Resumen

Endpep-Ms reaccin con MALDI-TOF anlisis

se extrajo el extracto acuoso de las perlas y luego se reconstituyeron en

18 uL de tampn de reaccin consistente en Hepes 0,05 M (pH 7,3),
ditiotreitol 25 mM y ZnCl2 y 20 uM y 2uL de sustrato peptdico especifico
para el anticuerpo.

la concentracin final de cada sustrato fue de 50 pmol/uL Todas las

muestras se incubaron a 37C durante 4 h sin agitacin.

se mezcl una alcuota de 2 uL de cda sobrenadante de reaccincon 18

uL de solucin matricial

se pipete una alcuota de 0,5 uL de esta mezcla sobre un punto de una

placa de desorcin/ ionizacin lser asistida por matriz (MALDI) de 384
puntos.

los espectros de masa fueron desde 900 a 5500 m/z en modo reflector
de iones MS positivo en un analizador de protemica.

Resultados y discusin

Deteccin de BoNT A, B, E Y F en leche entera

El mtodo Endopep-MS ha demostrado su potencial para diagnosticar el botulismo, una

enfermedad potencialmente mortal. Por otra parte la deteccin de BoNT en los alimentos es
importante ya que permite el descubrimiento del vehculo de transmisin en los casos de
botulismo de origen alimentario.

Para el anlisis de BoNT A en la leche entera se analizaron varios niveles de BoNT A donde muestra
que se han formado pico de 999 y 1427 m/z especficamente esto demuestra la presencia de BoNT
A enzimticamente activo en la leche. Para esta prueba se trataron dos tipos de leche, la entera y
la leche entera picada con 10 mLD50 de BoNT B, E yF respectivamente. Donde se determin que se
podra detectar tan poco como 0,1 mLD50 de BoNT E o 0,01 mLD50 de BoNT F. tambin se puedo
visualizar que el SubF intacto y el producto de escisin N-terminal producido por la escisin del
siustrato por BoNT F son pptidos largos con peso moleculares de 5510 y 3783 los cuales son rara
vez vistos por MALDI-TOF /MS, ya que normalmente esto se encuentran a 2556 m/z.

Deteccin de BoNT A, B, E y F en alimentos adicionales

El BoNT A, B,E y F fueron aadidos a la formula infantil, yogurt, brcoli, lquido de frijol verde,
salami, salmn, huevo lquido, jugo de naranja y jugo de tomate. Mediante los anlisis repetitivos
se logr determinar los lmites de deteccin de BoNT A, B,E y F en 1 l de estas matrices
alimenticias las mismas que estn por debajo del lmite de deteccin del bioensayo de ratn,
1mLD50. Estos lmites de deteccin oscilaron entre 0,01 mLD50 de BoNT F en la formula infantil,
yogurt, brcoli, liquido de frijol verde, salami y salmn hasta 0,75 mLD50 de BoNT A en huevo
lquido.

Por otro lado los valores de BoNT A, B, E y F de ciertos alimentos que eran de gran inters, a
niveles bajos del lmite de deteccin del bioensayo de ratn se introdujeron en 0,5 ml del alimento
y los resultados indican que BoNT A, B, E y f se detectaron con xito en 44 alimentos adicionales a
niveles inferiores a los del estndar histrico.

Los alimentos que eran ricos en proteasas tales como bistec, carne seca, estofado de carne y
jamn se beneficiaron enormemente del lavado de las pelas recubiertas con anticuerpos despus
de la captura de la toxina con NaCl 2 M para eliminar todas las proteasas de unin no especficas
de las perlas recubiertas con anticuerpo. Sin embargo los altos valores salinos tuvieron un efecto
negativo en matrices con alto contenido de grasa. El lmite de deteccin del ensayo co estas
matrices de alto contenido de grasa se mejor lavando las perlas slo en PBST.