1.

Transporte de los de ovarios de alpacas sacrificadas en

el camal

Los ovarios de alpacas colectados se transportan en bolsas de

polietileno con solucin salina (0.9% NaCl) + antibiticos
(100 U.I. /mL de penicilina + 1 mg/mL de estreptomicina),
dentro de un termo con agua caliente de 30 a 35C.

2. Obtencin de ovocitos

En el laboratorio los ovarios son lavados 2 veces con suero

fisiolgico temperado a 35C y secados con papel toalla.

Aspiracin de ovocitos de 2 a 5 mm con ayuda de una aguja 19

1
G X adosado a una jeringa de 5 mL y con una presin de
2
12 mL/ minuto.

El contenido de la aspiracin (fluido folicular + ovocitos)

verter en un tubo de ensayo de 10 mL de capacidad, dejar el
tubo en reposo por 10 min para separar el sedimento.

Seguidamente extraer el sobrenadante con ayuda de una

jeringa de tuberculina.

El sedimento se verter en una placa Petri cuadriculada en su

base y enjuagar el tubo con 2 mL de (PBS + 10% de SFB, TCM-
199 o fluido folicular centrifugado).

Dejar en reposo 2 a 3 min, luego continuar con la bsqueda de

ovocitos.

Estos ovocitos trasladar a otra placa para realizar la

evaluacin y seleccin de los ovocitos.

3. Clasificacin de los ovocitos

Categora A= Presentan ms de tres capas compactas de

clulas del cmulus que los rodean en toda su superficie
Categora B= presentan tres capas compactas de clulas
del cmulus.

4. Maduracin in vitro

Preparacin de medio de maduracin:

Centrifugar a 3500 rpm por 30 min el fluido folicular de

 folculos grandes y pequeos.

Adicionar 2 UI(2uL/mL) de eCG (FSH), 10 UI(2uL/mL) hCG

(LH), 5 uL/mL de Heparina y 10uL/mL de antibitico.

El medio de maduracin preparado colocar 500 uL en una placa

petri de dos pocillos cubiertos con aceite mineral.

Realizar el lavado de ovocitos en gotas de cultivo.

Incubar en bao mara con 5% de CO2 por 36 horas.

5. Evaluacin de maduracin

Los ovocitos madurados despus de 36 h de incubacin, sern

extrados a gotas de mPBS+10% de suero fetal para ser lavados
y evaluados en una placa Petri.

Para la evaluacin se tomara en cuenta el

Grado de expansin de las clulas del cumulus del
ovocito.

a la aspiracin la elasticidad del cumulus ophorus.

Para ratificar la maduracin el 50% de los ovocitos sern

desnudados, colocando en un tubo cnico de vidrio con 0.5 mL
de mPBS+10% de suero fetal.

Vorterizar al mximo de rpm (10 000 rpm) por 45 segundos.

Evaluar y contabilizar por la presencia del primer corpsculo

polar a 25X y 100X.

6. FERTILIZACIN IN VITRO

6.1. Coleccin, preparacin y capacitacin de

espermatozoides.

Preparacin de SPERM TALP:

Componente
SPERM TALP (stok) 1 mL 2mL 5mL
BSA Fraccin V 0.006g 0.012g 0.030g
Antibitico 10uL 20uL 50uL
Piruvato 10uL 20uL 50uL

Vorterizar a 3500 r / 30 seg para homogenizar la solucin.

Ajustar pH con CO2 (6.8-7.4)

Atemperar a 37C la solucin en un termo para la coleccin

de semen.

Colectar el semen de los machos del conducto deferente

desviado.

Evaluar la motilidad y concentracin de espermatozoides.

6.2 Fertilizacin in vitro

Preparacin de FERT TALP

Componente
FERT TALP (stok) 1 mL 2mL 5mL
BSA Fraccin V 0.006g 0.012g 0.030g
Antibitico 10uL 20uL 50uL
Piruvato 10uL 20uL 50uL

Vorterizar a 3500 r / 30 seg para homogenizar la solucin.

Ajustar pH con CO2 (6.8-7.4)

Verter la solucin en placas de 2 discos y en gotas, luego

cubrir con aceite mineral.

Incubar por 2 horas en bao mara con 5% CO2 para su

equilibracin.

Los ovocitos maduros lavar tres veces en gotas de FERT TALP

equilibradas.

Adicionar a FERT TALP (solucin de trabajo):

P-H-E 30uL/500 uL
Heparina 1uL/1 mL o 10 ug/mL

Inseminar con 2.5 x 106 de espermatozoides/ 2uL

Incubar por 36 horas con 5% CO2.