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TESIS DE MAGSTER
VALDIVIA CHILE
2010
ADICIN DE CEPAS LCTICAS PROBITICAS EN
LECHE EN POLVO 26% MG
por
VALDIVIA - CHILE
2010
Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias Agrarias
Profesor Patrocinante:
..
Renate Schbitz T.
Tec. Mdico, M.Sc. Food Microbiology
Instituto de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos
Profesores informantes:
Carmen Brito C.
Ingeniero en Alimentos, M.Sc. Food Science
Instituto de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos
.
Fernando Espina U.
Ingeniero Agrnomo, M.Sc. Food Science
Instituto de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos
A mis maravillosos padres Lily y Patricio
hermanas, cuaito y sobrino Vicente
el regalo ms bello
que Dios me ha
dado como
familia
AGRADECIMIENTOS
A los profesores Alejandro Romero (mi tutor del magster), Fernando Espina,
Marcia Costa, Emilio Teixido, Fernando Asenjo quienes en el transcurso de la
memoria, me brindaron su apoyo destacando a las profesoras Marcia Rojas y
Mariela Horzella junto con Vivi Riquelme por su incondicionalidad y afecto.
A mis panelistas sensoriales, miembros del Icytal y Yanina por buena disposicin.
NDICE DE CONTENIDOS
Captulos Pgina
RESUMEN 1
SUMMARY 3
1 INTRODUCCIN 5
1.1 Hiptesis 6
1.2 Objetivo general 7
1.3 Objetivos especficos 7
2 REVISIN BIBLIOGRFICA 8
2.1 Alimentos funcionales 8
2.2 Microorganismos probiticos 10
2.3 Efecto de los probiticos en las alergias atpicas y 19
diarreas por rotavirus
2.3.1 Alergias atpicas 19
2.3.2 Diarreas por rotavirus 20
2.3.3 B. lactis Bb12 y L. rhamnosus E800 21
2.4 Leche en polvo 25
2.4.1 Incorporacin de cepas probiticas a la leche en 26
polvo
2.5 Caractersticas de los probiticos del estudio 34
2.5.1 B. lactis Bb12 34
2.5.2 L. rhamnosus E800 35
3 MATERIALES Y MTODO 37
3.1 Lugar y duracin de la investigacin 37
3.2 Materiales 37
3.2.1 Materias primas 37
3.2.1.1 Cepas utilizadas 37
3.2.1.2 Sustrato para la inoculacin de las cepas 38
3.2.1.3 Bolsas utilizadas para envasar la leche en polvo 38
II
NDICE DE CONTENIDOS
Captulos Pgina
3.2.2 Equipos 38
3.2.2.1 Unidad de liofilizado 38
3.2.2.2 Mquina envasadora con sistema barrido 38
3.2.2.3 Cmara de almacenamiento termoreguladas 38
3.2.2.4 Cmara de congelacin 38
3.3 Metodologa de trabajo 38
3.3.1 Obtencin de cultivo celular en fermentador 38
3.3.2 Control del cultivo celular 39
3.3.2.1 Determinacin de absorbancia 39
3.3.2.2 Neutralizante 39
3.3.2.3 Control microscpico de los cultivos 39
3.3.2.4 Recuento de microorganismos probiticos 39
3.3.3 Liofilizacin de los cultivos celulares 41
3.3.3.1 Concentracin celular 41
3.3.3.2 Congelacin 41
3.3.3.3 Liofilizacin 41
3.3.3.4 Refrigeracin 41
3.3.4 Control posterior al proceso de liofilizacin 42
3.3.4.1 Recuento microbiolgico de cada cultivo 42
3.3.4.2 Anlisis de la humedad 42
3.3.5 Inoculacin y homogeneizacin de las cepas en la 42
leche en polvo y almacenamiento a temperatura
ambiente
3.3.6 Evaluacin del efecto de la temperatura de 43
almacenamiento y tiempo de almacenamiento de
la leche en polvo sobre la supervivencia de L.
rhamnosus E800 y B. lactis Bb12
3.3.7 Evaluacin del efecto de la temperatura de 44
reconstitucin de la leche sobre la viabilidad de las
cepas L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12
3.3.8 Evaluacin del efecto de las cepas probiticas 44
sobre las caractersticas organolptica de la leche
reconstituida, sometida a dos tiempos de
reconstitucin
III
NDICE DE CONTENIDOS
Captulos Pgina
3.3.9 Evaluacin fsico qumica 48
3.3.9.1 Viscosidad 48
3.3.9.2 Acidez 48
3.4 Diseo experimental y anlisis estadstico 48
4 PRESENTACIN Y DISCUSIN DE 50
RESULTADOS
4.1 Cultivo celular de cepas probiticas 50
4.1.1 Crecimiento de L. rhamnosus E800 en caldo GEM 50
4.1.2 Crecimiento de B. lactis Bb12 en caldo GEM 51
4.2 Efecto del liofilizado sobre la viabilidad de las 56
cepas probiticas
4.3 Efecto de la temperatura de almacenamiento en la 59
viabilidad de las cepas probiticas inoculadas en la
leche en polvo entera
4.4 Efecto de la temperatura de reconstitucin de la 75
leche en polvo sobre la viabilidad de las cepas
probiticas
4.5 Evaluacin de las caractersticas sensorial y fsico 82
qumica de los tratamientos sobre la leche en
polvo
4.5.1 Evaluacin sensorial 82
4.5.2 Acidez titulable 89
4.5.3 Viscosidad 91
4.5.4 Textura 94
5 CONCLUSIONES 96
6 BIBLIOGRAFA 98
7 ANEXOS 112
IV
NDICE DE TABLAS
Tabla Pgina
1 Alimentos con probiticos comercializados en Chile 15
2 Principales beneficios sobre la salud de las cepas 18
probiticas disponibles en Chile
3 Diseo experimental 49
4 Parmetros cinticos obtenidos en las cepas probiticas 54
en los distintos cultivos celulares en caldo GEM a pH
5,8
5 Efecto del liofilizado en la viabilidad de las cepas 56
probiticas en los distintos cultivos celulares
6 Evolucin de los probiticos viables hasta la adicin a la 60
leche en polvo
7 Evolucin de probiticos viables en leche en polvo (log 65
ufc/g + DE) y cultivo inicial almacenados a 25C + 2C
8 Efecto de tiempo de almacenamiento a 25 + 2C en la 67
viabilidad de las cepas probiticas
9 Evolucin de probiticos viables en leche en polvo (log 71
ufc/g + DE) y cultivo inicial almacenados a 40C + 2C
10 Efecto global del almacenamiento en la viabilidad de las 74
cepas probiticas adicionadas a la leche en polvo,
despus de 60 das
11 Evolucin de probiticos viables en leche en polvo (log 78
ufc/g + DE) a los 60 das de almacenamiento de la leche
en polvo a 25C y reconstituidas a 40C+ 2C
12 Evolucin de probiticos viables en leche en polvo (log 79
ufc/g + DE) a los 60 das de almacenamiento de la leche
en polvo a 25C y reconstituidas a 60C+ 2C
13 Promedio de acidez titulable de los tratamientos al 90
inicio, mitad y fines del almacenamiento a 25C + 2C
al cabo de 60 y 180 min
V
NDICE DE FIGURAS
Figura Pgina
1 Curva de crecimiento de L rhamnosus E800, (VTT 51
Technical Research Centre of Finland) en caldo G.E.M a
37C, con control de pH a 5,8
2 Curva de crecimiento de B. lactis Bb12 (Chr 52
Hansen) en caldo G.E.M a 37C (A) y 39C (B), con
control de pH a 5,8
3 Viabilidad de L rhamnosus E800, (VTT Technical 63
Research Centre of Finland), (T1), (A) y B. lactis
Bb12 (Chr Hansen), (T2), (B) durante el
almacenamiento a 25C y 40C
4 Interacciones entre las temperaturas de cmara y los das 64
de almacenamiento sobre la viabilidad de las cepas
probiticas
5 Recuento promedio de clulas viables de los 72
tratamientos con probiticos despus de los 60 das
de almacenamiento a 40C
6 Recuento de cultivos probiticos a los 60 das de 76
almacenamiento de la leche en polvo a 25C y
reconstituidas a 40C y 60C
7 Clulas viables de los cultivos probiticos por efecto de 77
la temperatura de reconstitucin
8 Promedio de los resultados de validacin del panel 84
sensorial de la leche en polvo en test triangular
9 Promedio de los resultados de evaluacin sensorial de la 86
leche en polvo a 60 min (A) y 180 min (B) de
reconstitucin en test triangular
10 Lectura de viscosidad en funcin de la velocidad de 92
rotacin, tratamientos y tiempo de reconstitucin 60 min
(A) y 180 min (B)
VI
NDICE DE ANEXOS
Anexo Pgina
1 Composicin del medio de fermentacin GEM utilizado 112
para el cultivo de L .rhamnosus E800 y B. lactis Bb12
Anexo Pgina
13 Recuento de probiticos viables en leche en polvo (log 126
ufc/g + DE) y cultivo inicial almacenados a 25C + 2C
14 Recuento de probiticos viables en leche en polvo (log 127
ufc/g + DE) y cultivo inicial almacenados a 40C + 2C
15 Recuento de probiticos viables en leche en polvo (log 128
ufc/g + DE) almacenadas a 25C + 2C y reconstituida A
40C
16 Recuento de probiticos viables en leche en polvo (log 129
ufc/g + DE) almacenadas a 25C + 2C y reconstituida A
60C
17 Determinacin del valor del tiempo de reduccin 130
decimal (D25 y D40) a partir de la recta de regresin (D=
1/K). Ejemplo de clculo
18 Anlisis estadstico para el recuento de probiticos 131
almacenados a 25C+2C y 40C+2C
19 Anlisis estadstico para el recuento de probiticos 133
almacenados A 25C + 2C
20 Anlisis estadstico para el recuento de probiticos 134
almacenados a 40C + 2C
21 Anlisis estadstico para el recuento de probiticos 135
viables en leche en polvo (log ufc/g + DE) almacenadas
a 25C + 2C y reconstituida a 40C + 2C y 60C + 2C
22 Anlisis estadstico para el recuento de probiticos 137
viables en leche en polvo (log ufc/g + DE) almacenadas
a 25C + 2C y reconstituida a 40C+ 2C
23 Anlisis estadstico para el recuento de probiticos 139
viables en leche en polvo (log ufc/g + DE) almacenadas
a 25C + 2C y reconstituida a 60C+ 2C
VIII
Anexo Pgina
24 Resultados de la validacin del panel sensorial de leche 141
en polvo en test triangular
24 Resultados test triangular para la evaluacin de leche en 141
polvo en comparacin con leche en polvo con cido
lctico incorporado
24b Resultados test triangular para la evaluacin de leche en 141
polvo en comparacin con leche en polvo oxidada con
sulfato de cobre incorporado
RESUMEN
ufc/g y en la mezcla de ambos se obtuvo log 7,6 0,3 ufc/g y log 7,3 0,4
ufc/g respectivamente. La concentracin de ambas cepas hasta el da 60 se
mantuvo sobre log 6,0 ufc/g, cifra lmite para tener un efecto teraputico del
probitico. Se present una prdida de viabilidad durante el almacenamiento a
40C, siendo esta disminucin ms significativa (p<0,05) al ser reconstituida la
leche a 60C.
SUMMARY
The objetive of the present research was to evaluate the viability of the
commercial probiotic strains L .rhamnosus E800 (VTT Biotechnology) and B.
lactis Bb12 (Chr. Hansen) in whole milk powder during storage and to
evaluate the effects of two reconstitution conditions. The dry supplementation
of milk powder with probiotics strains L rhamnosus E800 and B. lactis Bb12
was carried out from culture grown at fermenter scale and freeze dried in the
Instituto de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos laboratoty (ICYTAL,
UACh.
Three treatments were conducted with three replications each in milk powder:
a) with L rhamnosus E800, b) with B lactis Bb12, and c) with a mix of both
strains in a proportion of 1:1. The milk was stored under vacuum at 25C and
40C, for 60 days and the evaluation of the viability of the strains was
performed at days 0, 15, 30, 45 and 60. For the evaluation of the effect of the
reconstitution temperature of the milk on the viability of the probiotic strains,
the product was reconstituted and kept at 40C and 60C during 10 min.
Furthermore, sensory evaluation was performed after 0, 30 and 60 days of
storage. For the study the milk was dissolved in water at 40C and maintained
at 20C during 60 and 180 min.
The results showed that L rhamnosus E800 had an initial concentration of log
7,7 0,2 cfu/g and B. lactis Bb12 of log 7,6 0,5 cfu/g and in the mix of both
4
strains the counts were log 7,6 0,3 cfu/g and log 7,3 0,4 cfu/g respectively.
Probiotic bacteria remained viable during the 60 days of storage at 25C and
stayed over log 6,0 cfu/g, which is the minimum therapeutic concentration
recommended for probiotic bacteria, for both added separately or as a mix. A
greater loss of viability was found during storage at 40C. However, survival
of both strains decreased considerably (p<0,05) when the product was
reconstituted and kept at 60C during 10 min. On the other hand, in the
sensory evaluation the judges did not find a significant difference (p>0,05)
among the control without the added probiotic strains and milk powder with
the addition of strains. The physical and chemical characteristics were affected
significantly (p<0,05) by the incorporation of probiotic bacteria.
1. INTRODUCCIN
1.1.- Hiptesis
2. REVISIN BIBLIOGRFICA
Hasta finales del siglo XX, la meta en la alimentacin era asegurar un aporte
adecuado de energa y de nutrientes en la dieta. Hoy en da est naciendo un
nuevo concepto de nutricin, que procura, adems de los objetivos
tradicionales, la promocin de la salud y la prevencin de las enfermedades.
En este contexto, aparecen los alimentos funcionales, concepto que requiere
que su ingesta se efecte como componente habitual de la dieta y que ste
ejerza sus efectos en las cantidades ingeridas normalmente en una dieta
equilibrada.
Aunque todava no existe una normativa sobre los requisitos que deben
cumplir los probiticos que se incorporan a los alimentos. FAO/OMS (2002),
ha hecho unas recomendaciones acerca de los criterios de evaluacin de stos
incluyendo su identificacin intraespecfica, pruebas in vitro e in vivo para
constatar sus propiedades y efectividad y, gua sobre el etiquetado.
Roy (2005), seala que un producto fermentado debera contener 106 ufc de
bifidobacterias por gramo de producto al momento de ser consumido. Japn
desarroll un estndar para leches fermentadas y bebidas acidolcticas de 107
bifidobacteria por g o mL de producto para ser considerado un alimento
probitico (Ishibashi et al., 1993 citado por Prez, 2003).
Tabla 2. Principales beneficios sobre la salud de las cepas probiticas disponibles en Chile
L. L. L. L. L. L. L. B. B. B. B.
Beneficios para rhamnosus johnsonii acidophilus acidophilus casei rhamnosus paracasei lactis lactis lactis longums
la salud GG La1 NCFM La5 CRL431 HN 001 NCC2461 Bb12 DN173010 420 BB536
(DR20) ST11
Digestin de la no - si - si - - - - - -
lactosa
Inmuno- si si si - si si si si - si si
estimulante (modelo
animal)
Anti-bacteriano si si si - si si - si - - -
Anti-diarreico si - si si (colitis si - si si - - -
colagenosa)
Constipasin/ - - - - - - - si si - -
trnsito intestinal
Anti-inflamatorio si si - - - - - - - si -
Funcin si - - si - - si - - - -
intestinal de (modelo
barrera animal)
Anti-alrgico si - - - - si si si - si si
(modelo
animal)
Anticarcinognico si - si - - - - - si - si
Anti H. pylori no si . si (con - - - si - - -
Bb12) (con
La5)
Analgsico - - si - - - si - - - -
(modelo
animal)
Fuente: Cceres y Gotteland, 2010
19
El Ministerio de Salud de Chile indic que hasta noviembre del 2008, por el
sistema de vigilancia epidemiolgica para rotavirus en hospitales centinelas en
menores de cinco aos, se han notificado 6.149 casos de diarreas, de ellas
26,5% fueron positiva a rotavirus (Chile, Ministerio de Salud; 2008b).
La manipulacin gentica parece ser una nueva estrategia (Ross et al., 2005).
Al respecto Suokko et al. (2004), encontraron que la cepa L. rhamnosus E800
contiene dos genes capaces de codificar la protena del estrs trmico ClpL1 y
ClpL2 transcriptasa cuya expresin es capaz de incrementar la tolerancia de
la cepa a alta temperatura, donde la mxima expresin de la protena ClpL1,
ocurri despus de la aplicacin de 50C por 30 min. En el estudio se
evidenci adems, que la expresin de la protena ClpL2 se produca bajo
condiciones de tratamiento con perxido de hidrgeno. Por su parte, Park et
al., (2002) citado por Simpson et al., (2005), identificaron al gen rpoD para la
cepa B. animalis ssp lactis.
32
Segn Chavez y Ledeboer (2007), una opcin para mejorar la sobrevida de los
probiticos contenidos en el alimento es combinando los procesos de secado
por pulverizacin y vaco, de forma de disminuir la temperaturas del proceso
iniciando el proceso por pulverizacin a una temperatura de entrada y salida
de 80C y 48C, respectivamente, seguido por un proceso bajo vaco a 45C
con presin reducida de 10 mbar durante 24h.
Otro factor que reduce la vida til de los probiticos son la actividad de agua
(aw) o contenido de humedad de la matriz del alimento que lo contiene. En
este sentido Texeira et al. (1995), evidenciaron que la viabilidad de las
bacterias cido lctica es particularmente afectada cuando la actividad de agua
es superior a 0,25. Una tcnica especializada para otorgar estabilidad a los
microorganismos probiticos en entorno medioambientales de humedad asi
como de acidez y presencia de oxgeno, es el microencapsulamiento que busca
crear micro-ambientes en el cual la bacteria pueda sobrevivir. Ello facilita la
manufacturacin de productos fermentados con probiticos, ya que
proporciona, condiciones ms costantes (Anal y Smith, 2007). Sin embargo,
estudios con L rhamnosus GG incorporados en una frmula infantil en forma
encapsulada utilizando suero de protena como material de encapsulamiento,
han evidenciado que este ltimo procedimiento no asegura la supervivencia de
los mismo dentro de la cpsula (Weinbreck et al., 2010). Segn Anal y Smith
(2007), la eficiencia del microencapsulado esta en directa relacin con las
propiedades fisico-qumicas de los materiales de la pared como alginina,
carragenato, suero de protena, chitosan entre otros, del mtodo de
microencapsulacin empleados como secado por aspersin o secado por
33
Fumiaki et al. (2009), mezclaron en seco una frmula infantil comercial con la
cepas B. longum BB536, B. breve M -16V y B. infantis M63 con niveles de
incorporacin de recuento de 1010ufc/g, obteniendo al cabo de 24 meses a
30C valores de recuentos de 107ufc/g, atribuyendo los valores a la actividad
de agua del producto aw 0,25, lo que evidenci adems, la mejor estabilidad en
la cepa B. longum BB536.
2 Christian Hansen's Laboratorium (P1 / Sept. 2006). Hoja informativa. F DVS BB 12 Probiot Tec - Informacin de producto
35
3 Comunicacin personal. Mara Saarela 7 /10 / 2008. VTT Technical Research Centre of Finland.
36
4 VTT Technical Research Centre of Finland. Ficha Tcnica de Lactobacillus rhamnosus VTT E 97800 a potencial novel probiotic
strain
37
3. MATERIALES Y MTODOS
3.2 MATERIALES
3.2.1 Materias primas
3.2.1.1 Cepas utilizadas. Los microorganismos que se utilizaron para este
estudio correspondieron a cultivos liofilizados del tipo DVS (Direct Vat Set):
de L. rhamnosus E8005 y B. lactis Bb126. Los criterios tecnolgicos de
seleccin fueron sus tolerancias intrnsecas trmica y al oxgeno (Corcoran et
al., 2004; Simpson et al., 2005), la mantencin de elevados niveles de
viabilidad y estabilidad de sus propiedades en los productos deshidratados y la
resistencia a la liofilizacin, caractersticas importantes para el desarrollo de
los cultivos7.
5 Lactobacillus rhamnosus E97-800, VTT Biotechnology. Technical Research Centre of Finland, Espoo
6 Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb12, Chr. Hansen, Argentina.
7 VTT Technical Research Centre of Finland. Hoja informativa. Lactobacillus rhamnosus VTT E 97800 a potencial novel probiotic
strain
38
3.2.2 Equipos
3.2.2.1 Unidad de liofilizado marca Labconco modelo Triad Kansas City,
USA.
3.2.2.2 Mquina envasadora con sistema de barrido marca Multivac
modelo C100.
3.2.2.3 Cmaras de almacenamiento de leche, termoreguladas a 25C+2 y
40C+2.
3.2.2.4 Cmara de congelacin marca NuAire modelo -86C Ultra Low
Freezers, USA.
Se estudiaron tres tratamientos con tres repeticiones cada uno. Las variables
estudiadas fueron: viabilidad de los probiticos (0, 15, 30, 45 y 60 das) y,
caractersticas fsico-qumicas y sensoriales de la leche en polvo con
probiticos (0, 15 y 30 das).
2,5 12
2
y = 0,0884e0,4562x 2 11
1,5 2
R = 0,9368
1 10
0,5
0 9
-0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
8
-1 1
-1,5 7
-2
-2,5 6
Tiempo (h)
ln D .O . log Rcto .
2,5 12
0,2027x 11
1,5 y = 0,1377e
1 R2 = 0,995 10
0,5
0 9
-0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
8
-1
-1,5
7
-2
-2,5 6
Tiempo (h)
ln D . O. log Rcto .
2,5 12
1,5 2
R = 0,9398
1
10
0,5
0 9
-0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
8
-1
-1,5
7
-2
-2,5 6
Tiempo (h)
ln D . O. log Rcto .
Debido a que los controles del cultivo de las cepas probiticas seguido
mediante mediciones de densidad ptica y gasto de hidrxido de amonio al
20% (NH4OH) presentaron un descenso al cabo de 14 h (L. rhamnosus E800),
(Anexo 12a) 13 h y 11 h (B. lactis Bb12), (Anexo 12b y 12c) se procedi a
finalizar el proceso de fermentacin.
Los valores cinticos, calculados a partir de los datos de D.O de cada uno de
los cultivos durante su fase exponencial, se presentan en la Tabla 4. La
velocidad especfica de crecimiento (), que se define como la pendiente de la
curva de crecimiento logartmico en la fase de crecimiento exponencial, se
obtuvo mediante la ecuacin de la recta de regresin de una grfica que
representa la masa celular del cultivo en funcin del tiempo de incubacin
(Figuras 1 y 2). En tanto, el valor del tiempo de duplicacin se calcul de la
expresin, como refieren Shuler et al. (2002).
td = ln 2
Tabla 4. Parmetros cinticos obtenidos con las cepas probiticas en los
distintos cultivos celulares en caldo GEM a pH 5,8
Cepa Velocidad especfica Tiempo de duplicacin
Probitica de crecimiento
(h-1) tD (h)
L. rhamnosus E800 (*) 0,5 1,4
( 1crecimiento exponencial auxitico)
L. rhamnosus E800 (*) 0,21 3,3
(2 crecimiento exponencial auxitico)
B. lactis Bb12 (**), (37C) 0,20 3,4
B. lactis Bb12 (**), (39C) 0,19 3,0
(*)VTT Technical Research Centre of Finland
(**)Chr Hansen
55
26 Christian Hansen's Laboratorium (P1 / Sept. 2006). Ficha Tcnica. F DVS BB 12 Probiot Tec - Informacin de producto
56
A L. rhamnosus E800
8
7
log ufc/g
4
0 15 30 45 60
Tiempo de almacenamiento (das)
25C 40C
B B. lactis Bb12
8
7
log ufc/g
4
0 15 30 45 60
Grfico de Interaccin
7,9 Tiempo_das
0
7,5 15
log ufc g
7,1 30
45
6,7 60
6,3
5,9
5,5
25C 40C
Tmperatura cmara
Figura 4. Interacciones entre las temperaturas de cmara y los das de
almacenamiento sobre la viabilidad de las cepas probiticas.
65
Lankaputhra et al., 1996 citado por Prez (2003), sealan como causa
importante de deterioro en la viabilidad de bifidobacterias a los valores
obtenidos de pH, as reportan que el nivel de prdida de viabilidad puede
alcanzar hasta 82% para la cepa B. infantis presente en productos fermentados
con pH de 4,3.
L. rhamnosus B.lactis
E800 (*) Bb12(**)
Reduccin Reduccin
en ciclo log en ciclo log
Cultivo Cultivo
de la Sobreviv. de la Sobreviv.
Das inicial inicial
viabilidad log (%) viabilidad log (%)
(log ufc/g) (log ufc/g)
durante el durante el
almacen. almacen.
0 7,68 0 100 7,33 0 100
15 7,21 0,47 94 6,95 0,38 95
30 6,65 1,03 87 6,57 0,76 89
45 6,66 1,02 87 6,50 0,83 88
60 6,60 1,08 87 6,29 1,04 86
(*)VTT Technical Research Centre of Finland
(**)Chr Hansen
Pese a disminuir, se mantuvieron sobre el orden de log 6,0 por lo tanto, para
las condiciones de este estudio las cepas L. rhamnosus E800 y B. lactis Bb12
cumplieron con los requisitos de un probiticos en leche en polvo entera.
Thompkinson y Kharb. (2007), sealan que para frmula infantil el contenido
de clulas viables recomendable a lo largo de la vida til debera ser >106
ufc/g de polvo de frmula. Sin embargo, Shah y Lankaputhra. (2003), sealan
que, independiente de la dosis administrada para que el probitico pueda
68
Ello concuerda con los resultados obtenidos por Fumiaki et al. (2009), quienes
incorporaron las cepas B. longum, B. breve y B. infantis a una frmula infantil,
mantenindose niveles de recuento de 107 ufc/g al final del almacenamiento a
30C durante 24 meses, lo que se atribuy al bajo valor de aw< 0,25 del
producto.
8
7
6
5
log ufc/g
4 ab b
a b
3
2
1
0
L. rhamnosus B. lactis L. rhamnosus E800 B. lactis
E800 Bb12 en mezla Bb12 en mezcla
T2 T3a T3b
Segn los resultados del anlisis estadstico (Anexo 20), la viabilidad a los 60
da de almacenamiento a 40C en las dos cepas dependi tanto del tiempo de
almacenamiento, de la cepa y de la repeticin (p<0,05). No existe interaccin
entre la temperatura y tratamientos, es decir, la evolucin de la viabilidad con
el aumento de los das de almacenamiento muestra un comportamiento similar
en las dos cepas estudiadas.
Bifidobacterium
Bb12 (T3b),(**) 7,33 6,29 14,0 1,04 7,38 5,51 25 1,87
(*)VTT Technical Research Centre of Finland
(**)Chr Hansen
Los valores D corroboran que todas las cepas del estudio bajo la temperatura de
almacenamiento de 25C tendran una vida til ms prolongada y una menor
variabilidad que a 40C. En tanto, a 40C se evidencia la mayor tolerancia trmica
de la cepa L. rhamnosus E800 (36 das) en relacin a B. lactis Bb12 (28 das).
Los valores D deben considerarse como una estimacin aproximada de la
viabilidad de los cultivos, pero el hecho que se cumpla esta prediccin estar en
funcin directamente con la humedad y esta a su vez estar relacionada con el tipo
de envase utilizado (con efecto barrera).
Temperatura de reconstitucin
8
6
log ufc/g
a a a a
4
2
A A
B B
0
L. rhamnosus B. lactis L. rhamnosus E800 B. lactis Bb12 en
E800 Bb12 en mezcla mezcla
Tratamientos
40C 60C
Temperatura de reconstitucin
7
40C
log ufc/g
3
60C
1
Recuento
0 10 min 15 30 45 60
inicial de del da
leche con cero. Tiempo de almacenaiento (das)
cultivo
progresivo hasta llegar a una concentracin del orden de 2,5 log ufc/g (L.
rhamnosus E800) y 1,5 log ufc (B. lactis Bb12) donde se mantiene constante.
Con el fin de evaluar el efecto de las cepas probiticas sobre las caractersticas
sensoriales y fsico-qumicas de la leche reconstituda, se simularon las
condiciones de manipulacin a nivel del consumidor (preparacin de
mamaderas). Para ello la leche se reconstituy de acuerdo a la pauta referida
por Federacin Internacional de la Leche 99B (IDF/FIL, 1995), y se mantuvo
a temperatura ambiente durante 60 y 180 min. Como control se utiliz leche
en polvo sin incorporacin de probiticos.
grupo, se us como el criterio que predomin para ser eliminados del panel, ya
que tales panelistas podran desviar los resultados y proporcionar datos poco
confiables.
Resultados de la validacin
4
Puntaje
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Panelistas
Sabor cido Sabor metlico
8
7
6
5
4
3
2
1
0 30 60
8
7
6
5
4
3
2
1
0 30 60
Tiempo de almacenamiento
L rhamnosus E800 B. lactis Bb12 Mezcla
4.5.3 Viscosidad
Al evaluar la viscosidad en unidades de centipoises (cP) de los tres
tratamientos de leche en polvo con probiticos y leche polvo sola al cabo de 0,
30 y 60 das de almacenamiento (Figura 10 y Anexo 26), se observ que
todas las muestras tuvieron el mismo comportamiento incrementando los
valores a medida se aumentaban las RPM, concordante con las caractersticas
de los fluidos no newtonianodilatantes (shear thickening) fenmeno de
espesamiento (Ibarz, 1999).
25
Viscosidad (cP)
20
15
10
0
20 30 40 50 60 70 80 90 100
RPM
L. rhamnosus E800 B. animalis subsp lactis Bb12
Leche en polvo Mezcla de cepas probioticas
20
15
10
0
20 30 40 50 60 70 80 90 100
RPM
4.5.4 Textura
Visualmente se observ que a temperaturas de 25C, la textura del polvo
hacia el final del estudio permanece sin cambios. No obstante a 40C se
evidenci en tiempo cercano a los dos meses un aspecto apelmazado y un
descenso de la aw a 0,26. Alteracin fsica conocida como cristalizacin de la
lactosa, asociado a la exposicin de la leche en polvo a la alta temperatura en
95
Al cabo del estudio se logr evidenciar que el producto leche en polvo 26%
MG mezclado en seco con los microorganismos probiticos L. rhamnosus
E800 y B. lactis Bb12, es un producto que al ser almacenado a 25C y
reconstituido a 40C presenta un nmero suficiente de bacterias viables al
cabo de los dos meses y que al ser comparado con una leche en polvo
prototipo no presenta diferencias fisico- qumica ni sensoriales que sean
perceptibles por un panel entrenado.
96
5. CONCLUSIONES
6. BIBLIOGRAFIA
ANEXO 1
Ingrediente g/L
Peptona de soya28 30
Extracto de levadura29 7,0
Glucosa30 20
MgSO4 x 7H2031 1,0
K2HPO432 1,70
KH2PO433 1,36
ANEXO 2
Esquema general de propagacin
72h
37C+ 1C
Inoculacion
con asa de
una colonia
50 mL
Caldo MRS 24 h
+cys 37C+ 1C
Inoculacion
2%
18 h
Suspensin 37C+ 1C
20 mLGEM
Inoculacion
2%
pH 5,8
15 h
Suspensin 37C+ 1C
1L Agitacin suave
GEM (50 rpm)
ANEXO 3
Colonias de L. rhamnosus E800 en agar MRS 5,2
ANEXO 4
Colonias de B. lactis Bb12 en agar MRS- AB
ANEXO 5
ANEXO 6
Programa para el entrenamiento de panelistas de evaluacin sensorial
implementado
ANEXO 7
Cuestionario de seleccin de panelistas
DATOS A PANELISTAS.
Por favor, complete y conteste las siguientes preguntas:
1. Datos personales
Nombre:
__________________________________________________________
Lugar de Residencia
__________________________________________________________
Ocupacin:
__________________________________________________________
Fecha:
__________________________________________________________
Edad:
___________________________________________________________
Telfono:
___________________________________________________________
e-mail:
___________________________________________________________
SI ___ NO ___
SI ___ NO ___
119
Continuacin Anexo 7
3. Usted presenta algn problema de salud o intolerancia a la lactosa,
que pueda afectarle al participar en paneles de evaluacin sensorial?
SI ___ NO ___
Cules?
_______________________________________________________________
6. Podra usted dedicar un pequeo tiempo (20-30 min), con cierta frecuencia
(2 veces a la semana durante el entrenamiento y 3 veces a la semana durante
evaluacin sensorial para apoyar este proyecto?
SI ___ NO ___
10. Fuma? Si No
cuntos cigarrillos fuma habitualmente?
Hasta 8 cigarrillos diarios Ms de 8 cigarrillos diarios
Gracias !!!
FUENTE: Adaptado de STONE and SIDEL (1985)
120
ANEXO 8
Por favor, deguste cada una de las tres muestras que se presentan. En cada set
hay dos muestras idnticas y una diferente. Marque con un circulo la
diferente. Enjuguese la boca con agua antes de degustar y entre cada
muestra. Se permite volver a degustar
ANEXO 9
ANEXO 10
Por favor, deguste cada una de las tres muestras que se presentan.
En cada set hay dos muestras idnticas y una diferente. Marque con
un circulo la diferente. Enjuguese la boca con agua antes de
degustar y entre cada muestra. Se permite volver a degustar
ANEXO 11
5 4 5 5 57 27 29 31
6 5 6 6 58 27 29 32
7 5 6 7 59 27 30 32
8 6 7 8 60 28 30 33
9 6 7 8 61 28 30 33
10 7 8 9 62 28 31 33
11 7 8 9 63 29 31 34
12 8 9 10 64 29 32 34
13 8 9 10 65 30 32 35
14 9 10 11 66 30 32 35
15 9 10 12 67 30 33 36
16 10 11 12 68 31 33 36
17 10 11 13 69 31 34 36
18 10 12 13 70 32 34 37
19 11 12 14 71 32 34 37
20 11 13 14 72 32 35 38
21 12 13 15 73 33 35 38
22 12 14 15 74 33 36 39
23 13 14 16 75 34 36 39
24 13 14 16 76 34 36 39
25 13 15 17 77 34 37 40
26 14 15 17 78 35 37 40
27 14 16 18 79 35 38 41
28 15 16 18 80 35 38 41
29 15 17 19 81 36 38 41
30 16 17 19 82 36 39 42
31 16 18 19 83 37 39 42
32 16 18 20 84 37 40 43
33 17 19 20 85 37 40 43
La Tabla B ha sido reproducida de la Tabla de E.B. Roessler, J. Warren y J.F. Guymon,
publicada en Food Research, 13, 503-505 (1948).
ANEXO 12
Continuacin Anexo 12
ANEXO 17
Determinacin del valor del tiempo de reduccin decimal (D25 y D40) a
partir de la recta de regresin (D= 1/K). Ejemplo de clculo
y = -0,0199x + 7,714
R2 = 0,8039
7
log ufc/g
6
y = -0,0223x + 7,036
R2 = 0,7678
5
0 10 20 30 40 50 60 70
Dias de almacenamiento
25 40C Lineal (25) Lineal (40C)
25C 40C
K 0,0199 0,0225
D 50 44
y = -0,0185x + 7,324
7 2
R = 0,9299
log ufc/g
6
y = -0,0351x + 7,306
2
R = 0,7623
5
0 10 20 30 40 50 60 70
Dias de almacenamiento
25C 40C Lineal (25C) Lineal (40C)
25C 40C
K 0,0185 0,0351
D 54 28
131
ANEXO 18
Anlisis estadstico para el recuento de probiticos almacenados a 25C+2C y
40C+2C
Supuestos Anlisis de homogeneidad de varianzas para Recuento de probiticos
Test de Levene: 0.196767 P-valor = 0.898413
Analysis of Variance for log - Type III Sums of Squares
--------------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:Tratamientos 1,685 3 0,561668 6,44 0,0005 *
B:Temperatura cma 15,3713 1 15,3713 176,23 0,0000 *
C:Das de almacena 34,9927 4 8,74817 100,30 0,0000 *
D:Repeticin 1,92112 2 0,960559 11,01 0,0001 *
INTERACTIONS
AB 0,299326 3 0,0997752 1,14 0,3358 ns
AC 1,4693 12 0,122442 1,40 0,1789 ns
BC 3,32064 4 0,830161 9,52 0,0000 *
RESIDUAL 7,85008 90 0,0872231
--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 67,4171 119
--------------------------------------------------------------------------------
All F-ratios are based on the residual mean square error.
ANEXO 19
Anlisis estadstico para el recuento de probiticos almacenados A 25C +
2C
Supuestos Anlisis de homogeneidad de varianzas para Recuento de probiticos
Test de Levene: 0,140324 P-valor = 0,935427
ANEXO 20
Anlisis estadstico para el recuento de probiticos almacenados a 40C +
2C
Supuestos Anlisis de homogeneidad de varianzas para Recuento de probiticos
Test de Levene: 0,250209 P-valor = 0,860852
Analysis of Variance for log - Type III Sums of Squares
--------------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:Tratamientos 1,53659 3 0,512198 4,39 0,0095 *
B:Das de almacena 28,1268 4 7,03171 60,27 0,0000 *
C:repeticin 1,20849 2 0,604246 5,18 0,0103 *
INTERACTIONS
AB 1,34736 12 0,11228 0,96 0,4996 ns
RESIDUAL 4,43372 38 0,116677
--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 36,8955 59
--------------------------------------------------------------------------------
All F-ratios are based on the residual mean square error.
Multiple Range Tests for log by Tratamientos
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95,0 percent Tukey HSD
Tratamientos Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
M (Bb) 15 5,972 0,0881955 Xb
Bb 15 5,97533 0,0881955 Xb
M (Lb) 15 6,26067 0,0881955 XXab
Lb 15 6,32585 0,0904287 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
Contrast Difference +/- Limits
--------------------------------------------------------------------------------
Bb - Lb *-0,350513 0,339385
Bb - M (Bb) 0,00333333 0,335116
Bb - M (Lb) -0,285333 0,335116
Lb - M (Bb) *0,353846 0,339385
Lb - M (Lb) 0,0651795 0,339385
M (Bb) - M (Lb) -0,288667 0,335116
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
135
ANEXO 21
INTERACTIONS
AB 1,56847 2 0,784236 8,37 0,0006*
AC 1,14364 6 0,190607 2,03 0,0724
AD 1,64148 8 0,205185 2,19 0,0385*
BC 12,0024 3 4,00081 42,70 0,0000*
BD 0,102757 4 0,0256893 0,27 0,8937
CD 1,54382 12 0,128652 1,37 0,1997
Continuacin Anexo 21
Multiple Range Tests for log by Tratamiento
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95,0 percent Tukey HSD
Tratamiento Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
M (Bb) 29 4,18411 0,0653398 Xb
Bb 29 4,21492 0,0653398 Xb
M (Lb) 29 4,62747 0,0653398 Xa
Lb 29 4,73219 0,0670155 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
Contrast Difference +/- Limits
--------------------------------------------------------------------------------
M (Bb) - M (Lb) *-0,443361 0,241688
M (Bb) - Bb -0,0308056 0,241688
M (Bb) - Lb *-0,548079 0,244654
M (Lb) - Bb *0,412556 0,241688
M (Lb) - Lb -0,104718 0,244654
Bb - Lb *-0,517273 0,244654
--------------------------------------------------------------------------------
denotes a statistically significant difference.
ANEXO 22
INTERACTIONS
BC 0,866219 12 0,0721849 1,13 0,3677 ns
RESIDUAL 2,43233 38 0,0640086
--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 11,2684 59
--------------------------------------------------------------------------------
All F-ratios are based on the residual mean square error.
138
Continuacin Anexo 22
Multiple Range Tests for log by Tratamiento
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95,0 percent Tukey HSD
Tratamiento Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
M (Lb) 15 6,67467 0,0653241 Xa
Lb 15 6,72707 0,0669781 Xa
M (Bb) 15 6,81867 0,0653241 Xa
Bb 15 6,896 0,0653241 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
Contrast Difference +/- Limits
--------------------------------------------------------------------------------
M (Bb) - M (Lb) 0,144 0,248211
M (Bb) - Bb -0,0773333 0,248211
M (Bb) - Lb 0,0915983 0,251374
M (Lb) - Bb -0,221333 0,248211
M (Lb) - Lb -0,0524017 0,251374
Bb - Lb 0,168932 0,251374
Multiple Range Tests for log by Dias
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95,0 percent Tukey HSD
Dias Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
60 11 6,45059 0,0776852 X c
45 13 6,51241 0,0707758 Xc
30 12 6,595 0,0730346 Xc
15 12 6,93917 0,0730346 Xb
0 12 7,39833 0,0730346 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
Contrast Difference +/- Limits
--------------------------------------------------------------------------------
0 - 15 *0,459167 0,295745
0 - 30 *0,803333 0,295745
0 - 45 *0,885919 0,291208
0 - 60 *0,947746 0,305306
15 - 30 *0,344167 0,295745
15 - 45 *0,426752 0,291208
15 - 60 *0,488579 0,305306
30 - 45 0,0825855 0,291208
30 - 60 0,144412 0,305306
45 - 60 0,0618269 0,301379
139
ANEXO 23
Anlisis estadstico para el recuento de probiticos viables en leche
en polvo (log ufc/g + DE) almacenadas a 25C + 2C y reconstituida a
60C + 2C
Supuestos Anlisis de homogeneidad de varianzas para Recuento de
probiticos
Levene's test: 0.247577 P-Value = 0.862689
Continuacin Anexo 23
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95.0 percent Tukey HSD
Level Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
60 11 1.8303 0.123961 Xb
30 12 1.87333 0.118165 Xb
45 13 1.96821 0.113951 Xb
15 12 2.3075 0.118165 XXab
0 8 2.58265 0.150673 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
Contrast Difference +/- Limits
--------------------------------------------------------------------------------
0 - 15 0.275148 0.543633
0 - 30 *0.709314 0.543633
0 - 45 *0.614437 0.540418
0 - 60 *0.752351 0.549226
15 - 30 0.434167 0.474441
15 - 45 0.33929 0.466059
15 - 60 0.477203 0.486216
30 - 45 -0.0948771 0.466059
30 - 60 0.0430366 0.486216
45 - 60 0.137914 0.479949
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
141
ANEXO 24
Resultados de la validacin del panel sensorial de leche en polvo en test
triangular
ANEXO 26
Leche en polvo sola L rhamnosus (T1) B. lactis Bb12 (T2) Mezcla cepas probiticas
Da 0 60 min 180 min 60 min 180 min 60 min 180 min 60 min 180 min
20 rpm 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0 0+0
30 rpm 0+0 0+0 5 +8,660 0 0 0 0 0
50 rpm 18 17 +1 19 + 1 17,6 + 2,1 18,6 + 0,6 18 + 1 18,6 + 0,6 17 + 1
60 rpm 19,3 + 0,6 18,6 + 1,2 21 + 1,73 19,3 + 2,3 20 + 1 19 +1 20,3 + 0,6 19 + 1
100 rpm 21 + 0 21,6 + 1,2 24,3 + 2,31 22,3 + 1,53 23 + 1,53 21,6 + 1,53 23 + 1 22 + 1
Leche en polvo sola L rhamnosus (T1) B. lactis Bb12 (T2) Mezcla cepas probiticas
Da 60 60 min 180 min 60 min 180 min 60 min 180 min 60 min 180 min
20 rpm 0 0 0 0 0 0 0 0
30 rpm 0 0 0 0 0 0 0 0
50 rpm 18,3 +0,57 17,6 + 0,57 19 + 0 18,6 +0,57 18,3 +0,57 18+ 0 18 +0 18+0
60 rpm 20,3 + 0,57 19 + 0 21 + 0 20 + 0 21 + 0 20 + 0 21 + 0 19 + 0
100 rpm 22,6 + 0,57 22 + 0 24,6 + 0,57 23,6 + 0,57 23 + 0 23 + 0 23,6 + 0,57 22,3 + 0,57
149
ANEXO 27
INTERACTIONS
AB 36.6436 8 4.58045 7.63 0.0000*
AC 0.816667 2 0.408333 0.68 0.5072
AD 27.8246 6 4.63743 7.73 0.0000*
BC 8.79167 4 2.19792 3.66 0.0062*
BD 62.8126 12 5.23438 8.72 0.0000*
CD 0.171644 3 0.0572145 0.10 0.9626
Continuacin Anexo 27
Multiple Range Tests for cP by tratamiento
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95.0 percent Tukey HSD
tratamiento Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
Leche polvo 90 11.0944 0.0884368 Xc
Bb 12 90 11.9418 0.0884368 Xb
Mezcla 90 11.9455 0.0884368 Xb
L rhamnosus 90 12.3293 0.0884368 Xa
--------------------------------------------------------------------------------
Contrast Difference +/- Limits
--------------------------------------------------------------------------------
Bb 12 - L rhamnosus *-0.3875 0.305204
Bb 12 - Leche polvo *0.847396 0.305204
Bb 12 - Mezcla -0.00364583 0.305204
L rhamnosus - Leche polvo *1.2349 0.305204
L rhamnosus - Mezcla *0.383854 0.305204
Leche polvo - Mezcla *-0.851042 0.305204
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
Continuacin Anexo 27
Multiple Range Tests for cP by dias
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Method: 95.0 percent Tukey HSD
dias Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
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0 dias 120 11.3083 0.0707259 Xa
30 das 120 11.9333 0.115133 Xb
60 das 120 12.2417 0.0707259 Xb
--------------------------------------------------------------------------------
Contrast Difference +/- Limits
--------------------------------------------------------------------------------
0 dias - 30 das *-0.625 0.318191
0 dias - 60 das *-0.933333 0.235535
30 das - 60 das -0.308333 0.318191
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
ANEXO 28