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Orqudeas el Azafrn (Cultivo in vitro de semillas)

CULTIVO IN VITRO ORQUDEAS

NDICE PGINA

Polinizacin 1

Tiempos de maduracin de semillas 3

Material 4

Preparacin del medio de cultivo 5

Esterilizacin de la capsula y semillas y siembra 6


en medio de cultivo

Siembra en medio de cultivo 6

Cultivo 7

Resiembra 7

Siembra en macetas comunitarias 7

Cuidados 8
POLINIZACIN

La polinizacin se puede realizar con un palito de bamboo, palillo, lpiz etc. Se coloca el palillo
debajo de la columna dorsal jalando la antera hacia uno para obtener las polinias. Las polinias se
colocan en el estigma de la misma flor o de otra flor con la que se quiera hacer la cruza. Al retirar
el lpiz las polinias quedaran adheridas al estigma. Solo queda esperar a que se forme la capsula al
comenzar el desarrollo de las semillas en el ovario subfloral.

Fig. 1. Morfologa floral de las orqudeas. (http://paraisodeorquideas.blogspot.com/)

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Fig. 2. Partes detalladas de la flor de las orqudeas. Es importante identificarlas con claridad para
poder realizar la polinizacin realizar cruzas y obtener semillas.

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TIEMPOS DE MADURACIN DE SEMILLAS

Tabla 1. Ejemplos de los tiempos de maduracin de algunos gneros y especies de


orqudeas.Tomado de www.lamolina.edu.pe/agronomia/dhorticultura/html.../cuya.doc.

Calanthe 4 meses

Cattleya 11 meses

Coelogyne 13 meses

Dendrobium 12 meses

Epidendrum 4 meses

Miltonia 9 meses.

Odontoglossum 7 meses

Phalaenopsisi 6 meses.

Para tener ms detalles consulta el archivo de tiempos de maduracin de semillas donde


encontraras un archivo ms amplio con una mayor cantidad de especies descritas.

Fig. 3. Capsulas en desarrollo de Dendorbium sp. y Prosthechea mariae

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MATERIAL

Agar agar Jeringa de 10 ml con tapn

Agua destilada Jeringa de 60 ml sin aguja

Algodn estril Masking tape

Atomizador con solucin cloro 1 Cl: 4 (H2O) Medio de mantenimiento Phytamax Orchid
Maintenance Medium (Sigma)
Autoclave u olla de presin
Medio de siembra Phytamax orchid Medium
Bolsas de basura with Charcoal and Banana powder (Sigma)
Botes de polipropileno con tapa Microondas
Cmara estril Olla y cuchara
Cepillo de dientes estril o desinfectado Palillos largos
Cinta Micropore 3M Papel aluminio
Cinta testigo Papel china blanco
Cloro comercial Parafilm o plstico adherente
Detergente liquido Pinzas largas y cortas estriles
Frascos con agua destilada estril Probeta 1L
Frascos gerber Solucin cloro 1 Cl: 4 (H2O), 1 Cl: 9 (H2O)
Frascos polipropileno de 500 ml Tapas o tapones de goma
Guantes Toallas de papel
Hoja de papel

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PREPARACIN DE MEDIO DE CULTIVO

Para preparar el medio en frascos de polipropileno (PP), disolver la cantidad de medio Phytamax
de acuerdo a las indicaciones del fabricante en agua destilada. Agregar 8 gr de agar agar para cada
litro de medio preparado. Calentar hasta dar el primer hervor dejar cocer unos segundos, es
importante disolver correctamente por lo que debe de moverse constantemente hasta hervir. Se
deja enfriar un poco y se agregan 60 ml del medio en cada frasco, se coloca la tapa nicamente
apretando est en una parte del frasco y este se coloca en microondas por 3 minutos para
esterilizar el medio y el interior del frasco. Previamente se debe tener preparada una bolsa en la
cual con ayuda de un atomizador se desinfecta con solucin de cloro 1 Cl: 4 (H2O), se vuelve
desinfectar el interior de la bolsa rocindola con la solucin cada vez que se mete un frasco dentro
de esta. Los frascos deben de colocarse sin taparse totalmente para evitar una condensacin
elevada. Una vez enfriados estos se cierran dentro de la bolsa. Los frascos estn listos para
sembrar.

Fig. 4. Cultivo de semillas de Phalenopsis sp. en frascos de polipropileno (PP)

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Para preparar el medio en frascos de vidrio, existen dos maneras de hacer: la primera, se puede
preparar el medio y esterilizarlo en olla exprs o autoclave junto con los frascos vacios y
posteriormente en la cmara estril verter el medio en los frascos. La segunda, se puede preparar
el medio disolverlo correctamente por medio de calor y agitacin y colocarlo en los frascos y luego
estos con el medio esterilizarlos, de esta forma tenemos los frascos listos para sembrar.

Se recomienda dejar frascos tanto de PP como de vidrio unos das a temperatura ambiente antes
de sembrar para observar cualquier indicio de contaminacin de esta forma se evita desperdiciar
semillas o que la contaminacin provenga desde antes de la siembra de las semillas.

ESTERILIZACIN DE LA CAPSULA Y SEMILLAS Y SIEMBRA EN MEDIO DE CULTIVO

Cuando se hace el corte de la capsula antes de que esta se abra y libere las semillas debe de
colocarse dentro de la cmara estril en un recipiente con solucin de cloro 1 Cl: 9 (H2O) por 5-10
min, durante este tiempo cepillas con cepillo de dientes estril la superficie de la capsula, tambin
se puede agregar a la solucin una gotita de detergente liquido o reactivo TWEEN 20, con la
finalidad de romper la membrana celular de los microorganismos. Transcurrido el tiempo
enjuagar en agua destilada estril. Otra forma de desinfeccin es sumergir la capsula en alcohol
isoproplico sacarla y flamear el alcohol que quedo sobre la cpsula sin exponer la capsula a exceso
de calor.

Abrir la capsula con navaja estril, sacar las semillas con pinzas estriles y colocarlas en los medios
de cultivo. Tambin pueden transferirse las semillas a un frasco con agua estril y utilizar una
pipeta para colocar las semillas en el medio de cultivo. Esto ayuda a remover el algodoncillo que
rodea las semillas evitando el traspaso de estos residuos a los frascos de cultivo.

Para el caso de que la cpsula se abra y se liberen las semillas estas deben de recolectarse en una
hoja de papel el cual se dobla por la mitad, de esta manera utilizando el papel como un embudo se
colocan las semillas en una jeringa con tapn (sin aguja). Una vez las semillas dentro se coloca el
embolo hasta la parte superior sin presionar las semillas. En la punta de la jeringa se coloca el
tapn, al cual previamente se le hacen dos hoyos en la punta con una aguja caliente y se le coloca
una cuadrado pequeo de papel sanita o papel servilleta para evitar que se salgan las semillas
durante el lavado. Una vez montada la jeringa esta se sumerge en solucin de cloro 1 Cl: 4 (H2O) para
desinfectarla. Posteriormente se absorbe el volumen de la jeringa de solucin de cloro 1 Cl: 9 (H2O),
se agita constantemente por 10 minutos y se deja que las semillas se precipiten. Si quedan
semillas sin precipitar se quita el tapn y se elimina un poco de liquido para eliminar esta semillas
debido a que en ellas no ha penetrado el cloro y por lo tanto no se encuentran desinfectadas. Una
vez hecho esto se coloca el tapn y se elimina la solucin de cloro. Posteriormente se absorbe
agua destilada estril y se agita vigorosamente la jeringa para enjuagar las semillas, se deja de
agitar y se observa que las semillas comienzan a precipitarse. Este procedimiento de enjuagado se
repite 2 veces completando 3 enjuagadas. De la ultima enjuagas no se elimina totalmente el agua
con la finalidad de agregar a los medios de cultivo aproximadamente 1 ml del agua con semillas

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para hacer la siembra. Los frascos deben ser sellados para evitar que se contaminen, y deben ser
marcados como referencia.

CULTIVO

Los frascos deben de colocarse bajo luces fluorescentes por 8 horas diarias, aproximadamente 40
cm por debajo de la fuente de luz. Una vez hecha la siembra, la germinacin de las semillas puede
tomar de 1 a 9 meses.

RESIEMBRA

Aproximadamente a los 30 o 60 das despus de la germinacin ser necesario transferir las


plntulas a medio de cultivo nuevo para promover un mejor crecimiento. Para el trasplante debe
de colocarse el frasco madre y el frasco con el medio nuevo dentro de la cmara de siembra y
trabajar bajo condiciones de asepsia. Se debe colocar un frasco con solucin de cloro 1 Cl: 4 (H2O)
para sumergir los utensilios y enjuagarlos en agua destilada estril entre siembras. Se toman los
plntula con las pinzas desinfectadas esparcindolas en el medio de cultivo nuevo teniendo
cuidado de dejar espacio entre ellas para evitar la competencia. Es importante limpiar los
utensilios para tomar otras plntulas y trasplantarlas. Una vez trasplantada se tapan los botes, en
este caso la tapa del bote necesita tener un pequeo agujero cubierto con cinta Micropore 3M
(resistente a la autoclave) para permitir el intercambio gaseoso pero no la entrada de
microorganismos. Los frascos se colocan nuevamente bajo luz fluorescente por 8 horas diarias.

SIEMBRA EN MACETAS COMUNITARIAS

Cuando las plantas han crecido a un tamao de 5-6 cm y tienen de 3 a ms races, ya pueden ser
sacadas del frasco. Es importante abrir el frasco y permitir que se aclimaten las plantas por 24
horas antes de sacarlas. Se puede romper el frasco o colocar un poco de agua tibia para deshacer
el agar. Es importante limpiar el exceso de agar en las plantas para evitar la formacin de
microorganismos que pudieran daarlas. Se colocan las plantas en una mezcla de musgo y perlite,
una mezcla que permita buena aireacin y que absorba humedad. Rociar con fungicida/bactericida
como Physan 20 o RD-20. La siembra funciona mejor si se colocan las plantas juntas, colocando de
5 a 3 plantas en macetas de 3.

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CUIDADOS

Las plantas de deben de colocarse en un lugar con poca luz, sin luz directa, y con humedad y
temperatura constantes. Es importante no fertilizar las plantas por ahora, se puede agregar algo
de fertilizante a las 3 o 4 semanas de la siembra. Le tomara aproximadamente de 3 a 5 aos a las
plantas nuevas en producir la primera floracin. Repetir la aplicacin del fungicida/bactericida
cada 3 a 4 semanas. Conforme las plantas se aclimatan y desarrollan se pueden pasar a un lugar
con mayor luz y con periodos entre riegos mas extendidos.

Tomado y modificado de: Home Flasking by Sam Fifer,


http://www.lincolnorchidsociety.org/flasking/index.html#medium.

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