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Seminario N4
1. A qu se deben las infecciones respiratorias repetidas?
El sistema ms afectado es el respiratorio. Ello se debe a la obstruccin de los bronquiolos
por un moco espeso que favorece el crecimiento de microorganismos. Este hecho explica
las infecciones respiratorias repetidas por grmenes oportunistas.

2. A qu se debe la elevacin de Cloro en el sudor?

La alteracin en las glndulas sudorparas conduce a la presencia de un exceso de cloruro
de sodio en el sudor, sta prdida de sales es responsable de una deshidratacin aguda
en caso de exposicin al calor. El cloro se eleva ya que la protena CFTR es un
transportador de cloruro con capacidad de respuesta a cAMP (Adenosn monofosfato
cclico), lo que ayud a explicar el contenido alto de cloruro en el sudor en pacientes con
fibrosis qustica.

3. A qu se debe las heces voluminosas y ftidas del paciente?

Las heces voluminosas, grasosas y ftidas es debido a la falta de lipasa pancretica),
como en el presente caso. En 85% de los pacientes se puede observar como alteracin
digestiva una insuficiencia pancretica exocrina (con defecto en la produccin de enzimas)
que conduce a una obstruccin de los canales pancreticos y mala absorcin de protenas.
El estado de esta funcin pancretica exocrina (IP, insuficiencia pancretica o SP,
suficiencia pancretica) es un marcador de gravedad fenotpica siendo ms grave la IP que
la SP.

4. En qu consiste la tcnica del PLFR (Polimorfismo longitudinal de

fragmentos restrictivos)?
El anlisis de la variacin de RFLP en genomas ha supuesto en el pasado una herramienta
fundamental en el mapeo genmico y el anlisis de enfermedades genticas. Cuando los
investigadores pretendan determinar la localizacin cromosmica de una determinada
enfermedad, analizaban el ADN de los miembros de una familia afectada por la
enfermedad, y buscaban los alelos para RFLP que mostraban patrones de herencia
similares a los de la enfermedad. Una vez el gen era localizado, el anlisis RFLP de otras
familias podra predecir su riesgo de padecer esa enfermedad, o quines tenan
posibilidades de portar el gen mutante. Tambin se ha usado este anlisis para determinar
el origen parental de muchas trisomas en humanos, e incluso para determinar en qu fase
meitica ocurri el fenmeno desencadenante de la trisoma.
El anlisis RFLP fue tambin la base de las modernas tcnicas de anlisis de huellas
genticas (Genetic Fingerprinting analysis en ingls), tiles en la identificacin de muestras
recuperadas de la escena de un crimen, en pruebas de paternidad, y en el estudio de la
biodiversidad en poblaciones animales.

5. Cules son las caractersticas de la protena CFTR?

La protena CFTR est formada por 1480 aminocidos.
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Esta protena est formada por dos motivos repetidos compuestos cada uno por un
dominio hidroflico que atraviesa la membrana (MSD, membrane-spanning domain) que
contiene seis hlices y una regin hidroflica importante de unin a ATP (NBF, nucleotide
binding fold).

Ambos motivos se encuentran unidos por un dominio citoplasmtico (dominio R) codificado

por el exn 13 que contiene varios residuos cargados y la mayor parte de los lugares de
fosforilacin (probablemente sustratos de las protenquinasas A y/o C).

6. Qu papel tendra esta protena?

Funcin del canal de Cl-
Las primeras hiptesis sobre la posible funcin de la protena CFTR tuvieron en cuenta dos
posibilidades. La primera postulaba que la protena CFTR era un canal de Cl-. Esta
hiptesis era compatible con los defectos que se observaban en la permeabilidad de los
iones Cl- en las membranas apicales epiteliales de los pacientes con FQ. La otra hiptesis
propona que la protena CFTR no fuera un canal de iones sino que jugara un papel en la
regulacin de los canales de Cl- ya sea por asociacin con stos o por medio del
transporte de algn factor regulador de los canales de Cl- dentro o fuera de la clula.
Finalmente qued demostrada la primera de las hiptesis, que la funcin de CFTR era la
de canal de Cl-.

La protena CFTR, una protena multifuncional

Los descubridores del gen CFTR gene lo denominaron "regulador de la conductancia
transmembrana" (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). De hecho, la
protena CFTR regula tambin otros canales, como el canal de Cl- ORCC (Outwardly
Rectifying Chloride Channel), el canal de Na+ epithelial (ENaC, Epithelial Na+ Channel) y
al menos los dos canales de K+ ROMK1 y ROMK2. Adems de un regulador de canales,
tambin juega un papel en el transporte de ATP, modificando la exocitosis y endocitosis, y
en la regulacin del pH de los orgnulos intracelulares.

Esteatocrito cido
Es el porcentaje de grasa presente en las heces.
Con esta prueba se confirma la esteatorrea, la cual es clnicamente til en el diagnstico
del sndrome de malabsorcin, como para evaluar la respuesta a la terapia.
Normales de 0 a 2 %
2.Valores de 2 a 4 %, son fronterizos y requieren repeticin.
3.Patolgicos, superiores a 4 %

Prueba o Test del Sudor

El diagnstico de FQ se realiza mediante la cuantificacin del contenido de sal en el sudor.
La prueba de sudor es confiable y no dolorosa, y su anlisis requiere profesionales

Valores de referencia:

Normales: inferiores a 50 mmol/l de cloro o sodio

Dudosos: 50-60 mmol/l
Anormales: superiores a 60 mmol/l

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El Tripsingeno es el precursor de una de las enzimas pancreticas ms importantes que representa el 20%
de las protenas totales del jugo pancretico. El Tripsingeno es producido en el pncreas y es secretado en
el duodeno donde se convierte en su forma activa, la tripsina inmunoreactiva (IRT), por medio de la
enterocinasa que se encuentra en el intestino, (Floch, 2006,).En condiciones normales este debe ser el ciclo
del Tripsingeno, sin embargo, una escasa cantidad de este se puede autoactivar lentamente a tripsina en el
pncreas, siendo esta la razn por la cual se encuentran concentraciones altas de (IRT) en sangre.

La autoactivacin de tripsina en el pncreas puede ser producida por mltiples factores, que hacen que se
presente un desequilibrio en esta enzima, entre los factores de mayor importancia se encuentran las
mutaciones que afectan el gen regulador de la conductancia transmembranal de la Fibrosis Qustica (CFTR)

I- Antecedentes
Las primeras descripciones de la fibrosis qustica (FQ) se realizaron a finales de los 1930s.
En 1936, Fanconi identific la asociacin entre la FQ congnita del pncreas y la enfermedad
bronquial, inmediatamente despus Andersen (1938) realiz la primera descripcin
anatomopatolgica de la FQ.
En 1953, Di Sant'Agnese describi la existencia de un exceso de cloruro de sodio en el
sudor de los nios afectados por la FQ. Esto condujo rpidamente a la utilizacin de esta
alteracin como prueba diagnstica, la nica existente en ese momento.
A principios de los 1980s, Quinton (Quinton, 1983) describi de manera precisa esta
alteracin en el transporte de sales, explicando el defecto en la permeabilidad de los iones
cloruro (Cl-) en las clulas epiteliales afectadas de las glndulas sudorparas, seguidamente
Knowles (Knowles, 1983) observ el mismo fenmeno en el epitelio respiratorio.
En 1989 se aisl el gen CFTR, implicado en la FQ. Este gen se encuentra localizado en
7q31 y tiene 27 exones. La protena que codifica est compuesta por 1480 aminocidos.

II- Incidencia
La FQ es la enfermedad autosmica recesiva letal ms frecuente, y la peor en las poblaciones de
origen europeo afectando a una media de un individuo cada 2500 nacidos vivos (=q 2), por lo que
aproximadamente uno de cada 25 individuos (=2pq) es portador heterocigoto de la enfermedad.
Sin embargo, esta frecuencia es variable en funcin de la zona geogrfica y origen tnico de los
individuos.

III- Manifestaciones clnicas

La presentacin clnica de la FQ vara entre los individuos de distintas

familias e incluso entre los individuos de la misma familia. En la
mayora de los casos la enfermedad se diagnostica antes de la
adolescencia, aunque existen casos asintomticos hasta la edad
adulta. Es imposible diferenciar, tanto desde el punto de vista clnico
como biolgico, los heterocigotos portadores de los homocigotos que
no portan ninguna mutacin.
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La presentacin clnica vara con la edad. En 10% de los recin nacidos

afectados se presenta leo meconial (obstruccin intestinal debido a un
meconio anormalmente espeso). Posteriormente la sintomatologa se
presenta principalmente en dos sistemas, el respiratorio y el digestivo,
manifestado como infecciones respiratorias repetidas y signos de mala
absorcin.

El sistema ms afectado es el respiratorio. Ello se debe a la obstruccin

de los bronquiolos por un moco espeso que favorece el crecimiento de
microorganismos. Este hecho explica las infecciones respiratorias
repetidas por grmenes oportunistas.

En 85% de los pacientes se puede observar como alteracin digestiva

una insuficiencia pancretica exocrina (con defecto en la produccin de
enzimas) que conduce a una obstruccin de los canales pancreticos y
mala absorcin de protenas. El estado de esta funcin pancretica
exocrina (IP, insuficiencia pancretica o SP, suficiencia pancretica) es
un marcador de gravedad fenotpica siendo ms grave la IP que la SP
(Kerem, 1990).

La alteracin en las glndulas sudorparas conduce a la presencia de

un exceso de cloruro de sodio en el sudor, sta prdida de sales es
responsable de una deshidratacin aguda en caso de exposicin al
calor.

La enfermedad tambin afecta a otros rganos, entre los que destacan

el aparato reproductor y el hgado.

98% de los varones afectados son estriles por atrofia y ausencia del
vas deferens debido a la azoospermia obstructiva, por otro lado 80%
de las mujeres afectadas son frtiles.

La afectacin heptica del 30% de los casos comienza con

hepatomegalia y en 9% como insuficiencia heptica. Ello se debe a la
obstruccin de los tractos biliares intra y extrahepticos por
compresin a nivel del pncreas. En 2-5% ello conduce a cirrosis biliar.

Pronstico: si no se trata, la tasa mediana de supervivencia es de 3 a 5

aos.

No hay un tratamiento efectivo para la FQ, sin embargo la posibilidad

de un diagnstico ms temprano y la posibilidad de tratamiento
sintomtico ha hecho posible aumentar la supervivencia media a entre
25 y 30 aos.
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Este tratamiento sintomtico va desde la terapia antibitica a la

nebulizacin con broncodilatadores o mucolticos y administracin de
proteasas que inhiben los sntomas pulmonares hasta la administracin
de enzimas pancreticas sustitutivas y vitaminas para la insuficiencia
pancretica.

En los estados avanzados, se ha mostrado efectivo el transplante

triple (corazn-pulmn-rin), aunque el principal obstculo para ello
es la ausencia de rganos de donantes.

De entre los ltimos avances teraputicos, la terapia gnica se ha

encontrado con muchos obstculos. En la actualidad se estn
estudiando otras estrategias prometedoras que tienen como objetivo la
compensacin del defecto en la produccin y/o funcin de la protena
CFTR en funcin del tipo de mutacin.

IV- Diagnosis

El diagnstico de la FQ se basa en la prueba de la presencia de cloruro

de sodio en sudor. Esta prueba se considera, todava hoy, la prueba
ms fiable de la FQ. Las tcnicas usadas para ello son bastante simples
pero un factor limitante importante es la cantidad necesaria de sudor,
especialmente en recin nacidos, lo que aumenta la tasa de error al
30%.

Los valores de esta prueba varan en funcin del laboratorio, pero se

considera como un valor normal la presencia de menos de 40
mmoles/L de cloruro.

Cuando el valor obtenido se encuentra entre 40 y 60 mmoles/L, la

interpretacin es dudosa y la prueba debe repetirse.

Para que se pueda realizar un diagnstico claro, la concentracin de

iones cloruro en el sudor debe sobrepasar los 60 mmoles/L en dos
anlisis independientes.

Otra tcnica utilizada se basa en la medida de la diferencia de

potencial bioelctrico entre la piel y la mucosa nasal. Es un mtodo
simple, barato y accesible. Este valor es vlido en los siguientes casos:

1. para el diagnstico temprano de recin nacidos que muestran patologa digestiva

sospechosa y donde la prueba del sudor es difcil de realizar,

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2. para la confirmacin de casos dudosos con ciertos signos clnicos pero con valores
lmite o negativos en la prueba de sudor,
3. para el seguimiento del paciente, ya que existe una correlacin entre la severidad de la
afectacin respiratoria medida por espirometra forzada (FEV1, volumen mximo
espirado en el primer segundo de una espiracin forzada) y el valor de la diferencia del
potencial bioelctrico. The method is simple, less expensive and accessible.

V- El gen CFTR y sus mutaciones

V-1. Introduccin
El gen CFTR, cuya alteracin es responsable de esta enfermedad, tiene 27 exones y se extiende
sobre 250 kb del cromosoma 7 (7q31) dando lugar a un RNAm de 6,5 kb.

V-2. La mutacin DF508

La mutacin ms frecuente es la delecin de tres nucletidos que tiene

como resultado la prdida de una fenilalanina en la posicin 508
(DF508). Esta mutacin est presente en 70% de los alelos FQ.

Sin embargo, existe una gran heterogeneidad en su distribucin con un

gradiente noroeste/sudeste, por ejemplo en Dinamarca hay 88% de
casos DF508 pero 50% en Italia.

La extensin de esta mutacin en la poblacin europea se ha explicado

por una ventaja selectiva de los individuos heterocigotos portadores de
ella. Segn esta hiptesis los heterocigotos estaran ms protegidos
frente a la deshidratacin provocada por las diarreas causadas por las
enterotoxinas bacterianas. La protena DF508, junto a una menor
expresin de CFTR en las superficies epiteliares, disminuiran la
entrada de patgenos en el epitelio intestinal, protegiendo frente a
estas infecciones.

V-3. El espectro de mutaciones del gen CFTR

Desde el descubrimiento y clonaje del gen CFTR

(http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/) se han descrito ms de 1200
mutaciones, de las que nicamente 4 (excluyendo la DF508) se
encuentran en ms de 2% de los casos. La frecuencia de algunas de
estas mutaciones vara entre los distintos grupos geogrficos (p. ej. la
W1282X constituye el 48% de los alelos FQ de los judos Ashkenazi
pero slo el 2% de total de alelos FQ).

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La mayor parte de los defectos moleculares del gen CFTR son

mutaciones puntuales, de las que 42% son con cambio de sentido, 24%
son pequeas inserciones/deleciones con cambio en el marco de
lectura, 16% son mutaciones sin sentido, 16% afectan a regiones de
ayuste o splicing y 2% producen la prdida de un aminocido. Tambin
se han descrito algunas deleciones grandes.

Una de las particularidades de CFTR es la presencia de transcritos que

muestran la delecin de uno o ms exones entre los individuos
normales. Estos transcritos se deben a alteraciones en el proceso de
ayuste o splicing alternativo de la que la ms frecuente es la delecin
del exn 9 (9-). La presencia o ausencia de este exn se correlaciona
con la presencia de un polimorfismo de la secuencia del intrn 8
cercano al punto aceptor del splicing (5T, 7T 9T). Si se encuentra la
forma 7T 9T se producira un procesamiento normal en 90% de las
molculas de RNAm, sin embargo la presencia de la forma 5T slo
garantiza el procesamiento normal de entre 10 y 40 % de las molculas
de RNAm.

V-4. Correlacin genotipo-fenotipo

Cerca de la mitad de los pacientes con FQ son homocigotos para la

mutacin DF508. Estos individuos muestran la forma clsica de la
enfermedad con incremento de electrolitos en sudor, insuficiencia
pancretica y patologa obstructiva pulmonar.

La DF508 por s sola suma el 66 % de las mutaciones, 40 % de los

pacientes con FQ son heterocigotos mostrando la DF508 en uno de sus
alelos y otra mutacin en el otro alelo de CFTR.

Generalmente, tanto la funcin pulmonar como la edad de aparicin de

la enfermedad y la cantidad de sales de cloruro se relacionan con el
genotipo.

Por otro lado, la diferente severidad y variedad de los sntomas dentro

de la misma familia indican que el genotipo por s slo, a nivel de
alteraciones en CFTR, no puede explicar completamente el fenotipo
clnico.

nicamente la mutacin A455E se asocia fuertemente con la funcin

pulmonar.

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En cuanto a la funcin pancretica los pacientes con una o dos

mutaciones con cambio de sentido conservan la funcin exocrina (SP),
mientras que los pacientes que muestran los dos alelos con
mutaciones de splicing, sin sentido o con cambio de marco de lectura y
algunas con cambio de sentido muestran insuficiencia de esta funcin
(IP). Los pacientes que muestran en un alelo una mutacin causante de
IP y en el otro una mutacin causante de SP muestran un fenotipo SP.
Con slo una mutacin SP la funcin CFTR es suficiente para mantener
la funcin pancretica.

El efecto de una mutacin puede ser modificado por una segunda

mutacin en cis sobre el mismo alelo.

El polimorfismo de la zona de polipirimidinas del intrn 8 modifica la

penetrancia de algunas mutaciones

Mutaciones. Editor.

VI- La protena CFTR y sus funciones

VI-1. Estructura de la protena CFTR

La protena CFTR est formada por 1480 aminocidos.

Esta protena est formada por dos motivos repetidos compuestos cada
uno por un dominio hidroflico que atraviesa la membrana (MSD,
membrane-spanning domain) que contiene seis hlices y una regin
hidroflica importante de unin a ATP (NBF, nucleotide binding fold).
Ambos motivos se encuentran unidos por un dominio citoplasmtico
(dominio R) codificado por el exn 13 que contiene varios residuos
cargados y la mayor parte de los lugares de fosforilacin
(probablemente sustratos de las protenquinasas A y/o C).

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Figura 1: estructura propuesta para la protena CFTR, por Riordan et al., 1989 - Pascale Fanen.

Existe homologa entre la estructura primaria de la protena CFTR y

miembros de familias de protenas de membrana, como la familia de
los transportadores ABC (ATP-binding cassette), que son responsables
del transporte activo de sustratos a travs de la membrana celular, en
el que la hidrlisis del ATP es la fuente de energa.

VI-2. Funciones de la protena

VI-2.1. Funcin del canal de Cl-
Las primeras hiptesis sobre la posible funcin de la protena CFTR tuvieron en cuenta dos
posibilidades. La primera postulaba que la protena CFTR era un canal de Cl-. Esta hiptesis era
compatible con los defectos que se observaban en la permeabilidad de los iones Cl- en las
membranas apicales epiteliales de los pacientes con FQ. La otra hiptesis propona que la
protena CFTR no fuera un canal de iones sino que jugara un papel en la regulacin de los
canales de Cl- ya sea por asociacin con stos o por medio del transporte de algn factor
regulador de los canales de Cl- dentro o fuera de la clula. Finalmente qued demostrada la
primera de las hiptesis, que la funcin de CFTR era la de canal de Cl-.

VI-2.2. La protena CFTR, una protena multifuncional

Los descubridores del gen CFTR gene lo denominaron "regulador de la conductancia
transmembrana" (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). De hecho, la protena
CFTR regula tambin otros canales, como el canal de Cl- ORCC (Outwardly Rectifying
Chloride Channel), el canal de Na+ epithelial (ENaC, Epithelial Na+ Channel) y al menos los
dos canales de K+ ROMK1 y ROMK2. Adems de un regulador de canales, tambin juega un
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papel en el transporte de ATP, modificando la exocitosis y endocitosis, y en la regulacin del pH

de los orgnulos intracelulares.

Figura 2: CFTR, una protena multifuncional, por Schwiebert et al., 1999 - Pascale Fanen.

VI-3. Correlacin de las mutaciones en el gen CFTR con la funcin del canal de Cl-
Las alteraciones moleculares tiene diversos efectos sobre la protena CFTR y sus funciones.
Welsh y Smith han propuesto la clasificacin de estas alteraciones en relacin a la funcin del
canal de Cl- (Welsh & Smith, 1993) (figura 3).

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Figura 3: Clasificacin de las mutaciones del gen CFTR, por Welsh & Smith, 1993 - Pascale
Fanen.

VI-3.1. Clase 1: mutaciones que alteran la produccin de la protena. Estas mutaciones

tienen como consecuencia la ausencia total o parcial de la protena. En esta clase se incluyen las
mutaciones sin sentido y aqullas que conducen a la formacin prematura de un codn de parada
de la traduccin (algunas de las cuales producen alteraciones del splicing mientras que otras
producen un cambio en el marco de lectura). En algunos casos la no produccin de la protena se
debe a que el RNAm formado es inestable. En otros casos, aunque se produce la protena, sta es
inestable y se degrada rpidamente. Funcionalmente todas estas mutaciones se caracterizan por
una prdida de la conductancia del canal de Cl- en el epitelio afectado.

VI-3.2. Clase 2: mutaciones que alteran el proceso de maduracin celular de la

protena. Ciertas mutaciones alteran la maduracin de la protena y su transporte a la membrana
plasmtica. Ello conduce a que esta protena no est presente en la membrane o que lo est en
muy baja cantidad. Las mutaciones de esta clase son las ms frecuentes (DF508).

VI-3.3. Clase 3: mutaciones que alteran la regulacin del canal de Cl-. Estas mutaciones se
encuentran frecuentemente en el dominio de unin al ATP (NBF1 y 2).

VI-3.4. Clase 4: mutaciones que alteran la conduccin a travs del canal de Cl-. Ciertos
segmentos de los dominios que atraviesan la membrana participan el la formacin de un poro de
iones. Las mutaciones con cambio de sentido situadas en estas regiones generan una protena
correctamente posicionada con actividad de canal de Cl- cAMP dependiente. Sin embargo sus
caractersticas son distintas a las del canal CFTR nativo ya que muestran una disminucin del
flujo de iones y una selectividad modificada.

VI-3.4. Clase 5: mutaciones que alteran la estabilidad del RNAm

VI-3.4. Clase 6: mutaciones que alteran la estabilidad de la protena madura

n 1985, Sir Alec Jeffreys descubri los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restriccin que
en biologa molecular, el trmino RFLP (del ingls Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere a
secuencias especficas de nucletidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de
restriccin (tambin llamadasendonucleasas de restriccin) y que varan entre individuos. En un cromosoma
humano, una enzima de restriccin puede producir un gran nmero de cortes en los lugares donde reconozca la
secuencia especfica para hacerlo. Las secuencias de restriccin presentan usualmente patrones de distancia,
longitud y disposicin diferentes en el ADN de diferentes individuos de una poblacin, por lo que se dice que la
poblacin es polimrfica para estos fragmentos de restriccin. Los RFLP son marcadores gnicos del ADN y se
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pueden encontrar en regiones que codifican protenas o exones, en los intrones o en el ADN que separa un gen
de otro. Lo nico que se necesita para que puedan ser marcadores genticos es que sean polimrficos teniendo
ms de un alelo. La tcnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos particulares de personas con
riesgo a contraer ciertas enfermedades genticas, en ciencia forense, en pruebas de paternidad y en otros
campos, ya que puede mostrar la relacin gentica entre individuos.

Metodologa[editar]

El ADN de un individuo se extrae y se purifica. El ADN purificado puede ser amplificado usando la tcnica
molecular Reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (del inglsPolymerase Chain Reaction), luego tratado
con enzimas de restriccin especficas para producir fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Estas
enzimas de restriccin hacen un proceso de digestin restrictiva en el cual reconocen cortas secuencias
especficas en el ADN donde cortan formando fragmentos de distintas longitudes. Los fragmentos de restriccin
se separan mediante electroforesis en geles de agarosa a travs del cual corren debido a un campo elctrico y
su disociacin obedece a la masa o a la carga elctrica de las muestras segn la tcnica utilizada. Esto
proporciona un patrn de bandas que es nico para un ADN en particular debido a la diferencia en las
secuencias del ADN en los individuos donde los sitios de restriccin varan. Las bandas pueden ser transferidas
por Southern Blot a una membrana donde se hibridan con una sonda que permite determinar la longitud y la
separacin de los fragmentos. En este paso las cadenas de ADN tienen que estar desnaturalizadas, es decir, en
forma de cadena sencilla para permitir la hibridacin con las sondas especficas. Las endonucleasas de
restriccin en su mayora cortan el ADN de cadena doble en secuencias especficas y cada enzima reconoce un
sitio en particular. Un ejemplo es la EcoRI: corta solamente cuando encuentra la secuencia 5`G/AATTC3`
en la doble hlice. Para esta tcnica, es importante seleccionar endonucleasas que corten en sitios especficos
y no sea en secuencias degeneradas.

* Southern blot, hibridacin Southern o, simplemente,Southern es un mtodo de biologa

molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja
de este cido nucleico

Aplicaciones[editar]

El anlisis de la variacin de RFLP en genomas ha supuesto en el pasado una herramienta fundamental en el

mapeo genmico y el anlisis de enfermedades genticas. Cuando los investigadores pretendan determinar la
localizacin cromosmica de una determinada enfermedad, analizaban el ADN de los miembros de una familia
afectada por la enfermedad, y buscaban los alelos para RFLP que mostraban patrones de herencia similares a
los de la enfermedad. Una vez el gen era localizado, el anlisis RFLP de otras familias podra predecir su riesgo
de padecer esa enfermedad, o quines tenan posibilidades de portar el gen mutante. Tambin se ha usado
este anlisis para determinar el origen parental de muchas trisomas en humanos, e incluso para determinar en
qu fase meitica ocurri el fenmeno desencadenante de la trisoma.

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El anlisis RFLP fue tambin la base de las modernas tcnicas de anlisis de huellas genticas (Genetic
Fingerprinting analysis en ingls), tiles en la identificacin de muestras recuperadas de la escena de un
crimen, en pruebas de paternidad, y en el estudio de la biodiversidad en poblaciones animales.

Diagnstico de una enfermedad mediante screening de un marcador

RFLP[editar]

Cuando un RFLP normalmente se asocia con una enfermedad de origen gentico, la presencia o ausencia de
ste puede usarse a modo de consejo sobre el riesgo de desarrollar o transmitir la enfermedad.

La suposicin es que el gen en el que los investigadores estn realmente interesados est localizado tan cerca
del RFLP que su presencia puede servir como indicador de la alteracin en el gen. A veces, un RFLP en
particular puede estar asociado con el alelo sano. Por esto es esencial examinar no slo al paciente, sino a
todos los miembros de la familia que sea posible.

Las pruebas ms tiles para tales anlisis son las asociadas a una nica secuencia del DNA; esto es, una
secuencia que est presente en un solo lugar del genoma. A menudo, este DNA presenta una funcin que es
desconocida. Esto puede ser de ayuda si ha mutado libremente sin daar al individuo. La muestra del sujeto
sometido al diagnstico hibridar con distintas longitudes de DNA digerido de diferentes personas dependiendo
de los sitios de corte de la enzima que haya heredado. Una gran variedad de polimorfismos puede presentarse
en la poblacin, obteniendo una gran coleccin de alelos. Algunas personas sern homocigotos y presentarn
una nica banda, otros ( ej, todos los miembros de la familia mostrados abajo) sern heterocigotos y
presentarn una banda distinta por cada alelo.

El pedigr muestra la herencia del marcador RFLP a travs de tres generaciones en una sola familia. Un total de
8 alelos (numerados a la izquierda del gel) estn presentes en la familia. Los RFLPs de cada miembro de la
familia estn enumerados justo debajo de ellos.

Si, por ejemplo, cada persona que hered el alelo RFLP 2 tuviera tambin cierto desorden heredado, y ninguno
de los que carecieran del alelo tuviera la afeccin, deduciramos que el gen de la enfermedad est ligado de
manera muy prxima al RFLP. Si los padres decidieran tener otro hijo, un test prenatal podra revelar si el nio
presentara la enfermedad. Pero destacar que el cruzamiento durante la formacin de los gametos podran
mover el marcador RFLP al alelo sano. Por esto, a mayor distancia entre el RFLP y el locus del gen, disminuye
la probabilidad de un diagnstico preciso.

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