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Lo que vamos a ver hoy son unas tcnicas bsicas de biologa celular, las tcnicas que nos
han permitido estudiar la clula. La tcnica clsica es la microscopa, nosotros con nuestro
ojo tenemos una limitante para observar lo que constituye un tejido.
Gracias al desarrollo de la microscopa ptica podemos llegar hasta este recuadro, en donde
ya podemos observar un poco sobre la estructura interna de una clula, que hay un ncleo,
un retculo, un golgi, que hay clulas que tienen un retculo mas desarrollados que otras,
etc. Pero luego viene todo el desarrollo de la microscopa electrnica, que nos permite
observar hasta la estructura por ejemplo de un ribosoma, que es un organelo.
Hoy en da existe una microscopa que es de nivel atmico, que se utiliza mas que nada
para materiales, corrosin de materiales en la industria del petrleo, y esa permite ver
inclusive la estructura, la distribucin de un tomo, de una molcula.
Microscopa ptica.
Microscopa ptica normal (de campo brillante coloreado): El material a observar se tie
con colorantes especficos que aumentan el contraste (cidos o bsicos).
Microscopa en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco
concentrado sobre el espcimen, de manera que la parte lumnica de este
cono es la que atraviesa la muestra y todo el resto el campo queda
oscuro. El campo de visin del objetivo se encuentra en la zona hueca
del cono de luz y slo recoge la luz que se refleja en el objeto. Esto
entrega un mayor contraste y podemos observar tambin el material que
tenga algn pigmento.
Microscopa en contraste de fase: Utiliza los principales ndices de refraccin que tienen
las distintas partes dentro de una clula (capacidad que tiene el
material de poder desviar el haz de luz, cada parte de la clula tiene
un diferente ndice de refraccin). Se usa principalmente para
aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las clulas
sin teir. Es ideal para especimenes delgados, o clulas aisladas y
vivas. Se pueden ver clulas IN VIVO.
Nomarski (DIC): Utiliza dos rayos de luz polarizada y las
imgenes combinadas aparecen como si la clula estuviera proyectando
sombras hacia un lado. Es ideal para especimenes delgados, o clulas
aisladas y vivas. Es un dispositivo que yo agrego, que pongo luego de la
fuente de luz a un microscopio y me permite tener esta idea de luz y
sombra, una idea tridimensional de espcimen.
Aqu hay una
comparacin de
cmo podemos
ver una
micromuestra con
los diferentes
tipos de
microscopia.
La microscopia ptica de fluorescencia lo que hace es adaptar el microscopio con filtro, que
van a por un lado dejar pasar una longitud de onda especifica dependiendo del fluorocromo
con el cual nosotros hayamos tratado la muestra, puede ser un fluorocromo natural y luego
con un sistema de filtros que recogen y dejan pasar especficamente la long de onda de
emisin de ese mismo fluorocromo. Por ejemplo yo tengo una muestra que trate con un
fluorocromo que se llama la fluorescena, que absorbe una long de onda correspondiente al
color azul y luego emite en la gama de los verdes. El fluorocromo lo puedo hacer llegar a
mi muestra por ejemplo unido a un anticuerpo (protenas que reconocen con una alta
especificidad la protena para la cual se produjeron) y yo puedo poner ese anticuerpo con
un fluorocromo, y ese fluorocromo lo hago llegar al componente especfico dentro de la
clula. Quiero observar por ejemplo microtubulos, que voy a utilizar?, un anticuerpo anti
tubulina y de esa forma al poner al anticuerpo en contacto con la clula, llevo el
fluorocromo especficamente a los microtubulos.
Luego tenemos la microscopia electrnica, lo que utilizamos para irradiar nuestra muestra
es un haz de electrones, quienes tienen un tamao muy inferior a la long de onda de la luz
visible, por lo tanto el lmite de resolucin de esta es mucho mayor que la microscopia
ptica, la electrnica puede aumentar un objeto hasta un milln de veces.
Etapas:
Para aislar las mitocondrias voy a tener que realizar una centrifugacin en gradiente de
densidad, donde voy a separar estos compuestos por distinta densidad, cada uno de estos
componentes de esta fraccin si bien tienen un tamao similar poseen una distinta densidad,
lo que les da un diferente coeficiente de sedimentacin, y en un gradiente de densidad estos
componentes se van a movilizar dentro de esta, hasta que encuentre la lnea de gradiente
que tenga la densidad igual a la densidad de ellos, por que no va a poder avanzar hacia una
densidad mayor, por lo tanto construyo en un tubo una gradiente de densidad, la que se
utiliza generalmente es el gradiente de sacarosa, el que puede ser fraccionado, poniendo
solucin de sacarosa a distinta densidad o bien puedo hacer un gradiente continuo, donde a
travs de la mezcla de dos soluciones de densidades diferentes, lleno este tubito y hago un
gradiente continuo.
Yo tengo el tubito donde voy a construir la gradiente, pongo una pipeta al fondo y de aqu
lo que yo hago es sacar de dos vasitos que estn intercomunicados uno con la solucin al
5% y otro con la solucin al 15%, tienen un volumen determinado as que lo primero que
yo saco de aqu es del 5 % , y medida que va bajando va a ir pasando solucin del 15 a la
de 5 y yo estoy constantemente agitando la solucin, de manera que en la medida que vaya
bajando va a ir pasando solucin de mayor densidad, y la densidad de esta solucin (la de
5%) va a ir aumentando continuamente, como esto esta al fondo, la primera que sali de 5
va a ir subiendo y va a ir quedando en forma continua 5, 6, 7, 8 gradiente de densidad, el 5
arriba y el 15 abajo.
Aqu lo que yo tengo como matriz slida, son partculas con una determinada carga, por lo
tanto va a haber una interaccin con partculas de
carga contraria y repulsin con las de la misma carga.
Cromatografa de afinidad
CITOMETRIA DE FLUJO
Separa distintos tipos celulares o clulas que tienen distintas caractersticas y que tienen por
ejemplo a nivel de membrana, distintas protenas o distintos componentes expresados,
adems me puede caracterizar un conjunto de clulas y puede entregar datos de ese
conjunto de clulas en forma diferenciada, midiendo distintos parmetros. Lo que yo puedo
someter a una citometria de flujo es una suspensin de clulas, clulas aisladas en una
solucin, yo pongo esta suspensin en el citmetro, y este se encarga de separar estas
clulas una por una por unos capilares finsimos en donde se alinean una clula tras otra,
dentro de este citmetro las clulas son reconocidas por que previo a esto a la clula yo la
tengo que tratar con distintos fluorocromos que la marquen de acuerdo a sus tipos celulares,
por lo tanto distintos tipos celulares van a ir marcados con distintos colores (distintos
fluorocromos).
CULTIVO CELULAR
Las clulas hoy en da es posible cultivarlas, esta muy en boga todo lo que es el cultivo de
clulas madres.
Antiguamente era una tcnica que no se lograba, por que las clulas somticas de cualquier
tejido de un mamfero, suelen crecer o dividirse bastante lento y con algunos requisitos
mnimos del medio en el cual se encuentran. El cultivo celular se logra si yo lo hago en un
medio de cultivo slido, en donde la clula se ancla, o sea depende de poder afirmarse de
un sustrato slido y tambin crecen hasta que se topan una con otra o con la superficie
donde se esta llevando a cabo el crecimiento, lo que se llama inhibicin por confluencia,
adems estas clulas tienen un numero de divisiones predeterminadas, que tiene que ver
con la vida de esa clula. Entonces se tiene una solucin de clulas que se pone en un
medio semislido para que se puedan anclar y eso es lo que se denomina un cultivo
primario y van a crecer hasta que se produzca esta inhibicin por confluencia, saco una de
estas clulas y la hago crecer en un segundo cultivo, y esto es un cultivo secundario donde
puedo volver a tener inhibicin por confluencia o antes de eso las clulas pueden llegar al
numero predeterminado de divisiones que tienen y as este tejido deja de crecer y empieza a
morir. Es una tcnica terriblemente engorrosa y delicada.
Hoy en da se dispone de una lnea de clulas inmortales que son la clulas HELA, no tiene
un numero predeterminado de divisiones celulares, estas clulas datan de 1961(clulas
cancergenas), esta se usan para realizar estudios en clulas animales, ya que son
inmortales.