APLIKASI TEKNOLOGI BIOLOGI MOLEKULER DALAM

BIDANG KEDOKTERAN

1. Terapi gen dalam pengobatan penyakit genetik.

Terapi gen adalah penyiapan gen ke dalam sel individu dan jaringan
untuk mengobati penyakit, seperti penyakit keturunan dimana suatu
alel mutan merusak diganti fungsional. Terapi gen dapat diartikan
pula sebagai teknik untuk mengoreksi gen gen yang cacat yang
bertanggung jawab terhadap suatu penyakit. Terdapat beberapa
pendekatan dalam terapi gen, meliputi :
Menambahkan gen6gen normal ke dalam sel yang mengalami
ketidaknormalan
Melenyapkan gen abnormal dengan gen normal melalui
rekombinasi homolog
Preparasi gen abnormal dengan cara mutasi balik selektif
Mengendalikan regulasi ekspresi gen abnormal.
Terapi gen dikelompokan sebagai berikut :
1) Terapi gen germ-line
Tterapi ini dimaksudkan untuk memasukkan gen ke dalam sel germ
atau sel embrioomnipoten. Dalam hal ini, sel sel kuman yaitu
sperma dan sel telur dimodifikasi oleh pengenalan gen fungsional
yang biasanya diintegrasikan ke dalam genom mereka. Oleh karena
itu, perubahan akibat terapi akan diwariskan ke generasi berikutnya.
Namun atas dasar teknis dan etika, penerapan terapi dengan
metode ini masih belum dapat diaplikasikan pada manusia.
2) Terapi gen somatik
Dilakukan dengan memasukkan suatu gen kedalam sel somatik.
Gen terapeutik dipindahkan ke dalam sel somatik pasien. Setiap
modifkasi dan efek dibatasi hanya pada pasien yang bersangkutan,
dan tidak diturunkan pada generasi berikutnya.
3) Terapi gen ex vivo
Sel dari sejumlah organ atau jaringan (seperti kulit, sistem
hemopoiteik, hati) atau jaringan tumor dapat diambil dari pasien
dan dibiakkan dalam laboratorium. Selamapembiakan, sel tersebut
dimasuki suatu gen tertentu untuk terapi penyakit, diikuti dengan
reinfusi atau reimplementasi dari sel tertransduksi ke pasien
tersebut. Terapi gen ex vivo banyak digunakan pada uji klinis
 dengan menggunakan vektor retrovirus untukmemasukkan suatu
gen ke dalam sel penerima. Contohnya adalah terapi gen p53 untuk
kondisi karsinoma squamus kepala dan leher, sedangkan sel
targetnya adalah sel tumor.
4) Terapi gen in vivo
Organ seperti paru paru, otak, jantung tidak cocok untuk terapi gen
ex vivo, sebabpembiakan sel target dan retransplantasi tidak
mungkin dilakukan. Oleh karena itu, terapi gen somatik dilakukan
dengan pemindahan gen in vivo. Sistem penghantar gen in vivo
yang ideal adalah efisiensi tinggi masuknya gen terapeutik dalam
sel target. Gen tersebut dapat masuk kedalam inti sel dengan
sedikit mungkin terdegradasi, dan tetap terekskresi walaupun ada
perubahan kondisi.

2. Terapi siRNA pada penderita HIV & AIDS

Salah satu strategi dalam menyembuhkan penderita HIV &AIDS

dengan terapi antisense adalah dengan menggunakan short
interfering RNA (siRNA). Prinsip dari terapi ini adalah menggunakan
small RNA yang dapat menghambat ekspresi beberapa gen spesifik
virus' HIV & AIDS, sehingga dapat menghentikan sintesis protein
yang digunakan virus untuk bertahan hidup, diantaranya adalah
protein yang terlibat dalam replikasi. Selain itu, terapi dengan siRNA
juga dapat menghambat ekspresi gen spesifik pada sintesis protein
yang mendukung infeksi virus HIV & AIDS ke dalam sel host.

siRNA adalah RNA double stranded yang terdiri dari 21-23

pasangan basa yang mampu membentuk komplement dengan
target sekuen spesifik mRNA. SiRNA berasosiasi dengan molekul
helikase dan nuclease membentuk kompleks dengan RISC (RNA
inducing silencing compleks) yang akan melepaskan komplemen
siRNA membentuk ss-siRNA dan kemudian kompleks ini akan dapat
berkomplement dengan mRNA target, sehingga akan memotong
mRNA target. Selanjutnya potongan-potongan mRNA akan
didegradasi oleh enzim RNAse.
Penghancuran mRNA virus HIV & AIDS yang dimediasi oleh siRNA
selanjutnya akan menghentikan sintesis protein yang essensial bagi
virus untuk melakukan replikasi di dalam sel host dan atau tidak
dapat keluar dari sel host, sehingga akan membatasi infeksi pada
sel-sel sehat lainnya. Terapi pasien yang terinfeksi virus HIV & AIDS
saat ini didasari pada ekskresi beberapa protein penting dalam virus
HIV & AIDS yang mendukung infeksi virus ke dalam sel host,
replikasi dan pembentukan lapisan kapsid, serta protein protein
yang terlibat pada tahap akhir replikasi dan protein yang dibutuhkan
untuk proses lisis (keluar dari sel).

Beberapa protein yang mendukung proses infeksi ke dalam host

(disebut juga sebagai protein kofaktor selular) diantaranya adalah
NF-B, CD4 reseptor HIV, co-reseptor CXCR4 dan CCR5 Berbagai
protein ini bisa dijadikan sebagai target dalam terapi HIV & AIDS
dengan menggunakan siRNA. Beberapa hasil penelitian dapat
disimpulkan bahwa semua ekskresi gen dalam sintesis protein NF-B,
CD4 reseptor HIV, co-reseptor CXCR4 dan CCR5 telah berhasil
dihambat oleh siRNA dan mengakibatkan penghambatan dalam
replikasi virus HIV dalam beberapa cell line manusia, sel limposit )
dan hematopoetics stem cells yang berasal dari magropagh. Selain
itu, siRNA juga telah terbukti menghambat ekspresi gen pada
sintesis protein CD4 protein gag dan nef (protein yang terlibat
dalam regulasi mRNA virus di dalam sel host). CD4-siRNA mampu
mengurangi ekspresi gen protein CD4 pada sel Magi CCR5 yang
terinfeksi virus HIV-1 sebesar 75%.

Poliprotein gag (diekskresikan oleh gag gen virus HIV & AIDS) akan
dipecah secara proteolitik menjadi polipeptida p24, p17 dan p15
dan akan membentuk struktur inti kapsul virus. Polipeptida p24
berfungsi sebagai pelapis atau kemasan materi genetik virus. P24-
siRNA telah terbukti mengakibatkan degradasi pada region gag
mRNA virus,mengakibatkan penghambatan akumulasi genomik
virus dan p24.
 Akibatnya adalah terjadinya penghambatan replikasi virus HIV-1
dalam sel host. Dua hari setelah pemberian p24-siRNA terjadi
penurunan protein virus HIV-1 sebesar empat kali lipat dibanding
kontrol. Protein nef adalah salah satu protein regulasi (non-
struktural protein) yang diekskresikan oleh virus HIV-1 sebelum
terintegrasi dengan genom host. Penghambatan ekspresi gen p24
dan nef akan menghambat perbanyakan virus pada tahap awal
selama infeksi berlangsung.

3. Elektroforesis Gel Asam nukleat

Elektroforesis yaitu proses bergeraknya molekul bermuatan pada
suatu medan listrik. Dalam aplikasinya dalam bioteknologi
molekuler yaitu untuk memisahkan makromolekul asam nukleat
atau protein berdasarkan ukuran, muatan listrik & sifat-sifat fisis
lainnya, molekul DNA linear, pemisahan yg dilakukan terutama
tergantung pd ukurannya, Memisahkan campuran molekul DNA
menjadi pita-pita yg masing masing terdiri molekul DNA gengan
panjang yg sama.
Sistem ini bekerja dengan prisip bila berada dalam suatu medan
listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke
elektroda negatif dan sebaliknya. Elektroforesis untuk makromolekul
memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi
karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel
poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang
banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Salah
satunya yaitu menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida
(PAGE = poly-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel
protein.

4. PCR (Poly-Chain Reaction)

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk amplifikasi
(perbanyakan) primer oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan
DNA spesifik. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106-
kali lipat dari jumlah nanogram DNA template dalam latar belakang besar
pada sequence yang tidak relevan (misalnya dari total DNA genomik). PCR
memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer.
 Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai
cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi)
untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase,
deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida.
Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan
untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen
DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus
hidroksil bebas pada karbon 3. Setelah kedua primer menempel pada
DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua
primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan
nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan
fosfodiester antara OH pada karbon 3 dengan gugus 5 fosfat dNTP yang
ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh
enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 53 dan disebut
reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan
dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA
templat.
Berikut tahapannya :

a. Denaturasi
Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94 oC yang
menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai
DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai
DNA baru yang akan dibuat.
b. Penempelan (Annealing)
Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA
baru jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai
panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai
DNA target yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer.
Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target,
diperlukan suhu yang rendah sekitar 550C selama 30-60 detik.
c. Pemanjangan (Ektension)
 Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA
polymerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru
dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida.
Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai DNA
yang baru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi,
penempelan dan pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang
baru. Pengulangan proses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA
cetakan baru secara eksponensial.