UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

SEGUNDA ESPECIALIZACION EN MICROBIOLOGIA

CURSO: INMUNOMICROBIOLOGIA
II UNIDAD

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Dr. Pedro Mercado Martnez 1

 Anticuerpos: Estructura general

En mamferos existen cinco clases de Ig: M, G, A, D y E.

Bsicamente, la molcula de Ac consta de dos tipos de
cadenas: 2 ligeras idnticas y 2 pesadas idnticas.

Se han identificado dos tipos de cadena liviana, kappa (k )

y lambda (l ), y cinco clases de cadena pesada, mu (m ),
gamma (g ), alfa (a ), delta (d ) y psilon (e ).
Las cadenas pesadas establecen interacciones no
covalentes y covalentes (del tipo SH-) entre s y con las
cadenas livianas.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 2

 Anticuerpos: Estructura general

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 3

 Se han identificado dos tipos de dominio en las cadenas Ig:
el dominio variable (V) y el dominio constante (C).
Tanto la cadena liviana como la pesada poseen un dominio
variable designados VL y VH, respectivamente.

La cadena liviana posee un dominio constante (CL), y la

cadena pesada tres o cuatro dominios constantes (CH1,
CH2, CH3, CH4), dependiendo de la clase de Ig.
Los dominios VL y VH se conjugan en un mdulo funcional
denominado Fv, en el cual se encuentra el sitio de
reconocimiento del antgeno o paratopo.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 4

 Mediante la comparacin de secuencias de aminocidos
disponibles para numerosos dominios VL y VH, ha sido
posible identificar tres sitios en cada dominio V,
denominados regiones hipervariables.

Estas regiones contienen los residuos principales que

conforman el paratopo y, por ello, tambin se les conoce
con el nombre de regiones determinantes de
complementariedad (RDC).
Las RDC se encuentran flanqueadas por regiones de
menor variabilidad designadas marco (M) .
Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 5
 Anticuerpos: Estructura general

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 6

 Anticuerpos: Estructura general

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 7

 Son tres regiones (CDR1, CDR2 y CDR3) de
Secuencia de Aminocidos en la Regin Variable de
Inmunoglobulina que son altamente divergentes.
Juntas las CDRs de las cadenas leves y pesadas de
inmunoglobulina forman una superficie que es
complementar al antgeno.
Estas regiones estn tambin presentes en otros
miembros de la superfamilia de Inmunoglobulinas, por
ejemplo, receptores de clula T (TCR).

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 8

 En humanos, se ha estimado que el proceso de rearreglo
gnico de los segmentos V, D, y J, (adicin de nuevos
nucletidos e inversin) y uso simultneo de varios
segmentos D, tiene la potencialidad de generar 104
dominios VL y 108 dominios VH diferentes, pudiendo
combinarse aleatoriamente para generar hasta 1012
molculas de anticuerpo con especificidades diferentes.

Este gigantesco repertorio permite al sistema inmune

humoral disponer de la capacidad para reconocer y
responder prcticamente ante cualquier reto antignico.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 9

 Anticuerpos monoclonales de primera generacin

Los Acs. policlonales, o antisueros, son poblaciones

complejas de Ac, formadas por distintas clases de Ig en
las que est presente una variedad de especificidades.
Por el contrario, Ac. monoclonal (AcMo) es una poblacin
de Ac, todas idnticas, las cuales consecuentemente,
poseen todas la misma especificidad.

De lo anterior se desprende que, en una prueba analtica,

el chance de obtener falsos positivos, es decir,
"reconocer lo que no es como si lo fuera" es mucho
menor cuando se usan reactivos monoclonales.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 10

 En 1975, en un trabajo que posteriormente les vali el
premio Nobel, G. Kohler y C. Milstein demostraron la
posibilidad de producir AcMo mediante la fusin de
linfocitos B con clulas clulas tumorales inmortales.

Ellos demostraron que los hbridos resultantes de tal

fusin heredan la capacidad para crecer
indefinidamente en cultivo y para producir anticuerpos,
y que, adems, es posible aislar del producto
heterogneo de fusin aquellos hbridos secretores del
anticuerpo en el cual se est interesado.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 11

 As nacieron los AcMo, posteriormente denominados de
primera generacin, para distinguirlos de los anticuerpos
producidos mediante tcnicas de ADN recombinante, que
han sido llamados de segunda generacin.

El proceso se inicia con la inmunizacin de ratones de

laboratorio (cepa Balb/c) con el antgeno (varios eptopos)
para el cual se desea producir los anticuerpos.
Se obtiene el bazo, en el cual se encuentra una poblacin
numerosa de linfocitos B.
A continuacin, los esplenocitos se fusionan con clulas
mielomatosas inmortales.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 12

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 13
 El producto de la fusin es denominado hibridoma,
quienes heredan caractersticas fenotpicas de ambas
clulas parentales de manera tal que son capaces de
crecer indefinidamente y de producir el anticuerpo
codificado en los genes del esplenocito pariente.

La poblacin de hibridomas obtenida es heterognea en

cuanto a los anticuerpos secretados por ella.
(dependiendo de los eptopos del Ag.)
Con el objeto de seleccionar los hbridos productores
del anticuerpo de inters se realiza clonacin celular.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 14

 Esta clonacin consiste en sembrar los hibridomas en
microcultivos a una densidad celular tan baja que se
garantiza que las clulas integrantes de la poblacin
obtenida en cada microcultivo sean todas idnticas, es
decir, conformen un clon.

Los anticuerpos secretados por estas poblaciones

clonales de hibridomas son anticuerpos monoclonales.
Estos son analizados para conocer su capacidad de
unirse a un antgeno determinado, por ejemplo mediante
un ELISA, para seleccionarse y aislarse de la manera
ms efectiva.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 15

 Seleccin de hibridomas

Despus de la fusin se tiene 3 tipos celulares, LB,

mielomas y los hibridomas.
Los LB del bazo de ratn (con baja viabilidad) se fusionan
con clulas de mieloma deficientes en enzimas
implicados en la sntesis del nuevo ADN como
la timidina quinasa (TK) y la hipoxantina guanina
fosforibosil transferasa (HGPRT).

Los hibridomas son cultivados en medio HAT (de

hipoxantina, aminopterina y timidina) donde las clulas
mielmicas son eliminadas.
Solamente pueden crecer en el medio de cultivo HAT los
hibridomas.
Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 16
 En lo concerniente a aplicaciones biomdicas, los
AcMo de 1ra generacin han desplazado a los
anticuerpos policlonales y han permitido el desarrollo
de numerosas pruebas diagnsticas y son los
reactivos de eleccin para aplicaciones analticas,
tanto en el mbito de lo mdico-clnico como en
distintas reas de la investigacin en biociencias.

Lo anterior es cierto para todo aquello relacionado

con pruebas de laboratorio "in vitro", tanto en clnica
como en investigacin.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 17

 Por desgracia, el uso de AcMo, con intenciones
teraputicas en humanos ha encontrado obstculos
importantes, es que se trata de protenas extraas para
el ser humano (provienen de mridos: ratn o rata).

Hay molculas humanas, como los aloantgenos del

CMH y los Ags del sistema Rh, que no son distinguidos
por el SI de los roedores y, en consecuencia, no es
posible producir AcMo de utilidad prctica, con
especificidad, por estos antgenos.
Estas y otras son las razones por lo que se ha
introducido el uso de los AcMo de segunda generacin.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 18

 AcMo de segunda generacin

Los AcMo de segunda generacin, o anticuerpos

recombinantes (AcR), son molculas producidas
empleando tcnicas de biologa molecular y ADN
recombinante.
Dicho de otra manera, los AcR son generados a travs de
la inmortalizacin de los genes que codifican a la
molcula de Ig, en lugar de inmortalizar la clula
productora del Ac, como es el caso para los AcMo de
primera generacin.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 19

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 20
 De esta forma, es hoy posible clonar una pareja de
regiones VH y VL, responsables de una especificidad de
inters, y ensamblarla en la forma de un anticuerpo
funcional en el contexto de, prcticamente, cualquier
clase o subclase de Ig humana.
En la actualidad, usando la tcnica de desplegamiento de
Ac en fagos filamentosos ofrece una de las vas ms
poderosas para la creacin de Ac humanos artificiales
con inmunogenicidad reducida.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 21

 Los AcR constituyen un conjunto heterogneo de
protenas artificiales en el que se pueden
distinguir dos grandes grupos.

El primero incluye molculas completas de Ac, similares

a las conseguidas en forma natural, en las cuales estn
presentes los dos elementos estructurales, permitiendo
as la funcionalidad de la molcula; esto es, las porciones
Fab y Fc.
Los Ac quimricos y humanizados son ejemplos
representativos de este grupo.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 22

 El otro grupo est formado por un conjunto ms
heterogneo de protenas noveles, basadas en la
estructura de las Ig.
stas pueden encontrarse en la forma de entidades
recombinantes autnomas (fragmentos tipo Fab, Fv de
cadena sencilla -scFv-, "diabodies", "triabodies", etc.), o
como protenas de fusin (molculas en las que se
combina la porcin Fc o Fab con propiedades nuevas
provistas por una toxina, una enzima, un receptor celular,
una citoquina, etc.).

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 23

 Anticuerpos quimricos

Un anticuerpo quimrico (AcQ) es una molcula artificial

en la cual, las porciones constantes de las cadenas
pesada y liviana provienen de una Ig humana y las
regiones variables VH y VL son obtenidas de un AcMo
mrido.
El objetivo perseguido con la construccin de un AcQ es
reducir la inmunogenicidad para el humano de los AcMo
de ratn o rata, pero sin afectar la especificidad del Ac.
Es conocido que las porciones ms inmunognicas de la
molcula de Ig estn asociadas a la porcin constante de
la molcula, en particular a la regin Fc.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 24

 Anticuerpos quimricos

Al reemplazar estas regiones por las equivalentes de

origen humano se busca que la molcula resultante sea
menos "extraa" para los seres humanos y as facilitar su
uso in vivo para la profilaxis y tratamiento de
enfermedades humanas.
Adicionalmente, ya que la fisiologa, catabolismo y las
funciones efectoras de un Ac estn asociadas al
fragmento Fc, los AcQ debieran comportarse en forma
ptima al ser administrados en humanos.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 25

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 26
 El procedimiento implica la clonacin de los genes VH y VL
mridos y la insercin de los genes clonados en vectores de
expresin eucariota a los que, previamente, se ha
incorporado los genes codificadores de la porcin constante
de las cadenas pesada y liviana humanas.
Estos vectores son finalmente transfectados en forma
estable en una lnea celular seleccionada.
La clonacin de los genes VH y VL se realiza mediante RT-
PCR utilizando como molde ARN total o ARN mensajero
(ARNm) obtenido de un hibridoma secretor de la
especificidad de inters.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 27

 Anticuerpos humanizados

En los AcQ las regiones V mridas se mantienen

inalteradas de forma que la especificidad y la afinidad
de la molcula resultante no se afectan.
Desgraciadamente, algunas molculas quimricas an
son capaces de inducir una respuesta inmune humoral
cuando son administradas en humanos.
Esta inmunogenicidad "residual" ha sido atribuida a la
presencia de eptopos forneos presentes en las RDC y
en las regiones M de los dominios V mridos del AcQ

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 28

 Un paso adelante para reducir la inmunogenicidad de los
AcMo mridos, lo constituy la creacin de los Ac
humanizados (AcH).
La tecnologa para la produccin de AcH se basa en el
supuesto de que el sitio de combinacin al antgeno, el
partopo, se forma a partir de la combinacin espacial de
las asas hipervariables que corresponden a las RDC,
mientras que las regiones M slo funcionan como un
andamio cuya nica funcin es servir de soporte
estructural al partopo.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 29

 Asumiendo esto como cierto en la elaboracin de un AcH,
las RDC de un anticuerpo mrido son transplantados en
el contexto de regiones M humanas, formndose as una
regin V hbrida ratn-humano y confirindole la
especificidad deseada a una molcula que en el resto de
su estructura es completamente humana.
La ventaja de esto es que los eptopos asociados a las
regiones M mridas, los cuales estn presentes en los
AcQ, no se encuentran en los AcH.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 30

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 31
 Para producir un AcH es necesario conocer la secuencia
entera de los dominios V mridos y la localizacin de las
secuencias de ADN correspondientes a las 3 RDC
mridas.
Esta informacin se usa para disear y crear genes V
sintticos en los cuales, las RDC mridas son
combinadas con regiones M humanas seleccionadas,
cuidadosamente, en funcin de su parecido con las
correspondientes regiones M mridas.

Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 32

 A continuacin, los genes V "humanizados" se insertan en
vectores de expresin adecuados que contienen el resto
de la informacin estructural necesaria para la sntesis de
una cadena Ig humana liviana o pesada.
El resto es similar a lo ya descrito para los AcQ.
Dr. Pedro Mercado Martnez Inmunomicrobiologa UNPRG 33
 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Abbas, A.; Lichtman, A.; Pillai, Ch. 2008. Inmunologa

Celular y Molecular. 6ta. Edic. Edit. ELSEVIER
Espaa.
Rojas Espinosa O. 2006. Inmunologa. 3ra. Edic. Edit.
Mdica Panamericana.
Regueiro Gonzlez J: Lpez Larrea C; Gonzlez
Rodrguez S; Martnez Naves E. 2011. Inmunologa
Biologa y patologa del sistema inmunitario 4 edicin
revisada Edit. Mdica Panamericana.

Dr.
Dr.Dr.
Dr.
Dr. Pedro
Pedro
Pedro
Pedro
Pedro Mercado
Mercado
Mercado
Mercado
Mercado Martnez
Martnez
Martnez
Martnez
Martnez Inmunologa
Curso Mdica
Inmunologa Bsica
Inmunologia
Complementos UNPRG-FCB
USMP-FN
- USMP
Inmunomicrobiologa
Inmunologa UNPRG
UNPRG-EPG 34