PRODUCCION DE INDIGO POR BACTERIAS NAFTALENO-DEGRADAR

B. Bhushan, SK Samanta y RK Jain Instituto de Microbial Technology,

Chandigarh, India 69/99: plazo entre los 13 diciembre de 1999, 1 revisado
marzo de 2000 y aceptadas 3 de marzo de 2000 B. BHUSHAN, S. K. S AM
ANTAANDR. K. Jain. 2000.
Una cepa de tipo salvaje naftaleno-degradantes Pseudomonas putida RKJ1 y
dos cepas recombinantes cada uno de Ps. putida y Escherichia coli que portan
los genes para la degradacin de naftaleno en un plsmido recombinante
pRKJ3, producen ndigo y pigmentos indirrubina de indol. Naftaleno, salicilato y
clulas IPTG inducidos de bacterias recombinantes naftaleno-degradantes
producidos hasta dos veces mayor ndigo en comparacin con las clulas no
inducidas. Las tasas mximas de formacin de ndigo por Ps. putida RKJ1, de
Ps. putida RKJ5 / pRKJ3, de Ps. putida KT2442 / pRKJ3, E. coli TB1 / pRKJ3 y E.
coli AB1157 / pRKJ3 eran 060, 080, 060, 120 y 150 nmol min1 mg biomass1
seca, respectivamente, usando indol como sustrato. Los valores de Km
aparente de la formacin de ndigo por estas mismas bacterias fueron 022,
015, 010, 021 y 020 Ly1 mmol, respectivamente, de nuevo utilizando indol
como sustrato. El presente estudio revel que E. coli AB1157 fue el ms
efcient de los anfitriones probados para la expresin de los plsmidos
codificada genes (pRKJ3) de la Sal cepa de tipo salvaje. putida RKJ1. Adems,
ambas cepas de E. coli recombinantes eran capaces de producir ndigo
directamente de medio nutriente.
INTRODUCCIN
Indigo es uno de los colorantes textiles ms antiguos y fue producido
tradicionalmente a partir de un extracto de las plantas del gnero Indigofera.
Actualmente, est siendo producido por sntesis qumica y es comercializado
por muchas empresas lderes. Son muy pocos los informes estn disponibles en
relacin con la biosntesis microbiana de ail. Entre los productores de ndigo
microbianos, la mayora de los microorganismos son bacterias degradacin de
hidrocarburos aromticos tales como naftaleno-degradar Pseudomonas putida
NDO (Murdock et al. 1993), Ps. putida PPG7 (O'Connor y Hartman 1998), p-
cumate y Mand p-toluato degradadora de Ps. putida F1 y Sal. putida mt-2,
respectivamente (Eaton y Chapman 1995), estireno-degradar Ps. putida S12 y
CA-3 (O'Connor et al. 1997) y PS tolueno-degradantes. mendocina KR1 (Yen et
al. 1991). El sistema de enzima responsable de la formacin de ndigo
generalmente consiste de una o ms enzimas, tpicamente monooxigenasas,
dioxigenasas o hidroxilasas (O'Connor et al 1997;. Doukyu et al., 1998). Los
genes que codifican estas enzimas se han clonado a partir de Pseudomonas y
Rhodococcus spp. en cepas de Escherichia coli (Yen et al 1991;. Hart et al
1992;. Eaton y Chapman 1995) a fin de producir ndigo directamente de
cualquiera de medio nutriente (Ensley et al., 1983) o a partir de glucosa
(Murdock et al., 1993). Recientemente, un mtodo ha sido patentado por O'riel
y Kim (1998) para la produccin de ndigo y tintes indirubina utilizando un coli
Escherichia recombinante que contiene un gen que codifica una hidroxilasa
fenol a partir de Bacillus stearothermophilus. En el presente estudio, se
presenta en la formacin e identificacin de ail y pigmentos indirrubina por
uno de tipo salvaje y cuatro cepas bacterianas recombinantes.
MATERIALES Y MTODOS
Las bacterias, los medios y condiciones de cultivo
De las bacterias five utilizados en el presente estudio, Ps. putida RKJ1 (Samanta
et al. 1998) fue una cepa de tipo salvaje y era capaz de degradar naftaleno a
travs de salicilato. Cuatro bacterias recombinantes a saber Ps. putida RKJ5 /
pRKJ3, de Ps. putida KT2442 / pRKJ3, E. coli TB1 / pRKJ3 y E. coli AB1157 / pRKJ3
contena genes naftaleno-degradar en un plsmido recombinante pRKJ3 de la
de tipo salvaje Ps. putida RKJ1 (Samanta et al. 1998). Se encontr que los
genes naphthalenedegrading que se encuentra en un fragmento de 25 kpb
EcoR1 de un plsmido 83 kpb de tipo salvaje anfitrin Ps. putida RKJ1. El
fragmento de ADN de 25 kpb se clona en un vector de amplio rango de
husped de csmido pLAFR3 (Straskawicz et al. 1987) que se form el
plsmido recombinante pRKJ3 (Samanta et al. 1998). a continuacin, se
introdujo este plsmido en dos huspedes compatibles genticamente Ps.
putida RKJ5 (cepa plsmido-curado de Ps. putida RKJ1) y Ps. putida KT2442
(Franklin et al., 1981), y dos indol productoras de Correspondencia a: RK Jain,
Laboratorio de Biotecnologa Ambiental, Instituto de Microbial Technology,
Sector-39 A, Chandigarh-160 036, India (e-mail: RKJ @ Imtech. ernet.in). Las
letras en Applied Microbiology 2000, 31, 5Y9 = 2000 La Sociedad para la
Microbiologa Aplicada cepas de E. coli, es decir, TB1 (Li et al. 1979) y AB1157
(Bachmann 1972) por conjugacin usando E. coli pRK2013 como cepa auxiliar
(Jain et al. 1984). El medio de sales minerales (MSM) utilizado en el presente
estudio era mismo que el descrito anteriormente (Rani et al. 1996). Naftaleno,
salicilato de isopropilo y - (- D-tiogalactopiransido (IPTG) se aadieron al
medio basal ya sea solo o en combinacin, con el fin de inducir los genes
plasmidencoded En el caso de los medios suplementados con naftaleno, el
MSM se prepar de naftaleno. (Strandberg et al. 1986). salicilato y IPTG se
aadieron agua destilada saturada a los medios a una concentracin final de 2
mmol Ly1 y 1 mmol Ly1, respectivamente, para los propsitos de induccin.
con el fin de detectar la produccin de ndigo, los cultivos de siembra fueron se
inocularon en 100 ml de medio respectivo y se incubaron a 30C bajo
condiciones de agitacin (200 min1 rev). A mediados de la fase logartmica de
crecimiento, se aadi indol en los medios de comunicacin fermentada a una
concentracin final de 2 mmol Ly1. Los cultivos se incubaron adicionalmente
durante hasta 12 h bajo las mismas condiciones hasta pigmentos azules
aparecieron en el caldo de cultivo.
La purificacin e identificacin de ail e indirubina
Los pigmentos de todo el caldo de cultivo se extrajeron por el mtodo de Hill et
al. (1989) con algunas modificaciones. El caldo de cultivo conjunto se mezcl y
se agit con un volumen igual de cloroformo en un embudo de separacin. La
mezcla se centrifug a 16 200 g durante 20 min y la capa de cloroformo se
separ y se evapor a sequedad en un fondo redondo ASK usando un
evaporador rotatorio. Los pigmentos secos se suspendieron entonces en
cloroformo. La mezcla de pigmento as obtenido se someti a cromatografa en
capa analtico as como preparativa (gel de slice 60 F254 de placas 20 (20 cm,
Merck, Darmstadt, Alemania), junto con ndigo estndar como se describe por
Hart et al. (1992) con alguna Modficacion el disolvente utilizado de ejecucin
fue cloroformo-metanol.. (15: 1) los pigmentos separados fueron recuperados
de las placas de slice de la misma manera como se ha descrito por Hart et al
(1992) y adems analizado por espectrometra de cromatografa de gases-
masas (GC -MS). El GCMS anlisis se llevaron a cabo usando un Shimadzu
QP5000 GCMS (Tokio, Japn) equipado con un filter de masas cuadrupolar y
columna capilar DB-1 (100% dimetil polisiloxano) (30 m 025 mm) con un
espesor lm de 025 mm (J & W, Tokio, Japn). Otras condiciones fueron de
ionizacin por impacto electrnico de 70 eV, escanear intervalos de 15 s y
rango de masa 40 500. La temperatura del horno fue de 150 C durante 5
min con 10 aumento C por minuto hasta una temperatura final de 300 C
durante 5 min, la temperatura del inyector fue kep t en 250.
Cintica de la formacin de ndigo
La biomasa celular utilizada en el presente estudio se obtuvo haciendo crecer
el cultivo bacteriano durante la noche en MSM (descrito anteriormente), la
cosecha a 4 C por centrifugacin, lavado con MSM y se suspende en el mismo
medio a una concentracin de 1 mg ml1 biomasa seca . Las tasas especficas
de la formacin de ndigo por varias bacterias se determinaron por el mtodo
de O'Connor y Hartmans (1998) excepto que la concentracin indol final
utilizado en la mezcla de ensayo fue de 0,50 mmol Ly1. Las muestras se
tomaron cada 10 min durante un mximo de 60 min. La tasa especfica de la
formacin de ndigo se calcul a partir del aumento en la DO a 610 nm con el
tiempo. Con el fin de determinar la Km aparente y las tasas mximas de
formacin de ndigo por diferentes bacterias, las tasas especficas de formacin
de ndigo se determinaron a diferentes concentraciones de indol a partir de 0,1
mmol l-1 a 1,0 mmol l-1. El tiempo de ensayo se mantuvo constante a 10 min.
Los valores de Km aparente se calcularon a partir de las curvas de Michaelis-
Menten dibujadas entre la concentracin y ail tasas de formacin de indol. Las
tasas mximas de formacin de ndigo se calcularon a partir de la grfica de
Lineweaver-Burk dibujado por separado para cada bacteria. Todos los
experimentos excepto la purificacin de pigmentos ndigo se realizaron de
forma independiente por triplicado y los resultados dados aqu son la media de
los tres. Las desviaciones estndar estaban dentro se realiz la inyeccin de
15% C. A splitless.

productos qumicos
Indol, ndigo, naftaleno, salicilato e IPTG fueron adquiridos de Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO, EE.UU.. Todos los dems productos qumicos eran de la ms
alta calidad disponible en el mercado.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Los cinco bacterias utilizadas en el presente estudio produjeron dos tipos de
pigmentos, es decir, azul (pigmento 1) y prpura (pigmento 2). Los valores de
Rf de pigmentos 1 y 2 de los cinco bacterias en cromatografa de capa fina
(TLC) fueron 079 y 052, respectivamente, utilizando cloroformo-metanol (15: 1)
como la mezcla de disolventes. El valor Rf de pigmento 1 coincide exactamente
con la de autntico ail. La identificacin adicional de los pigmentos se llevaron
a cabo utilizando la tcnica GC-MS. Los tiempos de retencin de pigmentos 1 y
2 eran 2,212 y 2,157 min, respectivamente, en GC-MS analiza. Los m / zvalues
(intensidad relativa, [composicin propuesta de iones]) de iones principales
que se encuentran en el espectro de masas de pigmento 1 fueron 262 (100,
[M] ??), 234 (24, [M-CO] ??) , 205 (37, [MCO-CHO] ??), 179 (9, [MCO-CO-
C2H2] ??), 151 (7), 131 (14, [M / 2] ??), 104 (48, [M / 2-HCN] ??) y 76 (53, [M /
2- CO-HCN] ??) que se corresponda exactamente el espectro de masas de la
autntica ndigo (datos no mostrados). Por otro lado, el espectro de masas de
pigmento 2 fue 262 (100, [M] ??), 234 (33, [M-CO] ??), 205 (31, [M-CO-CHO] ??)
, 179 (43, [M-COCO-C2H2] ??), 151 (8), 131 (18, [M / 2] ??), 104 (53, [M / 2-
HCN] ??) y 76 (49, [M / 2-CO-HCN] ??) que exactamente se corresponda con el
espectro de masas de indirubina publicado anteriormente por Eaton y
Chapman (1995). Aunque ail y indirubina se produjeron simultneamente a un
grado variable por todas las cepas bacterianas utilizadas aqu, slo hemos
descrito la cintica de la produccin de ndigo. Los resultados obtenidos de los
estudios de formacin de ndigo, despus de la induccin con naftaleno,
salicilato, IPTG, naftaleno ?? IPTG y salicilato ?? IPTG, revel que en el caso de
los de tipo salvaje de Ps. putida RKJ1, todas las condiciones de induccin,
excepto IPTG, estimul la produccin de ndigo significativamente
(Fig. 1a). Por otro lado, las clulas de $ recombinante. putida RKJ5 / pRKJ3 (Fig.
1b) y Ps. putida KT2442 / pRKJ3 (Fig. 1c), en todas las condiciones de induccin,
produjo ndigo en mayor medida en comparacin con sus respectivas clulas
no inducidas. Aunque no haba una diferencia significativa entre la produccin
de ndigo por las clulas inducidas y no inducidas de TB1 de E. coli / pRKJ3 (Fig.
1d) y E. coli AB1157 / pRKJ3 (Fig. 1e), se observ que estas dos cepas producen
ndigo hasta 20 25 veces ms que la de tipo salvaje y $ recombinante. cepas
putida
(Fig. 1). Tambin se determinaron las tasas especficas de formacin de ndigo
por diferentes cepas. Se encontr que la velocidad mxima de formacin de
ndigo por la de tipo salvaje Ps. putida RKJ1 inducida con naftaleno era 060
nmol min1 mg biomass1 seco, mientras que, la tasa mxima de la formacin
de ndigo obtenido a partir de cepas recombinantes Ps. putida RKJ5 / pRKJ3, E.
coli TB1 / pRKJ3 y E. coli AB1157 / pRKJ3 fueron 13, 20 y 25 veces mayores,
respectivamente, en comparacin con Ps. putida RKJ1 (Tabla 1). Puesto que los
padres de cepas de
E. coli recombinantes eran capaces de producir indol a partir de triptfano, la E.
coli TB1 recombinante / pRKJ3 y cepas de E. coli AB1157 / pRKJ3 producen
ndigo directamente desde

Fig.- 1 curva de progreso de la formacin de ndigo por Pseudomonas putida

RKJ1 (a), Ps. putida RKJ5 / pRKJ3 (b), Ps. putida KT2442 / pRKJ3 (c), Escherichia
coli TB1 / pRKJ3 (d) y E. coli AB1157 / pRKJ3 (e). Smbolos para las diversas
condiciones utilizadas: clulas no inducidas (W), clulas naphthaleneinduced
(*), las clulas-salicilato inducida, las clulas inducidas por IPTG, naftaleno
IPTG induce clulas (&), salicilato de clulas IPTG inducidas (&). Todos los
experimentos se realizaron de forma independiente por triplicado y los
resultados aqu presentados son la media de los tres. Las desviaciones
estndar fueron dentro del 15%
Tabla 1 Velocidad de formacin de ndigo por varias bacterias
medio nutriente. Como es evidente a partir de la Tabla 1 los Ps recombinante.
putida RKJ5 / pRKJ3 mejor la tasa de formacin de ndigo a partir de indol en
hasta un 30% en comparacin con su cepa de tipo salvaje Ps. putida RKJ1.
Adems, las tasas de formacin de ndigo a partir de indol por las cepas de E.
coli recombinantes fueron casi 25 veces mayor en comparacin con la de Sal
clonado. cepas putida (Tabla 1), que podra ser debido a la mejor expresin de
los genes responsables de la produccin de ndigo en cepas de E. coli
comparados con los Ps. putida cepas que son de otro modo genticamente
anfitriones ms compatibles. Esto puede ser debido al hecho de que los genes
que codifican la produccin de indol en cepas de E. coli pueden estar actuando
sinrgicamente con los genes que codifican el proceso de biotransformacin de
indol a ail. El estudio revel que en general E. coli AB1157 / pRKJ3 era el ms
eficiente de los anfitriones probados para la expresin de genes codificadas por
plsmidos para la produccin de ndigo y indirubina obtenido originalmente de
Ps. putida RKJ1. Por el contrario, O'Connor y Hartmans (1998) han informado de
la regulacin a la baja de los genes de Pseudomonas que codifican dioxigenasa
naftaleno en E. coli constructos que a su vez dieron como resultado menores
tasas de formacin de ndigo por este ltimo. Los valores de Km aparente de la
formacin de ndigo de Ps. putida RKJ1, de Ps. putida RKJ5 / pRKJ3, de Ps. putida
KT2442 / pRKJ3, E. coli TB1 / pRKJ3 y E. coli AB1157 / pRKJ3 se determinaron
como 0.22, 0.15, 0.10, 0.21 y 0.20 mmol l -1, respectivamente. Los valores de
Km aparente de la formacin de ndigo como determinados a partir de curvas
de Michaelis-Menten indicaron que una concentracin ms alta indol (> 0,5
mmol Ly1) es txico para las bacterias que impiden de este modo la
biotransformacin de indol a ail. Las tasas mximas de formacin de ndigo
calculada a partir del grfico de Lineweaver-Burk fueron 0,60, 0,90, 0,60, 1,00
y 1,40 nmol min1 mg biomasa-1 seco, respectivamente. Las tasas mximas
de formacin de ndigo se exhibieron por E. coli AB1157 / pRKJ3 que era casi
dos veces mayor que la dada por de tipo salvaje Ps. cepa putida, y 15 2
veces mayor que la propuesta por el Sal recombinante. cepas putida. No hay
datos similar est disponible en la literatura para la comparacin de valores de
Km aparente y las tasas de formacin de ndigo a partir de cepas
naphthalenedegrading. formacin Indigo bajo diferentes condiciones de
induccin tambin revel que ambas cepas de E. coli producen ndigo de
manera ms eficiente que los Ps. putida cepas bajo todas las condiciones,
especialmente cuando las clulas fueron inducidas con salicilato ?? IPTG.

EXPRESIONES DE GRATITUD
Los autores agradecen a la Sra Gitika Maingi para la asistencia tcnica y el Sr.
Ashvini Chauhan para un debate fructfero. Este trabajo fue apoyado por el
CSIR y DBT, Gobierno de la India. Esta es la comunicacin IMTECH no. 045/99.
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