PRCTICA N 7

DETERMINACIN DE LA HEMOGLOBINA
Lic. Csar Martnez Valdivia

OBJETIVOS
Conocer y explicar el fundamento y la importancia de la determinacin de la
Hemoglobina.
Determinar y cuantificar los valores de la Hemoglobina.

INTRODUCCIN:

El Hierro

Es un oligoelemento que cumple rol importante en el organismo. Cuatro tomos de fierro

de la hemoglobina se unen lbilmente al oxgeno en cantidades variables en relacin a la
presin parcial de O2, actuando como transportadora de O2 de la atmsfera a los tejidos,
igualmente sucede con la mioglobina que se encuentra en los msculos. Iones ferrosos y
frricos se encuentran presentes en los citocromos y en muchas protenas presentes en
muchas clulas en relacin con ganancia o prdida de electrones:

Fe2+ ===== Fe3+ + e

Este proceso es importante en la cadena de transportadora de electrones.

La fuente alimentaria de fierro lo constituye los alimentos de origen animal; las carnes
contienen entre 2 a 3.5 mg/100 g, mientras que el hgado de vacuno contiene 6 mg/100 g, el
de cerdo es de 30 mg/100 g, en las aves es de 1.3 a 1.8 mg/100 g, en los huevos es - 1
mg/100 g, la leche y sus derivados casi no contienen este oligoelemento. Las legumbres
tienen un contenido de - 3 mg/100 g (espinacas).

Intercambio frrico en el organismo. En el organismo adulto se encuentra 4 g de fierro,

poco o casi nada del hierro es excretado por el intestino o los riones y el hierro corporal se
mantiene constante por absorcin controlada en cantidad suficiente a nivel intestinal para
remplazar las prdidas de las clulas descamadas y muertas de las superficies. Tambin se
pierde hierro cuando hay sangrado y en las mujeres mediante las menstruaciones, las cuales
llegan a ser igual a las de las descamaciones celulares. Durante la gestacin se requiere
hierro para el feto y la placenta y hay prdida durante el trabajo de parto, por lo tanto las
mujeres en esta etapa de la vida requieren dos veces ms hierro que el hombre.

La anemia debido a deficiencia de hierro es uno de los trastornos nutricionales ms

comunes a nivel mundial. Se presenta comnmente en mujeres con excesiva prdida
menstrual y en ambos sexos en las reas tropicales donde existe amplia infestacin de
anquilostomas, los cuales absorben sangre a nivel intestinal.

Excrecin. La excrecin de hierro es de 100 a 500 ug/24 horas, algo de este presente en los
hemates, leucocitos, y clulas epiteliales del sedimento. El hierro fecal corresponde, sobre
todo, a aquel no captado por la apoferritina, ms el de la descamacin intestinal.

La deficiencia de hierro, antes de producir anemia, pasa por las siguientes etapas:

a) prelatente, las reservas frricas se encuentran disminuidas, los niveles de ferritina srica
son u 12 u/dL, el hierro es an suficiente para suplir la mdula sea y no producir
variaciones en la hemoglobina

b) latente, existe disminucin del hierro srico e incremento de la TIBC, siendo el

indicador til el % de saturacin de transferirn (Fe srico/TIBC x 100); existe
reduccin del aporte frrico a la mdula sea. Una saturacin < 15% cursa con
disminucin de la hemoglobina; las protoporfrinas eritrocitarias se encuentran
elevadas, an antes que caiga la hemoglobina

c) anemia manifiesta, existe una restriccin tal de fierro hacia la mdula sea que ella se
manifiesta en los niveles de hemoglobina; al inicio los eritrocitos son normocticos y
normo crmicos, las cifras de protoporfrinas se elevan y la anemia se hace microcitica
e hipocrmica. En esta etapa la cada de hemoglobina traduce una deplecin frrica de
varios cientos de mg de hierro.
Mediante estudio con radioistopos se ha podido determinar que las prdidas de hierro
en sujetos sanos es de alrededor de 1 mg; la absorcin de una cantidad similar de hierro
de la dieta se acepta en la actualidad es suficiente para cubrir las necesidades del
organismo en ausencia de prdida sangunea.

Las mujeres pierden hierro a travs de las menstruaciones. En las mujeres britnicas y
suecas las prdidas sanguneas mensuales son de 20 a 40 mL por periodo, lo que
equivale de 2.5 a 5.0 g de hemoglobina con 8.6 a 17.1 ug de hierro, con la finalidad de
hacer frente a estas prdidas es necesario de 0.3 a 0.6 mg de hierro extra ..

Necesidades. La dieta de la mayor cantidad de personas proporciona 5 a 10 mg/da de

hierro, teniendo en cuenta el hecho de que solamente una parte es absorbida. En las
mujeres que menstran y en las gestantes estas necesidades son mayores hasta 15 a 25
mg/da cuando consumen alimentos de origen animal; estas necesidades son del orden
de 20 a 30 mg'/da si la alimentacin es a base de vegetales .

Absorcin. La cantidad de hierro absorbido de los alimentos depende de la forma del

fierro y de la constitucin de los alimentos. En los alimentos de origen animal la mayor
cantidad de fierro forma parte de del hierro hemnico y se encuentra como Fe2+. El
hierro hemnico se absorbe mejor que el hierro inorgnico proveniente de los vegetales
y es poco afectado por los otros componentes de la dieta.

El hierro de los alimentos vegetales es no hemnico y posee Fe3 + que se une a las
protenas, fitatos, oxalatos, fosfatos y carbonatos de manera insoluble.

Los cereales completos son ricos en fierro, pero este es pobremente absorbido; en
comunidades donde 70% de la energa proviene de cereales completos (cimos) las
ingestas diarias deben ser mayor de 20 mg/da. La adicin de vegetales verdes, frutas y
carnes en pequeas cantidades favorecen la absorcin del hierro de stas dietas
carenciales antes bien que mejorar la ingesta de protenas o de prevenir el escorbuto.
Los Taninos impiden la absorcin del fierro dietario, en cambio el alcohol puede
promoverla. El cido clorhdrico gstrico facilita la absorcin del hierro no heminico
por conversin del hierro frrico en ferroso .

Transporte. El hierro absorbido pasa directamente al torrente sanguneo y es

transportado unido a la transferirn formada principalmente en el hgado; su
concentracin srica es de 0.3 a 0.4 g/dL. Una molcula fija 2 tomos de fierro, as la
capacidad total de fijacin de hierro (TIBC) del plasma es de 0.31 a 0.51 mg/d; la
TIBC se incrementa en el embarazo por carencia de hierro. Normalmente la transferrina
no se encuentra totalmente esturada y en el plasma de sujetos sanos vara entre 0.08 y
0.16 mg/dl siendo ms baja en las mujeres que en los hombres.

Remocin. Como la vida media de los eritrocitos es de 120 das, 1/120 de la

hemoglobina corporal es degradada y re sintetizada diariamente. En este proceso cerca
de 20 mg de hierro debe ser transportado del bazo, hgado y otros tejidos linforetculares
donde se degradan los eritrocitos, hacia la mdula sea donde se forma otros. El hierro
intracelular (~ 500 mg) es reemplazado continuamente como se hace con el hierro de
las clulas intestinales descamadas. La remocin de hierro en este proceso es de cerca
de 15 mg/da, lo que da una remocin corporal total de 35 mg/da, cantidad mucho
mayor que 1 mg del absorbido diariamente por la dieta .

Almacenamiento. Se almacena hierro en las clulas como ferritina complejos solubles

de apoferritina + Fe3+ y como hemosiderina, complejo insoluble, probablemente
formado a partir de ferritina. El hierro almacenado en el organismo alcanza 1 g y lo
hace como ferritina cuando se incrementan las reservas la hemosiderina puede verse a
simple vista en el hgado y el bazo despus de agregar ferrocianuro de potasio,
formando azul de Prusia (ferrocianuro frrico). Esta condicin se conoce como
hemosiderosis.
Sobrecarga de fierro. Uno de los ejemplos es la hemosiderosis, error innato del
metabolismo del hierro; el defecto primario se encuentra a nivel de la absorcin
intestinal, depositndose el exceso de hierro a nivel de los tejidos: parnquima
heptico, glndulas endocrinas, pncreas, incluyendo a los islotes de Langerhans. Antes
que ocurra alteracin de los tejidos, la cantidad de hierro debe, por lo menos,
quintuplicarse. Tambin puede ocurrir sobrecarga de fierro cuando existe anemia
hemoltica.

La sobrecarga dietara de hierro se conoce como siderosis y ocurre cuando las ingestas
de hierro son altas, se puede llegar hasta ingestas mayores de 50 mg/da . En algunos
pases la sobrecarga de fierro proviene de los utensilios de cocina hechos en fierro o de
algunas bebidas fermentadas como la cerveza, puede ocurrir cirrosis heptica, igual
sucede cuando se consume vino y que este contiene > 100 mg/dl de fierro .

Consecuencias de la carencia de hierro. La manifestacin carencial de fierro ms

estudiada es la anemia ferro priva. Ella produce efectos deletreos en los individuos, en
especial en los nios; se observa fatigabilidad, bajo rendimiento en el trabajo fsico,
alteraciones en la regulacin de la temperatura corporal, mayor susceptibilidad a la
intoxicacin con plomo. Igualmente ocurre susceptibilidad a las infecciones; se ha
sealado al fierro como un factor de crecimiento bacteriano .

Recientemente se ha enfatizado el efecto sobre el proceso de desarrollo mental y motor

y disminucin en la capacidad de atencin y rendimiento escolar. Como interpretacin
se ha sealado disminucin de los receptores de dopamina D2 a nivel cortical, sin
embargo, ello no puede correlacionarse positivamente con las pruebas sobre desarrollo
que miden alteraciones de la conducta y presencia de anemia. La evidencia ms clara
de efecto causal se tiene a nivel de desarrollo del rea psicomotora. La administracin
de fierro mejora el rendimiento de dicha rea.

Mtodos de diagnstico e interpretacin. Existen diversas pruebas de laboratorio con

la finalidad de evaluar la deficiencia de hierro. Se debe tener en cuenta para su uso la
sensibilidad y la especificidad; la sensibilidad se refiere al porcentaje de sujetos
deficientes en hierro detectados por una prueba determinada y especificidad se define
como el porcentaje de sujetos normales clasificados como deficientes en hierro por
dicha prueba.

Las determinaciones ms utilizadas son: la determinacin de hemoglobina,

hematocrito, constantes corpusculares, hierro srico, capacidad total de fijacin de
fierro (TIBC), porcentaje de saturacin de transferrina, ferritina srica y protoporfrinas
libres eritrocitaria. Debe sealarse que estas pruebas no estn exentas de errores, siendo
importante el volumen de muestra utilizada y el proceso de la misma que puede
introducir errores con efecto multiplicador. Se utilizan alrededor de 0.2 ml de sangre
con excepcin de la determinacin de saturacin de transferrna y ferritina srica.

La determinacin de hemoglobina es la prueba ms sencilla, es rpido y de bajo costo.

Existe entrecruzamiento de valores normales y anormales, lo que hace difcil su
interpretacin, no correlacionando necesariamente las cifras de hemoglobina y las de
hierro srico, en cambio un incremento en las cifras de hemoglobina al administrar
suplementacin de hierro puede ser indicador de una deficiencia de dicho
oligoelemento.

La determinacin de hematocrito se hace mediante la cuantificacin de una columna

de hemates despus de haber centrifugado una muestra de sangre en un tubo
capilar. Es una tcnica rpida y de bajo costo. Es un buen indicador de estado
nutricional en dicho micronutriente.

Tanto la hemoglobina como el hematocrito se incrementan con la edad y, de otro

lado, es mayor en el sexo masculino que en el sexo femenino en la edad adulta; en
el geronte ambas tienden a disminuir y hacerse parecidos.

El fierro se encuentra en la sangre unido a una protena transportadora: la

transferrina. Ella se determina indirectamente a travs de la medicin de la TIBC.
Debe sealarse que el hierro srico muestra grandes fluctuaciones y parece tener un
ciclo nictemeral, es mas bajo en las maanas y ms alto en las tardes; tambin vara
con el sexo, los hombres poseen tasas mayores que las mujeres. La TIBC se
incrementa cuando existe deficiencia de hierro, an antes que ste disminuya.
La saturacin de transferrina es uno de los indicadores ms sensibles. Disminuye en
enfermedades inflamatorias adems de la carencia de fierro, hecho a tener en cuenta en
caso de estudios poblacionales.

La ferritina sirve para reconocer el estado de las reservas marciales. Una cifra u 12 ug/dL a
cualquier edad es indicativo de deplecin de las reservas frricas.

Las protoporfirinas libres eritrocitarias sirven para diferenciar la deficiencia de fierro de la

talasemia. Se pueden encontrar niveles altos no slo en caso de anemia ferropenia sino
cuando existe intoxicacin por plomo.

FUNDAMENTO:
El reactivo de Hemoglobina se basa en el mtodo de cianmetahemoglobina. Los eritrocitos
son lisados por accin de un agente tensioactivo presente en el reactivo, liberando su
contenido de Hemoglobina en la solucin.
La Hemoglobina liberada es oxidada a metahemoglobina por el ferricianuro, siendo esta
ltima convertida en cianmetahemoglobina por la presencia de cianuro. La absorbancia de
la cianmetahemoglobina es medida a 540 nm, siendo la intensidad de color obtenida
directamente proporcional a la concentracin de Hemoglobina en la muestra.

REACTIVOS :
Reativo de Hemoglobina:
Ferricianuro de Potasio 0.6 mM
Cianuro de Potasio 0.7 mM
Sterox-SE 1.0 ml/L

Standard Hemoglobina:
Metahemoglobina disuelta en reactivo de hemoglobina equivalente a 18 g/dl de
hemoglobina.
Es importante indicar que el reactivo se descartara si su coloracin es diferente al
amarillo, o en caso de aparicin de algn precipitado.
MUESTRA:
En la sangre total obtenida se utilizara al EDTA (cido etilendiaminotetracetico) como
anticoagulante. Tambin se puede utilizar como anticoagulantes al citrato, oxalato o
heparina, La muestra colectada con anticoagulante, es estable por una semana a temperatura
ambiente.
El EDTA es una solucin de sales sdicas y potsicas del cido etilendiaminotetracetico.
Las sales de sodio i potasio en este cido se comportan como poderosos anticoagulantes ya
que inhiben la participacin del in calcio en la cascada de la coagulacin de la sangre. El
EDTA no afecta la morfologa de las clulas hemticas y no modifica la velocidad de
sedimentacin globular.

PROCEDIMIENTO:
Preparacin de reactivo de trabajo:
Diluir el reactivo 1:10 con agua destilada antes de usar. La solucin Standard se provee lista
para su uso, medir su absorbancia directamente contra el blanco reactivo.

En tres tubos de prueba marcados B (Blanco), S (Standard) y MP (Muestra

Problema), Colocar:

TUBOS Blanco Standard Muestra Problema

Muestra 0 0 0.01ml
Standard --- 2.5 ml 0
Reactivo de
2.5 ml 0 2.5 ml
Trabajo

Mezclar e incubar 3 minutos a temperatura ambiente (sobre 20 C) o 10 minutos si la

temperatura ambiental es muy baja. Leer las absorbancias llevando a cero el equipo con el
Blanco Reactivo. El color obtenido es estable aproximadamente 1 hora.
CALCULO DE LOS RESULTADOS

[ Hemoglobina ] g/dl = Absorbancia MP x Fc

Fc = Standard Hemoglobina g/dl

Absorbancia Standard

VALORES DE REFERENCIA
Hombre : 13 16 g/dl
Mujer : 12 15 g/dl

Cuestionario
1. Qu es el efecto Bohr?..
2. Cul es la composicin de la hemoglobina fetal?
3. Por qu la hemoglobina fetal tiene menor afinidad por el 2,3 DPG que la HbA?
4. Qu diferencia existe entre hierro hemnico y hierro no hemnico?