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2017-5-28 Haplotipo del gen del factor VIII en el diagnostico molecular de la hemolia A: Estudio de una familia

RevistaHabaneradeCienciasMdicas MiSciELO
versinOnlineISSN1729519X
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Rev haban cienc mdv.9n.1Ciudad de La Habanaene.-mar.2010


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YaixaPilotoRoque1,ArletAcandadelaRocha2,IsmaelCervera Permalink
Garca3,YuliaClarkFeoktistova4,TeresaCollazoMesa5

CentroColaboradordelaOMSparaelDesarrollodeEnfoquesGenticosenlaPromocindeSalud.Calle146nm.
3102esq.Ave31.Marianao.CiudaddeLaHabana.Cuba.

LaboratorioBiologaMolecular.Telfonos:2089991/97ext.10421047.

1Lic.Bioqumica.AspiranteaInvestigador.Instructora.yaixa.piloto@infomed.sld.cu
2Lic.Bioqumica.AspiranteaInvestigador.arlet@cngen.sld.cu
3Lic.LaboratorioClnico.Instructor.icervera@infomed.sld.cu
4Lic.Bioqumica.AspiranteaInvestigador.yulia.clark@cngen.sld.cu
5Lic.Bioqumica.InvestigadoraAuxiliar.tcollazo@infomed.sld.cu

RESUMEN

LahemofiliaAsecaracterizaporserunaenfermedadcongnitadeltrastornodelacoagulacinyconstituyeun
desordenrecesivoligadoalcromosomaX.Elestudiomolecularserealizaporestudioindirecto,porsercausadapor
mutacionesheterogneasenelgendelfactorVIII.Seestudiunafamiliaafectada,paraladeteccindeportadora

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delagestanteyposteriormenteserealizeldiagnsticoprenatal.LaextraccindeADNsehizoporelmtodode
precipitacinsalinaSaltingOutatresmuestrasdesangreyunadelquidoamnitico.Seefectuelanlisisdelos
polimorfismosSt14,BclIyHindIII.Paraladeterminacindesexofetal,seestudielgenAMXY.Latcnica
empleadafuelareaccinencadenadelapolimerasa.

ElanlisisdelmarcadorBclIarrojquelagestanteeraportadoradehemofiliaA,peroalserhomocigticanoera
informativaelpolimorfismoSt14porssolonobrindabalainformacindelacondicindelagestante,peroalser
heterocigticaparaelmismoyconociendodeantemanolainformacindeserportadora,sepudorealizar
diagnsticoprenatal,graciasalanlisisconjuntodelosmarcadores.ElpolimorfismoHindIIInofueinformativo.El
fetoresultservarnsano.

Palabrasclave:HemofiliaA,BclI,St14,HindIII,factorVIII.

ABSTRACT

HemophiliaAisacoagulationdisordercongenitaldiseasewhichconsistinarecessivedisorderlinkedtoX
chromosome.HAiscausebyheterogeneousmutationsinfactorVIIIgen,thatswhy,thestudywascarryoutby
indirectstudies.Westudiedonefamilyafectedweweredeterminatedofcarrierstatusofpregnancywomanand
laterwerelizatedofprenataldiagnosis.TheDNAextractionfromthethreebloodsamplesandoneamnioticfluid
wasobtainedbythesalineprecipitationprocedure(SaltingOut).

WestudiedthepolymorphismsSt14,HindIIIandBcl1.ThedeterminationoffetalsexwasstudiedofAMXYgen.
ThetechniqueusedwasPolymeraseChainReaction.

TheBclImarkeranalysisshowedthatthemotherwasacarrierofhaemophiliaAbutbeinghomozygouswasnot
informative,ST14polymorphismalonedidnotprovideinformationontheconditionofthemotherbuttobe
heterozygousforitandknowingbeforehandinformationofbeingacarrierprenataldiagnosiswaspossiblethanks
tojointanalysisofthemarkers.HindIIIpolymorphismwasnotinformative.Themalefetuswasfoundtobe
healthy.

Keywords:HaemophiliaA,BclI,St14,HindIII,factorVIII.

INTRODUCCIN
LahemofiliaA(hemofiliaclsica,HA),enfermedadrecesivaligadaalcromosomaX,eslacoagulopatacongnita
severamscomnsedebealadeficienciaoausenciadelfactorVIII(FVIII).Debidoasupatrndeherencia,
sueleafectarcasiexclusivamentealosvarones,aunqueexistenreportesdemujeresheterocigticas.Presentauna
incidenciade1:5000a1:10000varones.1

ElgendeFVIIItiene186kbdelongitudesunodelosgenesmslargoscaracterizadoshastaelpresente,contiene
26exones(conunrangodelongitudesquevadesde69a3106paresdebases,pb)y25intrones(algunostan
largoscomo32,4kb)yestlocalizadoenlaregindistaldelbrazolargodelcromosomaXaniveldelabanda
Xq28.EstegenproduceunRNAmde9kb.1,2

LaHAnopresentaningunaalteracinvisibleconmtodoscitogenticos,yademselanlisisanivelmolecularha
sidomuydifcildebidoalgrantamaodelgen,asucomplejaorganizacingenmicayalaheterogeneidadallica
detectadaenlosdistintosindividuos.Enlaactualidad,sehanreportado65%demutacionespuntuales,28%de
delecionesy6%deinserciones.1,2

Ladeteccindeportadorassepudieraabordarpormtodosdirectoseindirectos.Eldiagnsticodirectocaracteriza
laalteracinmolecularenlospacientesysusfamilias.Sinembargo,esteanlisisesmuycomplicadoenesta
enfermedad,puesestegenesunodelosmsgrandesdelgenomaylamayoradelasmutacionessonpuntualesy
lafrecuenciadelasmismasesmenorde1%exceptounamutacincomplejaqueconsisteenunainversina
niveldelintrn22que,segnreportalaliteratura,afectaaproximadamentea50%delosenfermos.3

Porestarazn,elestudioindirectousandomarcadorespolimrficosasociadosalgendelfactorVIII,eslamejor
opcin.

EnCuba,paraladeteccindeportadorasydiagnsticoprenataldelaHAseempleanlosmarcadoresmoleculares
intragnicosBclIyHindIIIambossonpolimorfismosdelongituddefragmentosderestriccin(RFLP`s)yse
localizanenelintrn18y19,respectivamente.ElotropolimorfismousadoesSt14,elcualseencuentraenel
locusDXS52,esunVNTR(repeticionesentndemdenmerovariable),elcualpresentahasta14alelos,segn
reportalaliteratura.46

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MATERIALYMTODOS
Seestudiunafamiliadiagnosticadaclnicaybioqumicamente.Eluniversodeestudioestuvoconformadoporla
gestantequeeselpropsitodelestudio,elhermanohemoflico,osea,elenfermoylamadre.Nofueposible
estudiarlamuestradelpadre.SerealizlaextraccindeADNporelmtododeprecipitacinsalinaSaltingOut7a
partirde10mLdesangreperifricaconEDTA56mg/mLcomoanticoagulantey20mLdellquidoamnitico.

Seuslatcnicadereaccinencadenadelapolimerasa(RCP)yposteriordigestinenzimticaenlos
polimorfismosdelongituddefragmentosderestriccinBclIyHindIIIsevisualizaronlosresultadosengelde
agarosaa3%.ElproductodeamplificacindelpolimorfismoSt14setestdirectamenteengeldeagarosaa2%.
LascondicionesdePCRydigestionesenzimticasserealizaronsegnlodescritoporScottycol.5Ladeterminacin
delsexofetalsehizoestudiandoelgenAMXY,tcnicadescritaporMehraycol.8

RESULTADOS
Enlafigura1,semuestraelrbolgenealgicodelafamilia,analizadajuntoconelhaplotipodelosmarcadores
molecularesanalizados.ParaBcl1,elenfermotieneelalelo2delmarcadorylagestanteeshomocigticaparael
mismo.(figura2).ParalospolimorfismosSt14yHindIII,elenfermoposeeelalelo1paracadamarcador
respectivamentesinembargo,paraSt14laembarazadaesheterocigtica(1/3)yparaHindIIIeshomocigtica
(1/1).

Figura1.rbolgenealgicodelafamiliaanalizada.Alladodecadamiembroestudiado:I.1,II.1,II.2semuestran
losalelosencontradosdelosmarcadoresBclI,St14yHindIII,respectivamente.

Figura2.Geldeagarosaa3%,mostrandoelpolimorfismoBclI.Carrilera1(c+):controlpositivoheterocigtico,
laenzimaBclIyseobtienenlasbandascorrespondientesa142,99y43pb.CarrileraII.2:Madredelagestante,
presentalas3bandas,heterocigtica.CarrileraII.1:hemoflico,alelo2(bandas99y43pb).CarrileraI.2.
Gestantehomocigticaparaelalelo2(bandas99y43pb).

Alefectuarladeterminacindesexoresultserunfetovarn.LasbandashalladasenelestudiodelgenAMXY
fueronde1000pb,800pby470pb,talcomosemuestraenlafigura3.

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A:controlhembranormalB:casoenestudioC:controlvarnnormal
Lasbandasobservadascorrespondena1000pb,aleloenelcromosomaX800pb,aleloenelcromosomaY470
pb,controlinternodeamplificacin.(Esindudablequeennuestropacientelasbandassonlasesperadasenun
varn).

Cuandoserealizeldiagnsticoprenatal,seestudielmarcadorSt14elfetopresentelalelo3paraeste
marcador.(figura4).

Figura4.Geldeagarosaal2%mostrandoelpolimorfismoSt14.Carrilera1:controlpositivo.Carrilera2(III.1):
fetovarnsano(alelo3).Carrilera3(II.1):hemoflico,presentaelalelo1,Carrilera4(I.1):madredelagestante,
homocigticaparaelalelo1,Carrilera5(II.2):Gestante,presentaelalelo1y3.

DISCUSIN
AlanalizaralpolimorfismoBclI,seestablecequeelgenafectadoseestsegregandojuntoconelalelo2dedicho
marcador,comosemuestraenlaFigura2.Paralarealizacindelosestudiosindirectosengeneral,esnecesario
analizarvariosmiembrosdelafamiliaafectadaesimprescindibleelenfermoparaestablecerlafasedeligamiento,
peroademslospadresyencasodelahemofilia,debidoasupatrndeherencia,enocasionesesimprescindible
estudiarhastalosabuelos.Laobtencindemuestrasdelosmiembrosdelafamiliacomodelapacienteserealizan
bajolasnormasticas.Nofueposibleestudiaralpadredelagestante,peroellaresultser2/2portanto,se
infierequeheredelalelo2delpadreyel2delamadre,locualdeterminasucondicindeportadoradelalelo
afectado,peroalserhomocigticanoesinformativa.Conelestudiodelpolimorfismo
St14,nosepuedeconocersilagestanteesportadoraono,debidoaquesumadreeshomocigtica,pero,sin
embargo,seconocequeesportadoraporlainformacinqueofrecielotromarcadorylagestantees
heterocigtica,portanto,sepuederealizardiagnsticoprenatal.

ElpolimorfismoHindIIIfuenoinformativocomoseobservaenlaFigura1,lagestanteylamadreson
homocigticas.

EldiagnsticoprenatalserealizestudiandoalmarcadorSt14,pueseraelnicoparaelcuallagestanteera
heterocigticaelfetopresentelalelo3paraestemarcador(Figura4)porlotanto,esunfetovarnsano.

Conelestudiodeestostresmarcadores,seresaltalaimportanciadeestudiarvariospolimorfismosparala
deteccindeportadorasyeldiagnsticoprenataldelahemofiliaA.Elestudiodirectonospermitedetectarla
mutacinensqueestprovocandolaenfermedad,peroestaentidadesdegranheterogeneidadallicayadems
elporcientodelasmutacionesesmenorde1%esimposibledeterminarcadaunadelasmutacionesreportadas
enelgenafectadoy,porotraparte,lasecuenciaesunatcnicamuycara.Lanicamutacincandidataaestudiar
eslainversindelintrn22,quesegnreportalaliteraturasufrecuenciaesde50%enpacientesconhemofiliaA

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severa.9,10Conelanlisisdeestafamilia,presenciamoscmolainformacindelospolimorfismosse
complementanentres.Enenfermedadescomolahemofiliaesmuyimportanteelestudiopormtodosindirectos,
puesnosposibilitallegaraundiagnsticoenuncortoperododetiempo,yaqueelanlisisanivelmoleculares
muydifcildebidoalgrantamaodelgenysucomplejaorganizacingenmica.Deah,lasugerenciadeestudiar
otrospolimorfismosdelgendelfactorVIIIparagarantizarunmayorporcientodediagnsticoyconestoelevarla
calidaddelestudiomoleculardelasfamiliasafectadas,talescomo:VNTRdelintrn13ydelintrn22.1114

CONCLUSIONES
ConelestudiodelosmarcadoresmolecularesBclI,HindIIIySt14,sedeterminlacondicindeportadorade
hemofiliaAdelagestante.Adems,fueinformativaparaelmarcadorSt14y,portanto,serealizeldiagnstico
prenatal.Resultserunfetovarnsano.

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