Introduccin

En microbiologa el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que

proporciona importante informacin para la identificacin temprana y definitiva
de los microorganismos. En la valoracin de las muestras, es trascendente el
poder de resolucin del microscopio, el cual se define como la capacidad que
posee un objetivo para distinguir la distancia mnima entre dos puntos del
objeto para que se puedan visualizar como dos puntos separados. El poder de
resolucin de un objetivo es el responsable de la calidad, claridad, nitidez y
fineza detallada de la imagen, y depende de la longitud de onda () del haz de
luz utilizado y de la apertura numrica del objetivo empleado. El mximo poder
de resolucin en un microscopio de luz emitida es de 0.2 m, por lo que se
requiere de una amplificacin entre 1000-1400x, mientras que el poder de
resolucin del ojo humano es de aproximadamente 0.2 mm. Para aprovechar
esta ventaja de los microscopios, se han desarrollado tcnicas tintoriales que
destacan las caractersticas morfolgicas de los microorganismos. Existe una
gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del campo de la
microbiologa.
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a clulas,
tejidos, fibras, etctera. De acuerdo con su origen, se pueden dividir en:
colorantes naturales, los cuales son extrados de plantas o animales, y
colorantes artificiales, que son aquellos de minerales procesados y
manipulados en el laboratorio. Qumicamente, el colorante est constituido de
un componente cromforo y un auxcromo. El cromforo es todo grupo aislado,
covalente e insaturado, que tiene una absorcin caracterstica en la regin
ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la capacidad que tiene la
molcula para que sus electrones absorban energa o luz visible, se exciten y
emitan diversos colores de acuerdo con la longitud de emitida como resultado
del cambio en el nivel energtico. Cabe mencionar que esta longitud de onda
corresponde al rango de espectro visible. Los cromforos se pueden presentar
en dos formas fundamentales: en sistemas conjugados pi o complejos
metlicos. Los cromforos son principalmente grupos funcionales con dobles y
triples enlaces carbono-carbono, anillos aromticos, grupos carbonilos, imino,
diazo, nitro y enlaces entre carbono-y (y es un tomo con pares libres).Los
aux- cromos son grupos funcionales o radicales que constituyen una molcula
y poseen carga parcial positiva; tienen la funcin de intensificar la formacin
de color mediante la accin de grupos de tomos no saturados; su funcin es
desplazar a los cromforos hacia longitudes de ondas largas para aumentar la
intensidad. Los siguientes grupos funcionales son considerados auxcromos:
grupo metilo, halgenos, hidroxi, alcoxi y amino.4,5 Aunque los
microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al
microscopio ptico, la mayora de las veces es necesario teirlos para que, por
medio del uso de colorantes, sea mucho ms fcil su identificacin, adems, la
presencia de ciertas estructuras, as como su reaccin a determinadas
tcnicas, nos permite clasificar a las bacterias. As pues, los colorantes tienen
las siguientes funciones:
1.Permiten hacer visibles a los objetos microscpicos y transparentes.
2. Revelan su forma y tamao.
3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.
4. Producen reacciones qumicas especficas.
Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tie
del mismo color y se utiliza un slo colorante (azul de lactofenol o tinta china);
tincin diferencial, cuando se visualiza ms de un color porque se utiliza ms
de un colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tincin especfica, cuando se utilizan
anticuerpos marcados con una molcula fluorescente para identificar una
estructura celular en particular (inmunocitoqumico). El control de calidad de
los mtodos tintoriales es importante, ya que as se asegura que la preparacin
de la muestra haya sido adecuada, por lo que se recomienda realizar al mismo
tiempo de la evaluacin de la muestra clnica, la tincin de un agente
infeccioso ya identificado mediante esa tincin, el cual funcionar como un
control positivo. Algunas tcnicas tintoriales como Gram o ZiehlNeelsen
requieren antes de su proceso la fijacin de las muestras, con la finalidad de
preservar la arquitectura estructural y qumica de las clulas. Existen dos tipos
de fijadores: fsicos y qumicos. Entre los procesos de fijacin fsicos se tienen
los siguientes: desecacin, calor seco, calor hmedo, ultrasonido y microondas,
mientras que los procesos de fijacin qumicos se pueden clasificar como
oxidantes y reductores, de acuerdo con sus propiedades qumicas. Entre los
agentes qumicos oxidantes se encuentran: xido crmico, cido actico, cido
pcrico, acetona, dicromato de potasio. Los agentes qumicos reductores son:
formaldehdo, glutaraldehdo, etanol, metanol, paraldehdo, etctera. Quiz el
mtodo fsico con mayor utilizacin en microbiologa es el calor seco, que
consiste en exponer directamente la laminilla a la flama del mechero, con esto
se logra detener los procesos vitales de las clulas y los microorganismos. Sin
embargo, la sobreexposicin, o la exposicin en una zona incorrecta de la
flama (zona fra, zona caliente y zona de fusin) repercutir en el efecto
deseado; es muy comn provocar alteraciones morfolgicas y destruccin
celular. Este mtodo preserva el extendido por poco tiempo, por lo que se
recomienda utilizar un mtodo qumico, que precipite protenas, antes de teir.
Los mtodos qumicos ofrecen mejores resultados para la fijacin, ya que son
lquidos con potencial alto de difusin intracelular y detienen procesos enzim-
ticos que provocan autolisis. Los reactivos poseen la capacidad de interactuar
con biomolculas como protenas, glicoprotenas, peptidoglicanos, lpidos,
glicolpidos, lipoprotenas, pigmentos, cidos pcticos y nucleicos. El metanol
es el reactivo que se encuentra al alcance de todos los laboratorios; es un
reactivo reductor, deshidratador, y es clasificado como fijador coagulante, de
tal manera, coagula protenas y las hace insolubles, pero sin desnaturalizarlas.
Se preserva la arquitectura de la pared celular y evita la sobrecoloracin. El
metanol tiene un potencial reductor mayor que el etanol. La concentracin
ideal es > 99%. El metanol preserva la integridad de los cidos nucleicos, por
lo que tambin es ideal para inmunohistoqumica e hibridacin in situ.