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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL
INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGA

Laboratorio de Biotecnologa Farmacutica

Prctica No.1

OBTENCION DE ADN GENMICO DE HONGOS

5FV1

Equipo: 3

Integrantes:

Galarza Castillo Guadalupe Monserrat


Gutirrez Torres Clara Isabel
Oaxaca Bureos Ana Luisa
Rodrguez RodrguezMassiel

Profesores:

Estela Flores Gmez


Hernn Cortes Arrollo
Erick Prez Sols

Fecha de entrega: 10 de marzo de 2017.


I.- OBJETIVOS

Objetivo general

Extraccin de ADN genmico de hongos de importancia farmacutica.

Objetivos especficos
a) Comprender los fundamentos del proceso de extraccin de ADNg.
b) Analizar la calidad de ADNg a travs de la electroforesis en gel de agarosa.
c) Analizar la pureza y concentracin de ADNg.
d) Obtener el peso molecular de ADNg.
e) Discutir la importancia de la ingeniera gentica dentro de la farmacutica.

II.- INTRODUCCIN

En los ltimos aos los avances realizados en el campo de la gentica molecular


han mejorado de forma notable el conocimiento de los mecanismos
fisiopatolgicos y el diagnstico de distintas enfermedades. En el DNA se
encuentra toda la informacin gentica del individuo; por tanto, el primer paso para
llevar a cabo un estudio gentico molecular implica la obtencin de muestras de
cidos nucleicos, especialmente de DNA.

Las tcnicas de extraccin de DNA son sencillas, pero es importante mantener


una serie de precauciones para evitar la degradacin por nucleasas durante la
manipulacin. El objetivo de obtener la mxima cantidad y la mayor calidad posible
de DNA. Se han desarrollado diversos protocolos de extraccin teniendo en
cuenta el origen o fuente de DNA. El DNA se puede obtener a partir de:

Sangre: Las clulas nucleadas de sangre perifrica son una de las fuentes
ms accesibles y utilizadas en medicina para la obtencin de DNA
genmico. En esta extraccin se separan los leucocitos y se lisan con una
solucin que contiene el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) y la
proteinasa K, la cual libera el DNA por precipitacin de las protenas
celulares provocada con una solucin saturada de NaCl, y finalmente se
obtiene el DNA por precipitacin con alcohol etlico absoluto.
Tejidos conservados en congelacin: Se requiere un primer paso de
homogeneizacin que rompa el tejido y facilite la posterior lisis de las
clulas que forman el tejido. Despus el tejido homogeneizado se incuba
durante 12 horas con SDS y proteinasa K para desnaturalizar y digerir las
protenas. Posteriormente el DNA se somete a unas serie de extracciones
con fenol y cloroformo que tienen como objeto acabar de digerir las
protenas y separarlas del DNA.
Tejidos parafinados: El DNA de estas muestras es estable durante muchos
aos. Se obtienen secciones, se desparafinan y se incuban durante 72
horas con SDS y proteinasa K, a partir de aqu el procedimiento es idntico
al descrito para el caso de tejidos conservados por congelacin; extraccin
con fenol-cloroformo y precipitacin con etanol absoluto. Para futuros
anlisis se ha de tener en cuenta que a veces el DNA genmico de tejidos
incluidos en bloques de parafina se encuentran muy fragmentados, y que,
por ejemplo, no es recomendable montar reacciones en cadena de la
polimerasa (PCR) para buscar y amplificar fragmentos de DNA superiores a
300 a 400 pares de bases. Tambin es importante saber que algunos
fijadores degradan el DNA de forma ms intensa que otros.

El uso de apropiados mtodos de muestreo, el tipo de tejido y la utilizacin de


protocolos viables de extraccin del ADN son puntos crticos en estudios
basados en PCR.

El uso del protocolo de extraccin con fenol-cloroformo ha sido el mtodo ms


usado para obtener ADN genmico. Estos protocolos tienen buenos resultados
para muestras de diversos orgenes. Sin embargo, es un mtodo lento,
laborioso y contaminante (Yue y Orban, 2001). La extraccin de ADN usando el
protocolo con sal comn (NaCl) es una alternativa simple, fcil, rpida y no
contaminante que permite obtener ADN de buena calidad, en cantidades
suficientes, desde muestras de tejido.

El propsito de este estudio en un principio fue obtener un mtodo simple,


reproducible, econmico y no contaminante para la obtencin de ADN
destinados a estudios con marcadores moleculares RAPD y microsatlites.
Con este objetivo se compar un protocolo modificado de extraccin con sal
comn (NaCl) con un protocolo modificado de extraccin con fenol-cloroformo
en muestras.

III.- RESULTADOS

Tabla 1. Tipos de hongos y propiedades farmacuticas

EQUIPO NOMBRE CIENTIFICO PROPIEDADES FARMACUTICAS


1 Grifola frondosa Se extraen proteglucanos, se utiliza
como antiviral, anticancergeno
2 Letinulaedodes Anticancergeno, regula la presin,
antiviral, mejora la digestin.
3 Ganodermalucidum Fuente de polisacridos activos,
antitumoral, actividad hipoglucemiante,
actividad heptica.
4 Ganodermalucidum Fuente de polisacridos activos,
antitumoral, actividad hipoglucemiante,
actividad heptica.
5 AgaricusBisporus Antidepresivo

Tabla 2. Resultados de absorbancia y concentracin de las dos muestras ms


representativas de cada equipo.

EQUIPO NOMBRE CIENTIFICO | 280nm| [ADN] ng/L


| 260nm|


1 Grifola frondosa 1.385//1.654 135//848
2 Letunilaedodes 1.771//1.805 2980//1923
3 Ganodermalucidum 1.301//1.346 1550//350
4 Ganodermalucidum 1.130//1.310 4478//2365
5 Agaricusbisporus 1.740//1.735 853//950
Figura 1. Gel de agarosa al 0.7% para visualizar la integridad del ADN.
Carril 1,2 muestras del equipo 1; Carril 3,4 muestras del
equipo 2; Carril 5,6 muestras del equipo 3;
Carril 7,8 muestras del equipo 4; carril 9,10 muestras del equipo 5;
carril 11,12,13 vacos; carril 14 marcador de peso molecular
CSLMDNABP 100-10000pb.

Descripcin de los carriles

IV.- ANALISIS DE RESULTADOS

Existen distintos tipos de ADN presentes en


diversos organismos; el ADN cromosmico es el ADN que se
encuentra
empaquetado en los cromosomas, gracias a protenas llamadas histonas, y
se encuentra dentro del ncleo celular, el AND genmico es ADN de carcter
cromosmico nuclear que ha sido aislado directamente de clulas o tejidos
y el ADN plasmdico posee una conformacin tipo doble hlice al
igual que el ADN cromosmico, aunque, por definicin, se
encuentran fuera de los mismos, a diferencia del ADN cromosmico,
el plasmdico no tienen protenas asociadas.

*Preparacion de la muestra

El mtodo de lisis permite obtener los productos presentes en el interior de las


clulas y ste es seleccionado dependiendo el tamao de los productos y la
influencia que tendrn en las operaciones que se utilicen para su separacin.
Existen mtodos fsicos, qumicos y biolgicos. Los mtodos fsicos pueden ser
mtodos lquidos, mtodos slidos y por congelacin o descongelacin. Los
mtodos qumicos pueden ser liofilizacin, tratamiento con cidos, detergentes,
extraccin con acetona-tolueno y cambio en la presin osmtica. Los mtodos
biolgicos pueden ser enzimas que digieran la pared celular, fagos y agentes que
inhiban la pared celular.

El mtodo de lisis utilizado en la prctica fue por medio de un detergenteaninico


(SDS), debido a que ste posee una zona hidroflica y otra hidrofbica pueden
interactuar tanto con el agua como los lpidos, solubilizando los lpidos presentes
en la pared celular

El primer paso para la extraccin y purificacin de ADN comienza en la lisis


celular, en este paso las interacciones entre las molculas que conforman la
pared, la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que
los cidos nucleicos se liberen. En el trabajo en laboratorio se realiz mediante el
uso de un mortero, pistilo, arena y una solucin buffer de extraccin, el buffer de
extraccin fue adicionado antes de comenzar la friccin con ayuda del pistilo, el
buffer nos permite desnaturalizar las protenas y mantener estable el pH del ADN,
se utiliz una cama de hielo lo cual evita que el ADN se fragmente por el calor
generado por la friccin.

El buffer de extraccin, es una solucin bsica que permite disolver la


membrana celular, el EDTA que contiene forma un complejo con los iones
2+
de Mg impidiendo el funcionamiento de las DNAsas. El tris es un

compuesto muy utilizado para mantener el pH de la solucin, el SDS


permite la desnaturalizacin de las protenas de la muestra, mientras que el
NaCl debido al sodio, neutraliza la carga negativa de los grupos fosfato del
ADN, para que ste se vuelva soluble.

Los componentes celulares no solubles (material fibroso y protenas) que


permanecen en solucin se separan del ADN por centrifugacin.

Posteriormente se separan los lpidos y protenas usando solventes orgnicos


utilizando la fuerte tendencia hidroflica de los grupos fosfato para separarlos en
medios acuosos, mientras que las protenas y lpidos son separados en solventes
orgnicos.

Fenol:Cloroformo:Isoamlico
El fenol y alcohol isoamlico son solventes orgnicos mientras que el
cloroformo es un solvente inorgnico

Para separar la fase acuosa y la fase orgnica, se somete a centrifugacin lo que


permite aislar al ADN. Es necesario tener cuidado de no contaminar la muestra
(fase acuosa) con el fenol contenido en la fase orgnica.

Para precipitar la muestra de ADN se adiciona soluciones con alta concentracin


de iones de sodio o amonio, en el protocolo realizado se utiliz acetato de sodio.

Acetato de sodio: Los iones de sodio se unen a los grupos fosfato,


reduciendo las fuerzas repulsivas entre las cadenas permitiendo que el
ADN se pliegue formando un precipitado,
Isopropanol: La funcin del propanol es precipitar los cidos nucleicos, esto
lo lleva a cabo debido a su baja constante dielctrica.

Posteriormente se centrifuga para separar el ADN y del etanol, se decanta y el


precipitado se lava con alcohol al 70 %
Alcohol 70%: El alcohol se utiliz para lavar, ya que cumple la funcin de
eliminar las elevadas concentraciones de sal y de protenas que se
precipitaron en la muestra, Esto debido a que su constante dielctrica al
70% es mayor que la del isopropanol.

El ltimo paso de la extraccin del ADN es la resuspensin de ste, para hidratar


el ADN.

Agua miliQ: Permite que el ADN se encuentre en un medio con pH=7


evitando una hidrolisis cida.

Tambin es posible utilizar una solucin amortiguadora para lo cual es preferible


utilizar una solucin de TrisHCl a 10mM y EDTA a 0.1 M a un pH=8 para el
almacenar el material.

*importancia de los hongos empleados

Algunos de los hongos empleados durante la prctica tienen importancia


farmacutica, al generar metabolitos que despus pueden ser ampliamente
usados; tras pasar por cierta serie de procesos, ya que algunos pueden llegar a
ser antitumorales y anticancergenos, as como activadores en el tratamiento de
enfermedades en el hgado y otros funcionan como antidepresivos.

*pruebas que se realizan al metabolito que se produce y relacin con la


ingeniera gentica.

Cuando se obtiene ose asla el ADN de inters suelen hacerle pruebas de


estabilidad, se prueba en diferentes organismos para asegurarse que este no
mute y genere cambios en el mismo.

*electroforesis fundamento y para qu sirve cada solucin empleada (buffer de


corrimiento:TAE, TBE, TAE vs TBE , burrer de carga, Fluorocromos: Rojo Texas,
Bromuro de etidio, Rojo Texas, gel red, sybrsafe, cuidados, marcador :
CSLMDNABP 100-10000 pb

El uso de las celdas de cuarzo para llevar a cabo la medicin de absorbancia de


las muestras es debido a que la medicin se llev a cabo en el rango UV y el
cuarzo no absorbe la luz en este rango de longitud de onda, por lo tanto no
provoca interferencias en la medicin.

Para determinar si nuestro ADN efectivamente se encontraba puro, se midi


absorbancia de la muestra a 260 nm porque a esa longitud de onda se miden los
cidos nucleicos y tambin se midi a 280 nm porque a esa longitud de onda se
miden las protenas. Y la relacin de ambas absorbancias debe dar en un rango
de 1.8-2.0 para que se diga que el ADN se encuentra puro, debido a que nuestra
relacin nos dio de 1.3 podramos decir que nuestro ADN contena impurezas, y
esto lo corroboramos en el gel de electroforesis.

*Transiluminador

El transiluminador es un equipo necesario que usa en principio luz UV con


diferentes longitudes de onda como recurso para observar, analizar y tomar
fotografas de protenas, aminocidos, pptidos, cidos nuclecos en geles de
agarosa con colorantes como el bromuro de etidio.

*Gel de agarosa-limite de deteccin

*obtencin de peso molecular (explicar si se puede o no obtener el peso de


nuestra muestra)

El Peso molecular se obtiene haciendo una grfica con la distancia en el eje x de


cuanto corri el colorante y en el eje y el log del PM de los marcadores de peso
molecular (que son fragmento de ADN con PM conocido) se obtiene la ecuacin
de la recta y= m(x)+b donde y es igual al log del PM y x es la distancia de
corrimiento de la protena de peso molecular desconocido. Se le saca antilog a la
m ( x )+ b
ecuacin para que quede de forma: PM= 10 .

En nuestra muestra no es posible determinar el PM ya que apenas y se nota la


muestra

V.- CUESTIONARIO

1. Cul es la importancia de los hongos en la industria farmacutica?


Los hongos han tomado gran importancia en la industria farmacutica debido a su
gran importancia econmica adems de que la ingeniera farmacutica a ocupado
diferentes para la obtencin de medicamentos o compuestos de inters farmacutico,
un ejemplo de ellos, los antibiticos que han sido producidos principalmente por
hongos filamentosos.

2. Cmo utilizara la ingeniera gentica el ADN obtenido en la prctica?


Tomar un fragmento que codifique para la produccin del principio activo de inters
farmacutico, despus lo modificaran para posteriormente colocarlo en un plsmido
para lograr una mayor produccin de principio activo de inters u ocupara ingeniera
gentica codificar el gen de producir el principio activo.

3. para que se usa el buffer de corrimiento TAE?


Es utilizado para preparar el gel y desarrollar la electroforesis recibe el nombre de las
iniciales de sus componentes (Tris, cido actico, EDTA).
Contiene un pH alcalino para que todos los grupos fosfatos del DNA estn ionizados
por completo y este se mantenga cargado negativamente. La composicin habitual
es Tris 40nM, cido actico 19nM, EDTA 1mM, pH=7.5
En la electroforesis permite mantener las molculas de DNA con cargas negativas
uniformes y constantes, es por ello componente del gel y del tapn de electroforesis,
adems sirve como amortiguador debido a su inocuidad con las protenas y evita la
accin de las nucleasas.

4. Cules son las caractersticas de buffer de carga?


Este buffer le da peso a la muestra para que el ADN se precipite en el fondo de los
pozos as como indicar el corrimiento de cada muestra debido al colorante.
Sacarosa: se usa en el buffer de carga para conferir peso a la muestra y esta no se
disocia en el buffer de corrimiento.
Azul de bromofenol: el azul de bromofenol permite ver la corrida durante la
electroforesis controlando que la muestra no se caiga del gel o no se dirija a otro
pocillo.

5. Cmo funciona el rojo texas?


El rojo Texas es un marcador fluorocomo unido de forma covalente a sondas de
hibridacin y sondas de PCR, sus dos ncleos aromticos confieren la capacidad de
intercolorante, es decir que tiene afinidad a unirse aun DNA, pues se introducen entre
sus bases apiladas. Esto se debe a su geometra plana y a su estructura aromtica,
que interacciona favorablemente con el interior hidrfobo de doble hlice.
Una cadena aliftica larga que hace conectar entre ambos ncleos intercalantes, por
otra parte su ligera carga positiva facilita su unin al DNA.
Su actividad deriva as mismo de su fluorescencia.
En su forma libre los dos ncleos aromticos interaccionan entre si y por ello la
molcula apenas es fluorescente. Al unirse al DNA los dos ncleos se separan y al
encontrarse en un entorno hidrfobo, emiten fluorescencia intensa.
6. Existen otros colorantes adems del rojo Texas para hacer visible el DNA en el gel
de agarosa?
Bromuro de etidio: se trata de un compuesto intercalante, e decir que tiene
afinidad para unirse al DNA pues se une en las bases apiladas.
En la electroforesis se ocupa para teir el DNA, para revelar su posicin en el
gel. Se puede baar el gel tras una electroforesis en una disolucin de bromuro
de etidio o bien incorporar este a la disolucin de agarosa o con lo que se
prepare el gel.

Hydra Green: no es un agente intercalante ya que no se intercala en el espacio


de los pares de bases, si no que asocia a la molcula de DNA intercalando con
la hendidura menor del DNA.

7. Por qu se utilizan celdas de cuarzo y no de plstico para leer el DNA en el


espectrofotmetro?
Debido a que las celdas de vidrio o plstico absorben una cantidad significante de
luz, nos impediran lecturas correctas de la muestra, por el contrario el cuarzo no
absorbe tanta cantidad de luz, por lo que favorecen la lectura de la muestra.

8. Por qu se lee el DNA en absorbancia de 260 a 280para ver su pureza?


Los cidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia
de bases aromticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas nitrogenadas de DNA.
La absorbancia de UV de DNA es una caracterstica de la molcula, que es usada
eficientemente para determinar su concentracin. Cada uno de las bases tiene su
propio y nico espectro de absorbancia y por lo tanto contribuye de manera diferente
a la propiedad total de la absorcin de UV en una molcula de DNA. para muchas
aplicaciones, el porcentaje de distribucin de cada uno de las bases al espectro de
absorcin de UV de una molcula de DNA de doble cadena de alto peso molecular
puede ser ignorado. Sin embargo esas contribuciones son ms significativas cuando
se trata de oligonucletido y deben ser consideradas si se requieren determinar
correctamente la concentracin.

9. Cmo se llama el equipo que permite visualizar DNAg?


Transiluminador UV, es un equipo que usa el principio de luz UV con diferentes
longitudes de onda como recurso para observar analizar y formar fotografas de
protenas, aminocidos, pptidos, cidos nucleicos en geles de agarosa con
colorantes como el bromuro de etidio.
10. Cul es el porcentaje adecuado de agarosa para realizar el gel de acuerdo al PM
(pb)?
La concentracin de agarosa que se ocupa comnmente para separar cidos
nucleicos, se encuentra en el rango de 0.5%-4% (incluso 0.3%si se utiliza agarosa
DS) en este caso se ocupar una concentracin de 1%.

La concentracin adecuada en cada caso depende del tipo de agarosa y el tamao de


los fragmentos que se quieren separar. Como regla general ay que tener en cuenta
que a mayor concentracin menor es el tamao de los fragmentos que se separan

VI.- CONCLUSIONES

La obtencin de ADNg no fue homogneo, debido a que se obtienen purezas de


1.301 y 1.310, para concentraciones de 1550 y 350 respectivamente.
La electroforesis nos confirma la pureza de la muestra obtenida en las lecturas de
absorbancia debido a que se alcanza a apreciar parcialmente las bandas.
Las condiciones de recoleccin de muestra tienen repercusiones en la integridad de la
muestra al momento de la extraccin de DNAg
El uso de un colorante para el corrimiento de la electroforesis es til para ubicar a
nuestra muestra y as evitar que se salga del carro.

Los mtodos espectrofotomtricos para obtener datos del factor de pureza y la


electroforesis en gel de agarosa son mtodos que nos permiten identificar el ADN
extrado con la metodologa seguida.
Se comprendi la importancia de los hongos en la industria farmacutica y la
utilidad de la ingeniera gentica para mejorar procesos de produccin.

VII.- MEMORIA DE CLCULO

o Solucin de acetato de sodio


PM= 28.0343g/mol
V= 10ml

w
M=
PM L
w=MPML
mol
w=3 ( 0.01 L ) (83.0343 g /mol)
L
w=2.4610 g

o Buffer de extraccin
Tris HCl pH 8.0 Ci= 1000mM:100mMVf=7.2ml
Na2EDTA pH8.0 Ci=500mM:20mMVf=2.88ml
NaCl 2.10g, SDS(1%) 0.72ml Vf=72ml

Tris HCl
1000 mM ( 72 ml )
Vf= =7.2 ml
100 mM
Na2EDTA
20 mM (72 ml )
Vf= =2.88 ml
500 mM

NaCl 0.5M

w
M=
PM L
w=MPML
mol
w=0.5 ( 0.072 L ) (58.44 g/mol)
L
w=2.10 g

VIII.- REFERENCIAS

Francisco Fierro Fierro, "electroforesis de ADN [en linea] (ref: 9 febrero 2017) sitio
web: <www2.inecc.gob.mx>
Ivan Arenas Sosa, etal, "espectrofotometria de absorcion", Instituto de
biotecnologia, UNAM. Cuernavaca Morelos Junio 2004.
"electroforesis de proteinas y acidos nucleicos" [en linea] (ref:9 febrero 2012) sitio
web: <biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio/htm>
Antonio Gmez "caracteristicas y preparacion de buffer", [en linea] (ref:9 febrero
2012) sitio web:Antoniogomezmartin.wordpress.com