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ARTCULO DE INVESTIGACIN

Cultivo por lote de Wickerhamomyces anomalus en un


biorreactor a escala laboratorio para la produccin de una
poligalacturonasa
Batch culture of Wickerhamomyces anomalus in a lab scale bioreactor
for poligalacturonase production
Maria Alicia Martos*, Ana Paula Butiuk*, Natalia Lorena Rojas**, Roque Alberto Hours**

Resumen
Wickerhamomyces anomalus, una levadura aislada de frutas ctricas en la provincia de Misiones, Argentina, produce una
poligalacturonasa (endo-PG) con capacidad macerante de tejidos vegetales. El objetivo del presente trabajo fue determinar
los parmetros cinticos y estequiomtricos del crecimiento de W. anomalus y la produccin de la enzima poligalacturona-
sa en un medio de cultivo sinttico, operado en sistema por lote, en un biorreactor a escala laboratorio. Los cultivos se rea-
lizaron en un biorreactor de 4 l que contena 3 l de un medio sinttico compuesto por glucosa, pectina de citrus, vitaminas,
aminocidos, sulfato de amonio y sales, y se incubaron con agitacin y aireacin, a 30 C durante 12 h. El transcurso del
proceso fermentativo se sigui por medidas de biomasa, glucosa residual, actividad poligalacturonasa y contenido de O2 y
CO2 de los gases a la salida del reactor. La velocidad especfica de crecimiento mxima (m) de W. anomalus fue de 0,337
h-1 y el rendimiento de biomasa producida (Yx/s) de 0,401 gx/gs. Al finalizar el cultivo, la actividad PG en el sobrenadante fue
de PG de ~ 83,7 UE/ml. La actividad especfica y la productividad obtenidas fueron de ~ 1,91. 104 UE/gx y ~ 9.301 UE/l.h,
respectivamente. El cociente respiratorio fue cercano a 1 durante el proceso fermentativo. No se form ningn otro pro-
ducto, adems de biomasa y CO2. El cultivo por lote result ser una buena alternativa para la produccin de PG a partir de
W. anomalus, obtenindose un extracto con elevada actividad enzimtica, en un medio de cultivo sinttico y de bajo costo.
Palabras clave: Wickerhamomyces anomalus, poligalacturonasa, cultivo por lote, parmetros estequiomtricos, parmetros
cinticos.

Abstract
Wickerhamomyces anomalus, a yeast isolated from citrus fruit peels in the province of Misiones, Argentina, produces a
polygalacturonase (endo-PG) with maceration activity of vegetable tissues. The objective of the present work was to deter-
mine kinetic and stoichiometric parameters of W. anomalus growth and polygalacturonase production in a synthetic culture
medium, operating in a batch-type bioreactor at laboratory scale. Cultures were performed in a bioreactor of 4 l, containing
3 l of a synthetic medium composed of glucose, citrus pectin, vitamins, amino acids, ammonium sulfate and salts, and were
incubated with agitation (450 rpm) and aeration at 30 C, during 12 h. The course of the fermentation process was followed
by measuring biomass, residual glucose, polygalacturonase activity and O2 and CO2 content of outlet gases from the reac-
tor. The maximum specific growth rate (m) of W. anomalus was 0.337 h-1 and the biomass yield (Yx/s) was 0.40 gx/gs. At the
end of the culture, PG activity in the supernatant was ~84 UE/ml. The specific activity and the productivity obtained were
~1.91 104 UE/gx and ~9,301 UE/l.h, respectively. Respiratory quotient was approximately 1.0 throughout the fermentation
process. No other product different from biomass and CO2 was detected. Batch culture could be an adequate alternative
for the production of polygalacturonase from W. anomalus and an extract with high enzymatic activity using a synthetic and
economic culture medium could be obtained.
Key words: Wickerhamomyces anomalus, polygalacturonase, batch culture, kinetic parameters, stoichiometric parameters.

Recibido: febrero 5 de 2014 Aprobado: octubre 20 de 2014

* Facultad de Ciencias Exactas, Qumicas y Naturales, Universidad Nacional de Misiones, Misiones, Argentina. amartos@fceqyn.unam.edu.ar.
** Centro de Investigacin y Desarrollo en Fermentaciones Industriales (CINDEFI), Universidad Nacional de La Plata - CONICET, La Plata,
Argentina.

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Introduccin la realizacin de estudios relacionados con su produc-
Las enzimas pcticas son las responsables de la degra- cin a mayor escala.
dacin de las pectinas presentes en la laminilla media El presente trabajo tuvo como objetivo estudiar el cre-
y en la pared celular primaria de las plantas superiores. cimiento de W. anomalus y la expresin de la enzima
Segn su modo de accin se clasifican en: poligalactu- poligalacturonasa en un medio de cultivo sinttico y
ronasa (PG), pectinesterasa (PE), pectinliasa (PL) y pec- de bajo costo en un biorreactor a escala laboratorio,
tatoliasa (PAL). Algunas pectinasas tienen la capacidad operado en sistema por lote.
de hidrolizar restringidamente la protopectina presente
en los tejidos vegetales, liberando pectina soluble con Materiales y mtodos
la consiguiente separacin de las clulas sin producir
mayores daos, proceso denominado maceracin. Microorganismo
De este modo las clulas conservan muchos de sus
compuestos intracelulares, entre los cuales se cuentan Wickerhamomyces anomalus, aislada a partir de frutas
carotenoides, vitaminas (C, B6, B9 y E) y flavonoides, ctricas en la provincia de Misiones, Argentina (Martos
compuestos que poseen reconocidos beneficios sobre et al., 2013a).
la salud. El proceso de maceracin mediante enzimas
pcticas es empleado en la industria alimenticia para Medios de cultivos
la obtencin de alimentos destinados a nios y adultos
mayores (Jayani et al., 2005; Tari et al., 2007). a) Medio de conservacin (medio YM): extracto de le-
vadura (Sigma), 5 g/l; triptona (Difco-Becton Dickin-
Las enzimas pcticas son producidas por una gran va- son), 5 g/l; glucosa bacteriolgica (Britania), 10 g/l;
riedad de microorganismos como hongos filamento- agar-agar (Britania) 18 g/l, a pH 5,0.
sos, levaduras y bacterias. La produccin de pectinasas
de levaduras tiene algunas ventajas en comparacin b) Medio de fermentacin: glucosa bacteriolgica
con la produccin a partir de hongos filamentosos. Las (Britania), 10 g/l; pectina de citrus (Parafarm), 5 g/l;
levaduras son organismos unicelulares por lo que su (NH4)2SO4, 3 g/l; KH2PO4, 1 g/l; MgSO4, 0,5 g/l; CaCl2,
crecimiento es relativamente simple y fcil de cambiar 0,1 g/l; solucin de vitaminas (1000 ), 1 ml/l; solucin
de escala y a muchas de ellas se las considera como de aminocidos (100 ), 10 ml/l; solucin de microele-
microorganismos GRAS (Generally Recognized as mentos 1000 , 1 ml/l; pH 5,0.
Safe) (Souza et al., 2003; da Silva et al., 2005). Solucin (1000 ) de vitaminas (Sigma) (g/l): biotina,
2; pantotenato de Ca, 400; cido flico, 2; inositol,
Teniendo en cuenta que el costo de los medios de
2000; niacina, 400; cido p-aminobenzoico, 200; piri-
fermentacin es uno de los factores determinantes en
doxina, 400; riboflavina, 200; tiamina, 400.
la produccin de enzimas pcticas, es importante for-
mular medios de cultivos con el menor costo posible y Solucin (100 ) de aminocidos (Sigma) (mg/l): histi-
que al mismo tiempo provean los requerimientos nutri- dina, 10; metionina, 20 y triptfano, 20.
cionales necesarios para el crecimiento adecuado del Solucin de microelementos 1000 (g/l): H3BO3,
microorganismo y la produccin enzimtica (Nigho- 500; CuSO45H2O, 40; Kl, 100; FeCl36 H2O; 200; Mn-
jkar et al., 2006). Los medios de cultivos definidos son SO4H2O, 400; NaMoO42H2O, 200; ZnSO47H2O,
convenientes porque brindan no solo reproducibilidad 400.
al sistema, sino tambin pureza para las protenas que
son secretadas al medio. La FCE (glucosa y pectina), el sulfato de amonio, los
fosfatos, el resto de las sales (MgSO4, CaCl2, solucin
Una levadura pectinoltica fue aislada a partir de csca- de microelementos) y los aminocidos, fueron esteri-
ras de frutas ctricas en la Provincia de Misiones, Argen- lizados por separado, en autoclave 15 min a 121 C,
tina, la cual fue identificada como Wickerhamomyces previo ajuste del pH a 5,0. La solucin de vitaminas
anomalus, reclasificacin de la especie Pichia anomala se esteriliz por filtracin utilizando membranas de
(Passoth et al., 2011). W. anomalus, al crecer en un me- nitrato de celulosa de 0,22 m de tamao de poro
dio de cultivo compuesto por Base Nitrogenada para (Sartorius). Antes de su utilizacin, se mezclaron las
Levaduras (Yeast Nitrogen Base, YNB), glucosa como cantidades correspondientes de cada una de las solu-
fuente de carbono y energa (FCE) y pectina de citrus ciones en forma asptica y se midi el pH del medio
como inductor, excreta al medio una enzima con ac- completo.
tividad poligalacturonasa (endo-PG, EC 3.2.1.15). Esta
enzima es de gran importancia industrial ya que posee Crecimiento de W. anomalus en un biorreactor
actividad protopectinasas (PPasa) o capacidad mace-
rante de tejidos vegetales (papa, mandioca, zanahoria,
a escala laboratorio
etc.) (Martos et al., 2013a, Martos et al., 2013b). La Inculo: se inocularon tres frascos Erlenmeyers de 500
potencial aplicacin industrial de esta enzima justifica ml que contenan 95 ml del medio de fermentacin,

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con 5 ml de inculo (DO620 = 0,96) proveniente de un VL: volumen de medio (l).
cultivo joven (24 h) de W. anomalus en medio YM. Los T0 y T: 273 K y temperatura de trabajo respectivamente.
mismos se incubaron a 30 C con agitacin (180 rpm), Po y P: 760 mmHg y presin de trabajo respectivamente.
durante 20 h. Al cabo de este tiempo, los cultivos (300 22,4: volumen (l) ocupado por un mol de gas en condicio
ml) se cosecharon por centrifugacin a 4068 g a 5 C, nes normales de temperatura y presin.
durante 10 min. El sobrenadante se descart y las clu- Xo2 y fraccin molar de oxgeno y anhdrido carbnico,
las se suspendieron en 100 ml de agua destilada estril. XCO2: respectivamente.
Fermentacin: Se utiliz un biorreactor LKB (Bromma, El coeficiente respiratorio (CR) se calcul como la rela-
Suecia) de 4 l de capacidad. El mismo fue esterilizado cin entre la velocidad de formacin de CO2 (rCO2) y la
en autoclave (121 C, 15 min) con la solucin de glu- velocidad de consumo de O2 (rO2).
cosa y pectina a la que se le agreg 500 l de aceite
de silicona como antiespumante (Sigma). El resto de las La cantidad total de O2 consumido y de CO2 produ-
soluciones de nutrientes (aminocidos, vitaminas, sales) cido durante el cultivo se calcul como la integral de
y la suspensin de clulas se mezclaron, antes de su uti- las respectivas velocidades en funcin del tiempo, em-
lizacin, en un frasco Erlenmeyer de 1000 ml con salida pleando el programa Sigma Plot:
lateral y se utiliz inmediatamente para inocular el bio-
rreactor e iniciar el proceso fermentativo, obtenindose Determinaciones analticas
un volumen final de 3 l. El cultivo se agit a 450 rpm y
se le suministr aire estril con un caudal de 2,82 l/min. Actividad poligalacturonasa: la actividad PG se midi
0 2 total consumido tt f0 r02 dt
Luego de 5 min se comenzaron a tomar muestras;
las mismas fueron centrifugadas a 6505 g, durante C 0 2 total producido tf
rC02 dt
t0
5 min a 5 C. Las clulas decantadas se usaron para
medir biomasa por peso seco y el sobrenandante se utilizando como sustrato 2 g/l de cido poligalactur-
utiliz para medir pH, glucosa residual y actividad PG.
nico (APG, Sigma), en buffer acetato de sodio/cido
Los cultivos se realizaron por duplicado y se tomaron actico 0,2 M, pH 5,0. La reaccin se efectu a 37
para los clculos los valores promedios. C, 10 min y se determinaron los grupos reductores
liberados por el mtodo del DNS (Miller, 1959). Como
Medida de gases: Las medidas del contenido en O2
y en CO2 de los gases de salida del reactor fueron referencia se utiliz cido galacturnico (Sigma). Una
realizadas mediante un detector de tipo paramagn- unidad enzimtica (UE) se defini como la cantidad de
tico (Servomex, UK) y un detector infrarrojo (Horiba enzima que libera 1 mmol del monmero correspon-
Pir 2000, Japn), respectivamente. Con estos datos y diente por min en las condiciones de ensayo.
el valor del caudal de aire se determinaron las veloci- Determinacin de biomasa: el crecimiento microbiano
dades de consumo de O2 y produccin de CO2, en (g/l) se determin por medidas de peso seco. Luego
condiciones normales de presin y temperatura, me- del proceso de centrifugacin, las clulas fueron lava-
diante las siguientes ecuaciones que surgen de balan- das con agua destilada, centrifugadas y colocadas en
ces de materia en fase gaseosa y lquida, planteadas estufa a 80 C, hasta peso constante (Cavalitto et al.,
por Cooney et al. (1977) (ec. 1 y ec. 2): 2000).
(X 02 )1 Glucosa residual: se utiliz el mtodo de glucosa oxi-
FG 0,79 60 T0 P 1 ( X ) (X )
ro2
02 1 CO2 1
(ec. 1) dasa-peroxidasa (Glicemia, Wiener, Argentina).
VL T 22,4 P0 ( X 02 )2
1 ( X ) ( X )
Las determinaciones se realizaron por triplicado y se
02 2 CO2 2 tomaron para los clculos los valores promedios.
( X C 02 )1
FG1 0 ,79 60 T0 P 1 ( X ) (X ) (ec. 2) Resultados y discusin

02 1 CO2 1
rCO2
VL T 22,4 P0 ( X C 02 )2 En la figura 1 se presentan los perfiles de crecimiento
1 ( X ) ( X )
02 2 CO 2 2
y concentracin remanente de la FCE (glucosa) y en la
figura 2 los valores de actividad PG y pH, durante el
Los subndices 1 y 2 representan valores a la entrada y cultivo de W. anomalus en el biorreactor, operado en
salida del reactor respectivamente. sistema por lote.
Siendo: En la figura 1 se observa que a las 8 h de cultivo se con-
ro2: velocidad de consumo de O2 (moles/l.h). sume la mayor parte de la FCE y finaliza el crecimiento
rCo2: velocidad de produccin de CO2 (moles/l.h). exponencial. La biomasa total producida fue de 4,013
FG: caudal de aire (l/min). 0,26 gx/l, obtenindose un rendimiento (Yx/s) de
0,79: fraccin molar de nitrgeno en el aire. 0,401 gx/gs (yx/s = 0,466 C-molx/C-mols) en base a glu-
60: factor que convierte minutos a hora. cosa. De la curva de crecimiento microbiano se deter-

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Figura 1: Evolucin del cultivo de W. anomalus. Smbolos: Figura 3: Velocidad de consumo de O2 (r O2) y velocidad de
biomasa (), glucosa (). formacin de CO2 (r CO2) durante el cultivo de W. anomalus.
Smbolos: r O2 () y r CO2 ().

mento equivalente en la concentracin de protones


en el medio de cultivo, con el consiguiente descen-
so continuo en el pH, resultado que efectivamente se
observ considerando que el mismo disminuy en el
transcurso de la fermentacin desde un valor inicial de
4,72 hasta valores cercanos a 2,6 al finalizar el cultivo
(Fig. 2). Estos bajos valores de pH alcanzados, podran,
de prolongarse el cultivo, afectar la estabilidad de la
enzima PG, ya que en estudios previos se determin
que la enzima permanece estable en un rango de pH
Figura 2: Produccin de PG y valores de pH en el cultivo de entre 3,0 a 6,0 (Martos et al., 2013b).
W. anomalus. Smbolos: actividad PG (), pH (). En la figura 3 se presentan las respectivas velocidades
de consumo de O2 (rO2) y formacin de CO2 (rCO2), en
min un valor de m de 0,337 h-1 (R2: 0,920), similar al el transcurso del cultivo. Como puede observarse, los
reportado en trabajos anteriores para el cultivo de W. picos de las velocidades de consumo de O2 y produc-
anomalus en frascos agitados, usando el medio YNB, cin de CO2 se obtuvieron alrededor de las 8 h y lue-
adicionado con glucosa y pectina de citrus (m: 0,346 go disminuyeron al consumirse totalmente la glucosa.
h-1) (Martos et al., 2013a). Las curvas de ro2 y rCO2 corrieron paralelas, indicando
que el CR fue cercano a 1 durante todo el tiempo de
Los valores de m y rendimiento obtenidos en el pre- fermentacin, valor razonable para un metabolismo
sente estudio son similares a los informados para el completamente respiratorio.
crecimiento de la mayora de las levaduras sobre mo-
nosacridos. As, Geotrichum klebahnii, al crecer en Estudios previos indicaron que la levadura W. anomalus
un medio sinttico, present un rendimiento (Yx/s) de es incapaz de utilizar pectina, cido poligalacturnico o
0,49 gx/gs, y un valor de m de 0,47 h-1 (Cavalitto et al., sus productos de hidrlisis (cido galacturnico) como
2000), mientras que una cepa de S. cerevisiae Narince FCE pero los necesita para inducir la sntesis de la en-
3, aislada de uvas present un valor de m de 0.535 h-1 zima (Martos et al., 2003a). Por lo tanto, el crecimien-
al crecer en un medio de cultivo que contena glucosa, to de W. anomalus en el medio sinttico, utilizando
extracto de levadura y sales (Karasu Yalin & zbas, glucosa como FCE, amonio como fuente de nitrgeno
2004). y asumiendo biomasa estndar (CH1,8O0,5N0,2), puede
ser representado mediante la siguiente ecuacin este-
En la figura 2 se observa que la produccin detectable
quiomtrica (expresada en C-mol):
de PG comenz a las 2 h, obtenindose al finalizar el
cultivo un valor de actividad PG de 83,7 1,79 UE/ml. CH2O + a NH3 + bO2 yx/s CH1,8O0,5N0,2 +
La sntesis de la enzima estuvo directamente asociada
al crecimiento. yCO2/S CO2 + yp/sCHaObNc + wH2O
Siendo:
En este cultivo se utiliz (NH4)2SO4 como fuente de
nitrgeno. Si bien el uso de una sal de amonio sim- a: moles de nitrgeno consumido/C-mol de FCE
plifica el proceso de esterilizacin (puede hacerse en b: moles totales de O2 consumido/C-mol de FCE
autoclave conjuntamente con el resto del medio), es yx/s: C-mol de biomasa producida /C-mol de FCE (rendi
sabido que el consumo de amonio implica el incre- miento de biomasa)

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yco2/s: moles totales de CO2 producidos/C-mol de FCE. alta densidad, lo que podra potenciar la expresin de
yp/s: C-moles de producto/C-mol de FCE. la enzima, aumentando la productividad del proceso.
Aplicando balances de carbono y grado de reduccin
Conclusiones
a la ecuacin de crecimiento microbiano se obtienen
las siguientes ecuaciones: El crecimiento de Wickerhamomyces anomalus en un
biorreactor de 4 l, operado mediante sistema tipo por
1 yx/ s yp / s y CO2/ s (ec. 3) lote y usando un medio de cultivo a base de glucosa
x 4 b como FCE, pectina Cooney como inductor y sulfato
yx/ s yp / s p 1 (ec. 4) de amonio como FN, se desarroll con una velocidad
s s s de crecimiento mxima de 0,337 h-1. Se alcanz un
rendimiento de biomasa de 0,401 gx/gs y una activi-
Siendo s grado de reduccin del sustrato; x grado de dad enzimtica de ~ 84 UE/ml. Adems, se obtuvo
reduccin de la biomasa, p grado de reduccin del una actividad especfica de ~1,91.104 UE/gx y una pro-
producto. ductividad de ~9.301 UE/l.h. Bajo estas condiciones
La tabla 1 muestra los valores de los parmetros este- de operacin no se present formacin de productos
quiomtricos del cultivo y los resultados del balance carbonados diferentes a biomasa y CO2.
de carbono (ec. 3) y balance de grado de reduccin El cultivo en sistema por lote result ser una buena
(ec. 4), los que permiten determinar si se form algn alternativa para la produccin de PG por W. anoma-
producto y si hubo consistencia interna en los resul- lus, obtenindose un extracto enzimtico con elevada
tados experimentales obtenidos. Los valores de gra- actividad enzimtica en un medio de cultivo sinttico
do de reduccin se determinaron considerando NH3 y de bajo costo.
como nivel de referencia.
Los resultados obtenidos en los balances de carbono Referencias bibliogrficas
(ec. 3) y grado de reduccin (ec. 4) indican que, en las Cavalitto, S.F.; Hours, R.A.; Mignone, C.F. 2000. Growth and proto-
condiciones de crecimiento, no hubo generacin de pectinase production of Geotrichum klebahnii in batch and
ningn producto carbonado diferente a la biomasa y continuous cultures with synthetic media. J. Ind. Microbiol Bio-
CO2. Segn fue informado por otros autores, P. ano- technol. 25: 260-265.
Cooney, C.; Wang, H.; Wang, D. 1977. Computer-aided material
mala (W. anomalus) es producida de manera eficiente
balancing for prediction of fermentation parameters. Biotech-
considerando que es una levadura que presenta efec- nology and Bioengineering. 19: 55-67.
to Crabtree negativo, es decir que respira y produce Da Silva, E.G.; de Ftima Borges, M.; Medina, C.; Piccoli, R.H.;
biomasa en presencia de O2, independientemente de Schwan, R. F. 2005. Pectinolytic enzymes secreted by yeasts
la concentracin de azcar presente en el medio (Pas- from tropical fruits. FEMS Yeast Res. 5(9): 859-865.
soth et al., 2011). Jayani, R.S.; Saxena, S.; Gupta, R. 2005. Microbial pectinolytic enzy-
mes: A review. Process Biochem. 40(9): 29312944.
La actividad especfica obtenida fue de 1,91. 104 290 Karasu, Yalin S.; zbas, Z.Y. 2004. Effects of different substrates on
UE/gx y la productividad de 9.301140 UE/l.h. growth and glycerol production kinetics of a wine yeast strain
Saccharomyces cerevisiae Narince 3. Process Biochem. 39(10):
Al hacer una estimacin de costos, se obtuvo un valor 12851291.
de ~ US$ 2, para 4 l de medio de cultivo utilizado en el Martos, M.A.; Zubreski, E.R.; Combina, M.; Garro, O.A.; Hours, R.A.
presente estudio (medio de fermentacin). 2013a. Isolation of a yeast strain able to produce a polygalac-
turonase with maceration activity of cassava tissues. Food Sci
Considerando que la sntesis de la enzima estuvo Technol. 33 (2): 332-338.
directamente asociada al crecimiento, los datos ci- Martos, M.A.; Zubreski, E.R.; Garro, O.A.; Hours, R.A. 2013b. Pro-
duction of Pectinolytic Enzymes by the Yeast Wickerhanomyces
nticos obtenidos en el presente estudio se podran anomalus Isolated from Citrus Fruits Peels. Biotechnol Res Int.
utilizar para el diseo de un cultivo por lote alimenta- 1: 1-7.
do. En dichos cultivos, la alimentacin restricta del nu- Miller, G.L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determina-
triente limitante permite que las clulas crezcan a una tion of reducing sugar. Anal Chem. 31(3): 426428.

Tabla 1: Parmetros estequiomtricos del cultivo de W. anomalus

O2 total CO2 total yx/s yco2/s b


Bal. C Bal.
(moles) (moles) (C-mol) (molCO2/C-molFCE) (molO2/C-molFCE)
0,187 0,182 0,466 0,543 0,555 1,008 1,043

Bal. C: balance de carbono. Bal. : balance de grado de reduccin.

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Nighojkar, S.; Phanse, Y.; Sinha, D.; Nighojkar, A.; Kumar, A. 2006. Souza, J.V.B.; Silva, E.S.; Maia, M.L.S.; Teixeira, M.F. 2003. Screening
Production of polygalacturonase by immobilized cells of As- of fungal strains for pectinolytic activity: endopolygalacturona-
pergillus niger using orange peel as inducer. Process Biochem. se production by Paecilomyces clavisporus 2A.UMIDA.1. Pro-
cess Biochem. 39:455-458.
41(5):1136-1140.
Tari, C.; Ggus, N.; Tokatli, F. 2007. Optimization of biomass, pe-
Passoth, V.; Olstorpe, M.; Schnrer, J. 2011. Past, present and future llet size and polygalacturonase production by Aspergillus sojae
research directions with Pichia anomala. Antonie Van Leeuwen- ATCC 20235 using response surface methodology. Enzyme Mi-
hoek. 99(1): 121125. crobial Technol. 40(5): 1108-1116.

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