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Ciencia y Tecnologa para la salud Visual y Ocular No 5: 51-58 / Julio - diciembre 2005

ARTCULO DE REVISIN DE TEMA

Citologa de impresin una tcnica novedosa y


sencilla para el diagnostico de alteraciones de la
superficie ocular
Martha Fabiola Rodrguez A.* / Patricia Hernndez Rodrguez**

RESUMEN
El presente artculo es una revisin de la tcnica de
citologa de impresin como herramienta
diagnstica para las alteraciones de la superficie
ocular. Se han utilizado un amplio rango de tcnicas
adaptadas a la citologa de impresin de conjuntiva
y cornea, como son: diferentes coloraciones para
observar las muestras en microscopio ptico,
microscopia electrnica, inmunofluorescencia,
inmunohistoquimica, reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) y citometra de flujo.
Actualmente, esta tcnica es muy utilizada como
una alternativa no invasiva para obtener biopsias
muy delgadas y clulas epiteliales de la superficie
ocular, especialmente porque no presenta efectos
colaterales o contraindicaciones. Ha sido
demostrado que es una ayuda diagnostica muy
utilizada en optometra y oftalmologa, en una gran
variedad de procesos a nivel ocular. Durante la
ltima dcada, su uso como herramienta de
investigacin y diagnstico ha experimentado un
enorme crecimiento y ha contribuido ampliamente
en el conocimiento de las patologas de la superficie
ocular.

Palabras claves: citologa de impresin, ojo seco,


PCR, immunohistoquimica, infecciones virales.

* Bacteriloga, Magster en Inmunologa. Docente Investigador, Facultad de Optometra. Universidad de La Salle.


Correo electrnico: martharodrguez@lasalle.edu.co
** Biloga, Epidemiloga, Magster en Biologa. Docente Investigador, Departamento de Ciencias Bsicas, Facultad de Optometra,
Universidad de La Salle. Correo electrnico: phernandez@lasalle.edu.co
Fecha de recepcin: octubre 24 de 2005.
Fecha de aprobacin: noviembre 8 de 2005.

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Ciencia y Tecnologa para la salud Visual y Ocular No 5 / Julio - diciembre 2005

INTRODUCCIN en etanol al 95% y se envan al laboratorio para


colorear con cido perydico de Schif (PAS) y
La citologa de impresin es una tcnica simple y hematoxilina, se pasan por xilol para deshidratar y
no invasiva, sirve para obtener biopsias de la aclarar el papel, finalmente se fijan en una lmina.
superficie ocular. Fue introducida por Egbert et al. Las muestras se estudian en el microscopio de luz
en 1977, los autores encontraron que se poda para determinar el numero de clulas
obtener una impronta de las capas del endotelio, al mucosecretantes y la relacin ncleo-citoplasma
ejercer presin sobre la conjuntiva con un papel de (N:C) de las clulas epiteliales y as estimar el grado
filtro de acetato de celulosa (Egbert, 1977). de metaplasia escamosa (Murube, 2002).

FIGURA 1. CITOLOGA DE IMPRESIN CON PAPEL FILTRO Recientemente, se describi el uso de una nueva
DE ACETATO DE CELULOSA. membrana de Biopore (Millicell-CM 0.4) para el
diagnstico de infecciones virales a nivel ocular.
Las membranas de Biopore vienen en estuches
individuales estriles que facilitan la toma de la
muestra (Thiel, 1997) (Ver Figura 2) y evita los
inconvenientes del papel de acetato de nitrocelulosa,
como cortar, esterilizar las tiras y conseguir
recipientes individuales para fijar y enviar al
laboratorio. Adems estas membranas brindan una
buena adhesin de las clulas, evitan el background
con las coloraciones, son transparentes cuando se
humedecen permitiendo una mejor observacin de
las muestras (Thiel, 1997).
Fuente; Aguilar, 1999.
FIGURA 2. CITOLOGA DE IMPRESIN UTILIZANDO

MEMBRANAS DE BIOPORE.
La tcnica se realiza con anestesia tpica de la
cornea y/o conjuntiva y posteriormente con una
pinza se toma una tira de papel de filtro de acetato
de celulosa (Millipore HAW304), se coloca sobre la
superficie ocular a estudiar haciendo presin
suavemente por unos segundos con la parte plana
de la pinza y se retira el papel. De esta manera
quedan pegadas de una a tres capas de la conjuntiva
y una sola de la cornea. Se pueden hacer varias
tomas, en la conjuntiva bulbar superior, inferior,
medial y lateral y de la cornea para obtener un mapeo
completo de la superficie ocular. Las tiras se fijan

Fuente: Derek, 2001.

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Desde su inicio, la citologa de impresin ha sido PRINCIPALES TCNICAS UTILIZADAS SOBRE


utilizada para el estudio histolgico mediante LA CITOLOGA DE IMPRESIN
coloraciones, muchos investigadores han modificado
la citologa de impresin y la han utilizado en INMUNOHISTOQUMICA
combinacin con mtodos inmunolgicos y
Esta tcnica permite la visualizacin de antgenos
moleculares que son aplicados directamente sobre
mediante la aplicacin secuencial de anticuerpos
las membranas para la deteccin de antgenos de
especficos dirigidos contra el tejido (anticuerpo
superficie, microbiolgicos, ambientales,
primario), un anticuerpo secundario dirigido contra
cancerigenos, inmunolgicos entre otros (Thiel,
el primario y un complejo enzimtico con un sustrato
1997; Solomon, 2001). La aplicacin de diversas cromognico, con pasos de lavados intercalados.
tcnicas sobre las membranas de Biopore pueden La activacin enzimtica del cromgeno produce
arrojar resultados entre 1 y 4 horas, de manera que una reaccin visible en el sitio donde esta presente
podra llegar a ser una importante herramienta el antgeno (vase Figura 3). Luego se puede
diagnstica de rutina en la prctica optomtrica y contrateir la muestra y cubrirla con un porta
oftalmolgica. objeto. Los resultados se interpretan usando un
microscopio ptico (Jonathan, 1994).

FIGURA 3. INMUNOHISTOQUIMICA, DE IZQUIERDA A DERECHA: ADICIN DEL ANTICUERPO ESPECFICO (NEGRO), ADICIN DEL

ANTICUERPO SECUNDARIO (BLANCO) CON LA ENZIMA (ROMBO), ADICIN DEL SUSTRATO Y COLORACIN SOLO DEL TEJIDO

MARCADO .
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INMUNO FLUORESCENCIA
TCNICAS QUE UTILIZAN CLULAS
Al igual que la anterior, se utilizan anticuerpos COLECTADAS POR CITOLOGA DE IMPRESIN
monoclonales especficos frente al antgeno que se
encuentra en una clula, tejido o impronta; la Las clulas recolectadas en las membranas o papel
diferencia entre las dos radica en el sistema de de filtro son aproximadamente 1x105 en total por
revelado: en esta tcnica la unin antgeno cada membrana. Estas clulas pueden desprenderse
anticuerpo se visualiza con un colorante fluorescente del papel para ser utilizadas en otro tipo de tcnicas
o fluorocromo, los ms utilizados son la fluorescena como Citometra de Flujo, PCR, PCR reversa y otras.
y rodamina. Para visualizarlo es necesaria la lectura
en un microscopio de fluorescencia (Kuby, 1997).

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CITOMETRA DE FLUJO condiciones estrictas, se logra amplificar


nicamente el DNA que se busca detectar; velocidad
Consiste en un sofisticado sistema que permite la porque permite un procesamiento rpido si se
separacin, lectura y anlisis de diferentes tipos compara con otras tcnicas para detectar bacterias,
celulares, organelos citoplasmticos y cromosomas, hogos, parsitos y virus, que requieren la utilizacin
cuya base y principio fundamental es la utilizacin de cultivos y finalmente se puede mencionar que
de un adecuado fluorocromo. ofrece versatilidad, ya que con el mismo
fundamento, se permite el diagnstico de diversas
El citometro de flujo permite separar grupos patologas. La PCR reversa tiene el mismo
homogneos de clulas de una poblacin fundamento solo que se extrae RNA, se utiliza la
heterognea; basndose en la cantidad de enzima transcriptasa reversa y posteriormente se
fluorocromo, las partculas con cierto grado de realiza la reaccin en cadena de la polimerasa.
fluorescencia son desplazadas y separadas por el
seleccionador de clulas. Este instrumento SINDROME DE OJO SECO
comprende una unidad que incluye el lser,
detectores de emisin y un computador para el El sndrome de ojo seco es una de las enfermedades
anlisis de datos por graficas (Current protocols, oculares mas frecuentes todo el mundo (Albeitz,
1992). 2000); se le considera una condicin multifactorial,
caracterizada por la deficiencia en la cantidad o
La citometra de flujo tiene una amplia gama de calidad de la pelcula lagrimal y el dao en la
utilidades a nivel oftalmolgico; permite el estudio superficie ocular por lo cual, tambin se le conoce
de patologas de origen gentico, inmunolgico, como Keratoconjuntivitis Sica (KCS) (Albeitz, 2001).
hematolgico y microbiolgico entre otros.
Los sntomas ms frecuentes de la enfermedad son:
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) sensacin de cuerpo extrao, es el sntoma
patognomnico de la sequedad ocular, sequedad
La tcnica molecular de PCR, amplifica ocular: rara vez lo refiere el paciente, fluctuaciones
exponencialmente un fragmento especfico de DNA de la visin o alteraciones espordicas de la
extrado de las clulas, obtenidas de la superficie agudeza visual, visin de halos coloreados, ardor,
ocular, por citologa de impresin. La reaccin se prurito leve y fotofobia (Aguilar, 1999).
realiza en un termociclador que denatura el DNA
(95C), permite la alineacin del primer sobre la La deficiencia en cualquier componente de la
secuencia a estudiar (45C - 55C) y elonga la cadena pelcula lagrimal es el factor que desencadena el
durante el periodo de extensin (65C - 72C); este dao en la superficie ocular. Esto produce
procedimiento se efecta en forma repetitiva metaplasia escamosa, que puede ser graduada por
originando mltiples copias de la secuencia inicial. citologa de impresin con coloracin de PAS en 6
Esta tcnica ofrece sensibilidad pues a partir de (vase Figura 4) que se correlacionan directamente
cantidades muy pequeas de material gentico se con los grados de severidad clnica. Las
detecta la presencia de DNA viral, bacteriano, caractersticas citolgicas ms importantes para la
fngico entre otros; especificidad debido a que, bajo clasificacin de metaplasia escamosa son las
siguientes:

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 Grado 0. El epitelio conjuntival es normal, con  Grado 3. Todas las clulas epiteliales presentan
moderado o abundante nmero de clulas una pronta y leve queratinizacin; algunas
caliciformes dispuestas entre las clulas clulas tienen visibles filamentos de queratina.
epiteliales no secretoras. El citoplasma es El citoplasma sufre un moderado aplanamiento,
eosinfilo. La proporcin ncleo/citoplasma es y es metacromtico. En este estado aparecen
clulas con ncleos levemente picnticos. La
de 1/1.
relacin ncleo/citoplasma es de 1/6.

 Grado 1. Disminucin marcada y temprana de


 Grado 4. Las clulas epiteliales son de gran
clulas caliciformes. Las clulas epiteliales no
tamao, alargadas y presentan una moderada
secretoras presentan un leve alargamiento. El queratinizacin; muchas de ellas con densos
citoplasma es eosinfilo. La relacin ncleo/ paquetes de filamentos de queratina y ncleos
citoplasma es de 1/2 a 1/3. No existe picnticos. El citoplasma es metacromtico,
queratinizacin. tendiendo a ser basfilo. La relacin ncleo/
citoplasma es de 1/8.
 Grado 2. Prdida total de clulas caliciformes.
Las clulas epiteliales presentan un moderado  Grado 5. Las clulas epiteliales presentan una

alargamiento y aplastamiento. El citoplasma es avanzada queratinizacin, con densos paquetes


eosinfilo-basfilo. La relacin ncleo/ de filamentos de queratina y ncleos
citoplasma es de 1/4. No existe queratinizacin. marcadamente picnticos o ausentes. El
citoplasma es basfilo (Murube, 2002).

FIGURA 4. CITOLOGA DE IMPRESIN DE CONJUNTIVA EN SUJETOS NORMALES Y PACIENTES CON OJO SECO. DE IZQUIERDA A

DERECHA: GRADO 0, GRADO 1 Y GRADO 2. SE OBSERVA LA PERDIDA GRADUAL DE LAS CLULAS CALICIFORMES (MS
OSCURAS), EL AUMENTO DE TAMAO DE LAS CLULAS EPITELIALES Y MAYOR SEPARACIN ENTRE ELLAS.

Fuente: Murube, 2002.

En los pacientes con ojo seco se han medido varios presencia del proceso inflamatorio en esta
tipos de marcadores inmunolgicos como complejo enfermedad (Solomon, 2001; Brignole,2000).
mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II,
molculas de adherencia, citoquinas y -defensinas La Interleukina 1 (IL-1) es un importante mediador
en citologa de impresin para corroborar la inflamatorio que ha sido implicado en la patognesis

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de enfermedades inflamatorias, por modular la (vase Figura 5), demostrando que en los pacientes
expresin de otras citokinas, molculas de con ojo seco hay un marcado incremento en epitelio
superficie y que conllevan a la migracin de los conjuntival (en biopsia y citologa de impresin)
leucocitos a la superficie ocular. En un estudio se sugiriendo que este puede ser el origen del aumento
determin el incremento de IL-1 en lagrimas, de esta citokina en lgrimas (Solomon, 2001).
biopsia y citologa de impresin de conjuntiva

FIGURA 5 EXPRESIN DE IL-1 POR INMUNOFLUORESCENCIA EN CITOLOGA DE IMPRESIN DE CONJUNTIVA, EN SUJETOS

NORMALES (IZQUIERDA), PACIENTES CON OJO SECO (DERECHA).

Fuente: Solomon, 2001.

La IL-1 aumenta la expresin de otras molculas requera determinar si haba una expresin
como las -defensinas, estas protenas son pptidos diferencial de -defensinas en comparacin con
antimicrobianos que se expresan de forma basal personas sanas. Se observ que las -defensinas
siendo importantes porque reducen el riesgo de no tienen el mismo espectro antibacteriano ni la
infecciones conjuntivales y corneales; por otra misma expresin: hBD-1 y hBD-3 son proteccin
parte, regulan la produccin de citoquinas, median base mientras que hBD-2 puede ampliar el espectro
quimiotaxis y estimulan la liberacin de histamina de proteccin. A partir de los resultados obtenidos
por mastocitos. Srihari, N. et al., 2003 realizaron en los pacientes y controles los autores determinan
un estudio en 9 pacientes con sndrome de ojo seco que como hBD-2 puede jugar un papel quiotctico
con el fin de determinar la expresin de - en la mediacin del incremento de las
defensinas en clulas obtenidas por citologa de subpoblaciones de clulas T observadas en los
impresin y compararon la expresin de estas pacientes; al estimular la liberacin de histamina
molculas en 8 individuos sanos. Los autores para permitir la presencia de signos y sntomas de
hicieron nfasis en hBD-1 (expresadas irritacin ocular; se puede concluir que la hBD-2 tiene
constitutivamente en cornea y conjuntiva) hBD-2 y dos roles en los pacientes: 1) Brindar proteccin
hBD-3 (inducidas por citoquinas proinflamatorias y antimicrobiana (Positivo) y 2) Contribuir al dao de
por productos bacterianos), como en los pacientes la superficie ocular (Negativo) (Srihari, et al.,
con enfermedad de ojo seco se aumenta la 2003).
expresin de citoquinas proinflamatorias, se

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PENFIGO CICATRICIAL OCULAR mediante la deteccin de antgenos virales por


inmunohistoqumica en biopsia o raspados de las
El penfigo cicatricial es una enfermedad autoinmune lesiones; esta manipulacin mecnica para la toma
que se manifiesta mediante inflamacin y la de la muestra, muchas veces ocasiona dao del
presencia de vesculas que forman ampollas en las tejido.
distintas mucosas corporales, principalmente en la
oral y ocular. El siguiente paso es la cicatrizacin Algunos investigadores han comprobado el xito de
de estas mucosas. En el penfigo cicatricial ocular, la deteccin de antgenos virales en infecciones
la cicatrizacin progresa hasta la queratinizacin oculares por medio de inmunohistoquimica en
total del epitelio crneo-conjuntival. A nivel ocular, muestras tomadas con citologa de impresin,
la consecuencia ms grave de esta enfermedad es demostrando que con este tipo de muestras se
la ceguera (Pepouse, 1996). En la mayora de los obtiene replicas exactas de la lesin corneal (Figura
pacientes pasa desapercibido el inicio de la 6) sin dao del epitelio corneal y con una alta
enfermedad tanto para dermatlogos, como para sensibilidad (Nakagawa, 1993; Thiel, 1997).
oftalmlogos. El estudio histopatolgico e
inmunohistoqumico sobre citologa de impresin FIGURA 6: KERATITIS HERPTICA. CITOLOGA DE

ha mostrado contribuir al reconocimiento temprano IMPRESIN DE UNA LESIN DENDRTICA CORNEAL

de la enfermedad. Los pacientes con penfigo COLOREADA POR INMUNOHISTOQUMICA.

cicatricial ocular presentan una disminucin


progresiva de la densidad de clulas caliciformes,
aumento progresivo de las clulas inflamatorias
mayor nmero de clulas inflamatorias que
epiteliales; as como grandes redes de filamentos
mucosos en la citologa de impresin (Sanz, 2001).

INFECCIONES VIRALES

Las enfermedades virales, ms frecuentes, a nivel


ocular, son la conjuntivitis por adenovirus,
queratoconjuntivitis herpetica y conjuntivitis
Fuente: Thiel, 1997.
hemorrgica epidmica. La infeccin por herpes
simple en cornea es reconocida clnicamente sin Finalmente, la citologa de impresin ha sido
requerir confirmacin del laboratorio; sin embargo, utilizada tambin en la investigacin de alergias,
en algunos casos, el diagnstico se hace difcil y es neoplasias e inflamacin de la superficie ocular. Esta
necesario diferenciarlo de lesiones no herpeticas, tcnica podra constituir una valiosa ayuda en el
tales como pseudodendritas, causadas por varicella- diagnstico y por lo tanto en el tratamiento
zoster (Pepouse, 2000). En estas situaciones se adecuado de los desordenes de la superficie ocular
requiere confirmar el diagnstico por el laboratorio (Baudoinc, 1992, Dereck M, 2001).

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