Universidad aut nma de Chiapas

Facultad de ciencias qumicas

Campus IV

LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA

PRACTICA NO. 1

antibigrama

CATEDRATICO:

Q.F.B. LUIS HUMBERTO ROSALES FURUKAWA

ALUMNO:
RIOS ROQUE FABIOLA
PEREZ NUN ES NANCY KARINA
ESPINOSA MARTINEZ GLADIS GUADALUPE
GODINES CITALAN NOE
RODAS HERRERA MIGUEL ANGEL

SEMESTRE: 6 GRUPO: A

TAPACHULA CHIAPAS A 05 DE MARZO DEL 2010

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 MARCO TEORICO
El diagn stic y tratamient de un paciente sn muy cmplejs. Desde su llegada a
un establecimient de salud hasta el alta reciben la prestaci n de muchs
prfesinales. Est a su vez genera diferentes prcess, siend el labratri un
de ls ma s imprtantes. Para que ls resultads de labratri sean u tiles en el
manej del paciente, debems asegurar la cnfiabilidad y validez de e sts. Es
necesari entnces, asegurar el cumplimient adecuad de tds ls pass
invlucrads, desde la slicitud del tip de examen y muestra, su transprte,
prcesamient, la emisi n de un resultad, y la adecuada interpretaci n de e ste. De
un examen slicitad y mal rientad, se btendra una muestra inadecuada y pr
tant una infrmaci n errada.

La resistencia bacteriana es un tema de imprtancia en la salud pu blica. Su

extensi n a nivel mundial, desarrll de resistencia a nuevs agentes
antimicrbians, as cm su presencia en pat gens relacinads cn
enfermedades prevalentes, cm sn la enfermedad diarreica aguda, las
infeccines respiratrias agudas y las infeccines intrahspitalarias, le dan el
cara cter de prblema priritari. Pr ell, el cncimient de ls perfiles de
susceptibilidad
Antimicrbiana debe rientar a la elabraci n de esquemas de tratamient ma s
eficaces y adema s, la infrmaci n prprcinada pr la vigilancia debe servir de
insum para la elabraci n de un prgrama de us racinal de antibi tics.

El primer bjetiv del antibigrama es el de medir la sensibilidad de una cepa

bacteriana que se sspecha es la respnsable de una infecci n a un varis
antibi tics. En efect, la sensibilidad in vitr es un de ls requisits previs para
la eficacia in viv de un tratamient antibi tic. El antibigrama sirve, en primer
lugar, para rientar las decisines terape uticas individuales.

El segund bjetiv del antibigrama es el de seguir la evluci n de las resistencias

bacterianas. Gracias a este seguimient epidemil gic, a escala de un servici, un
centr de atenci n me dica, una regi n un pas, es cm puede adaptarse la
antibiterapia emprica, revisarse regularmente ls espectrs clnics de ls
antibi tics y adptarse ciertas decisines sanitarias, cm el establecimient de
prgramas de prevenci n en ls hspitales.

Cua nd realizar un antibigrama?

Siempre que una tma bacteril gica de finalidad diagn stica haya permitid el
aislamient de una bacteria cnsiderada respnsable de la infecci n.
Establecer esta respnsabilidad exige una clabraci n entre el bacteri lg y el
clnic. En efect, en ciertas circunstancias, el micrbi lg n pdra determinar
cn certeza que el aislamient de una bacteria exige un antibigrama, sin ls dats
clnics que le aprta el me dic. Pr ejempl, una bacteria n pat gena puede ser
respnsable de la infecci n de un enferm inmundeprimid en un lugar
determinad del rganism. La presencia de signs clnics puede ser tambie n

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determinante para la realizaci n de un antibigrama (pr ejempl: la infecci n
urinaria cn un nu mer reducid de ge rmenes).

Sensibilidad bacteriana a ls antibi tics

La determinaci n de la Cncentraci n Inhibidra Mnima (CIM) es la base de la

medida de la sensibilidad de una bacteria a un determinad antibi tic. La CIM se
define cm la menr cncentraci n de una gama de dilucines de antibi tic que
prvca una inhibici n de cualquier crecimient bacterian visible. Es el valr
fundamental de referencia que permite establecer una escala de actividad del
antibi tic frente a diferentes especies bacterianas.
Hay diferentes te cnicas de labratri que permiten medir calcular de rutina, y
de manera semicuantitativa, las CIM (me tds manuales y me tds autmatizads
semiautmatizads). Ests diferentes me tds de rutina permiten categrizar
una cierta cepa bacteriana en funci n de su sensibilidad frente al antibi tic
prbad. Esta cepa se denmina Sensible (S), Intermedia (I) Resistente (R) al
antibi tic.

Para un determinad antibi tic, una cepa bacteriana es, segu n la NCCLS:

Sensible, si existe una buena prbabilidad de e xit terape utic en el cas de un

tratamient a la dsis habitual.
Resistente, si la prbabilidad de e xit terape utic es nula muy reducida. N es
de esperar ningu n efect terape utic sea cual fuere el tip de tratamient.
Intermedia, cuand el e xit terape utic es imprevisible.

Cada antibi tic se caracteriza pr un espectr natural de actividad antibacteriana.

Este espectr cmprende las especies bacterianas que, en su estad natural, sufren
una inhibici n de su crecimient pr cncentracines de su antibi tic
susceptibles de ser alcanzadas in viv. A estas especies bacterianas se les dice
naturalmente sensibles a dich antibi tic. Las especies bacterianas que n se
encuentran incluidas dentr de dich espectr se denminan naturalmente
resistentes.

Me td base de diluci n en cald

En ls me tds de diluci n en cald, de casi tds ls me tds utilizads en la

actualidad, se clcan cncentracines decrecientes del agente antimicrbian,
generalmente dilucines 1:2, en tubs cn un cald de cultiv que sstendra el
desarrll del micrrganism. El cald ma s cmu nmente usad para estas
pruebas es el de Mueller-Hintn suplementad cn ls catines magnesi y calci.

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Ls agentes antimicrbians se preparan en "slucines madre" cncentradas y
lueg se diluyen en cald hasta btener las cncentracines aprpiadas.

Un tub de cald se mantiene sin incular cm cntrl negativ de crecimient.

Lueg de la incubaci n adecuada (usualmente de un da para el tr) se bserva la
turbidez de ls tubs que indicara desarrll bacterian. El micrrganism
crecera en el tub cntrl y en tds ls trs que n cntengan suficiente agente
antimicrbian cm para inhibir su desarrll. La cncentraci n de antibi tic
que presente ausencia de crecimient, detectada pr falta de turbidez (igualand al
cntrl negativ), se designa cm la Cncentraci n Mnima Inhibitria (CMI).

Para medir la capacidad de un

antimicrbian para matar a un
micrrganism (CMB) se debe realizar
la prueba de actividad bactericida, que
emplea el mism sistema de diluci n en
cald que para medir la sensibilidad.

Al mism tiemp que la suspensi n

inicial del micrrganism es inculada
en ls tubs de cald, se tma una
alcuta del tub de cntrl de
crecimient, inmediatamente despue s
de ser sembrad, y se incula tambie n
en una placa de agar para determinar el
nu mer real de unidades frmadras de
clnias (UFC) del in cul. Este nu mer
se btiene al cntar las clnias presentes lueg de la incubaci n de la placa de
agar hasta el da siguiente y pr multiplicaci n pr el factr de diluci n. Pr
ejempl, usand un asa calibrada de 0,01 ml para sembrar la placa y cntand unas
250 clnias, en 1 ml del tub riginal habra 250/0,01.

Una vez determinada la CMI, se siembra una cantidad cncida de in cul de cada
un de ls tubs de cald que n presentaban turbidez en placas de agar (la
pequen a cantidad del agente antimicrbian que es llevada junt cn el in cul se
elimina pr diluci n en el agar), y el nu mer de clnias que crece en ests
subcultivs, despue s de incubar durante la nche, se cmpara cn el nu mer de
UFC/ml del cultiv riginal. Dad que inclus las drgas bactericidas n siempre
esterilizan ttalmente una pblaci n bacteriana, la mnima cncentraci n del
agente antibacterian que permite sbrevivir a mens de 0,1 % del in cul riginal
se denmina cncentraci n bactericida mnima (CBM) cncentraci n letal
mnima (CLM).

Me td de difusi n en agar

Una vez demstradas las grandes ventajas de las te cnicas de diluci n en cald, el
pas siguiente, pensand sbre td en pder realizar fa cilmente pruebas de

3
sensibilidad de un micrrganism frente a mu ltiples antibi tics a la vez,
cnsisti en buscar la manera de aplicar la idea directamente a las placas de agar.

Las primeras pruebas se realizarn inculand la superficie de una placa de agar

cn el micrrganism en estudi, clcand pequen as cubetas (de metal vidri)
sbre el agar y agregand las slucines de ls diferentes antimicrbians dentr
de dichas cubetas. Ls agentes antimicrbians difundan en el medi en frma
radial alrededr de la cubeta e inhiban el desarrll del micrrganism en la
zna dnde su cncentraci n era suficientemente alta. Las a reas de inhibici n
grandes indicaban una actividad antimicrbiana ma s efectiva.

Este me td fue mdificad en 1947 pr Bndi y cl. incrprand el agente

antimicrbian a discs de papel de filtr. Fue un pas adelante gigantesc ya que
el us de ls discs de papel permita preparar un gran nu mer de pruebas
ide nticas y almacenarlas para us futur.

En 1966, despue s de ls estudis realizads pr Bauer, Kirby, Sherris y Turk,

ensayand diferentes cepas bacterianas, el emple de ls discs de papel de filtr
para las pruebas de sensibilidad fue estandarizad y crrelacinad
definitivamente cn las CMI crrespndientes.

Durante muchs an s, y a pesar de ser una te cnica puramente cualitativa, el

me td de difusi n pr disc ( me td Kirby-Bauer), en funci n sbre td de su
cmdidad, ecnma y fiabilidad, ha sid, y aun es, un de ls ma s utilizads en
ls labratris de td el mund.

El micrrganism a investigar se incula en una varias placas de agar y sbre su

superficie se dispnen ls discs crrespndientes a varis antibi tics. Se incuban
las placas durante 16-24 hras a 35C y al cab de este tiemp se estudia el
crecimient en ellas. Se valra el dia metr de la zna de inhibici n que se frma
alrededr de cada disc y se cmpara cn las referencias prtunas publicadas pr
el NCCLS. Cn esta referencia pdems infrmar si el micrrganism es Sensible,
Intermedi Resistente (S, I, R) a cada un de ls antibi tics ensayads en las
placas.

Me td de E-test

Es un de ls me tds ma s recientes que se han presentad en el mercad y

resulta de una curisa cmbinaci n de caractersticas de ls me tds anterires. Se
trata de una te cnica cuantitativa en placa que permite btener una lectura directa
de CMI en g/ml, ya que se emplean tiras pla sticas impregnadas en
cncentracines crecientes de antibi tic indicadas en una escala graduada sbre
la prpia tira.

Una de sus grandes ventajas, dadas sus caractersticas, es que resulta un me td

ideal para estudiar cualquier tip de micrrganism, aerbi anaerbi,

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incluyend aquells llamads "fastidiss" ls que tengan requerimients
especiales para crecer.

El micrrganism a investigar se incula en una placa y sbre ella se depsita la

tira del antibi tic ( antibi tics) a ensayar. Tras la incubaci n de 16-24 hras a
35C se bservan las placas y se valra la zna de inhibici n, de frma elptica,
alrededr de cada tira. La CMI se lee directamente bservand el punt ma s baj
de la elipse que presente crecimient.

Antibigrama realizad pr el me td de E-test

En la ftgrafa de la izquierda se muestra una vista general de una placa cn

crecimient bacterian y cn ds tiras de E-test. La zna de clr ma s clar que
cupa la mayr parte de la placa es el crecimient bacterian en las znas n
inhibidas. Las elipses ma s scuras que rdean la parte superir de las tiras E-test
marcan las znas en que ls respectivs antibi tics han inhibid, cn mayr
menr eficacia, el crecimient del micrrganism a estudi.

La ft de la derecha, un plan ma s cercan de la mitad inferir de la placa,

permite bservar cn ma s detalle l sen alad en el pa rraf anterir. Se aprecia
perfectamente cm el pic de la zna ma s estrecha de la elipse en la tira de MZ
cincide, en la escala graduada, cn la franja entre las marcas de 1.5 y 2, l que ns
indicara que la CMI de este antibi tic (MZ) para este micrrganism sera de 2
g/ml.

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 OBJETIVO

Cncer a que antibi tic es sensible un determinad micrrganism

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 PROCEDIMIENTO
Muestra:
Exudad farnge: se prcede a un legrad en el a rea de inflamaci n, se recge el
exudad si existe; se debe evitar el cntact cn la saliva prque puede inhibir la
recuperaci n de ls estreptccs del grup A.

Muestras del tract respiratri superir:

La mayra de las infeccines bacterianas de la faringe esta n prducidas pr
Estreptccs del grup A. tras bacterias que pueden prducir faringitis sn
Corynebacterium diphteriae, B. pertusis, Neisseria gonorrhoeae. Sin embarg, estas
bacterias sn relativamente infrecuentes y se deben utilizar te cnicas especiales
para aislarlas.
Otras bacterias ptencialmente pat genas cm Staphylococus aureus, S.
pneumoniae, Haemophilus influenzae, enterobacterias y Pseudomonas aeruginosa,
pueden estar presente en la rfaringe, per rara vez prducen faringitis.
Se debe utilizar un hisp de Dacrn de alginat de calci para recge las
muestras farngeas. Deben tmarse muestras de la zna de las amgdalas, la faringe
psterir y de cualquier exudad zna ulcerada. Se debe evitar la cntaminaci n
de la muestra cn saliva prque las bacterias de la saliva pueden experimentar un
sbre crecimient inhibir el crecimient de ls estreptccs del grup A.

Medis realizads:
Agar Estafilccs 110
Agar sal y manitl
Agar TSA
Tubs de cald nutritiv
Para la realizaci n de ests medis de cultiv se realizarn ls ca lculs que venan
inscrits en ls frascs que l cntenan al igual que el prcedimient para su
realizaci n

Frtis:
Tinci n de Gram:
Recger muestras
Hacer el extendid
Dejar secar a temperatura ambiente

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Fijar la muestra cn metanl durante un minut al calr (flamead 3 veces
aprx.)
Agregar azul vileta (cristal vileta vileta de genciana) y esperar 1 min. Tdas
las ce lulas Gram psitivas y Gram negativas se tin en de clr azul-purpura.
Enjuagar cn agua.
Agregar lugl y esperar entre 30 segunds y 3 minuts
Enjuagar cn agua.
Agregar acetna y/ alchl y esperar entre 15 y 20s
Enjuagar cn agua.
Tinci n de cntraste agregand safranina fucsina ba sica y esperar 1-2 min Este
tinte dejara de clr rsad-rjiz las bacterias Gram negativas.
Enjuagar cn agua.
Para bservar al micrscpi ptic es cnveniente hacerl a 100x cn aceite de
inmersi n

Me td base de diluci n en cald

1.- En este me td se clcan cncentracines decrecientes del agente

antimicrbian, generalmente dilucines 1:2, en tubs cn un cald de cultiv que
sstendra el desarrll del micrrganism.
2.- El cald ma s cmu nmente usad para estas pruebas es el de Mueller-Hintn
suplementad cn ls catines magnesi y calci per el que utilizams nstrs
fue el cald nutritiv.
3.- Ls agentes antimicrbians se preparan en "slucines madre" cncentradas y
lueg se diluyen en cald hasta btener las cncentracines aprpiadas.
4.- Un tub de cald se mantiene sin incular cm cntrl negativ de
crecimient. Lueg de la incubaci n adecuada (usualmente de un da para el tr)
se bserva la turbidez de ls tubs que indicara desarrll bacterian.
El micrrganism crecera en el tub cntrl y en tds ls trs que n cntengan
suficiente agente antimicrbian cm para inhibir su desarrll.
5.- La cncentraci n de antibi tic que presente ausencia de crecimient,
detectada pr falta de turbidez (igualand al cntrl negativ), se designa cm la
Cncentraci n Mnima Inhibitria (CMI).
6.- Para medir la capacidad de un antimicrbian para matar a un micrrganism
(CMB) se debe realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea el mism
sistema de diluci n en cald que para medir la sensibilidad (la que explicams a
cntinuaci n en placas de TSA)

Sensibilidad a ls antibi tics antibigrama:

Me td de difusi n en agar
1.- el germen aislad, se distribuye en frma unifrme (incul abundante) sbre
un medi slid adecuad (TSA)
2.- ls discs (unidiscs multidiscs) se clcan sbre la placa inculada, cn
pinza este ril, dejand 2 cm., entre disc y disc, se presinan suavemente cn las
pinzas. Se recmienda n pner ma s de 9 discs pr placa

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3.- las placas se incuban, invertidas, en seguida dentr de ls 30siguientes a 37C
4.- ls resultads se leen cuand se tenga un crecimient satisfactri, dentr de
las 18 a 24 hras de incubaci n

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OBSERVACIONES

Morfologa de las colonias que se

desarrollaron en este medio:
redondas
pequeas
blancas y amarillas
convexas

Este es el medio sal y manitol y en este no

hubo mucho crecimiento solo en una placa
que viro a color amarillo, lo que significa que
se fermento el manitol. Los estafilococos
coagulasa (+) fermentan el manitol.

Estas sn las placas del medi TSA que se

utilizarn para el antibigrama cn ls
multidiscs

Ests sn ls 11 tubs de cald nutritiv

que se Utilizarn para suspender las
bacterias de nuestra muestra
(Staphylococus aureus)

Aqu estamos realizando la tincin de

Gram para las muestras de frotis de
exudado farngeo

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 Estos son los frotis que se realizaron
con las tinciones de Gram:
Las colonias se agrupaban en forma de
racimos de uva, Gram positivos ya que
se tieron de color azul-purpura por tal
motivo ya tenemos los argumentos para
decir que nuestro m.o. aislado fue
estafilococos aureus.
Visto a 100x

Frotis realizado Frotis realizado

del medio del medio sal y
estafilococos 110 manitol

En el tubo 1 tenemos a las bacterias

resuspendidas en solucin salina.
En el tubo 2 tenemos al tubo de Mc-
1 2 Farland No. 1.
La turbidez de las bacterias
resuspendidas en la solucin salina
tuvo que ser igual a la del tubo de Mc-
Farland.

Aqu podemos ver cuando estbamos

agregando 1 gota de la solucin salina
con bacterias a cada uno de los 11
tubos de caldo nutritivo

11
 Aqu estamos realizando las diluciones en
serie del antibitico amoxicilina en los 11
tubos de caldo nutritivo. La 1ra
concentracin para llevar a cabo las
diluciones en serie del medicamento fue
de 64mg/L.

Colocacin

del

multidiscos

en las placas

de TSA

CMI

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 32mg/L 16mg/L

antibi tic Radi (cm) Radi (cm) Radi (cm) Media

PER 1.3 1.2 1.2 1.23
CTX 1.4 1.3 1.4 1.36
CXM 0.7 0.7 0.8 0.73
SXT 0 0 0 0
AM 0.4 0.3 0.3 0.33
E 1 0.9 0.9 0.93
CF 1.4 1.3 1.3 1.33
PE 0 0 0 0
GE 0.9 0.9 0.9 0.9
TE 0.1 0.1 0.1 0.1
CAZ 0.5 0.5 0.5 0.5
DC O.3 0.3 0.3 0.3

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 RESULTADOS

CMI: fue el tub que tenia la cncentraci n de de 16mg/L de nuestr

antibi tic

CMB: n tuvims dicha cncentraci n, ya que al resembrar las bacterias

cntenidas en ls tubs de cald en cncentracines de antibi tic de
32mg/L y 16 mg/L en placas de TSA hub crecimient exagerad de m..

Segu n ls dats arrjads del antibigrama ls antibi tics sn:

Resistente a: SXT, PE, TE
Sensible intermedi: CXM, AM, GE, CAZ, DC
Sensible: PER, CXT, E, CF

DISCUSIONES

En el me td base de diluci n en cald, el tub de ensaye que mstr la CMI

(Cncentraci n mnima inhibitria) fue el tub de ensaye que tub la
cncentraci n de 16mg/L del antibi tic (el antibi tic usad fue amxicilina).
Esta ns indica que esta cncentraci n es la menr cncentraci n de nuestras
dilucines de antibi tic que prvca una inhibici n visible de la bacteria, dich de
tra manera, este tub fue el que tuv la menr cncentraci n diluida de
antibi tic en el que n se presentaba una turbidez presente en ls tubs
anterires a e l, l que significa que n hub crecimient bacterian visible.

Despue s de haber btenid la CMI, ls tubs siguientes y el tub de la CMI

Se resembrarn en placas de TSA para btener la CMB (cncentraci n mnima
bactericida).
La CMB es la capacidad que tiene un antimicrbian para matar a un
micrrganism. En este cas ls tubs que se resembrarn en placas de TSA
fuern ls tubs que tenan las cncentracines de 32mg/L y 16mg/L.
Al resembrar y dejar incubar las placas de TSA en la estufa a 35C pr 24 hras, di
cm resultad crecimient en las 2 placas l que ns da a entender este
antibi tic n puede matar a nuestra bacteria, adema s de crecimient de trs
tips de micrrganisms.

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Al igual, pensams que al dar este resultad nuestra estufa ha de estar
cntaminada adema s de que n llega hasta la temperatura adecuada que es de
37C sin llega hasta 35C, ya que td el prcedimient de resembrad se llev a
cab en cndicines de esterilidad.

Crrbrams cn la literatura de que el me td de diluci n en cald ns

da a cncer la CMI y la CMB, ya que nuestra cncentraci n mnima inhibitria fue
de 16 mg/L y la CMB n la llegams a cncer ya que este micrrganism es
resistente a este antibi tic al grad de n pder acabar cn e l.

BETALACTA MICOS: La resistencia a meticilina implica tambie n pe rdida de

sensibilidad a este grup de antimicrbians, pr l que n tienen cabida en el
tratamient del SARM, n bstante a est, se esta n desarrlland nuevas
cefalsprinas que, en estudis de experimentaci n animal, han demstrad una
mejr actividad bactericida que la vancmicina, plantea ndse inclus su us en
terapias de cmbinaci n. Existen adema s nuevs carbapene mics, cn una afinidad
aumentada para las PBP2, que ya han demstrad resultads psitivs en las
primeras fases de investigaci n. Pr tr lad, en alguns estudis se ha bservad
que la asciaci n de vancmicina y clxacilina imipenem puede ser sine rgica.
Nstrs crrbrams la literatura cn nuestra practica ya que la penicilina
al pertenecer al grup de ls betalactamics n cre hal de inhibici n, pr tal
mtiv ests medicament ya n surten ningu n efect cntra ests
micrrganisms

CONCLUSIONES

Gracias a esta pra ctica aprendims a realizar td el prcedimient para

cncer la sensibilidad de un micrrganism a algu n medicament
determinad, realizand ls prcedimients para encntrar la CMI y la CMB
mediante ls me tds de diluci n en cald y de difusi n en agar. Tambie n
supims que al utilizar el me td de diluci n en cald encntrams tant la
CMI y la CMB y mediante la utilizaci n de multidiscs sl sabems a que
tip de medicaments es susceptible el micrrganism.

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 BIBLIOGRAFIA
Varis autres, 1989. Micrbilga me dica. Manual Mdern (1990),
Me xic
Bailey Sctt. Diagn stic micrbil gic. Editrial me dica panamericana (1989),
Argentina
Regueir Garca, B. Resistencia a la infecci n.
Varis autres. Gua de terapia antimicrbiana. Dade-Grifls
http://www.micrinmun.qb.fcen.uba.ar/SeminariAntibitics.htm

secretaria de cmerci y fment industrial

Nrma mexicana
Nmx-bb-012-1974
"multidiscs para antibigramas"

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