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UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE

CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA


INGENIERA EN BIOTECNOLOGA
BIOLOGA MOLECULAR III

INTEGRANTES:
CRISTHIAN BENALCAZAR
SHARON ORTIZ
GEOVANNA PUCHAICELA
PATRICIA TORRES
FECHA: 09-05-2017
NRC: 4162

TEMA: Enzimas de restriccin (SmaI)

SmaI
La enzima de restriccin SmaI fue extrada por primera vez del bacilo gramnegativo Serratia
marcescens perteneciente a la familia de las enterobacterias. Pertenece a las enzimas de
restriccin de Tipo II, es decir, corta ambas cadenas de DNA y utiliza como cofactor Mg 2+.
Tiene la caracterstica de reconocer una secuencia corta (5 CCCGGG 3), no metilada,
palndromas y realizar un corte de tipo romo mediante una actividad cataltica hidrolasa.
(REBASE , s.f.)

Imagen 1. Captura de pantalla. Programa bioinformtico Rebase. Descripcin de la enzima SmaI. Enz Num 1704.
(REBASE , s.f.)
Imagen 2. Captura de pantalla. Programa bioinformtico BioLabs. Enzimas que reconocen la secuencia
5 CCCGGG 3. (BioLabs, s.f.)

Comercialmente, Smal no es la nica enzima que reconoce la secuencia 5 CCCGGG 3, al


contrario, otras cinco enzimas reconocen la misma secuencia, sin embargo, Smal es la nica que
realiza un corte romo en lugar de cohesivo o pegajoso. Adems, en esta fuente s especifica que
la fuente del producto es una cepa de Escherichia coli que lleva un gen de Smal de S.
marcescens. Tambien, de acuerdo a la casa comercial, se especifican las condiciones de
incubacin, almacenamiento, tiempo de vida media y buffer correspondiente. (BioLabs, s.f.).
Por ejemplo:

Imagen 3. Captura de pantalla. Programa bioinformtico BioLabs. Descripcin de las propiedades y uso de la enzima
Smal. (BioLabs, s.f.)
APLICACIONES

Terapia gnica para la enfermedad mitocondrial mediante la entrega de la enzima


de restriccin SmaI en las mitocondrias
La endonucleasa de restriccin SmaI se ha utilizado para el Diagnstico de debilidad muscular
neurognica, ataxia y Retinitis pigmentosa o enfermedad de Leigh, que es causada por la
mutacin Mt8993T G lo que resulta del remplazo de una Leu156Arg que bloquea la
translocacin del protn de la subunidad a de F0F1-ATPasa.
El objetivo del paper es aplicar SmaI a la terapia gnica para esta enfermedad, ya que el mutante
mitocondrial ADN (mtDNA) coexiste con el tipo salvaje, y porque slo el mutante mtDNA,
pero no el tipo salvaje mtDNA, es Selectivamente restringido por la enzima.
Para este propsito de los analisis, se expres el gen SmaI combinando a un gen mitocondrial, la
secuencia de orientacin en los hbridos que llevan el mutante mtDNA donde, se demostr la
enzima SmaI eliminaba especficamente de la mtDNA mutado.
Esta eliminacin se sigui con la repoblacin por el mtDNA de tipo salvaje, lo que resulta en la
restauracin de la normal ATP intracelular y el potencial de membrana mitocondrial.
Los defectos en este genoma son ahora reconocidos como causas importantes de diversas
enfermedades y pueden tomar la forma de mutaciones puntuales o reordenamientos. No hay el
tratamiento eficaz para los pacientes con mutaciones de ADNmt en la actualidad.
Estos resultados dependieron de las clulas satelitales libres de mutantes, que podran ser
estimuladas para volver a entrar en el ciclo celular y fusionarse con las miofibras existentes en
respuesta a las seales de crecimiento muscular o reparacin.
Materiales y mtodos
Se obtuvieron fibroblastos de piel de un paciente con enfermedad de Leigh que portaba la
mutacin Mt8993T G.
Se establecieron dos lneas celulares cbridos: NARP3-1 con una alta relacin mutante mtDNA
98%., NARP3-2 con una baja relacin mutante mtDNA 60%.
Construccin de plsmidos para entregar endonucleasas de restriccin en mitocondrias
El gen de SmaI se amplific por PCR a partir del ADN total aislado de Serratia marcescens
mediante el uso de los cebadores: apaI-xhoI-SmaI-U (5) -gag ccc ctc gag CAA GCA GGG ATG
ACC AAC TC-3)) y BamHI-SmaI-L (5) -gga tcc ATT GGG CCC GAG GCG GCG GTA GAA
TAA AA-3)).
El gen para EcoRI se amplific mediante el uso de los cebadores:
apaI-xhoI-EcoRI-U (5) -gag ccc ctc gag CAT CTAATA AAA AAC AGT CA-3) ) y bam HI-
EcoRI-L (5) -gga tcc ATT GGG CCC GCT TAG ATG TAA GCT GTT CA-3)).
Los genes fusionados se amplificaron por PCR, luego se subclonaron en el plsmido pCR2.1-
TOPO, donde los genes de fusin combinados se insertaron finalmente en el EcoRI.
Transfeccin y seleccin de clulas transfectadas
Las clulas se cultivaron a 37C bajo una atmsfera de 5% de CO2 y 95% de aire.
Durante 2-3 das y luego se usaron para el siguiente ciclo de transfeccin y seleccin.
Resultados
Primero estableci la lnea celular cbrida NARP3-1 por transferencia citoplasmtica de
mitocondrias de fibroblastos de un paciente con enfermedad de Leigh en la lnea celular de
carente de ADNmt.
El NARP3-1 hibrido tena un alto porcentaje de mutantes mtDNA aproximadamente el 98%.
El contenido de ATP de los cbridos NARP3-1 era 70% de la de las clulas 143B que portaban
el mtDNA de tipo salvaje.
Luego insertamos este gen fusionado en un vector de expresin de mamfero (pMACSKkII),
como se ilustra en la figura 1.

Figura 1. Un esquema de la nueva estrategia para la terapia gnica de la enfermedad NARP causada por la mutacin Mt8993T G.

Cuando Se transfect el NARP3-1 cybrids con el plsmido que contiene el gen fusionado
(pMACSKkII-pCoxIV-SmaI), el mutante mtDNA fue eliminado por completo, y slo una
pequea cantidad de mtDNA de tipo salvaje se detect (Figura 2, da 2).

Debido a que la cantidad de ADN total aplicada a cada carril de la figura 2 era la misma, la
seal de transferencia de Southern en cada muestra refleja el contenido de ADNmt en clulas
individuales.
Estos resultados indican que las enzimas de restriccin importadas en las mitocondrias son
segregadas con seguridad dentro del compartimiento de la matriz mitocondrial sin atacar el
ADN nuclear, al menos en las condiciones de cultivo celular usadas aqu.
Para confirmar si la expresin transitoria de las endonucleasas de restriccin dirigidas a las
mitocondrias puede aplicarse de forma segura para terapia in vivo, se introdujeron dos tipos de
plsmidos, uno que expresaba -galactosidasa y el otro que expresaba EcoRI dirigido
mitocondrialmente, en hmster.

Bibliografa
BioLabs. (s.f.). Smal. Obtenido de https://www.neb.com/products/r0141-smai
REBASE . (s.f.). SmaI. Obtenido de The Restriction Enzyme Database:
http://rebase.neb.com/rebase/enz/SmaI.html
Tanaka, M., Borgeld, H. J., Zhang, J., Muramatsu, S. I., Gong, J. S., Yoneda, M., ... & Shamoto,
M. (2002). Gene therapy for mitochondrial disease by delivering restriction endonuclease SmaI
into mitochondria. Journal of biomedical science, 9(6), 534-541.

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