Microbiologa, Universidad del Tolima

OBSERVACIN DE BACTERIAS Y MTODOS DE TINCIN

Docente: Maryeimy Varn Lpez

Barrero CI, Gaitn JII, Orjuela JIII, Prez AIV

INTRODUCCIN emitida como resultado del cambio en el nivel

Los microorganismos son seres vivos
diminutos que individualmente suelen ser
demasiado pequeos para ser observados a
simple vista. El grupo incluye bacterias,
hongos, protozoos y las algas microscpicas.
Tambin incluye los virus, viroides y priones,
entidades no celulares que a veces se
consideran en el lmite entre lo vivo y lo
inerte. (Tortora, 2007). Los microorganismos
son capaces de realizar sus procesos vitales de
crecimiento, generar energa y reproduccin,
independientemente de otras clulas, sean de
la misma clase o de otra diferente (Brock et
al, 2004).
Como casi todos los microorganismos, son
casi incoloros cuando se les observa a travs
de un microscopio, a menudo es preciso
prepararlos para la observacin y una de las
maneras de hacerlo consiste en someterlos a
tincin. (Tortora, 2007). Aunque los
microorganismos vivos se pueden observar
directamente en fresco al microscopio ptico,
la mayora de las veces es necesario teirlos
para que por medio del uso de colorantes, sea
mucho ms fcil su identificacin, adems, la
presencia de ciertas estructuras, as como su
reaccin a determinadas tcnicas, nos permite
clasificar a las bacterias. (Lpez et al, 2013)
Qumicamente, los colorantes estn
constituidos de un componente cromforo y
un auxcromo. El cromforo es una molcula
con capacidad de que sus electrones absorban
energa o luz visible, se exciten y emitan
diversos colores de acuerdo con la longitud de
energtico. Los auxcromos son grupos
funcionales o radicales que constituyen una
molcula y poseen carga parcial positiva;
tienen la funcin de intensificar la formacin
de color mediante la accin de grupos de
tomos no saturados; su funcin es desplazar
a los cromforos hacia longitudes de ondas
largas para aumentar la intensidad. (Lpez et
al, 2013)
Las tinciones se pueden clasificar como
simples cuando toda la muestra se tie del
mismo color y se utiliza un solo colorante;
tincin diferencial cuando se visualiza ms de
un color porque se utiliza ms de un
colorante; tincin especifica cuando se
utilizan anticuerpos marcados con una
molcula fluorescente para identificar una
estructura celular en particular. (Lpez et al,
2013)
Es importante su investigacin en el mbito
cientfico como educativo ya que los
microorganismos se encuentran implcitos en
nuestro ecosistema, en los procesos
fisicoqumicos que suceden constantemente
en la naturaleza y en nosotros mismos. El
correcto uso de los colorantes y el
procedimiento para teir bacterias es una
herramienta bsica para estudiantes de
microbiologa que brinda las bases para
futuros trabajos. El presente trabajo tiene por
objetivo ensear los fundamentos bsicos del
proceso de tincin, observacin de
microorganismos, reconocimiento de formas,
agrupaciones e importancia de los mismos.

I-II-III-IV Programa de Biologa, Facultad de Ciencias, Ibagu, 2016.

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MATERIALES Y METODOS Para la tincin de Ziehl Neelsen se us un cultivo

previamente realizado en el laboratorio, de dos
Se realiz diferentes montajes de bacterias para su
tipos de bacterias: Mycobacterias y
observacin con colorantes.
Staphylococcus sp, para lograr observar el
Para la Tincin de Gram se trabaj con cuatro contraste entre las bacterias Alcohol acido
muestras diferentes de bacterias: Proteus sp, resistentes (AAR) y las No Alcohol acido
Staphylococcus sp, Klebsiella sp y Bacillus sp. Se resistentes (NAAR). Se tom una muestra de
tom muestras de cada cepa de forma lquida y Mycobacterias y Staphylococcus sp, con ayuda de
slida. Para las muestras liquidas, se calent un un asa caliente de la caja de Petri donde se
asa en un mechero, se extrajo una gota de la encontraba, y se deposit sobre una gota de agua
muestra y se deposit sobre un portaobjeto, en un portaobjetos. Luego, se procedi a fijar la
siendo posteriormente fijada con ayuda del muestra y a realizar el procedimiento de tincin
mechero. Para las muestras slidas, se deposit que se presenta en la Grafica 2.
una gota de agua en un portaobjeto con ayuda de
un asa previamente calentada. Luego, al calentar
el asa de nuevo, se tom una pequea muestra de
la cepa encontrada en una caja de Petri y se
deposit sobre la gota de agua, realizando un leve
barrido para mezclar la gota con la muestra. El
proceso llevado a cabo para la coloracin se
presenta en la Grafica 1. Los lavados se realizaron
de forma paralela a la muestra para evitar daos.

Grafica 2. Diagrama de flujo del proceso de

tincin de Ziehl Neelsen.

Para la Tincin de Schaeffer y Fulton se utiliz un

solo tipo de bacteria, Bacillus sp, para la
observacin de sus endosporas y las clulas
vegetativas. Se realiz el proceso de tomado de la
muestra del medio slido para depositarlo en un
portaobjetos y ser fijado. Posteriormente, se
realiz el proceso para la tincin de las bacterias
que se muestra en la Grafica 3.

Grafica 1. Diagrama de flujo del proceso de

tincin de Gram.

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RESULTADOS

Al realizar la tincin de Gram a los cuatro tipos

de bacterias se obtuvieron diferentes resultados:

Staphylococcus sp (Ver Grafica 5)

Forma: Cocos
Tamao: 1 m
Asociacin: Racimos
Gram Positivos

Grafica 3. Diagrama de flujo del proceso de

tincin de Schaeffer y Fulton.

Finalmente, para la tincin negativa se us un solo

tipo de bacteria, Klebsiella sp, para la observacin
de sus capsulas. Se tom una muestra con ayuda
de un asa previamente calentada del cultivo Grafica 5. Observacin al microscopio
encontrado en una caja de Petri, se llev a una de Staphylococcus sp.
gota en un portaobjetos y se procedi a fijar. El
procedimiento realizado para la coloracin se Klebsiella sp (Ver Grafica 6)
puede observar en la Grafica 4. Forma: Bastones
Tamao: 1 m
Gram Negativos

Grafica 6. Observacin al microscopio

de Klebsiella sp.

Proteus sp (Ver Grafica 7)

Grafica 4. Diagrama de flujo del proceso de Forma: Bastones
tincin negativa. Tamao: 1 m
Gram Negativos

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Grafica 7. Observacin al microscopio Grafica 9. Observacin al microscopio de

de Proteus sp. Mycobacterias y Staphylococcus sp en tincin de
Ziehl Neelsen.
Bacillus sp
Forma: Bastones En la tincin de Schaeffer y Fulton se observ en
Tamao: 0,5 2,5 m verde las endosporas y en rosa los cuerpos
Asociacin: Cadenas vegetativos de Bacillus sp (Ver Grafica 10)
Gram Positivos

Grafica 10. Observacin al microscopio de

Grafica 8. Observacin al microscopio
Bacillus sp con tincin de Schaeffer y Fulton.
de Bacillus sp.
Al realizar la tincin negativa en Klebsiella sp se
observaron las capsulas de las bacterias como se
Al realizar la tincin de Ziehl Neelsen se observ
observa en la Grafica 11.
dos tipos de bacterias: Mycobacterias y
Staphylococcus sp, siendo las primeras Rosadas
(ARR) y las segundas Azules (NARR) como se
presenta en la Grafica 9.

Grafica 11. Observacin al microscopio de

Klebsiella sp y sus capsulas con tincin negativa.

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DISCUSIN
Tincin de Gram.
Esta tincin desarrollada por el doctor Christian
Gram en 1884, es hoy la ms utilizada en los
laboratorios de bacteriologa y permite, de
acuerdo con la estructura y grosor de la pared
bacteriana, agrupar las bacterias en Gram
positivas y en Gram negativas. Las Gram
positivas poseen una capa gruesa de
peptidoglicano y carecen de membrana externa,
mientras que las Gram negativas tienen una capa
ms delgada de peptidoglicano y poseen una
membrana externa. (Rodriguez et al, 2005). En
trminos generales, la tincin de Gram involucra
varios pasos como se observa en la Grafica 1: El
paso de decoloracin (Aplicar el alcohol acido en
la muestra) es el crtico de esta tincin, pues si se
exagera, decolora las Gram positivas y si se hace
muy dbil no decolora las Gram negativas.
(Rodrguez et al, 2015)
Adems de una excesiva decoloracin, otro factor
que puede influir en que las bacterias Gram
positivas se observen parcial o completamente
rosadas, es la edad del cultivo; las clulas viejas
tienden a perder su capacidad de retener el
complejo cristal violeta-yoduro y por lo tanto las
bacterias se vern rosadas. Otro factor de
variabilidad podra ser condiciones de estrs
durante el cultivo, que genera formas Gram
negativas no viables, dentro de un cultivo de
clulas Gram positivas. Debe prestarse atencin
a los lavados que se realizan al ir agregando los
diferentes reactivos, si se deja un exceso de agua
en la lmina los reactivos se diluirn,
especialmente el yoduro. (Rodrguez et al, 2015)
Al realizar el procedimiento de Tincin de Gram,
se observ que los microorganismos del gnero
Staphylococcus sp y Bacillus sp (Ver grafica 5 y
8) presentaron una coloracin morada,
caracterstica qumica que est ligada
ntimamente a la estructuracin de la envoltura
celular de estos microorganismos, la cual posee
una membrana citoplasmtica, y una pared celular
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compuesta por una gruesa capa de
peptidoglucano, que rodea a la anterior,
otorgndole a las clulas que poseen esta
estructuracin una resistencia mayor (Ghuysen,
1994), siendo la responsable de la retencin del
tinte en la Tincin de Gram; lo cual clasifica a
estos dos gneros de bacterias dentro del grupo de
las Gram positivas (Harris et al, 2002) (Kloss,
1997) (Gordon et al, 1973) (Sneath, 1986).
Al realizar el mtodo de la tincin de Gram en los
microorganismos de gnero Klebsiella sp y
Proteus sp (Ver grafica 6 y 7) se observ que
adquirieron una coloracin rosada, debido a que
estas presentan una doble membrana lipdica,
entre las que se localiza el espacio periplsmico,
en el que se encuentra una sustancia conocida
como periplasma, la cual contiene enzimas que
retienen la safranina utilizada en el proceso
(Ghuysen, 1994), por ende su coloracin y
clasificacin es en el grupo de las bacterias Gram
negativas; lo que concuerda con la literatura que
se tuvo en cuenta para esta discusin (Murray et
al, 2007) (Leal et al, 2006) (Hyle et al, 2005).
Algunas bacterias se clasifican como Gram
variables, pues simultneamente presentan
tincin de Gram positivas y de Gram negativas,
aun bajo condiciones ptimas de cultivo. Sin
embargo, en su estructura estas bacterias poseen
una pared de Gram positivas, aunque la capa de
peptidoglicano es ms delgada que la mayora de
las bacterias Gram positivas. (Rodriguez et al,
2005)
Tincin De Ziehl Neelsen.
Al finalizar el proceso de tincin segn el mtodo
Ziehl Neelsen, comparando bacterias del tipo
Mycobacterias y Staphylococcus sp, se observ
que las Mycobacterias presentaron una coloracin
rosada, lo cual indica que son Acido Alcohol
Resistentes (ARR), gracias a que en su pared
celular presenta una gran cantidad de cidos
grasos (cidos miclicos) de cadena larga, los
cuales confieren esa habilidad de resistir a la
decoloracin con alcohol-cido (Rosileia, 2006)
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(Zimmer et al, 1999); y los microorganismos del
gnero Staphylococcus sp presentaron una
coloracin morada, gracias a que presentan dos
membranas celulares, y una delgada pared celular
de peptidoglicanos en medio de estas (Ghuysen,
1994), lo que permite la retencin de colorantes
como la safranina, pero no evita la perdida de la
coloracin gracias al efecto del alcohol-cido, lo
cual expresa que son No Alcohol Acido
Resistentes.
Las Mycobacterias, a pesar de ser
filogenticamente Gram positivas, presentan una
capa externa con grandes cantidades de materiales
lipdicos, cidos micolicos, por lo que su pared es
hidrofbica. Por esta razn repelen el agua y son
impermeables a los colorantes y otros compuestos
qumicos en solucin acuosa. Para lograr teir
este tipo de bacterias, deben emplearse
procedimientos tintoriales especiales, entre ellos
la tincin de Ziehl Neelsen. (Rodrguez et al,
2015)
Tincin de Schaeffer-Fulton
La tcnica de tincin de esporas de Schaeffer y
Fulton permite visualizar las endosporas, que son
formas de resistencia, altamente deshidratadas y
con una serie de cubiertas muy poco permeables,
que hacen que sean difciles de teir, excepto si se
calienta la preparacin para permeabilizarlas; sin
embargo, pueden apreciarse en preparaciones a
fresco o con diversas tinciones, pues las esporas
aparecen como estructuras refringentes no
coloreadas. Las esporas son producidas por
Bacillus, Clostridium, Sporosarcina,
Sporolactobacillus y Desulfotomaculum, generos
de bacterias Gram positivas; aunque
recientemente han sido descritas en algunas
bacterias Gram negativas. (Rodrguez et al, 2015)
La tincin de Schaeffer y Fulton emplea verde
malaquita como colorante primario, el cual es
eliminado posteriormente del resto de la celula
bacteriana, pero no de la espora, mediante un
enjuague con agua. Como contra tincin, se
emplea safranina, la cual tie la clula vegetativa.
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(Rodrguez et al, 2015). Una vez finalizado el
proceso de tincin, se puede observar que las
endosporas de los microorganismos utilizados del
gnero Bacillus sp, adquieren la coloracin verde
y los cuerpos vegetativos adquieren una
coloracin rosada.
Tincin Negativa
Usar esta tincin permite identificar la estructura
externa que envuelve a algunas bacterias. Utiliza
como colorantes primario tinta china o Nigrosina.
La tcnica de tincin negativa usa un colorante
acido que se compone de partculas demasiado
grandes para penetrar la clula y de carcter
negativo. Por tanto, al examinar la preparacin las
capsulas aparecern como una zona transparente
que rodea a la pared celular, sobre un fondo negro.
(Rojas, 2011)
En este procedimiento se pudo comprobar el
contraste generado por el uso de tinta china en
organismos del gnero Klebsiella sp, gracias a
que las cpsulas de estos son principalmente una
capa de mucosas, ms o menos gruesas que
envuelven la pared celular de algunos
organismos; est tiene en sus componentes
principales gran cantidad de polisacridos,
mucopolisacaridos o polipptidos, los cuales al
tener gran contenido de agua, reaccionan
dbilmente al uso de cierto tipo de colorantes
(como la Tinta China); en el caso del gnero al
que se le aplic la tincin, al ser un organismo que
esporula, se puede analizar y visualizar a las
esporas como entes refringentes sobre un campo
oscuro (Woeste & Demchick, 1991).
Existe una tendencia a asociar a los
microorganismos solo con enfermedades
importantes como el SIDA, infecciones
desagradables o inconveniencias frecuentes
como el deterioro de los alimentos. Sin
embargo, la mayora de ellos realizan
contribuciones fundamentales al bienestar de
los habitantes del mundo porque ayudan a
mantener el equilibrio de los organismos
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vivos y las sustancias qumicas en nuestro
ambiente. (Tortora, 2007).
En el caso de Staphylococcus sp, los cocos se
asociaron por primera vez a enfermedades
humanas cuando fueron observados en
materiales purulentos provenientes de
abscesos humanos. En 1880 el cirujano
escocs Sir Alexander Ogston demostr que
cocos agrupados en forma de racimo eran la
causa de ciertos abscesos pigenos en
humanos. (Sejia, 2008). Los resultados
concuerdan con Sejia, 2008, quien deca que
se trata de cocos Gram positivos que poseen
tendencia a agruparse en racimos, tienen una
forma esfrica y un dimetro de alrededor de
una micra.
Por otro lado, el resultado de la tincin de
Bacillus sp concuerda con los resultados
obtenidos de Bartram, 2003, quien afirma que
los microorganismos del gnero Bacillus son
bacilos de gran tamao (4 - 10m),
grampositivos, aerobios estrictos o la endotoxina de pared, que es un
anaerobios facultativos encapsulados con una
caracterstica importante: forman esporas
extraordinariamente resistentes a condiciones
desfavorables.
Aunque la mayora de las especies de Bacillus
son inocuas, algunas son patgenas para las
personas y los animales. Bacillus cereus
causa una intoxicacin alimentaria similar a
la estafiloccica. Algunas cepas producen
una toxina termoestable en los alimentos que
se asocia con la germinacin de esporas y que
genera un sndrome de vmitos en un plazo
de 1 a 5 horas tras la ingestin. Otras cepas
producen una enterotoxina termolbil tras la
ingestin que produce diarrea en 10 a 15
horas. Se ha comprobado que Bacillus cereus
causa bacteriemia en enfermos
inmunodeprimidos, adems de sntomas
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como vmitos y diarrea. Bacillus anthracis
produce carbunco en personas y animales.
(Bartram, 2003)
Las infecciones por Bacillus sp se asocian con
el consumo de diversos alimentos,
especialmente arroz, pastas y hortalizas, pero
tambin leche cruda y productos crnicos. La
enfermedad puede producirse como
consecuencia de la ingestin de los
microorganismos o de las toxinas producidas
por stos. (Bartram, 2003).
En el caso de Klebsiella sp, se obtuvieron
resultados que son concomitantes con lo
descrito por Romero, 2007, quien afirma que
los miembros del genero de Klebsiella son
bacilos no flagelados, y por lo tanto son
inmviles. Cabe resaltar que poseen una gran
capsula caracterstica, que se pudo observar
igualmente con la tincin negativa. Los
factores de patogenicidad de este gnero son
la capsula, que es un factor antifagocitario, y
lipopolisacarido. La especie ms conocida de
Klebsiella es K. pneumoniae, ya que produce
la neumona. (Romero, 2007)
Las bacterias del genero Proteus incluyen
patgenos responsables de amplia gama de
infecciones para el hombre; sin embargo, es
encontrado en la flora intestinal normal.
Presentan flagelos, fimbrias, protenas de
membrana, ureasa, no producen toxinas
solubles y son resistentes a antibiticos (a
excepcin de P. mirabilis). (Baron, 1996)
Los resultados obtenidos son concomitantes
con la bibliografa citada de Baron, 1996,
quien afirma que Proteus son bacterias gram
negativas con forma de bacilo flagelados.
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CONCLUSIONES
Los mtodos de tincin son una base fundamental
para el estudio de los microorganismos, ya que
permiten el reconocimiento de estructuras y
estrategias de estos para subsistir bajo
condiciones adversas, y por ende, a descubrir
nuevos mtodos para su tratamiento y control. A
pesar de que la mayora de microorganismos no
son perjudiciales para el hombre, si se tienen en
altas concentraciones pueden llegar a ser muy
virulentos y/o patgenos.
El correcto uso de los colorantes y la buena
aplicacin de los protocolos para la tincin de los
microorganismos, permite tener una visin ms
acertada de las estructuras, estrategias, y formas
de vida que se tratan en el laboratorio en el mbito
investigativo y acadmico.
Se demuestra la importancia de microscopa al
momento de trabajar con organismos, como una
herramienta importante en el desarrollo de la
microbiologa, biologa molecular, bacteriologa,
entre otras ramas.
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