Laboratorio 3

Procesamiento de los datos

1. Construir una curva de calibrado para la cuantificacin espectrofotomtrica de p-NP

Note que se debe restar la absorbancia del blanco a los diferentes estndares. Esto, puesto que el
lector de microplaca no realiza esta operacin.

Curva de Calibracin
pNP Carbonato Abs pNP
Solucin (L) (L) Absorbancia .corregida (M)
1 0 1000 0.0427 0 0
2 125 875 0.0963 0.0536 7.5
3 250 750 0.1514 0.1087 15
4 500 500 0.2538 0.2111 30
5 750 250 0.3612 0.3185 45
6 1000 0 0.4708 0.4281 60

pNP (mM)
0.5
0.4
y = 0.007109x
Absorbancia

0.3 R = 0.999900

0.2
0.1
0
0 20 40 60 80
p-NP (M)
De esta manera se tiene: Abs= 0.007109*[p-NP]

2. Calcular la actividad expresada por la enzima fosfatasa cida de germen de trigo a cada
pH y temperatura evaluada.

Para esquematizar los procedimientos se tomar como ejemplo la condicin 4C y pH 5.

i) Restar la absorbancia obtenida a tiempo cero a los diferentes valores de

absorbancia obtenidos a la misma condicin (pH y Temperatura). El tiempo cero
corresponde a un blanco, que incluye la absorbancia basal del sustrato y la
enzima.
ii) Calcular la concentracin de p-NP utilizando la curva de calibrado y las
absorbancias corregidas.
 Tiempo Temperatura Abs
(min) (C) pH Absorbancia corregida pNP (M)
0 4 5 0.0503 0 0
5 4 5 0.0568 0.0065 9.143339429
10 4 5 0.0695 0.0192 27.00801801
20 4 5 0.0833 0.033 46.42003095

iii) Graficar la concentracin p-NP versus el tiempo de reaccin. Calcular la velocidad

inicial de reaccin mediante regresin.

pH5 y 4C
50
40
y = 2.369900x
p-NP (M)

30 R = 0.984779

20
10
0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (min)
iv) Calcular la actividad enzimtica especfica a la condicin estudiada.

mol L mol
actividad=2.37 *500L 6 =0.001185 =0.001185 UI
Lmin 10 L min
Note que el volumen de reaccin corresponde a 500 L, el cual est formado por 200 L
de sustrato, 200 L de tampn y 100 L enzima. Adems, tenga presente que 1 M
equivale a 1 mol/L.

Luego la actividad especfica se calcula dividiendo la actividad por la cantidad de

enzima agregada (ver la gua).
0.001185 UI UI
actividad especfica= =0.0237
10 mg/mL mg
0.1 mL* ( 20 )
 v) Repetir el punto 2 para las restantes condiciones de pH y temperatura.

Para los datos de sus compaeros tenemos:

Actividad especfica (UI/mg)

pH

Temperatura 5 7.4 9.5

(C) 4 0.0237 0.0070 0.0034
37 0.1864 0.0082 0.0005
60 0.3664 0.0000 0.0000

3. Analice el efecto del pH y la temperatura en la actividad enzimtica.

Para ello realice grficos como el siguiente, que faciliten la visualizacin del efecto de
ambas variables.

0.4
Actividad especfica (UI/mg)

0.3

0.2

0.1

0.0
4 5 6 7 8 9 10
pH

4C 37C 60C

Tenga presente que el grfico anterior es slo un ejemplo.

4. Discuta sus resultados.

Dato: la actividad especfica declarada por Sigma para el preparado de fosfatasa
acida de germen de trigo es 0.4 UI/mg a condiciones ptimas (pH 4.8 y 37 C).