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Giddings previo que el desempeo de la cromatografa de lquidos sera mejor si se pudieran usar
partculas pequeas, bajo mayor presin de flujo. Un par de aos despus Csaba Horvart y su
colega S. R. Lipsky de la universidad de Yale construyeron el primer equipo de HPLC, y lo llamaron
Cromatografa de lquidos de alta presin.
Hasta los primeros aos de 1970, con el desarrollo de la tecnologa para producir pequeas
partculas de slice silanizadas, que fue posible usar las columnas de volumen pequeo y mayor
longitud que permitieron un funcionamiento con alta resolucin. Hoy en da, a este mtodo se le
llama cromatografa de lquidos de alta eficiencia.
Qumica Analtica Sexta edicin, Gary d. Christian Pg. 604,605 Cromatografa de lquidos de
alta eficiencia.
Principios.
El primero es que el material de empaque debe estar finamente dividido y tener una alta
regularidad esfrica para permitir una ptima homogeneidad y densidad de empaque; en segundo
lugar, la fase estacionaria debe estar en forma de una pelcula delgada y uniforme, sin lugares para
el estancamiento. La primera condicin permite tener menor valor de A en la ecuacin de Van
Deemter (menor difusin por arremolinamiento) y la segunda da como resultado un valor pequeo
de C (transporte de masa ms rpido entre las fases, necesario para tener gran rapidez de flujo).
Debido a que la difusin molecular en lquidos es pequea, el trmino B de la ecuacin 19.8 es
pequeo. Por tanto, el aumento perjudicial en H a tasa baja lenta no sucede.
Fases estacionarias:
Fases estacionarias: Las micro partculas en la HPLC original eran de gel de slice o de almina,
irregulares, porosas, de 10 nm o menos. Desde entonces se han desarrollado partculas esfricas
que se pueden empacar en forma ms homognea y permiten alcanzar mayor eficiencia. Las
partculas son de slice de alta pureza, con bajo contenido de trazas de metales, y su dimetro
tpico es de 5 a 10 nm; sin embargo, las partculas de 3 nm se estn usando cada vez ms en la
cromatografa de alta velocidad. Los tamaos de poro estn en el intervalo de 60 a 100 , aunque
se usan tamaos de poro de 300 o ms con biomolculas ms grandes, que les permiten
penetrar los poros.
Qumica Analtica Sexta edicin, Gary d. Christian Pg. 606 fases estacionarias.
Las partculas pequeas aseguran mayor eficacia pero requieren
mayor presin.
La eficacia de una columna empaquetada aumenta al disminuir el tamao de
las partculas de la fase estacionaria. El tamao tpico de las partculas en HPLC
es de 3-10 nm, la siguiente figura ilustra el aumento de la resolucin que se
consigue al disminuir el tamao de partcula al pasar de 10 a 5 nm. Se puede
ver como los picos s hacen ms estrechos y como se resuelve un pico nuevo
del ultimo pico del cromatograma.
Cuantas ms pequeas son las partculas, mayor es el nmero de platos. Una razn por la cual
las partculas Cromatogramas de una sola muestra, obtenidos con una columna empaquetada con partculas
pequeas de slice de a) 10nm y b) 5 nm de diametro
originan mejor es que permiten un flujo ms uniforme a travs de la columna, reduciendo as el
trmino de camino mltiple A de la ecuacin de van Deemter.
Otra razn es que el camino que debe recorrer el soluto en su difusin en la fase mvil que hay
entre las partculas es del orden del tamao de las partculas, cuanto ms pequeas son las
partculas menor es la distancia en la que deben difundirse el soluto en la fase mvil. La desventaja
que tienen las partculas pequeas es la resistencia que ofrecen al flujo de disolvente.
Anlisis Qumico Cuantitativo, 3 edicin, Daniel C. Harris. Pg. 609 Cromatografa de lquidos.
Las partculas de slice tienen grupos silanol, SiOH, superficiales. stos se usan
para unir qumicamente fases estacionarias mediante reacciones de
silanizacin con clorosilanos:
Ms o menos la mitad de los grupos silanol se unen qumicamente, y el resto se
recubre con grupos trimetilsililo para hacerlos inertes. Tambin Zorbax
prepara partculas en las que los enlaces siloxano estn protegidos por
impedimento estrico de parte de los voluminosos grupos ter-butilo.
Grupo ter-
butilo
Que son ms grandes que los dos grupos metilo en el agente derivatizante de
organoclorosilano. Las fases no polares enlazadas ms comunes (para
cromatografa de fase inversa) son las que poseen C18 y C8 (se mostraron
antes); el ms popular es C18 (llamado ODS, de octadecilsilano); el C8 tiene
hidrofobicidad intermedia y el C18 es no polar. Tambin son tiles los grupos
fenilo. Las partculas con C5 se usan para HPLCmasas debido a sus bajas
propiedades de sangrado.
Qumica Analtica Sexta edicin, Gary d. Christian Pg. 607 fases estacionarias.
Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamao de partcula entre
2 y 10 nm que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografa de liquidos, se requieren
presiones de algunos cientos de kg- fuerza por centmetros cuadrado. Como consecuencia de
estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser ms sofisticados y caro
que el que se utiliza en otros tipos de cromatografa. En la siguiente figura se muestra un esquema
de los componentes fundamentales de un Cromatgrafo de liquidos de alta eficiencia tpico.
El medio ms simple y antiguo para la introduccin de las muestras implicaba la inyeccin con una
jeringa a travs de un elastmero que se cierra hermticamente. Con esta finalidad se utilizaban
microjeringas capaces de resistir presiones de hasta 1500 psi. En las inyecciones a flujo
determinado, el flujo de disolvente se detiene momentneamente, se retira el conector de la
cabeza de la columna y la muestra se inyecta directamente en el relleno de la cabeza de la
columna despus se retira el accesorio y el sistema se vuelve a presurizar.
Principios de anlisis instrumental Quinta edicin, Skoog. Holler. Nieman. Pg. 791 Sistemas de
inyeccin de muestra.
La columna:
Los tramos rectos de tubo de acero inoxidable permiten la construccin de columnas excelentes.
Son de varios dimetros y longitudes, los cuales dependen de la aplicacin. En general, el dimetro
interno tiene 3.9 o 4.6 mm. Una columna de 4.6 mm de dimetro, bien empacada con partculas de
5 nm (dp) debe tener un nmero de platos del orden de 60 000 a 90 000 placas/metro, a flujos de 1
mL/min. Una columna convencional de 15 cm de longitud con 4.6 mm de dimetro interior tiene 15
000 platos, con partculas de 3 nm, 9 000 platos con partculas de 5 nm y 5 000 platos con
partculas de 10 nm. Las partculas menores se limitan a longitudes de 25 cm o menos, por las
grandes cadas de presin. Con 25 cm es posible tener 50 000 placas a una presin de 5 000 psi, y
con mezclas de agua-metanol. Pueden resolver 50 a 100 mximos, que es ms o menos el lmite
superior de la cromatografa de lquidos de alta eficiencia convencional. Ms adelante se ver que
puede hacerse cromatografa rpida con columnas de mayor dimetro y cortas, pero las columnas
delgadas producen mayor resolucin.
Qumica Analtica Sexta edicin, Gary d. Christian Pg. 611 Columna.
Columnas analticas: La mayora de las columnas para cromatografa de lquidos tiene una
longitud de entre 10 y 30 cm. Por lo comn las columnas son rectas y se pueden alargar, si es
necesario, acoplando dos o ms columnas. En algunas ocasiones se pueden encontrar columnas
configuradas con forma helicoidal aunque el resultado es una cierta prdida de eficacia. El
dimetro interno de las columnas es a menudo de cuatro a 10 nanmetros y los tamaos de las
partculas de los rellenos ms comunes son de 5 a 10 nm. Tal vez la columna mas frecuentemente
utilizada es la de 25 c de longitud y 6.6 mm de dimetro interno, y rellena con partcula de 5nm.
Este tipo de columnas tiene de 40000 a 60000 platos/metro.
Principios de anlisis instrumental Quinta edicin, Skoog. Holler. Nieman. Pg. 792
Cromatografia de liquidos.
Precolumnas: Para aumentar la vida de la columna analtica, se coloca delante una precolumna
que elimina no solo la materia en suspensin y los contaminantes de los disolventes si no tambin
componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria, en cromatografa
liquido-liquido, la precolumna sirve para saturar la fase mvil con la fase estacionaria y as
minimizar las prdidas de esta en la columna analtica.
Principios de anlisis instrumental Quinta edicin, Skoog. Holler. Nieman. Pg. 793
Cromatografia de liquidos.