTG y no tanto la prdida de DNA y las
protenas de los cromosomas, durante el tratamiento con la tripsina. Esta hiptesis que
diferencia entre bandas G positivas (oscuras) y bandas G negativas (claras) puede ser
debido a la distribucin de las protenas cromosmicas y el DNA. Tambin se ha
sugerido que las bandas G positivas son relativamente ricas en protenas disulfuro,
mientras que las bandas G negativas contienen sulfhidrilos.

Soluciones :
1. Solucin Tripsina 1%
2. Solucin Salina Fisiolgica
3. Colorante Giemsa 4%

Procedimientos:
1. Se coloca en Bao Mara a 37 o C el frasco Nro 1 de Solucin de tripsina 1% (5ml de Tripsina
+ 22.5 Buffer Fosfato + 22.5m de SSF)
2. Se colocan las lminas con la preparacin cromosmica (menos de 1 semana)
en el frasco Nro 1 por 10 segundos.
3. Se enjuaga las lminas en el frasco Nro 2 de Solucin salina fisiolgica.
4. Se colocan las lminas en el frasco Nro 3 de Colorante Giemsa 4% por 10
minutos.
5. Lavar con agua corriente y Examinar al microscopio

20
5.3 TECNICA DE BANDAS R:

El principio bsico de esta tcnica es el tratamiento de las lminas a altas temperaturas en varios
buffer, seguido por la tincin con Acridina Orange (RFA) o en Giemsa (RHG, bandas R, por calor
usando Giemsa). Las bandas que produce est tcnica en los cromosomas humanos son el
reverso de las bandas G o bandas Q, es decir que las bandas claras en Q o G son bandas
oscuras en R y viceversa. (Dutrillanx and Lejeune 1971; Sehested, 1974; Bobrow and Madan,
1973).

Una de las ms importantes ventajas de la Tcnica de bandas R, es que las regiones telomricas
de los cromosomas son teidas, a diferencia de las Tcnicas bandas Q y G en las que no son tan
claras. El mecanismo de las bandas reversas no esta totalmente conocido. (Coming's 1978).

El tratamiento con calor induce denaturacin de las protenas cromosmicas as como de las
secuencias del DNA ricas en nucletidos A-T, mientras que el DNA rico en G-C de las bandas R
en una configuracin nativa (SUMMER 1982). Coming s (1978) detalla que a temperaturas altas
el DNA rico en A-T de las bandas G es denaturada y parcialmente extrada mientras que el DNA
nativo de las bandas R no lo es.

5.4 TECNICA DE BANDAS C:

La tcnica de bandas C produce una tincin selectiva de la Heterocromatina

constitutiva. Estas bandas estn localizadas en la regin pericentromerica de los
cromosomas humanos.

El mtodo original descrito por Arrighi y Hsu (1971) involucra primero un tratamiento
con lcali, (OH)Na, para denaturar el DNA Cromosmico y subsiguiente incubacin en
una Solucin Salina. Posteriormente se describe un mtodo por SUMMER (1972) en la
que el lcali usado es el (OH) 2Ba. Ambos mtodos producen un patrn caracterstico
similar de bandas C.

El tratamiento de denaturacin con el lcali (OH)2 Ba es crtico y debe ser ptimo para
obtener mejor calidad bandas C. La duracin del tratamiento depende de la edad (vejez)
de la preparacin cromosmica y del tejido de origen. Un tratamiento inadecuado con
lcali produce una pobre diferenciacin de bandas C, mientras que un tratamiento
excesivo resulta en la prdida de la morfologa cromosmica.

Las bandas C requieren de dos pasos sucesivos para la prdida del DNA cromosmico,
primero una depurinacin y denaturacin sucesiva durante el tratamiento con un cido
(HCl) y un lcali (Ba(OH) 2). La denaturacin del DNA es seguida de una remocin de
los pequeos fragmentos y eliminacin de ellos durante la incubacin en la solucin
2xSSC.

La principal aplicacin de la tcnica de bandas C es para demostrar la variacin de tamao de

la regin de Heterocromatina Constitutiva presente en las regiones pericentromrica de los
cromosomas, en especial de los cromosomas 1, 9, 16 y los brazos largos del cromosoma
Y. Estas variaciones constituyen los llamados Polimorfismos. Adems esta tcnica es til
para demostrar la presencia de una inversin pericentromerica.

21
Bandas C

Cuestionario:

22
 CITOGENETICA CURSO PRCTICO
PRACTICA Nro 10
SISTEMA DE NOMENCLATURA CROMOSOMICA

1. Introduccin:
Cada cromtide de un cromosoma est formada por una molcula de ADN en un soporte de
protenas. La cromtide est constituida por cromatina; que es el conjunto del ADN con las
protenas de soporte, formadas fundamentalmente por histonas y otras.

Los cromosomas cambian ligeramente de forma segn la etapa de la

divisin celular; son ms alargados en profase y alcanzan el mximo de
condensacin en la metafase; por lo cual es el momento ideal para
observarlos.

En esa etapa podemos observar que cada cromosoma tiene una zona que es como una
constriccin, y se llama el centrmero (constriccin primaria). El centrmero determina en el
cromosoma los brazos cortos (p) y los brazos largos (q).

2. Competencias:
Los alumnos adquirirn conocimientos sobre el manejo de tcnicas citogenticas que
les sirve para la identificacin de cromosomas.
Capacidad de identificacin y diferenciacin cromosomica.
Capacidad de aplicacin e implementacin en el laboratorio.
Capacidad de trabajar en equipo.

3. Contenidos:
Ciclo Celular.
Sistema Internacional de nomenclatura cromosomica.

4. Metodologa:
La metodologa a usar ser nicamente prctica, cada alumno procesara su propia
muestra y trabajara con fotografas al final de la prctica identificara cada uno de los
cromosomas.

5. Definiciones:

Segn la posicin del centrmero, los cromosomas se clasifican en:

Metacntricos: el centrmero se localiza a mitad del cromosoma y los dos brazos

presentan igual longitud.
Submetacntricos: la longitud de un brazo del cromosoma es algo mayor que la del
otro.
Acrocntrico: un brazo es muy corto (p) y el otro largo (q).
Telocntrico: slo se aprecia un brazo del cromosoma al estar el centrmero en el
extremo (este tipo de cromosomas no se encuentran en el cariotipo humano).

Los pares cromosmicos se ordenan de forma decreciente de tamao, y luego se clasifican

en grupos, de acuerdo al tamao y a la ubicacin del centrmero. Estos grupos se nombran
con las letras: A, B, C, D, E, F, G. La representacin ordenada de los cromosomas
constituye el cariotipo.

23
Grupo A: Metacntricos grandes. Cromosomas 1, 2, 3, excepto el 2, el cual es un
cromosoma submetacntrico grande.

Grupo B: Submetacntricos grandes. Cromosomas 4 y 5.

Grupo C: Submetacntricos medianos. Los cromosomas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y el

cromosoma X

Grupo D: Acrocntricos medianos. Cromosomas 13,14 y 15, presentan satlites en sus

brazos cortos.

Grupo E: Submetacntricos pequeos. Los cromosomas 16, 17, 18,

Grupo F: Metacntricos pequeos. Los cromosomas 19 y 20.

Grupo G: Acrocntricos pequeos. Los cromosomas 21 y 22 y el cromosoma Y

5.1 ANOMALAS ESTRUCTURALES DE LOS CROMOSOMAS

24
Deleccin: Cuando se pierde un fragmento de cromosomas. Puede ser
Terminal o intersticial.

Translocacin: Cuando hay cambio de posicin de un fragmento, el cual

va a parar a otro cromosoma, generalmente implica una ruptura en cada
cromosoma.

Recproca: Cuando hay intercambio de fragmentos entre dos cromosomas;

Robertsoniana: Unin entre los brazos largos de dos cromosomas
acrocntricos. Se dice que una translocacin es balanceada o equilibrada
cuando no hay prdida ni ganancia de material gentico en la misma (las
Robertsonianas se consideran balanceadas).

Inversin: Implica dos rupturas dentro del cromosoma. Puede ser

pericntrica o paracntrica, segn el segmento involucrado comprenda o
no al centrmero.
25
Es anomala balanceada, pero, mediante el fenmeno de
entrecruzamiento desigual, puede originar gametos con cromosomas
que contengan regiones duplicadas o faltantes.

Duplicacin: Es un fenmeno ms difcil de explicar; cuando no ha sido

consecuencia de una inversin en cromosomas paternos, probablemente
se debe a translocacin entre dos cromosomas homlogos, durante la
meiosis que origin uno de los gamentos paternos o maternos.
La duplicacin puede ser en serie o en espejo.

Cromosoma en anillo: Se origina por ruptura

en ambos extremos del mismo cromosoma.

26
5.2 NOMENCLATURA EN ANOMALIAS ESTRUCTURALES DE LOS
CROMOSOMAS

De acuerdo a la Conferencia de Pars (1971) y posteriores (hasta ISCN

1995) hay dos sistemas de nomenclatura: El breve y el detallado.
El breve solamente indica cules son los cromosomas involucrados y los
puntos de ruptura de un rearreglo.
El detallado describe cada uno de los cromosomas resultantes.

SIMBOLOS:

p brazo corto q brazo largo

de...... hasta : ruptura
:: Ruptura y unin cen centrmero
chi quimera mos mosaico
del delecin der
cromos. derivado
dic dicntrico fra lugar frgil
dup duplicacin dir directo
i isocromosoma mar cromosoma marcador
inv inversin ins insercin
mat de origen materno pat de origen paterno
r anillo t translocacin
rob translocacin robertsoniana ter telmero
add material adicional de origen desconocido

Delecin terminal
46,XX,del(8)(p12)
46,XX,del(8)(qterp12):

Delecin intersticial
46,XX,del(8)(q21q23)
46,XX,del(8)(pter21::q23qter)

Isocromosoma del brazo largo

46,X,i(X)(q10)

Isocromosoma del brazo corto

46,XY,i(5)(p10)

Inversin pericntrica
46,XY,inv(4)(p15q13)
46,XY,inv(4)(pterp15::q13p15::q13qter)

27
Inversin paracntrica
46,XY,inv(13)(q13q32)
46,XY,inv(13)(pterq13::q32q13::q32qter)

Cromosoma en anillo
46,XX,r(18)(p11q22)
46,XX,r(18)(p11q22)

Translocacin recproca
46,XY,t(2;8)(p13;q12)
46,XY,t(2;8)(2pter2p13::8q128pter;2qter2p13::8q128qter)

Trisoma y monosoma parciales por herencia de cromosomas derivados

46,XY, der(8)t(2;8)(p13;q12)pat
46,XY, der(8pter8q12::2p132pter)pat

Translocacin robertsoniana balanceada

45,XX,der(14;21) (q10;q10)
45,XX,der(14;21)(14qtercen21qter)

Translocacin robertsoniana desbalanceada

46,XX,+13,der(13;14)(q10;q10)
46,XX,+13,der(13;14)(13qter13q10::14q1014qter)

28