PRCTICA N5

Tincin diferencial Gram

Objetivo
- Demostrar a travs de la tcnica de tincin diferencial de Gram la existencia
de dos grupos principales de bacterias.
- Distinguir a travs de dos tcnicas de tincin diferencial la presencia de
endosporas bacterianas y diferenciarlas de las estructuras vegetativas
normales.
Fundamento:
Tincin diferencial Gram
Los microorganismos no slo difieren qumicamente de su entorno, sino tambin
muestran diferencias fsicas y qumicas entre ellos. Esto da lugar a que puedan
reaccionar diferencialmente ante un procedimiento de tincin. La tincin diferencial
por lo tanto, nos permite distinguir entre grupos de microorganismos .En particular,
la tincin de Gram, es la ms utilizada de las tcnicas de tincin diferencial para
distinguir entre dos grupos de bacterias: Gram positivas y Gram negativas.
La diferencia entre estos dos tipos de clulas radica en la variacin de capas que
conforman sus paredes. La pared de la gram- positivas es principalmente una gruesa
capa de peptidoglucano , mientras que las gram- negativas la pared es una multicapa
formada por una capa de peptidoglucano rodeada por una capa externa de protena y
lipopolisacrido. La diferente permeabilidad de estas estructuras de superficie ante
los reactivos utilizados en las tincin Gram, permite la diferenciacin en la
coloracin final.
La tincin de Gram requiere de cuatro soluciones :Un colorante bsico, Un
mordiente, un agente decolorante y un contraste (otro colorante bsico).
Las propiedades de los colorantes bsicos ya fueron discutidas previamente. Un
mordiente es una sustancia que incrementa la afinidad entre la clula y el colorante,
es decir ayuda a la fijacin del colorante en la estructura de inters. Ejemplos de
mordientes son cidos, bases, sales metlicas, y yodo. Bajo la accin de un
mordiente una clula se tie ms intensamente y es ms difcil decolorarla. Un
agente decolorante es una sustancia que retira el colorante de una estructura
teida. Algunas clulas teidas se decoloran ms rpidamente que otras, y est
variacin en la tasa de decoloracin es la que diferencia tipos de bacterias cuando la
tincin Gram y otras tinciones diferenciales se usan. El contraste es un colorante
 bsico de un color diferente al usado inicialmente. El propsito de su aplicacin es
da a las clulas decoloradas un color contraste con el inicial. Aquellas clulas que no
se decoloran rpidamente retienen el color del colorante bsico inicial, mientras que
las clulas que se decoloran fcilmente toman el color del contraste.
La tincin Gram se resume en lo siguiente: El primer paso es teir la preparacin
intensamente con un colorante bsico, preferentemente el cristal violeta. Esto es
seguido de por un tratamiento de las clulas teidas con un mordiente, por ejemplo,
un compuesto iodado como el lugol. La preparacin luego es tratada con un agente
decolorante como el alcohol o alcohol-cetona. Las clulas que retienen el colorante
bsico despus de la decoloracin son llamadas gram positivas, y aquellas que son
decoloradas son gram-negativas, y pueden ser reteidas con un contraste como la
safranina.
Materiales.
- Cultivos jvenes de microorganismos (18-24horas): Bacillus sp;
streptococcus sp; Escherichia coli.
- Colorantes bsicos: Cristal violeta; Safranina
- Decolorante: Alcohol-cetona
- Lminas porta objeto
- Mordiente : Lugol
- Papel secante
- Piseta de agua
- Soporte para tincin
- Asa de Kolle
- Aceite de inmersin.
Procedimiento.
1. Prepare una lmina fija de cada uno de los cultivos microbianos proporcionados
y una lmina fija con la mezcla Streptoccus y Escherichia coli
2. Agregue cristal violeta y deje que acte por 30 segundos.
3. Enjuague con agua
4. Cubra la pelcula teida con lugol y deje que acte por 30 a 60 segundos.
5. Enjuague con agua.
6. Decolore con alcohol acetona. Para una pelcula delgada, la exposicin al
decolorante por 10-20 segundos es suficiente.
7. Enjuague con agua
 8. Aplique el colorante de contraste safranina por 30 segundos.
9. Enjugue con agua y seque la lmina al aire o dentro del papel secante.
10. Examine cada muestra bajo el objeto de inmersin
11. Elabore los esquemas correspondientes.

Tincin Diferencial cido-Resistente

La tincin cido-resistente es una tincin diferencial que mide en clulas teidas la
resistencia a la decoloracin mediante cido. La propiedad de cido resistencia en
ciertas micobacterias y actinomicetos est correlacionada con su salto contenido
lipdico. Teir estas bacterias requiere de un tratamiento de alta temperatura y la
utilizacin de colorantes fuertemente a fines.
El procedimiento consiste en teir con carbolfucsina caliente, decolorar con una
solucin de alcohol-cido y reteir con un contraste. Las bacteria cido en
comparacin a otros microorganismos y retienen el color del colorante inicial.
Este tipo de coloracin es utilizada en el estudio y diagnstico de enfermedades
causadas por especies cido-resistentes como los de la tuberculosis, la lepra, y
tambin para la diferenciacin de estructuras resistentes como las endosporas
bacterianas.
Tincin De Endosporas
Las especies del genero Bacillus y Clostridium producen una estructura denominada
endospora. A diferencia de la clula la endospora es una estructura resistente capaz
de sobrevivir por largos periodos en ambientes desfavorables, en condiciones
extremas de alta temperatura o bajo la accin de agentes desfavorables, en
condiciones extremas de alta temperatura o bajo la accin de agentes qumicos.
Existen variadas tcnicas que se utilizan para la tincin de endosporas. Destacan
entre ellas la tcnica Drner y la de Schaeffer & Fulton. En la primera se emplea
carbol fucsina para teir la espora y nigrosina como agente decolorante y de tincin
negativa; la espora se tie de rojo, la parte vegetativa incolora y toda la estructura
aparece sobre un fondo oscuro .La tcnica se Schaeffer y Fulton emplea
carbolfucsina para teir la espora, alcohol cido como decolorante y verde malaquita
como colorante de contraste; la espora se tie de rojo y la parte vegetativa de verde.
Ambas tcnicas emplean fenol y alta temperatura como agentes coadyugantes para
lograr la penetracin de la Fucsina en la estructura de la espora.
Tcnica de Drner
Materiales
- Cultivo de 48 horas: Bacillus_sp; Clostridium sp.
- Aceite de inmersin
- Asa de Klle
- Bao de agua a 100C
- Lmina porta objeto
- Soluciones colorantes: Carbolfucsina, Nigrosina.
- Tubos con agua destilada estril.
Procedimiento.
1. Haga una suspensin concentrada del organismo en 2 3 gotas de agua destilada
contenida en un tubo pequeo de prueba.
2. Aada igual cantidad de carbolfucsina y coloque el tubo en un recipiente con
agua hirviendo por 10 min.
3. Transfiera una gota de la suspensin de clulas hervidas en un recipiente con
agua hirviendo por 10 minutos.
4. Agregue una gota de nigrosina y extienda la mezcla con ayuda de otra lmina
hasta obtener una delgada pelcula.
5. Seque la lmina al aire o dentro del papel secante.
6. Examine al microscopio compuesto bajo un objeto en inmersin.
7. Elabore los esquemas correspondientes.
Tcnica de Schaeffer y Fulton
Materiales.
- Cultivo de 48 horas: Bacillus_sp; Clostridium sp.
- Aceite de inmersin
- Asa de Klle
- Lmina porta objeto
- Mechero de alcohol
- Pinzas
- Soluciones colorantes: Carbolfucsina; verde malaquita.
- Solucin decolorante: Alcohol cido.
Procedimiento
1. Prepare una muestra fija del microorganismo proporcionado.
2. Agregue a la preparacin carbolfucsina hasta cubrirla totalmente.
 3. Con ayuda de una pinza, caliente la lmina con el colorante hacindola pasar
ligeramente por la llama del mechero hasta que observe el desprendimiento de
vapores.
4. Mantenga esta condicin durante tres minutos , evitando que el colorante se
seque o entre en ebullicin
5. La ve con alcohol cido hasta que este resulte incoloro.
6. Enjuague con agua.
7. cubra la preparacin con unas gotas de verde malaquita dejando que acte por
dos minutos.
8. Enjuague con agua.
9. Seque la lmina al aire o dentro del papel secante.
10. Examine al microscopio compuesto bajo un objeto de inmersin.
11. Elabore los esquemas correspondientes.

Resultados:

De acuerdo con lo practicado y ledo en el laboratorio pudimos observar a travs del

procedimiento de la tincin Gram, donde gracias a esta tincin muy diferente a ala
tincin simple, pues este tipo de tincin Gram es ms favorable, porque podemos
observar las Gram positivas (teidas de color azul o violeta) y Gram negativas
(teidas de color rojo o rosado), y tambin podemos diferenciar la pared celular de los
microorganismos.
Discusin:
Esta tincin desarrollada por el doctor Gram en 1884, es la ms utilizada en los
laboratorios de bacteriologa, y permite, de acuerdo con la estructura y grosor de
la pared bacteriana, agrupar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, las
Gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglican y carece de membrana
externa, las Gram negativas tinen una capa ms delgada de peptidoglican y poseen
una membrana externa. Algunas bacterias se clasifican como Gram variables,
pues simultneamente presentan tincin de Gram positivas y de Gram negativas,
aun bajo condiciones ptimas de cultivos. Segn Evelyn Rodrguez, Gamboa,
Hernndez, Danilo.

Existen muchas modificaciones de esta tincin, pero en todos los casos se realizan
los siguientes pasos esenciales: la extencion de celulas, fijadas por calor sobre
porta, se tile de modo sucesivo con un colorante bsico, el voleta de cristal, y con
una disolucin diouida de yodo. La preparacin se tarta luego brevemente con un
disolvente organico (alcohol o acetona). Las bacterias Gram positivas reissten
decoloracin y permanecen teidas de un color azul oscuro negro, las bacterias
Gram negativas son rapidas y completamente decoloradas. Al realizar este
procedimiento de tincin es esencial examinar celulas en crecimiento, ya que
ciertas bacterias Gram positivas pierden rpidamente la capacidad de retener el
complejo violeta cristal- yodo. Segn Roger Y, John L, Mark L, Page R.

Conclusin:
En la tincin Gram realizada en la prctica se observaron a las bacterias azul violeta por
lo que concluimos que se trata de las bacterias Gram positiva.
Gracias a las tinciones, podemos ahora estar preparados para elaborar muestras, que va a
ser de mucha utilidad en el anlisis de alimentos y estudios de microorganismos.

Cuestionario
1. Bajo que circunstancia la tincin diferencial de Gram podra resultar
errada? Cuando no se sigue el protocolo correcto; y es:
 Protocolo

Recoger muestras
Hacer el extendido en espiral
Dejar secar a temperatura ambiente
Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces
aprox.)
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas
las clulas gram positivas y gram negativas se tien de color azul-purpura.
Enjuagar con agua.
Agregar lugol y esperar entre 30 segundos y 3 minutos
Enjuagar con agua.
Agregar acetona y/o alcohol y esperar entre 15 y 20s
Enjuagar con agua.
Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar 1-2 min Este
tinte dejar de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.
Enjuagar con agua.
o Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con
aceite de inmersin

2. Que efecto traera reemplazar el lugol con otro agente oxidante.

No ejercera la accin misma que tiene este ante la tincin gran, por lo mismo el lugol es
empleado en la tincin de Gram para retener el colorante cristal violeta. El I2 entra en las
clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta.

3. Podra usted variar el colorante primario y el contraste obteniendo los

mismos resultados?
Las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de
alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para
poder retener el complejo de cristal violeta que se form previamente, y por lo tanto este
complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las
Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de
peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta
deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo
cristal violeta, y manteniendo la coloracin azul-violcea.
El colorante de contraste (la safranina) solo puede teir a las clulas vegetativas
(decoloradas por el agua).
Si cambiamos el orden del colorante con del contraste de la muestra de yogurt se
obtendran resultado la coloracin del contraste ya que las bacterias del yogurt son gran
positivas y retendran la primera decoloracin porque poseer una pared celular ms
resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del
solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide
que pueda escaparse la primera decoloracin , y manteniendo la coloracin primaria.

4. Cul es la influencia del pH? en la reaccin Gram?

Los microorganismos Gram positivos pueden hacerse Gram negativos al aumentar la
acidez, de la misma forma los microorganismos Gram negativos pueden hacerse Gram
positivos al aumentar la alcalinidad. Adems los microorganismos de reaccin positiva a
los colorantes cidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad y los
microorganismos de reaccin positiva a los colorantes bsicos pueden hacerse gram
negativos por aumentar la acidez.

5. Liste cinco ejemplos de bacterias gram positivas y cinco de Gram negativas,

sealando su importancia.
Muchas de estas especies causan enfermedades como:
Gram negativas:
Neisseria gonorrhoeae: causa la gonorrea.

Neisseria meningitidis: causa meningitis.

Moraxella catarrhalis. Sntomas respiratorios.

Hemophilus influenzae. Enfermedades respiratorias.

Helicobacter pylori: enfermedades gastrointestinales.

Gram positivas:
Los estafilococos: pueden causar neumona.
 Estreptococos: pueden ser responsables de infeccin en la sangre.

Bacillus. ntrax.

Clostridium: ttano.

Corinebacterias: difteria.

6. Cul de los mtodos utilizados le permiti observar mejor las endosporas

bacteriana? A qu atribuye la diferencia?

La tincin diferencial ,fue el mtodo ms eficaz pues es el ms usado ya que las

bacterias con endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a
los factores ambientales adversos .Este mtodo es el ideal para este tipo de bacterias.
La diferencia est en el tipo de colorantes usados los cuales, como ya dijimos son
capaces de distinguirse en las endosporas.

7. Qu efecto producir el reemplazar el alcohol cido por otro decolorante

como el alcohol cetona?

Permite la clasificacin de las bacterias en gram positivas y gram negativas segn su

composicin de su pared celular.
En cambio en las gram negativas deja el color rosado de la safranina.

8. Qu otros gneros de bacterias pueden formar endosporas?

Las bacterias que forman esporas se encuentran habitualmente en el suelo y pertenecen
principalmente a los gneros Streptomyces, Clostridium y Bacillus.
1. Otras formas de tincin:

Tincin Simple: utiliza un solo colorante.

Tincin de Gram:

Utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m, lavado con alcohol, Safranina 30
seg)
 Tincin cido Resistente:

Una vez teidos, conservan su color resistiendo al lavado con cido mineral reducido. En
esta tincin las bacterias cido resistentes conservan el colorante primario color rosa o
rojo, los dems microorganismos son decolorados por el cido y toman el color azul.
Tincin de Giensa:

El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de protozoos

en la sangre para observar materias ncleos de la clula.
Tincin de Esporas:

Se usa verde de malaquita en contraste con safranina.

Tincin de Cpsula:

Colorante negrosuna, aqu se observa microorganismos encapsulados creando

resistencias.
Tincin de Flagelos:

Se usa mordiente el cual aumenta el tamao del microorganismo

9. Revise otras tcnicas de tincin de esporas y comprelas con las tcnicas

usadas en este ejercicio. Destaque ventajas y desventajas.
Tincin con verde malaquita
Procedimiento

1. Cubrir el portaobjetos con verde malaquita.

2. Calentar hasta la emisin de vapores. Mantener durante 3 minutos.
3. Lavar con agua.
4. Cubrir del portaobjetos con safranina para contrastar. Dejar actuar 1 minuto.
5. Lavar con agua y secar con papel de filtro.

En la observacin microscpica las esporas aparecen teidas de verde y las clulas

vegetativas de rosa.

Todos los procedimientos para ver bacterias esporuladas son casi el mismo con la prctica
realizado en el laboratorio con pequeas variaciones como en la prctica mostrada porque
microscpica las esporas aparecen teidas de verde y las clulas vegetativas de rosa, por
lo dems son casi iguales
Observamos que cuanto ms preciso sea la tincin mejor ser la observacin en el
microscopio.

Anexos: