PRACTICA N 4

AGRUPACIONES, MORFOLOGA Y TINCIONES DE BACTERIAS

I. INTRODUCCIN:

Las bacterias son microorganismos unicelulares que se reproducen por fisin binaria.
La mayora son de vida libre, a excepcin de algunas que son de vida intracelular
obligada, como Chlamydias y Rickettsias. Tienen los mecanismos productores de
energa y el material gentico necesarios para su desarrollo y crecimiento. Las
bacterias integran el reino procariota (pro de primitivo y cariota de ncleo). Todos los
organismos vivos se pueden dividir en dos tipos celulares: eucariotas y procariotas.
Tienen estructuras en comn como la membrana celular, los ribosomas encargados
de la sntesis proteica y el cido desoxirribonucleico (ADN) portador de la informacin
gentica. (Gerald J.Totora, 2007)
TAMAO: El tamao de las bacterias oscila entre las 0.5 y 3 m, pudiendo llegar en
algunos tipos a 10 m. Las bacterias de inters mdico tienen un tamao entre 0.4 y
2 m. Solo son visibles entonces, al microscopio ptico o microscopio electrnico.
Para observarlas con el microscopio ptico se usa el objetivo de inmersin (100X),
sumergiendo esta lente en una gota de aceite (aceite de inmersin) en el preparado
a observar.
MORFOLOGA: Microscpica La forma de las bacterias al microscopio est
determinada por la rigidez de su pared celular. Bsicamente, se diferencian segn su
forma en cocos (esfricas u ovaladas), bacilos (cilndrica o de bastones; rectos o
curvos) y espirilos (espiral); dentro de estas ltimas se encuentran: Treponema,
Borrelia y Leptospira (Wojciech Pawlina 2007).
Para observarlas e identificarlas realizamos algunas tinciones como
Tinciones simples, Tinciones diferenciales: Tincin de Gram, Tincin de cido-alcohol
resistencia (ZiehlNeelsen), Tinciones especficas: Tincin de esporas de Wirtz-
Cortitlin, Tincin de flagelos de Leifson, Tincin negativa
TINCIONES SIMPLES: Se usa un nico colorante (siempre es de tipo bsico) que
proporciona contraste para observar mejor un organismo completo. Se tie con un
colorante bsico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina bsica) durante unos 5
minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tien casi todas las bacterias; la mayora
de los tejidos no se tien.
TINCIONES DIFERENCIALES: Consta de dos etapas: Una tincin primaria
(siguiendo el mismo mtodo que en una tincin simple) Y la tincin de contraste. Se
utiliza otro colorante que tie (y, por tanto, revela) las clulas no teidas por el primer
colorante. Por ejemplo, la tincin de Gram y la tincin de cido-alcohol resistencia,
ambas aplicadas a bacterias. (Julio R. Villanueva 1996)

OBJETIVOS:

Observar las formas tanto individual como en agrupacin de las

bacterias, su estructura, ya sean estables o inestables.
Realizar varios mtodos de coloracin para identificar a las bacterias.
II. PROCEDIMIENTO:

Cultivos puros bacterianos

1. Bacillus sp(subtilis)
2. Staphylococcus aureus
3. Escherichia coli
4. Enterobacter sp
5. Klebsiella sp
6. Pseudomonas aeruginosa

1.-COLORACION SIMPLE
Cristal violeta
1.1.- Prepare un frotis colocando una pequea gota de suero fisiolgico en el
centro de dos portaobjetos limpios.
Primera lamina: Bacillus sp
Segunda lamina: Escherichia coli

2.2.- Una vez esterilizada el asa de siembra extraemos el cultivo puro y

hacemos una suspensin expandiendo lo suficiente para facilitar su secado
3.3.- Tia con cristal violeta agregando suficiente colorante y deje que acte
durante 1 minuto para luego lavar suavemente con agua.
4.4.- Dejar secar para luego, agregarle aceite de inmersin y ser observada a
100 x,
5.5.- Observacin de morfologa y estructuras bacterianas

2.- COLORACION COMPUESTA/DIFERENCIAL

Tincin Gram
Reactivos: Cristal violeta/sol. Lugol/alcohol acetona/safranina
2.1.- En cuatro laminas portaobjeto una vez esterilizada el asa de siembra
agregamos una gota se suero fisiolgico y la expandemos
Primera lamina: Bacillus sp
Segunda lamina: Staphylococcus aureus
Tercera lamina: Escherichia coli
Cuarta lmina: Pseudomonas aeruginosa

2.2.- Colocar una pequea gota de suero en el centro de un portaobjetos. Es

necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de
siembra
2.3.- Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Tomar, en condiciones
aspticas, una pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y
transferirlo a la gota de suero. Remover la mezcla con el asa de siembra
hasta formar una suspensin homognea que quede bastante extendida para
facilitar su secado.
2.4.- Hacemos la fijacin respectiva para teir.
2.5.- Agregamos cristal violeta hasta cubrir la muestra por completo y dejamos
actuar por un minuto a las 4 lminas
2.6.- Inundamos suavemente con sol. Lugol por un minuto. Lavamos
suavemente con agua
2.7.- Decoloramos con alcohol acetona y dejamos secar
2.8.- Agregue la safranina para la tincin de contraste y finalmente secamos
para observar.
 2.9.- Observar a 100x con aceite de inmersin

3.- COLORACIN ESPECIAL

NEGATIVA
3.1.- En primer lugar, en una lmina portaobjeto una vez esterilizada el asa de
siembra agregamos una gota se suero fisiolgico y la expandimos.
3.2.- Colocar una pequea gota de suero en el centro de un portaobjetos. Es
necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de
siembra
3.3.- Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Tomar, en condiciones
aspticas, una pequea cantidad del cultivo bacteriano de Enterobacteria sp
en medio slido y transferirlo a la gota de suero. Remover la mezcla con el
asa de siembra hasta formar una suspensin homognea que quede bastante
extendida para facilitar su secado.
3.4.- Hacemos la fijacin respectiva para teir.
3.5.- Coloreamos la muestra primero con Maneval A haciendo un frotis.
Fijamos haciendo un secado en el mechero
3.6. Luego Agregamos el Maneval B hasta cubrir por completo la muestra.
Realizamos el secado con ayuda del mechero para llevar a observar las
capsulas bacterianas coloreadas.
3.7.- Observamos con aceite de inmersin a 100x.

WIRTZ
3.8.- En una lmina portaobjeto una vez esterilizada el asa de siembra
agregamos una gota se suero fisiolgico y la expandemos
3.2.- Colocar una pequea gota de suero en el centro de un portaobjetos.
Extraemos el cultivo puro bacteriano Bacillus sp para hacer una suspensin
3.9.- Fijar la muestra y coloreamos la muestra agregando verde de malaquita,
Enjuagamos suavemente y fijamos para llevar a observar esporas bacterianas
de color turquesa o verde
Observar a 100x con aceite de inmersin

III. RESULTADOS: Muestra: bacillus sp

Muestra: Echerichia
Coloracin:
Muestra: sp Coli
bacillusGram

Coloracin:
Coloracin:
Objetivo: 100X simple
simple
(cristal violeta)
(cristal violeta)
Descripcin: Gram
Objetivo:
positivas
Objetivo: 100X
(clulas
100X
vegetativas pintada de color
Descripcin:
Descripcin: bacterias
bacterias
violeta) forma alargada y en
en forma de
de bastoncitos,barra
forma alargada yen
estnnounidas
se encuentran
bastones,
formando su una
agrupacin
cadena.
agrupadas,
es en cadenas.sino ms
bien dispersas
IV. Muestra: staphylococcus
aureus

Coloracin: Gram

Objetivo: 100X

Descripcin: Gram
positivas (clulas
vegetativas pintada de color
violeta) bacteria en forma
de cocos, estn grupadas
formando racimos.
CONCLUSIONES:

En la practica realizada
se realizo distintos metodos
de tincion de bacterias,
simple, gram y diferencial, y Muestra: Echerichia Coli
cada uno de ellos nos
permitio identificarlas, Coloracin: Gram
tanto individualmente
con en agrupaciones, Objetivo: 100X
tambien nos permitio Descripcin: Gram
ver las esporas y las
negativas (clulas
distintas formas de sus
vegetativas pintadas de
celulas vegetativas.
color rosado) bacterias en
forma de barra y no se
V. encuentran agrupadas, sino
bien dispersas

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

Muestra: pseudomonas
D.Male; J.
aeruginosa Brostoff; D.
Coloracin: Gram Broth;I.
Roitt.
Inmunologa. Objetivo: 100X Espaa.
Sptima edicin.
Editor Elsevier Descripcin: Gram Mosby,
2007. 535 p. negativas (clulas
vegetativas pintadas de
color rosado) tiene forma de
bastoncillo, posee flagelos,
se encuentran dispersas.

www.biologia.edu.ar/bacterias/micro4.htm
 Patrick R. Murray , Ken S. Rosenthal, Michael A, Pfaller . Microbiologia
Medica, 6ta Edicion 2009 Elsevier Espaa, S.
Julio R. Villanueva y By Roger Y. Stanier, microbiologa, editorial reverte,
1996, Mxico.
Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case, Introduccin a la
microbiologa, editorial medica microbiana, 2007, Panam.
Wojciech Pawlina 2007, Michael H. Ross, Wojciech Pawlina,
Histologa, editorial medica panamericana, pag.15, 2007

VI. CUESTIONARIO:

1. Cual es la composicin qumica del agar comn?

0,5% de peptona;

0,3% de extracto de carne/extracto de levadura;

1,5% de agar;

0,5% de cloruro de sodio;

agua destilada;

pH casi neutro (6,8) a 25 C.

2.- El agar MarConkey es un medio de cultivo selectivo y diferencial? O

solamente selectivo?
- El agar MacConkey es un medio de cultivo selectivo y diferencial para
bacterias diseado para aislar selectivamente bacilos Gram negativos y
entricos (encontrados normalmente en el tracto intestinal) y
diferenciarlos en base a la fermentacin de la lactosa.

3.- Mencione 2 medios de cultivo selectivos:

- SELECTIVOS: son slidos en los que la selectividad se consigue

alterando las condiciones fsicas del medio o aadiendo o suprimiendo
componentes qumicos especficos con el fin de inhibir el crecimiento
de especies qumicas cuyo crecimiento no interesa.
Medios selectivos inhibidores de Gram
Medios selectivos antibioticos

4.- Como identificas los coliformes de agar MacConkey

- Para el conteo de coliformes totales se tienen tres mtodos

principalmente. *El primero se basa en la
tcnica del nmero ms probable (NMP), utilizando caldo Lauril Sulfato
Triptosa seguido de la confirmacin de los tubos positivos de formacin
 de gas en caldo Lactosa Bilis Verde Brillante. La incubacin es a 35 C.
*El segundo mtodo emplea nicamente el caldo McConkey. La
incubacin es a 37 C. *El tercer mtodo usa el
caldo Lactosa Bilis Verde Brillante a 35 37 C, seguido de confirmacin
en agar Bilis Rojo-Violeta o en agar Endo.

5.- La papa, leche, huevos, sangre puede considerarse como medios de

cultivo naturales?

- S, porque son medios de enriquecimiento adems de las sustancias

nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables
para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento
se hace por adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre,
suero, leche, huevo, bilis, etc.)

6.- Cual es el agente solidificante en el agar comn?

- La Gelatina es un agente solidificante pero se emplea mucho menos ya

que bastantes bacterias provocan su licuacin.

7.- Mencionar dos ejemplos de medios de cultivo que requieran su

esterilizacin por filtracin?

- Este procedimiento es aplicable a la esterilizacin de medios lquidos y

gases, especialmente los primeros. Cuando el lquido a filtrar no puede
resistir, sin descomponerse, la accin del calor, se aplica la tcnica de
filtracin, la que puede efectuarse mediante presin o aspiracin.
 Muestra: bacillus sp

Coloracin: Wirtz

Objetivo: 100X

Descripcin: bateras de
forma alargada y en
bastoncitos, estn unidas
formando una cadena, sus
clulas vegetativas
(bacterias) estn de color
violeta, y las esporas se
encuentran de color verde.

Muestra: Entero bacter sp

Coloracin: Maneval

Objetivo: 100X

Descripcin: bacteria en
forma de capsula, el cuerpo
bacteriano de color rojo y la
capsula y fondo azul, estas
bacterias se encuentran
dispersas.