Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
( HPLC )
OLEH :
A. Tujuan
- Dapat menjelaskan teori kromatografi cair kinerja tinggi.
- Dapat mengoperasikan alat kromatografi cair kinerja tinggi dengan baik
dan benar.
- Dapat menganalisa suatu senyawa kimia baik secara kualitatif maupun
kuantitatif menggunakan alat kromatografi cair kinerja tinggi.
tinggi sampai 20.000 Kpa ( 200 atmosfir) untuk mengalirkan fasa gerak
b) Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stailess steel, akan tetapi ada juga yang terbuat
dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tepat terjadinya
pemisahan campuran menjadi komponen-komponen. Bergantung keperluannya
kolom utama dapat digunakan untuk analisis atau preparatif setiap komponen
yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC
dihubungkan dengan fraction colector selain kolom utama dikenal pula kolom
pengaman.
Kolom utama berisi fasa dian dan jenisnya bervariasi bergantung pada
keperluan, misalnya dikenal kolom C8, C-18, cyanopropyl, dan penukar ion.
Kolom utama untuk HPLC biasanya berukuran panjang berkisar antara 5-30 cm
dan diameter dalam berkisar 4,510 mm.
Kolom pengaman (guard coloumn) disebut juga pra-kolom karena
letaknya sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek 5 cm
dengan diameter 4,6 mm biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran besar
dari ukuran partikel kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu:
menyaring kotoran yang terbawa oleh fasa gerak dan untuk menjenuhkan fasa
gerak dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut.
Kolom merupakan jantung kromatograf, keberhasilan atau kegagalan
analisis bergantung pada pilhan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat
dibagi menjadi dua kelompok :
- Kolom analitik
Garis tengah dalam 2-6 mm, panjang bergantung pada jenis kemasan,
untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan
mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm.
- Kolom preparative
Umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar, dan panjang 25-100 cm.
c) Pompa
Pada HPLC, pompa ini berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair
melalui kolom yang berisi serbuk halus. Digunakan pompa bertekanan tinggi
dalam metode ini sebagai akibat penggunaan fasa gerak yang berupa zat cair yang
akan sukar mengalir dalam kolom yang dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh
karena itu, agar zat cair dapat melewati kolom secara tepat maka dibutuhkan
bantuan pompa yang bertekana tinggi. Pompa yang digunakan dalam HPLC harus
memenuhi persyaratan sebagai berikut :
Menghasilkan tekanan sampai 5000 psi
Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit
Bahan tahan korosi
Keluaran bebas pulse
d) Injector Sample
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase
gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik
yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan
keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.
Salah satu jenis penyuntik untuk memasukan sampel ke dalam sistem
(kolom) kromatografi adalah penyuntik loop. Dalam prakteknya, loop tidak perlu
diisi penuh, tapi bila tidak diisi penuh akan mengakibatkan lebih jeleknya presisi
hasil eksperimen dan ketergantungan presisi tersebut kepada bagaimana si-
operator menggunakan penyuntik.
Perlu diingat, bahwa penyuntik tidak boleh dicabut sebelum pegangan
(handle) penyuntik diputar dari posisi load (pengisap) ke posisi inject
(suntik). Karena sampel akan mengalir ke saluran pembuangan. Hal yang
terakhir ini tentunya tidak diinginkan, pegangan penyuntik harus diputar cepat
agar pemutusan aliran ke dalam diinginkan. Pegangan penyuntik harus diputar
cepat agar pemutusan aliran ke dalam kolom, antara posisi pengisian (load) dan
posisi penyuntikan (inject) berlangsung cepat.
Yang menjadi faktor ketidak tepatan pengukuran HPLC salah satunya
terletak pada keterulangan pemasukan cuplikan kedalam paking kolom.
Masalahnya kebanyakan memasukan cuplikan kedalam kolom dapat
menyebabkan band broadening. Oleh karen itu cuplikan yang dimasukkan harus
sekecil beberapa puluh mikroliter. Beberapa teknik pemasukan cuplikan kedalam
sistem dapat diuraikan sebagai berikut :
Injeksi Syringe
Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang
syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapi keterulangan
injeksi stringe ini sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek.
Injeksi Stop Flow
Aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka
dan cuplikan disuntikan langsung kedalam ujung kolom. Setelah
menyambung kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. Untuk
memasukkan cuplikan kedalam fasa gerak perlu dua langkah : sejumlah
volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dan posisi load. Cuplikan
masih berada dalam loop ; kran diputar untuk mengubah posisi load
menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan kedalam kolom
(kran cuplikan)
Kran Cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak
digunakan. Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu 2
langkah, yaitu: sejumlah volume cuplikan disuntikan ke dalam loop dalam
posisi load, cuplikan masih berada dalam loop; kran diputar untuk
mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa
cuplikan ke dalam kolom.
e) Detektor
Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka
terhadap golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu
detektor yang peka terhadap golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya.
Diantara detektor yang digunakan dalam KCKT adalah :
Detektor Ultra Violet Visible (Sinar Tampak)
Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-
senyawa organik. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang
gelombang, sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih
sesuai dengan jenis cuplikan yang diukur.
Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan,
karena sensitivitasnya yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak
senyawa yang di analisis, dan memungkinkan untuk melakukan elusi
bergradien. Ada yang dipasang pada panjang gelombang tetap yaitu pada
panjang gelombang 254 nm, dan ada yang panjang gelombangnya dapat
dipilih sesuai dengan diinginkan antara 190-600 nm. Detektor dengan panjang
gelombang variabel ini ada yang dilengkapi alat untuk memilih panjang
gelombang secara otomatis dan dapat me-nol-kan sendiri (allto zero). Detektor
jenis ini juga ada yang menggunakan drode erray (sebagai pengganti photo
tube), sehingga dapat melakukan pembacaan absorban yang kontinyu pada
berbagai panjang gelombang.
Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias memberi respons terhadap senyawa yang dianalisis
apapun, termasuk pelarutnya sendiri. Prinsip dasar kerja detektor ini adalah
perubahan indeks bias karena adanya komponen sampel dalam pelarut. Detektor
ini bersifat tidak merusak (non-destruktif), sensitivitasnya cukup tinggi (minimum
10-6 g) dan umumnya digunakan dalam pekerjaan preparatif. Dengan detektor ini
tidak dapat dilakukan elusi bergradien. Detektor ini digunakan dalam
kromatografi eklusi dan dalam analisis karbohidrat.
Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menggunakan detektor indeks
bias :
1. Bila digunakan lebih dari satu pelarut, maka campuran dahulu hingga
homogen dan bebaskan dari gas terlarutnya.
2. Setelah detektor dihidupkan, tunggu beberapa lama sebelum digunakan
sampai detektor stabil.
3. Bila digunakan lebih dari satu detektor yang dipasang berurutan, maka
tempatkanlah detektor indeks bias pada urutan terakhir.
4. Untuk saluran pembuangan, gunakanlah selang teflon berdiameter dalam
(inner diameter) yang besar tapi pendek.
5. Tempatkan detektor pada kondisi suhu yang dipelihara tetap.
6. Jaga agar sel indeks bias selalu bersih.
6. Rekorder
Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa
kumpulan puncak (kromatogram) kromatogram HPLC yang didapat berguna
untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi
komponen dalam campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen.
Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi (rt)
analit atau sampel dengan waktu retensi standar. Sedangkan analisis kuantitatif
depat dilakukan dengan didasarkan pada luas peak atau tinggi peak dengan
metode standar kalibrasi.
Prinsip kerja instumentasi HPLC
HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari
sebuah campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap
komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan
HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi
untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom)
HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe 2SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18
atau C8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya
(gradien elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada
kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan
teramati pada spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.
Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi
karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam.
Keunggulan menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak
pada kemampuannya untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil
pada suhu tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa organik tapi mampu
menganalisis senyawa anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang mempunyai
molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis cuplik yang mempunyai titik
didih yang sangat tinggi seperti polimer.
Cara kerja instumentasi HPLC
Prinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui
kolom kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke
dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi
pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi
antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya
dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut
yang interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama.
Setiap komponen yang campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor
kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
Gambar Skema Instrumentasi HPLC
E. Analisis Percobaan
F. Kesimpulan
HPLC atau High Performance Liquid Chromatography merupakan teknik
pemisahan yang dilakukan berdasarkan sifat kepolaran masing-masing
komponen dalam analit terhadap fase geraknya.
Kegunaan umum HPLC untuk pemisahan sejumlah senyawa organic,
anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmakmuran, analisis
senyawa-senyawa mudah menguap, penentuan molekul-molekul netral,
amupun zwitter ion, dan lainnya.
Analisa caffeine yang dilakukan harus terhindar dari adanya gelembung-
gelembung atau gas udara dalam penganalisaan dari awal hingga akhir
agar pembacaan detector tidak terganggu dan hasilnya tidak kacau.
Read time caffeine dalam analisa ialah 4,57 menit dengan tinggi 141,514
mAu dan area 18,534 mAu*min
G. Daftar Pustaka
Kasie Laboratorium Kimia Analitik Instrumen. Penuntun Praktikum KAI :
High Performance Liquid Chromatography (HPLC). 2015. Palembang :
Politeknik Negeri Sriwijaya.
Ir. Muhammad Taufik, M.Si, dkk. Modul Kimia Analitik Instrumen. 2015.
Palembang: Politeknik Negeri Sriwijaya