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VANESSA HELOISA FERREIRA DE FARIA

GLIFOSATO: DESENVOLVIMENTO DE
METODOLOGIA PARA DETERMINAO EM
SOJA E MILHO E AVALIAO DE
PARMETROS LABORATORIAIS EM
TRABALHADORES EXPOSTOS A
AGROTXICOS.
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-
Graduao em Cincia Farmacuticas da
Faculdade de Farmcia da Universidade Federal
de Minas Gerais, como requisito parcial
obteno do ttulo de Mestre em Cincia
Farmacuticas.

Orientadora: Profa. Dra. Luci Maria SantAna Dusse


Co-orientadora: Profa. Dra. Leiliane Coelho Andr

Faculdade de Farmcia da UFMG

Belo Horizonte, MG
2013
Faria, Vanessa Heloisa Ferreira de.
F224g Glifosato: desenvolvimento de metodologia para determinao
em soja e milho e avaliao de parmetros laboratoriais em
trabalhadores expostos a agrotxicos / Vanessa Heloisa Ferreira de
Faria. 2013.
130 f. : il.

Orientadora: Profa. Dra. Luci Maria SantAna Dusse.


Co-orientadora: Profa. Dra. Leiliane Coelho Andr.

Dissertao (mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais,


Faculdade de Farmcia, Programa de Ps-Graduao em Cincias
Farmacuticas.

1. Glifosato Teses. 2. Produtos qumicos agrcolas Teses. 3.


Herbicidas Teses. 4. Espectrometria de Massas Teses. 5.
Cromatografia lquida Teses. 6. Trabalhadores rurais Teses. 7.
Toxicologia ambiental Teses. 8. Toxicologia Testes Teses. I.
Dusse, Luci Maria SantAna. II. Amorim, Leiliane Coelho Andr. III.
Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmcia. IV.
Ttulo.

CDD: 615.9
AGRADECIMENTOS

Acho que a gratido deve ser expressa durante o trabalho, no decorrer do processo
e no apenas com essas poucas palavras escritas aqui, mas queria deixar
registrado o quanto sou grata a todas as pessoas que me aconselharam, motivaram,
orientaram ou qualquer outra colaborao que de alguma forma resultou na
apresentao dessa dissertao e de todo o trabalho antes dela.

Agradeo a Deus, sempre e em primeiro lugar, por tudo, pela fora e sade para
lutar de vencer.

Agradeo minha famlia: irmos, sobrinhos, tios, primos... (como a famlia


grande), mas principalmente aos meus pais, irmos e ao meu marido, amor e
companheiro Michel, pelas lutas em conjunto, por estar sempre ao meu lado.

Agradeo aos colegas do Laboratrio de Resduos de Pesticidas (LRP) da Funed,


pelos auxlios tcnicos, conselhos de vida e companheirismo, principalmente
minha amiga e chefia imediata Tnia, pelo grande incentivo.

Agradeo aos tcnicos dos equipamentos que me ajudaram quando tudo estava
dando errado, ao Cludio Fiuza da Agilent e ao Hlio Martins Jr. da AB Sciex.

Agradeo ao diretor da APRAFAD Nilson Srgio Pereira e ao engenheiro agrnomo


Adenilson Martins pelo empenho e mobilizao dos agricultores pelo auxlio nessa
luta...

Agradeo equipe dos laboratrios de hematologia e bioqumica da FAFAR/UFMG


pelas anlises realizadas e Danyelle Rios pela grande ajuda da coleta de sangue
em Divinpolis.

s minhas orientadoras.
RESUMO

Desde 2008 o Brasil assumiu o posto de maior mercado consumidor mundial de


agrotxicos. Considerando toda a gama de princpios ativos, o glifosato tem
destaque nesse mercado, com 76% do total de vendas de herbicidas. Tendo em
vista a importncia deste produto no cenrio mundial e nacional, e o risco de
exposio ambiental e ocupacional, tornam-se necessrias medidas de proteo
sade da populao. Portanto, props-se o desenvolvimento e validao de
metodologia analtica para determinao de glifosato e AMPA em amostras de soja
e milho empregando-se a tcnica de cromatografia lquida acoplada
espectrometria de massas em tandem com ionizao por electrospray. A linearidade
do mtodo foi obtida na faixa de 0,005 a 0,05 ng/L para glifosato e 0,10 a 1,0 ng/L
para AMPA. Comprovou-se o efeito de matriz para ambas. A recuperao
apresentou uma faixa mdia de 86 a 107% e de 85 a 118% para o glifosato e AMPA,
respectivamente. Os limites de quantificao em milho e soja para o glifosato foram
de 1,0 e 2,0 mg/kg respectivamente. A incerteza expandida para o glifosato e AMPA
em milho variou de 22 a 24% e 24 a 26% respectivamente. Em soja os valores de
incerteza expandida para glifosato e AMPA foram respectivamente 27 a 31% e 59 a
93% sendo considerada insatisfatria no caso do AMPA, com base nos valores
aceitos pelo SANCO, necessitando, dessa forma de mais testes. Para aplicar a
metodologia validada foram analisadas 75 amostras de milho, no sendo detectados
resduos de glifosato ou AMPA nas mesmas. Associados ao desenvolvimento da
metodologia analtica foram determinados parmetros hematolgicos e bioqumicos
para avaliar o impacto sade de agricultores expostos ao glifosato e outros
agrotxicos, sabendo que a exposio na agricultura mltipla. A populao
estudada consistiu de 49 trabalhadores expostos a agrotxicos do municpio de
Divinpolis com mdia de idade de 42 anos, sendo todos do sexo masculino. Mais
de 61% dos trabalhadores utilizavam EPI completo e mais da metade (54%)
informou que faz uso do glifosato. Apesar disso, os inseticidas (43%) foram a classe
de agrotxicos mais utilizada pelo grupo, seguida pelos herbicidas (31%) e
fungicidas (26%). As alteraes hematolgicas foram discretas e consistiram em
diminuio da hemoglobina (4%), plaquetopenia (4%), neutrofilia (8,2%) e eosinofilia
(10,5%). Quanto aos parmetros bioqumicos, 19,1% dos trabalhadores tiveram
alterao de AST, 16,3% de ALT, 14,3% de GGT. Foi encontrado aumento da
creatinina srica em 76,6% e 8,2% de ureia nos trabalhadores pesquisados. A
biomonitorizao de efeito para a avaliao da exposio ocupacional a agrotxicos
complexa sendo limitado o estabelecimento do nexo causal entre as alteraes de
parmetros laboratoriais e a exposio ocupacional aos agrotxicos. A avaliao
peridica da funo medular, heptica e renal deve ser incentivada para prevenir
danos sade em decorrncia da exposio a esses compostos.

Palavras-chave: glifosato, validao analtica, espectrometria de massas,


cromatografia lquida, agrotxicos, biomonitorizao.
ABSTRACT

Since 2008 Brazil has assumed the position of the largest global consumer of
agrochemicals market. Considering the full range of active ingredients, the
glyphosate has highlighted that market, with 76% of total sales of herbicides.
Considering the importance of this product on the world, and the risk of
environmental or occupational exposure, measures to protect the health of the
population are necessary. Therefore, we proposed the development and validation of
analytical methodology glyphosate and AMPA determination in soybean and corn
samples by liquid chromatography coupled electrospray ionization tandem mass
spectrometry technique. The method linearity for glyphosate was 0.005 to 0.05 ng/L
and for AMPA 0.10 to 1.0 ng/L. The matrix effect was proved for both. The recovery
ranged from 86 to 107% and from 85 to 118% for glyphosate and AMPA,
respectively. The limits of quantification in corn and soybeans for glyphosate were
1.0 and 2.0 mg/kg respectively. The expanded uncertainty for glyphosate and AMPA
in maize ranged from 22 to 24% and 24 to 26% respectively. In soybean expanded
uncertainty values for glyphosate and AMPA were 27-31% and 59-93% respectively.
Is was considered unsatisfactory for AMPA, based on the values accepted by
SANCO further testing need be done. To apply the validated methodology, it were
analyzed 75 corn samples, waste is not detected at the same glyphosate and AMPA.
Hematological and biochemical parameters were avalysed aimig to determine the
impact on health of farmers exposed to glyphosate and other pesticides, since the
agrochemicals exposure in agriculture is multiple. A total of 49 men workers exposed
to pesticides in Divinpolis/Brazil with an average age of 42 years. Over 61% of the
workers wore full health protect equipment and over half (54%) reported using
glyphosate. Nevertheless, insecticides (43%) were the most widely used class of
pesticides, followed by herbicide (31%) and fungicides (26%). Hematological
abnormalities were mild and consisted in decreased hemoglobin (4%),
thrombocytopenia (4%), neutrophilphilia (8.2%), and eosinophilia (10.5%). Regarding
the biochemical parameters, 19.1% of workers had change of AST, ALT of 16.3%,
14.3% of GGT. Serum creatinine and urea were increased in 76.6% and 8.2% of the
workers repectively. Biomonitoring occupational exposure to pesticides is complex
and the causal link establishment between changes in laboratory parameters and
occupational exposure to pesticides is limited. Periodic assessment of bone narrow,
liver and kidney function should be encouraged to prevent damage to health due to
exposure to these compounds.

Keywords: glyphosate, analytical validation, mass spectrometry, liquid


chromatography, pesticides, biomonitoring.
LISTA DE FIGURAS

1 Estrutura qumica do glifosato e de seu principal metablito (AMPA). ..................................... 29


2 Dez ingredientes ativos mais comercializados no Brasil em 2009 (em toneladas) .................. 30
3 Espacializao da comercializao do ingrediente ativo glifosato, por estado, em 2009 ....... 30
4 Vendas de Produtos Formulados por Classe de Uso (kg) Brasil (2 semestre de 2010 e 1
semestre de 2011) ............................................................................................................................... 31
5 Participao das Vendas de Produtos Formulados por Ingrediente Ativo (kg) Brasil (2
semestre de 2010 e 1 semestre de 2011)......................................................................................... 32
6 Participao das Vendas de Herbicidas (Produto Formulado) por Ingrediente Ativo (kg) -
Brasil (2 semestre de 2010 e 1 semestre de 2011) ........................................................................ 32
7 Fluxograma do processo de extrao ........................................................................................... 52
8 Diagrama de um instrumento triploquadrupolo. Q1 e Q3 so espectrmetros de massas e o
quadrupolo do meio (q2) a clula de coliso ................................................................................ 53
9 Constantes de ionizao do glifosato e AMPA............................................................................. 56
10 Grficos exploratrios dos resduos da regresso de glifosato e AMPA no ensaio de
avaliao da linearidade com indicao dos respectivos valores extremos diagnosticados pelo
teste de resduos padronizados Jacknife ......................................................................................... 65
11 Curva de calibrao obtidas nos ensaios de avaliao da linearidade para Glifosato ......... 66
12 Curva de calibrao obtidas nos ensaios de avaliao da linearidade para AMPA .............. 66
13 Cromatogramas mostrando branco de soja. (A) Transio de quantificao do AMPA; (B)
Relao entre as transies de Quantificao e Qualificao do AMPA; (C) on pai com os dois
ons filhos para o AMPA; (D) Transio de quantificao do Glifosato; (E) Relao entre as
transies de Quantificao e Qualificao do Glifosato; (F) on pai com os dois ons filhos
para o Glifosato. .................................................................................................................................. 68
14 Cromatogramas mostrando branco de milho. (A) Transio de quantificao do AMPA; (B)
Relao entre as transies de Quantificao e Qualificao do AMPA; (C) on pai com os dois
ons filhos para o AMPA; (D) Transio de quantificao do Glifosato; (E) Relao entre as
transies de Quantificao e Qualificao do Glifosato; (F) on pai com os dois ons filhos
para o Glifosato ................................................................................................................................... 68
15 Cromatogramas de soluo padro de glifosato na concentrao de 1,0 mg/kg e soluo
padro de AMPA na concentrao de 20,0 mg/kg em soja. (A) Transio de quantificao do
AMPA; (B) Relao entre as transies de Quantificao e Qualificao do AMPA; (C) on pai
com os dois ons filhos para o AMPA; (D) Transio de quantificao do Glifosato; (E) Relao
entre as transies de Quantificao e Qualificao do Glifosato; (F) on pai com os dois ons
filhos para o Glifosato ........................................................................................................................ 69
16 Cromatogramas de soluo padro de glifosato na concentrao de 0,50 mg/kg e soluo
padro de AMPA na concentrao de 10,0 mg/kg em milho. (A) Transio de quantificao do
AMPA; (B) Relao entre as transies de Quantificao e Qualificao do AMPA; (C) on pai
com os dois ons filhos para o AMPA; (D) Transio de quantificao do Glifosato; (E) Relao
entre as transies de Quantificao e Qualificao do Glifosato; (F) on pai com os dois ons
filhos para o Glifosato ........................................................................................................................ 69
17 Supresso de sinal da soja e milho. ............................................................................................ 70
18 Efeito de matriz para glifosato em soja e milho. ........................................................................ 70
19 Efeito de matriz para AMPA em soja e milho. ............................................................................ 71
20 Efeito de matriz relacionado ao fator de diluio da amostra- Glifosato em milho ............... 72
21 Efeito de matriz relacionado ao fator de diluio da amostra- AMPA em milho .................... 73
22 Peso de alguns componentes da incerteza associada anlise de glifosato em milho e soja
respectivamente. ................................................................................................................................. 79
23 Peso de alguns componentes da incerteza associada anlise de AMPA em milho e soja
respectivamente. ................................................................................................................................. 79
24 Escolaridade dos trabalhadores rurais de Divinpolis pesquisados ...................................... 91
25 Informao sobre a ltima vez que o trabalhador entrou em contato com algum tipo de
formulao de agrotxicos. ............................................................................................................... 94
26 Percentual dos agrotxicos utilizados pelos trabalhadores rurais de Divinpolis segundo
classe/modo de ao. ......................................................................................................................... 95
27 Classificao toxicolgica dos agrotxicos utilizados pelos trabalhadores rurais de
Divinpolis ........................................................................................................................................... 95
28 Representao grfica da determinao da concentrao de hemoglobina nos
trabalhadores rurais expostos a agrotxicos .................................................................................. 98
29 Representao grfica da determinao do nmero de plaquetas nos trabalhadores rurais
expostos a agrotxicos. ..................................................................................................................... 99
30 Representao grfica da determinao da global de leuccitos nos trabalhadores rurais
expostos a agrotxicos. ..................................................................................................................... 99
31 Representao grfica da determinao da concentrao de AST srica nos trabalhadores
rurais expostos a agrotxicos. ........................................................................................................ 102
32 Representao grfica da determinao da concentrao de ALT srica nos trabalhadores
rurais expostos a agrotxicos. ........................................................................................................ 102
33 Representao grfica das transaminases hepticas nos trabalhadores rurais expostos a
agrotxicos. ....................................................................................................................................... 103
34 Representao grfica da determinao da concentrao de GGT srica nos trabalhadores
rurais expostos a agrotxicos. ........................................................................................................ 103
35 Representao grfica da determinao da concentrao de creatinina srica nos
trabalhadores rurais expostos a agrotxicos ................................................................................ 104
36 Representao grfica da determinao da concentrao de ureia srica nos trabalhadores
rurais expostos a agrotxicos. ........................................................................................................ 106
LISTA DE TABELAS

1 Vendas brasileiras de defensivos agrcolas por classes. ........................................................... 23


2 Classificao Toxicolgica dos Agrotxicos, segundo o Ministrio da Sade ........................ 24
3 Casos, bitos e letalidade de intoxicao humana, por agente, registrados no Brasil em 2010.
............................................................................................................................................................... 27
4 Casos de intoxicao por agrotxicos em geral, segundo zona de ocorrncia, registrados em
2009. ...................................................................................................................................................... 27
5 Agrotxicos a base de glifosato aptos para comercializao em Minas Gerais e as vrias
classificaes toxicolgicas. ............................................................................................................. 36
6 Limites mximos de resduos (LMR) e intervalo de segurana de glifosato de acordo com a
cultura onde aplicado. ..................................................................................................................... 41
7 Produo brasileira de milho ano safra 2012/2013, por Estado ................................................. 46
8 Produo brasileira de soja ano safra 2012/2013, por Estado. ................................................... 47
9 Parmetros da fonte de ionizao JetStream empregados nas anlises. .............................. 54
10 Parmetros otimizados para anlise de glifosato e AMPA em amostras de soja e milho. ... 55
11 Faixa de operao analtica validada para glifosato e AMPA. .................................................. 65
12 Concentraes das recuperaes, mdias de recuperao, desvios padro relativos sob
condies de repetitividade e de reprodutibilidade parcial para matriz Milho ............................. 74
13 Concentraes das recuperaes, mdias de recuperao, desvios padro relativos sob
condies de repetitividade e de reprodutibilidade parcial para matriz Soja .............................. 74
14 Limites de deteco e quantificao de Glifosato e AMPA para Soja e Milho. ...................... 76
15 Valores de incertezas expandidas relativas de Glifosato e AMPA........................................... 78
16 Dados relacionados aplicao e uso das misturas de agrotxicos ..................................... 93
17 Produtos formulados utilizados pelos trabalhadores rurais de Divinpolis .......................... 96
18 Venda de agrotxicos por classe em 2011 no Brasil ................................................................ 97
19 Parmetros hematolgicos dos trabalhadores rurais expostos a agrotxicos. .................... 98
20 Diferencial de leuccitos dos trabalhadores rurais expostos a agrotxicos ....................... 100
21 Avaliao dos parmetros bioqumicos em trabalhadores rurais expostos a agrotxicos.100
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABNT Associao Brasileira de Normas Tcnicas


AGROFIT Sistema de Agrotxicos Fitossanitrios
ALT Alanina Aminotransferase
AMPA cido Aminometilfosfnico
ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
APRAFAD Associao dos Produtores da Agricultura Familiar de
Divinpolis
AST Aspartato Aminotrasferase
CL50 Concentrao Letal inalatria suficiente para matar 50% de um
lote de animais.
CONAB Companhia Nacional de Abastecimento
DISAD Diviso Nacional de Vigilncia Sanitria de Saneantes
Domissanitrios
DL50 Dose Letal Suficiente para Matar 50% de um Lote de Animais
DNA cido desoxirribonucleico
DPRr Desvio Padro Relativo de Repetitividade
DPRR Desvio Padro Relativo de Reprodutibilidade Parcial
EC European Commission
EDTA cido etileno diaminotetrectico
EFSA European Food Safety Authority
EMATER Empresa de Assistncia Tcnica e Extenso Rural
EPI Equipamento de proteo individual
ESI Ionizao por Electrospray
EPSPS 5-enol-piruvil-shiquimato-3-fosfato sintetase
FIOCRUZ Fundao Oswaldo Cruz
FMOC-Cl Cloroformato de 9-fluorenilmetoxcarbonil
FMOC-OH Hidrxido de 9-fluorenilmetoxcarbonil
FPD Flame Photometric Detector
FUNED Fundao Ezequiel Dias
GGT Gama Glutariltrasferase
GHS Globally Harmonized System of Classification and Labeling of
Chemicals
GM Geneticamente Modificado
Hb Hemoglobina
HFB Heptafluorobutanol
Hm Eritrcitos
Ht Hematcrito
HPLC Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renovveis
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica
IDA Ingesto Diria Aceitvel
IDH ndice de Desenvolvimento Humano
IEA Instituto de Economia Agrcola
IMA Instituto Mineiro Agropecurio
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade
Industrial
IPCS International Programme on Chemical Safety
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
LACEN Laboratrio Central
LC/ESI-MS/MS Cromatografia Lquida Acoplada Espectrometria de Massas
em tandem com Ionizao por Electrospray
LD Limite de deteco
LMR Limite mximo de resduos
LQ Limite de quantificao
MAPA Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
MCH Hemoglobina corpuscular mdia
MCV Volume corpuscular mdio
MERC 2-mercaptoetanol
MMQO Mtodo dos Mnimos Quadrados Ordinrios
MR Material de Referncia
MRC Material de Referncia Certificado
MS Ministrio da Sade
NE No estabelecido
OGM Organismo geneticamente modificado
OMS Organizao Mundial da Sade
OPA orto-ftalaldedo
OPAS Organizao Pan-americana de Sade
PAA Programa de Aquisio de Alimentos
PAN AP Pesticide Action Network Asia & the Pacific
PARA Programa de Anlise de Resduos de Agrotxicos em Alimentos
PNAE Programa Nacional de Alimentao Escolar
PNCRC Programa Nacional de Controle de Resduos e Contaminantes
POEA Polietoxilenoamina
rpm Rotaes por minuto
RR Roundup Ready
SIM Selected Ion Monitoring
SINAN Sistema de Informao de Agravos de Notificao.
SINDAG Sindicato Nacional da Indstria de Produtos para Defesa
Agrcola
SINITOX Sistema Nacional de Informaes Txico-Farmacolgicas
SNVS Secretaria Nacional de Vigilncia Sanitria
SISAGRO Sistema de Alerta Rpido Agropecurio
SPE Extrao em Fase Slida
SRM Selected Reaction Monitoring
SUS Sistema nico de Sade
SVS Secretaria de Vigilncia Sanitria
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TFAA cido trifluoroactico anidro
TFG Taxa de filtrao glomerular
TFB Trifluoroetanol
TMOA Trimetilorto-acetato
TR Tempo de reteno
US EPA United States Environmetal Protection Agency
USDA United Stated Department of Agriculture
SUMRIO

AGRADECIMENTOS ........................................................................................................................... 4
RESUMO ............................................................................................................................................... 5
ABSTRACT ........................................................................................................................................... 7
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................ 9
LISTA DE TABELAS .......................................................................................................................... 11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .......................................................................................... 12
SUMRIO ............................................................................................................................................ 15
1 INTRODUO ..................................................................................................................................... 18
2 REVISO DA LITERATURA ................................................................................................................... 22
2.1 Agrotxicos.................................................................................................................................. 22
2.1.1 Classificao dos agrotxicos ............................................................................................... 23
2.1.2 Aspectos toxicolgicos e epidemiolgicos dos agrotxicos ................................................. 24
2.2 Glifosato ...................................................................................................................................... 29
2.2.1 Classificao toxicolgica do Glifosato................................................................................. 35
2.2.2 Glifosato em alimentos ........................................................................................................ 40
2.2.3 Aspectos analticos do glifosato ........................................................................................... 42
2.3 Milho ........................................................................................................................................... 45
2.4 Soja .............................................................................................................................................. 46
3 OBJETIVO GERAL ................................................................................................................................ 48
3.1. Objetivos especficos .................................................................................................................. 48
4 VALIDAO DA METODOLOGIA ANALTICA PARA DETERMINAO DE GLIFOSATO E AMPA EM SOJA
E MILHO (FUB) .................................................................................................................................... 49
4.1 Materiais e Mtodos ................................................................................................................... 49
4.1.1 Amostragem ......................................................................................................................... 49
4.1.2 Reagentes e Padres ............................................................................................................ 50
4.2 Equipamentos ............................................................................................................................. 50
4.3 Procedimentos de Extrao ........................................................................................................ 51
4.4 Espectrometria de massas .......................................................................................................... 53
4.5 Condies do sistema de cromatografia ..................................................................................... 54
4.6 Seleo da fase mvel ................................................................................................................. 55
4.7 Parmetros de Validao ............................................................................................................ 57
4.7.1 Linearidade e Curva de calibrao ....................................................................................... 58
4.7.2 Seletividade e Efeitos de matriz ........................................................................................... 59
4.7.3 Exatido ................................................................................................................................ 60
4.7.4 Preciso ................................................................................................................................ 61
4.7.5 Limite de Quantificao e Limite de Deteco ..................................................................... 62
4.7.6 Incerteza da medio ........................................................................................................... 63
4.8 Resultados e Discusso ............................................................................................................... 64
4.8.1 Seleo da fase mvel .......................................................................................................... 64
4.8.2 Linearidade e Curva de calibrao ....................................................................................... 65
4.8.3 Seletividade e Efeito de matriz............................................................................................. 67
4.8.4 Exatido ................................................................................................................................ 73
4.8.5 Preciso ................................................................................................................................ 74
4.8.6 Limite de Quantificao e Limite de Deteco ..................................................................... 75
4.8.7 Incerteza da medio ........................................................................................................... 77
4.9 Anlise das Amostras de milho (fub)......................................................................................... 79
5 AVALIAO DE PARMETROS HEMATOLGICOS E BIOQUMICOS DE TRABALHADORES RUAIS
EXPOSTOS A AGROTXICOS .................................................................................................................. 82
5.1 Avaliao da Exposio Ocupacional a Agrotxicos .................................................................... 82
5.2 Parmetros hematolgicos, plaquetrios e bioqumicos ............................................................ 84
5.2 Materiais e Mtodos ................................................................................................................... 86
5.3 Casustica ..................................................................................................................................... 87
5.3.1 Critrios de incluso ............................................................................................................. 88
5.3.2 Critrios de excluso ............................................................................................................ 88
5.4 Anlise Estatstica ........................................................................................................................ 88
5.5 Amostra biolgica........................................................................................................................ 89
5.6 Caractersticas da populao ...................................................................................................... 89
5.7 Caractersticas da exposio ....................................................................................................... 90
5.8 Metodologias para as determinaes dos parmetros hematolgicos e bioqumicos .............. 90
5.9 Resultados e Discusso ............................................................................................................... 90
5.9.1 Caractersticas da populao ............................................................................................... 90
5.9.2 Caractersticas da exposio ................................................................................................ 94
5.9.3 Parmetros hematolgicos e bioqumicos ........................................................................... 97
6 CONCLUSES .................................................................................................................................... 107
7 LIMITAES DO ESTUDO.................................................................................................................. 108
8 PERSPECTIVAS DE ESTUDOS ............................................................................................................. 109
9 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................................................ 110
10 ANEXO ............................................................................................................................................ 126
10.1 Anexo 1 Aprovao pelo COEP/UFMG ................................................................................. 126
10.2 Anexo 2 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ........................................................ 127
10.3 Anexo 3 Ficha de coleta de dados ........................................................................................ 128
18

1 INTRODUO

A denominao agrotxicos refere-se aos praguicidas normalmente


utilizados na agricultura. O termo agrotxico passou a ser utilizado, no Brasil, para
denominar os venenos agrcolas, aps grande mobilizao da sociedade civil
organizada. Mais do que uma simples mudana da terminologia, esse termo coloca
em evidncia a toxicidade desses produtos para o meio ambiente e a sade
humana. (BRASIL, 1997). Apesar de praguicidas ser uma denominao tcnica
referente ao combate de pragas, foi utilizado neste trabalho a denominao
agrotxicos, tendo em vista que o mesmo tornou-se mais amplo e conhecido por ter
sido aceito no mbito da sade pblica.
A utilizao dos agrotxicos na agricultura inicia-se na dcada de 1920, poca
em que eram pouco conhecidos do ponto de vista toxicolgico. No Brasil, foram
primeiramente utilizados em programas de sade pblica, no combate a vetores a
controle de parasitas, passando a ser utilizados mais intensivamente na agricultura a
partir da dcada de 1960. Aps um incentivo oficial para a disseminao da
utilizao de agrotxicos pelos setores da agricultura brasileira na dcada seguinte,
o pas comea a perceber a necessidade de controlar os efeitos sade decorrente
da utilizao desses compostos (BRASIL. MS, 1997).
A crescente demanda de alimentos no mundo impulsiona o desenvolvimento
de tcnicas agrcolas, uso de agrotxicos e a manipulao gentica das plantas,
permitindo um aumento considervel na produo mundial de alimentos. O Brasil
apresenta um papel estratgico para a produo de alimentos, tanto para o mercado
interno quanto externo. O surgimento de alimentos geneticamente resistentes ao uso
de agrotxicos sugere um risco ainda maior de exposio tanto dos trabalhadores
quanto da populao em geral que ir consumir tal alimento, em funo do aumento
da quantidade e frequncia do uso destes produtos.
Com o processo de automao da produo agrcola nas dcadas de 1960-
1970 no Brasil na chamada Revoluo Verde, os agrotxicos ganharam uma
posio de destaque (RIBAS E MATSUMURA, 2009). Seu uso proporcionou grande
benefcio para a produo de alimentos, principalmente por aumentar a
produtividade por hectare. Entretanto, paralelo aos benefcios, surgiu o efeito
potencial de resduos de agrotxicos no ambiente e nos alimentos, sendo a ingesto
19

de alimentos contendo agrotxicos uma das principais rotas de exposio humana


(PALMA, 2011).
Cumpre destacar o impacto da Revoluo Verde principalmente para o
trabalhador rural, que a classe de maior risco por estar em contado direto com
grandes quantidades de produtos txicos. Se para o consumidor o maior risco a
longo prazo, para o trabalhador rural o problema est associado ao risco de
intoxicao. A falta de orientao adequada tambm acaba deixando os agricultores
de pequenas propriedades ou de propriedades familiares em uma situao de maior
risco de exposio (ANVISA, 2006).
O trabalhador rural pode contar com o Programa de Sade do Trabalhador,
vinculado ao Sistema nico de Sade (SUS), que tem como um de seus objetivos a
preveno dos danos sade causados por agentes qumicos presentes no
ambiente de trabalho, neste caso, os agrotxicos. Para isso, tornam-se necessrias
a identificao e quantificao do risco por meio da avaliao ambiental e biolgica
da exposio. A deteco precoce de uma exposio perigosa pode diminuir
significativamente a ocorrncia de efeitos adversos na sade dos trabalhadores
expostos a esses produtos (AMORIM, 2003).
As formulaes dos agrotxicos so misturas complexas que incluem, alm
do(s) ingrediente(s) ativo(s), vrios outros componentes como solventes, agentes
umidificantes, emulsificantes e aditivos. Alm disso, comum na agricultura que
diferentes formulaes sejam simultaneamente utilizadas com combinaes
variadas, aumentando a complexidade da exposio e dificultando a
biomonitorizao destes compostos para a avaliao da exposio. A utilizao de
exames comumente realizados nos laboratrios clnicos da rede pblica pode ser
uma forma de detectar o incio de intoxicao desses trabalhadores expostos
diretamente aos agrotxicos. Esses compostos so metabolizados e excretados pelo
fgado e rins, respectivamente, sendo que os mdicos devem estar atentos ao tipo
de trabalho do paciente e a qualquer alterao em exames de rotina.
Mundialmente, os herbicidas pertencem classe de agrotxicos mais utilizada
e desde 2008 o Brasil assumiu o posto de maior mercado consumidor mundial de
agrotxicos em geral. As vendas destes produtos somaram US$ 7,125 bilhes,
diante US$ 6,6 bilhes do segundo colocado, os Estados Unidos em 2010, segundo
o Sindicato Nacional da Indstria de Produtos para Defesa Agrcola - SINDAG
(IBAMA, 2010).
20

De acordo com o Instituto de Economia Agrcola (IEA), no Brasil, em 2011, os


herbicidas movimentaram US$ 2,74 bilhes, ou seja, 32,3% do faturamento total do
setor, e responderam por 48,8% da quantidade total vendida em produto comercial.
Nesse perodo, a soja foi a principal consumidora de agrotxicos no pas, sendo
responsvel por 43,5% do valor total das vendas. Em seguida, apareceu o algodo
(12,5%), a cana-de-acar (11,6%), o milho (8,8%), o caf (3,7%), os citros (3,1%),
culturas de inverno (2,4%) e feijo (2,4%). Nos trs primeiros meses de 2012,
estima-se que as vendas de agrotxicos tiveram um aumento de 27,2% em relao
ao mesmo perodo de 2011, impulsionadas pelas culturas de cana-de-acar,
algodo, milho e citros (IEA, 2012).
Observa-se uma grande concentrao de uso de agrotxicos nas regies em
que h o predomnio do agronegcio, destacando-se os estados da regio Centro
Oeste e Sul do Brasil. Considerando toda a gama de princpios ativos registrados no
Brasil, o ingrediente ativo glifosato tem destaque no mercado de herbicidas,
ultrapassando 90 mil toneladas comercializadas em 2009, o que representa 76% do
total de herbicidas (IBAMA, 2010).
Segundo a Organizao Mundial da Sade (OMS), a toxicidade aguda do
ingrediente ativo glifosato considerada baixa, com uma DL50 oral do principio ativo
puro de 1950 a 5000 mg/kg de massa corporal para camundongos, ratos e cabras
(FARZA, CUNHA e MALTY, 2009). No entanto, a DL50 estabelecida a partir de
estudos de toxidade aguda, no indicando os riscos de doenas de evoluo
prolongada como, por exemplo, cncer, neuropatias, hepatopatias, problemas
respiratrios crnicos e outros (FARIA, FASSA e FACCHINI, 2007).
Devido s suas propriedades fsico-qumicas como alta polaridade, baixo peso
molecular e ausncia de grupos cromforos, o glifosato no pode ser analisado
pelos mtodos de multirresduos. Assim, o monitoramento de resduos de glifosato
em alimentos demanda a realizao de anlises por mtodos de molcula nica,
no sendo, por isso, priorizados pelos principais programas nacionais de controle de
resduos de agrotxicos em alimentos como o Programa de Anlise de Resduos de
Agrotxicos em Alimentos (PARA) coordenado pela Agncia Nacional de Vigilncia
Sanitria (ANVISA).
Considerando-se a ampla utilizao do glifosato em todo o mundo, devido s
suas propriedades herbicidas de largo espectro, ainda classificado como pouco
21

txico para os animais em geral, justifica-se a necessidade de implementao de


programas de monitorizao ambiental e biolgica (TEFILO, 2003).
Cumpre ressaltar que a biomonitorizao de efeito para a avaliao da
exposio ocupacional a agrotxicos complexa sendo limitado o estabelecimento
do nexo causal entre as alteraes de parmetros laboratoriais e a exposio
ocupacional a esses compostos.
A avaliao peridica da funo medular, heptica e renal dos trabalhadores
rurais deve ser incentivada para prevenir danos sade em decorrncia da
exposio aos agrotxicos.
22

2 REVISO DA LITERATURA

2.1 Agrotxicos

De acordo com a lei n 7.802/89 agrotxicos so os produtos e os agentes de


processos fsicos, qumicos ou biolgicos, destinados ao uso nos setores de
produo, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrcolas, nas
pastagens, na proteo de florestas, nativas ou implantadas, e de outros
ecossistemas e tambm de ambientes urbanos, hdricos e industriais, cuja finalidade
seja alterar a composio da flora ou da fauna, a fim de preserv-las da ao
danosa de seres vivos considerados nocivos; substncias e produtos, empregados
como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento
(BRASIL, 1989).
Desde 1998, trs rgos esto envolvidos no processo de comercializao de
produtos agrotxicos no Brasil, ao Ministrio da Agricultura, Pecuria e
Abastecimento (MAPA) cabe verificar a pertinncia e eficcia do agrotxico,
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) cabe avaliar os impactos do
mesmo sobre a sade humana e ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos
Recursos Naturais Renovveis (IBAMA) compete analisar as implicaes desse no
meio ambiente, desse modo, cada um deles faz uma avaliao distinta. Pela
legislao brasileira, o registro de agrotxicos, depois de concedido, definitivo,
porm os rgos reguladores podem reavali-lo sempre que houver indcios de que
o seu uso oferece riscos (IBAMA, 2010).
Os dados do monitoramento nacional PARA / ANVISA (Programa de Anlise
de Resduos de Agrotxicos em Alimentos), permitem concluir que o maior problema
brasileiro, em relao aos nveis de agrotxicos no alimento in natura, no est na
forma de aplicao do produto em alimento, mas sim no uso indiscriminado e no
recomendado para determinados alimentos, resultando, em sua grande maioria, em
irregularidades (KUSSUMI, 2007; ANVISA, 2013a). A Tabela 1 ilustra a importncia
do comrcio de agrotxicos no Brasil, tanto em quantidade comercializada quanto
nos valores financeiros envolvidos, mostrando a venda destes produtos,
denominados por defensivos agrcolas pelo SINDAG de 2007 a 2011.
23

Tabela 1 - Vendas brasileiras de defensivos agrcolas por classes.


PRODUTO COMERCIAL (t) VALOR - US$ 1.000
CLASSES
2.007 2.008 2.009 2.010 2.011 2.007 2.008 2.009 2.010 2.011
TOTAL: 599.834 673.892 725.577 787.790 826.683 5.371.965 7.125.140 6.625.610 7.303.918 8.487.944
HERBICIDAS 349.905 389.401 429.693 415.171 403.620 2.304.062 3.200.721 2.505.414 2.427.878 2.743.000
FUNGICIDAS 68.254 78.495 89.889 136.972 174.194 1.264.416 1.573.600 1.791.477 2.128.377 2.315.188
INSETICIDAS 116.609 138.754 137.908 160.593 170.932 1.537.390 2.027.771 1.987.800 2.364.868 2.944.726
ACARICIDAS 19.888 20.321 12.281 11.755 9.326 92.136 112.876 88.195 91.285 110.180
OUTRAS 45.178 46.921 55.806 63.299 68.611 173.961 210.172 252.724 291.510 374.850
Fonte: SINDAG, 2012.

2.1.1 Classificao dos agrotxicos

Os agrotxicos podem ser classificados de diversas maneiras, como em


relao ao seu modo de ao no organismo alvo, em relao sua estrutura
qumica, em relao aos efeitos sade humana ou ao meio ambiente, ou pela
avaliao da neurotoxicidade, carcinogenicidade, dentre outras (SAVOY, 2011).
Quanto ao modo de ao do ingrediente ativo no organismo alvo ou
natureza da praga combatida, os agrotxicos so classificados como inseticidas,
fungicidas, herbicidas, rodenticidas e/ou raticidas, acaricidas, nematicidas,
fumigantes, moluscicidas etc. (SAVOY, 2011).
A classificao dos agrotxicos segundo o seu grau de toxicidade
estabelecida a partir dos valores de Dose Letal (DL50) ou Concentrao Letal (CL50),
sendo de responsabilidade do Ministrio da Sade (ANVISA). No Brasil, a portaria
da Secretaria Nacional de Vigilncia Sanitria (SNVS) n 03 de 16 de janeiro de
1992 redefiniu os critrios de classificao toxicolgica anteriormente vigentes
definidos pelas Portarias da Diviso Nacional de Vigilncia Sanitria de Saneantes
Domissanitrios (DISAD) de 1980 e 1987. Mantiveram-se quatro classes
toxicolgicas definidas principalmente pela DL50 dos produtos e tambm por outros
dados relacionados a danos na crnea, leses na pele e concentrao letal
inalatria para ratos (CL50), prevalecendo a classificao pelo dado mais agravante.
A Lei n 7802/89, regulamentada pelo Decreto n 4074/2002, dispe que os rtulos
desses produtos devem conter uma faixa colorida indicativa de sua classificao
toxicolgica (Tabela 2) (BRASIL. MS, 1992; BRASIL. MS, 2002; GARCIA,
24

BUSSACOS e FISCHER, 2009; SAVOY, 2011). J a Consulta Pblica da ANVISA n


02, de 25 de janeiro de 2011 sugeriu a adoo dos critrios de classificao
toxicolgica do Globally Harmonized System of Classification and Labeling of
Chemicals (GHS) ou Sistema Global Harmonizado de Classificao e Rotulagem de
Produtos Qumicos, um sistema internacional criado pela Organizao das Naes
Unidas que visa padronizar internacionalmente a classificao dos produtos
qumicos, entretanto esse sistema ainda no foi aceito (ANVISA, 2011).
Por outro lado, o IBAMA o responsvel pela classificao ecotoxicolgica
dos agrotxicos (relacionado ao meio ambiente), regulamentado pela portaria
normativa n 84, de 15 de outubro de 1996, dentre outras portarias, que estabelece
procedimentos obedecidos pelo Ministrio do Meio Ambiente (IBAMA) para
avaliao ecotoxicolgica de agrotxicos e afins (BRASIL. IBAMA, 1996). Nem
sempre a avaliao e classificao do agrotxico feita por essas duas agncias
reguladoras similar.

Tabela 2 Classificao Toxicolgica dos Agrotxicos, segundo o Ministrio da Sade


CL 50
(mg/L) DL 50 (mg/kg) Oral DL 50 (mg/kg) Drmica
Classe Toxicidade Rtulo Inalatria
Gs/ 1h Slido Lquido Slido Lquido

I Extremamente Vermelho 0,2 5 20 10 40


Txico

II Altamente Amarelo 0,2 a 2 5 a 50 20 a 200 10 a 100 40 a 400


Txico

III Mediamente Azul 2 a 20 50 a 500 200 a 2000 100 a 1000 400 a 4000
Txico

IV Pouco Txico Verde > 20 > 500 >2000 > 1000 > 4000

Fonte: BRASIL. MS, 1992.

2.1.2 Aspectos toxicolgicos e epidemiolgicos dos agrotxicos

O termo toxicidade a medida do potencial txico de uma substncia, a


capacidade latente, inerente, que uma substncia qumica possui. Admite-se que
no existe substncia qumica atxica, mas tambm no existe substncia qumica
25

que no possa ser utilizada com segurana limitando a dose e a exposio


mesma. Os principais fatores que influenciam a toxicidade de uma substncia so a
frequncia de exposio, a durao da exposio e a via de administrao. Para
uma avaliao completa da toxicidade de uma substncia necessrio conhecer
que tipo de efeito ela produz, a dose para produzir tal efeito, as caractersticas da
substncia e as informaes sobre a exposio do indivduo (MICHEL, 2000).
O risco de determinado agrotxico dado por sua toxicidade intrnseca, modo
e o tempo de exposio a ele. Se ocorrer alta exposio ao agrotxico, mesmo que
esse tenha baixa toxicidade, o risco alto. Do mesmo modo, a exposio baixa a
produto de alta toxicidade, o risco tambm alto. O glifosato um exemplo que se
enquadra no segundo caso, sendo classificado como pouco txico (classe IV), mas
amplamente utilizado no Brasil e no mundo (TRAP, 2003). Sendo assim, devido ao
seu alto risco, deveria levar a uma maior preocupao de seu uso.
A questo da toxicidade no se resume apenas em ser alta ou baixa, mas a
outros problemas toxicolgicos existentes. Sabe-se que a classificao dos
agrotxicos relativa toxicidade refere-se principalmente a problemas agudos mas,
em contrapartida, h poucos dados na literatura mundial para inferir sobre toxicidade
crnica, sinergismo de agrotxicos ou mesmo sobre os modos de ao no
organismo do homem (TRAP, 2003).
Os principais dados de registro de intoxicao por agrotxicos no Brasil so
obtidos atravs de dois sistemas: o SINITOX - Sistema Nacional de Informaes
Txico-Farmacolgicas e o SINAN - Sistema de Informao de Agravos de
Notificao. O SINITOX tem como principal atribuio coordenar a coleta, a
compilao, a anlise e a divulgao dos casos de intoxicao e envenenamento
notificados no pas e est vinculado Fundao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). O
SINAN, vinculado diretamente ao Ministrio da Sade, alimentado, principalmente,
pela notificao e investigao de casos de doenas e agravos que constam da lista
nacional de doenas de notificao compulsria, sendo facultado aos estados e
municpios inclurem nesse sistema outros problemas de sade importantes em sua
regio.
Dados nacionais oficiais sobre intoxicaes por agrotxicos no retratam a
realidade do pas. Os sintomas agudos de tais intoxicaes so apenas a ponta do
iceberg de um problema muito mais amplo que fica escondido por trs da
subnotificao dos casos e da quase ausncia de informao sobre as doenas
26

crnicas causadas por exposio a agrotxicos, j que no h registros oficiais


sobre os efeitos crnicos causados pelo contato com os agrotxicos. (BOCHNER,
2007, BOMBARDINI, 2011).
As agncias internacionais de sade como a Organizao Mundial de Sade
(OMS) consideram que em pases como o Brasil, no qual existem graves problemas
de estrutura da sade pblica, ocorre um sub-registro de casos de intoxicaes por
agentes qumicos em geral, inclusive agrotxicos. Estima-se que os casos
registrados de intoxicaes representem somente 2% do total de casos que ocorrem
anualmente. Embora no SINITOX em 2010 (Tabela 3), tenham sido registrados
cerca de 10 mil casos, estima-se que ocorreram mais de 513 mil intoxicaes por
agrotxicos no Brasil em 2010. Estes dados registrados referem-se apenas aos
casos de intoxicaes agudas que chegam ao conhecimento dos centros de controle
de intoxicaes, no incluindo, portanto, os casos relacionados aos efeitos adversos
crnicos (TRAP, 2001).
Os dados dos efeitos crnicos so obtidos normalmente atravs de estudos
isolados. Tumores hematolgicos e do sistema nervoso foram associados aos
trabalhadores norte-americanos expostos a agrotxicos (FLEMING et al., 2003). Na
Alemanha, conseguiu-se levantar dados que forneceram evidncias de leucemia
infantil e uso de agrotxicos, sendo este domstico ou agrcola (MEINERT et al.,
2000). Estudo canadense inferiu que o risco de linfoma no-Hodgkin aumenta com o
aumento do nmero de princpios ativos utilizados e algumas combinaes
especficas de agrotxicos (HOHENADEL et al., 2011). Na Itlia, uma pesquisa entre
pessoas que trabalham na agricultura, desde os aplicadores at os manipuladores
dos alimentos in natura, indicou aumento do risco de cnceres hematopoticos
(COSTANTINI et al., 2001). Ainda na Europa, um estudo sueco associou o uso de
glifosato ao aumento de linfomas no-Hodgkin (HARDELL, ERIKSSON e
NORDSTRM, 2002).
27

Tabela 3 - Casos, bitos e letalidade de intoxicao humana, por agente, registrados no


Brasil em 2010.
Casos bitos Letalidade
Agente
n n %
Medicamentos 24056 67 0,28
Agrotxicos/Uso Agrcola 4789 171 3,57
Agrotxicos/Uso Domstico 2094 7 0,33
Produtos Veterinrios 810 2 0,25
Raticidas 2576 18 0,70
Agrotxicos no geral 10269 198 4,85
Domissanitrios 10813 11 0,10
Cosmticos 1120 0 -
Produtos Qumicos Industriais 5135 18 0,35
Metais 312 4 1,28
Drogas de Abuso 5289 47 0,89
Plantas 1132 5 0,44
Alimentos 946 0 0,00
Animais Pe./Serpentes 2476 7 0,28
Animais Pe./Aranhas 3261 0 -
Animais Pe./Escorpies 9317 6 0,06
Outros Animais Pe./Venenosos 4649 6 0,13
Animais no Peonhentos 3605 0 -
Desconhecido 2106 9 0,43
Outro 2214 10 0,45
Total 86700 388 0,45
Fonte: FIOCRUZ/SINITOX, 2010

Tabela 4- Casos de intoxicao por agrotxicos em geral, segundo zona de ocorrncia,


registrados em 2009.
Zona Rural Urbana Ignorada Total
Agente n n n n %
NORTE 23 212 17 252 2,16
NORDESTE 189 1134 16 1339 11,50
SUDESTE 1790 3202 159 5151 44,25
Minas Gerais 680 695 31 1406 12,08
Esprito Santo 319 659 101 1079 9,27
Rio de Janeiro 182 19 4 205 1,76
So Paulo 609 1829 23 2461 21,14
SUL 606 1951 151 2708 23,26
Paran 142 398 103 643 5,52
Santa Catarina --- --- --- --- ---
Rio Grande do Sul 464 1553 48 2065 17,74
CENTRO-OESTE 341 1796 54 2191 18,82
Mato Grosso do Sul 61 197 4 262 2,25
Mato Grosso --- --- --- --- ---
Gois 163 705 44 912 7,83
Distrito Federal 117 894 6 1017 8,74
Total 2949 8295 397 11641 100,00
% 25,33 71,26 3,41 100,00
Fonte: FIOCRUZ/SINITOX, 2009
--- Dados numricos no disponveis
28

A Tabela 4 indica que a rea urbana responsvel por mais de 71% das
notificaes. Certamente que este percentual resulta da maior conscientizao da
necessidade de notificao, bem como da facilidade de acesso aos centros de
sade para faz-la, e no relacionado quantidade de agrotxico usada quando se
compara as zonas urbana e rural.
Dados da ANVISA, provenientes do PARA, so alarmantes tanto para os
consumidores, quanto para os agricultores e produtores. Um nmero elevado de
diferentes agrotxicos encontrado em um mesmo alimento. No h no Brasil uma
legislao que limite o nmero de princpios ativos por alimento e os estudos de
toxicologia levam em conta apenas um composto, no havendo estudos sobre o
sinergismo entre os vrios agrotxicos.
Alm disso, no pas, o maior problema dos alimentos in natura no a
utilizao de agrotxicos em maior quantidade que a permitida (aquela acima do
Limite Mximo Permitido LMR), mas a utilizao de agrotxicos proibidos para
determinada cultura, aqueles que j tiveram a monografia excluda ou nunca foram
permitidos no Brasil e, apesar das proibies, tais princpios ativos ainda sim so
utilizados e no esto includos na estimativa do risco quando se calcula a Ingesto
Diria Aceitvel (IDA). Deve-se preocupar tambm com a grande quantidade de
agrotxicos contrabandeados que no possuem nenhum tipo de controle por
nenhuma das agncias reguladoras.
Formulaes de agrotxicos so misturas complexas que contm alm do
ingrediente ativo, vrios outros componentes como solventes e emulsionantes,
dentre outros. Alm disso, comum o uso de diferentes formulaes
simultaneamente e em diversas combinaes levando a ocorrncia de exposies
complexas tornando o biomonitoramento muito difcil. Os possveis efeitos txicos da
exposio a mltiplos compostos ainda so desconhecidos e as informaes da
toxicidade relacionada apenas aos ingredientes ativos isolados no so suficientes
para avaliar o risco dos efeitos adversos dos agrotxicos sade. Assim, a
informao isolada relativa toxicidade de um ingrediente ativo ou produto
formulado no suficiente para avaliar o risco de efeitos adversos relacionados
exposio a agrotxicos (FALCK et al., 1999).
29

2.2 Glifosato

O glifosato (N-(fosfonometil)glicina)) um herbicida no seletivo, sistmico,


ps-emergente, com rpida absoro foliar e translocao, tanto pelo xilema quanto
pelo floema da planta tratada. (TEFILO, 2003). Apresenta frmula molecular
C3H8NO5P e massa molecular de 169,01g/mol (Figura 1). Em condies ambientais,
slido cristalino, branco e inodoro, muito solvel em gua (11,6 g/L a 25C, pH 7),
quase insolvel em solventes orgnicos, funde-se a 185C e degrada-se a 187C.
Suas formulaes apresentam-se bastante estveis em presena de luz, inclusive
em temperaturas superiores a 60C, sendo que sua meia vida no solo de 47 dias
(MARQUES, 2008; RODRIGUES, 2009; USDOE, 2000).

Figura 1 - Estrutura qumica do glifosato e de seu principal metablito (AMPA).

A degradao do glifosato no solo mais rpida que na gua devido


quantidade elevada de microrganismos existentes no solo. Estes microrganismos
usam este herbicida como fonte de energia e fsforo, por meio de duas rotas
catablicas, produzindo o cido aminometilfosfnico (AMPA) como o principal
metablito, e sarcosina como metablito intermedirio (GALLI e MONTEZUMA,
2005; MARQUES, 2008).
O glifosato foi criado em 1950 pelo Dr. Henri Marin, um qumico suo da
indstria qumica Cilag. Posteriormente, em 1970, o Dr. E. Franz da Monsanto
Company sintetizou novamente a molcula e descobriu sua capacidade herbicida,
dando-lhe o nome de Roundup e lanou-a no mercado dos Estados Unidos em
1974 (AULING, 2009; FERRARO, 2009).
Nas formulaes comerciais, ao principio ativo adicionado o surfactante
polietoxilenoamina (POEA) para melhorar a eficcia do produto, o qual tem efeitos
toxicolgicos prprios evidenciados (MARQUES, 2008). O uso de aditivos nas suas
30

formulaes (como tensoativos, emulsificantes, leos minerais e vegetais) permite


um transporte mais rpido do agrotxico do solo para a planta, protegendo-o da
evaporao e retardando o processo de lixiviao. No entanto, tais aditivos
normalmente no tm estudos de toxicidade isolados, muito menos, estudos de
sinergismo com o princpio ativo (TEFILO, 2003).
As Figuras 2 e 3 mostram a distribuio da comercializao brasileira do
glifosato em relao aos outros princpios ativos e sua comercializao por Estado
do Pas.

Figura 2 - Dez ingredientes ativos mais comercializados no Brasil em 2009 (em toneladas).
Fonte: IBAMA, 2010

Figura 3 - Espacializao da comercializao do ingrediente ativo glifosato, por estado, em


2009. Fonte: IBAMA, 2010
31

De acordo com dados compilados do programa Sistema de Controle


Semestral de Agrotxico (SISAGRO) do Instituto Mineiro de Agropecuria (IMA)
referente ao primeiro semestre de 2010, obtidos atravs de relatrios fornecidos por
funcionrio autorizado, relacionado a ingredientes ativos comercializados em Minas
Gerais, os dez maiores municpios mineiros consumidores de glifosato (incluindo
seus sais) correspondem a 54,6% de todo consumo em Minas Gerais, sendo que
apenas o municpio de Una responsvel por 27% dessa parcela (IMA, 2012).
Dados da ANVISA (Figuras 4, 5 e 6) mostram a importncia dos herbicidas
no Brasil, em especial do glifosato, sendo este, no 2 semestre de 2010 e 1
semestre de 2011, o responsvel por 29% de toda a venda de produtos formulados
(kg) e por 50% quando se leva em considerao apenas os herbicidas.

Figura 4 - Vendas de Produtos Formulados por Classe de Uso (kg) Brasil (2 semestre de
2010 e 1 semestre de 2011). Fonte: ANVISA, 2012
32

Figura 5 - Participao das Vendas de Produtos Formulados por Ingrediente Ativo (kg)
Brasil (2 semestre de 2010 e 1 semestre de 2011). Fonte: ANVISA, 2012

Figura 6 - Participao das Vendas de Herbicidas (Produto Formulado) por Ingrediente Ativo
(kg) - Brasil (2 semestre de 2010 e 1 semestre de 2011). Fonte: ANVISA, 2012
33

O glifosato tido como o mais especfico e menos txico agrotxico para o


ecossistema sendo que plantas transgnicas tolerantes a esse composto tm sido
desenvolvidas seguindo tal argumento (RICHARD et al., 2005).
Atualmente, mais de 80% da rea cultivada no mundo de plantas
geneticamente modificadas (GM), sendo a maioria dessas resistentes a nveis
elevados de glifosato. As principais culturas GM so a soja, milho, canola e algodo,
cultivadas principalmente nos EUA, Canad, Argentina, Brasil e Paraguai. De acordo
com o documento da rede Pesticide Action Network Asia & the Pacific (PAN AP), em
2008, a soja transgnica, tolerante a glifosato, correspondia a 53% do total das
culturas GM no mundo, seguida pelo milho (30%) e algodo (12%) (WATTS, 2009).
Em 2010, o Brasil manteve e fortaleceu sua posio como segundo maior
produtor de GM no mundo, com cerca de 25,4 milhes de hectares, sendo
responsvel pela produo de 17% de todas as culturas GM no mundo. O primeiro
maior produtor de GM so os Estados Unidos com 66,8 milhes de hectares
(JAMES, 2010).
Alm do aumento de consumo de transgnicos, quantidades maiores de
glifosato vm sendo usadas nas lavouras transgnicas resistentes ao mesmo, pois
no h preocupao com a quantidade aplicada. Geralmente, este herbicida
pulverizado em cima da planta e no somente nas ervas daninhas que esto
prximas ao solo, fazendo com que os gros apresentem nveis maiores de resduos
(LONDRES, 2011). Observa-se uma grande concentrao de uso de agrotxicos
nas regies em que h o predomnio do agronegcio, destacando-se os municpios
da regio Sul e Centro Oeste no Brasil. A soja ocupa o primeiro lugar em vendas de
agrotxicos com 47,1% dos agrotxicos vendidos no pas sendo destinados a essa
cultura, seguida pelo milho (11,4%) e a cana (8,2%) (BOMBARDINI, 2011).
Talvez pela dificuldade de anlise de glifosato na maioria das matrizes, sua
prevalncia e efeitos no so bem estudados. No Brasil esse herbicida ainda no
contemplado pelo PARA, monitorizao esta que vem sendo feita no pas desde
2001 (ANVISA, 2013a). Mesmo com tcnicas mais modernas como a cromatografia
acoplada a espectrometria de massas, a maioria das metodologias analticas para
determinao do glifosato e AMPA requerem etapa de derivatizao, uma vez que
ambos no apresentam grupos cromforos, no sendo por isso detectados por
mtodos usuais colorimtricos ou de fluorescncia.
34

Fatores como estes dificultam ainda mais a anlise deste composto que,
somando-se s suas caractersticas fsicas, no contemplado por mtodos de
multirresduos, comumente utilizado na rotina dos laboratrios que analisam
resduos de agrotxicos. Nesse caso, grupos de molculas com caractersticas to
peculiares necessitam dos chamados mtodos de molcula nica, aumentando o
tempo de anlise total e consequentemente, os custos. Alguns estudos vm
indicando que a anlise do glifosato e AMPA, sem derivatizao, possvel
utilizando-se espectrmetro de massas com anlises de massas sequencial (SRM)
(MARTINS-JNIOR et al., 2009).
O AMPA, principal metablito do glifosato, mais persistente no solo (76 a
240 dias) do que o glifosato (2 a 197 dias) e existem evidncias que esse pode
alcanar lenis freticos profundos (FERRARO, 2009). Nesse sentido, a Portaria
2914 de 2011 do Ministrio da Sade que estabelece os parmetros de potabilidade
para gua de consumo humano, incluiu a pesquisa de glifosato e AMPA no controle
e vigilncia de gua potvel. Apesar do glifosato no ser considerado de alto risco
como outros agrotxicos, a sua incluso nesta portaria se justificou pela a amplitude
de seu uso. O valor permissvel para o glifosato e o AMPA estabelecidos como a
soma dos dois de 500 g/L (BRASIL. MS, 2011).
No Brasil, segundo o Sistema de Agrotxicos Fitossanitrios AGROFIT,
encontram-se registradas quatro principais formas qumicas de glifosato: glifosato,
glifosato-sal de amnio, glifosato-sal de isopropilamina e glifosato-sal de potssio.
Os produtos formulados registrados no pas podem conter como ingrediente ativo
apenas o glifosato, ou esse associado a outros herbicidas ou ainda, formulaes
contendo formas qumicas distintas do glifosato entre si. At dezembro de 2012,
havia no pas, 72 produtos formulados registrados a base de glifosato e seus sais
(BRASIL. MAPA, 2013).
A maioria dos estudos sobre os efeitos do glifosato e seus derivados sobre a
sade e o meio ambiente so realizados pelos prprios fabricantes do produto,
interessados em aprovar seu uso e impulsionar as vendas. Soma-se a isso, a
dificuldade de realizar estudos independentes sobre o produto, uma vez que so
poucos os laboratrios que possuem os recursos, equipamentos e tcnicas
necessrias a uma efetiva avaliao dos seus impactos. A carncia de estudos e a
dificuldade de detectar objetivamente os efeitos do glifosato sobre a sade humana
tm dificultado uma avaliao segura acerca do risco do seu uso. No entanto,
35

admite-se que este risco est diretamente relacionado ao aumento do seu uso,
especialmente em culturas transgnicas resistentes (PACHECO e SHOTTS, 2005).

2.2.1 Classificao toxicolgica do Glifosato

A toxicidade do glifosato foi associada inicialmente apenas aos vegetais, uma


vez que esse age, nas plantas, por inibio competitiva da 5-enol-piruvil-shiquimato-
3-fosfato sintetase (EPSPS), enzima responsvel pela sntese de aminocidos
aromticos (fenilalanina, tirosina e triptofano) por via especfica do reino vegetal (via
metablica do cido chiqumico). Mais tarde, descobriu-se que, alm de efeitos
agudos de irritao, tambm pode intervir no funcionamento do complexo do
citocromo P450 e da glutationa-S-tranferase, envolvidas no metabolismo de
substncias txicas pelo fgado, e de outras enzimas vitais para o organismo
(FARZA, CUNHA e MALTY, 2009).
A portaria n 03 de 16 de janeiro de 1992 do MS redefiniu as regras de
classificao toxicolgica, buscando adequar-se aos padres internacionais. Dessa
forma, o glifosato, que antes pertencia classe toxicolgica II, passou a pertencer
classe IV, podendo induzir falsa impresso de que esse composto tornou-se
menos txico (BRASIL. MS, 1992; FARIA, FASSA e FACCHINI, 2007).
A Tabela 5 mostra a classificao de todas as formulaes de agrotxicos
base de glifosato aptos para comercializao no Estado de Minas Gerais, at
dezembro de 2012.
36

Tabela 5 Agrotxicos a base de glifosato aptos para comercializao em Minas Gerais e as


vrias classificaes toxicolgicas.
Classificao
Marca Comercial Empresa
Toxicolgica
CRUCIAL I NUFARM INDSTRIA
DIRECT IV MONSANTO
FERA III FMC
GLIATO II PRENTISS
GLIFOS IV CHEMINOVA
GLIFOS PLUS III CHEMINOVA
GLIFOSATO 480 AGRIPEC II NUFARM INDSTRIA
GLIFOSATO 480 HELM IV HELM
GLIFOSATO 480 PIKAPAU IV Prod. Qum. So Vicente
GLIFOSATO AGRIPEC 720 WG III NUFARM INDSTRIA
GLIFOSATO ATANOR III ATANOR
GLIFOSATO ATANOR 48 III ATANOR
GLIFOSATO ATAR 48 III ATAR DO BRASIL
GLIFOSATO FERSOL 480 NA III FERSOL
GLIFOSATO NORTOX IV NORTOX
GLIFOSATO NORTOX 480 SL III NORTOX
GLIFOSATO NORTOX NA IV NORTOX
GLIFOSATO NORTOX WG IV NORTOX
GLIFOSATO NUFARM II NUFARM INDSTRIA
GLIFOXIN III HELM
GLIOX IV NORTOX
GLIPHOGAN 480 III MILENIA
GLISTER II SINON
GLI-UP 480 SL III CROPCHEM
GLIZ 480 NA IV DOW
GLIZ 480 SL III DOW
GLIZ PLUS II DOW
GLIZMAX II DOW
GLYPHOTAL III CCAB AGRO
PILARSATO III PILARQUIM
POLARIS IV DU PONT
PRETORIAN III ATANOR
RADAR III MONSANTO
RADAR WG III MONSANTO
RODEO IV MONSANTO
RODEO N.A. IV MONSANTO
RONAT-A III ATANOR
ROUNDP READY MILHO II MONSANTO
ROUNDUP NA III MONSANTO
ROUNDUP ORIGINAL IV MONSANTO
ROUNDUP READY II MONSANTO
ROUNDUP TRANSORB II MONSANTO
ROUNDUP TRANSORB R II MONSANTO
ROUNDUP ULTRA II MONSANTO
ROUNDUP WG IV MONSANTO
RUSTLER III MONSANTO
SCOUT III MONSANTO
SCOUT N.A. IV MONSANTO
SHADOW 480 SL III CONSAGRO
STINGER III MONSANTO
SUCESSOBR III OURO FINO
SUM I PILARQUIM
TOUCHDOWN III SYNGENTA
TROP III MILENIA
TROP N.A. IV MILENIA
TUPAN III CROPCHEM
ZAPP QI 620 III SYNGENTA
Fonte: IMA, 2013
37

De acordo com dados da Organizao Mundial da Sade (WHO, 1994), o


glifosato no apresenta propriedades mutagnicas e carcinognicas. A toxicidade
aguda desse composto considerada baixa, apresentando uma DL50 oral na faixa
de 1950 a 5000 mg/kg para camundongos, ratos e cabras (FARZA, CUNHA e
MALTY, 2009). Os efeitos txicos de formulaes de glifosato podem resultar da
presena de surfactante e outros elementos aditivos. O surfactante POEA tem
toxicidade estimada cerca de trs vezes maior que o glifosato.
Estudos toxicocinticos em animais mostram uma absoro aproximada de
30-40% no tubo digestivo e escassa absoro cutnea. Uma vez absorvido se
distribui amplamente pelo organismo, com maiores concentraes nos ossos, mas
tambm encontrado nos intestinos, clon e rins. Quase no metabolizado sendo
que 97-99% eliminado inalterado. Tem uma meia vida de aproximadamente dois
dias e seu principal produto de biotransformao o AMPA. (BURGER e
FERNNDEZ, 2004; OGA, 2003).
No homem, a excreo desse composto ocorre pelas vias intestinal (62 a
70%) e renal (15 a 36%). O Glifosato eliminado principalmente na sua forma
inalterada e em pequena proporo na forma de seu metablito AMPA, e no
evidenciada a formao de outros metablitos mais txicos (ACQUAVELLA et al.,
2004; BURGER e FERNNDEZ, 2004; ROMANO, ROMANO e OLIVEIRA, 2009).
Chan e Mahler (1992) administraram glifosato marcado com C14 em ratos por via oral
(dois grupos com concentraes 5,6 e 56 mg/kg) e analisaram amostras de tecido,
urina, sangue e fezes aps 72 horas. Verificaram que 20-30% foi eliminado na urina,
70-80% nas fezes e aproximadamente 1% permaneceu nos tecidos.
Chan e Mahler (1992), tambm realizaram estudos com ratos expostos ao
glifosato por via oral, e verificaram que os ratos machos, que ingeriram doses mais
elevadas, tiveram significante diminuio na contagem de esperma e as fmeas
tiveram um aumento do cio. A ao do glifosato no funcionamento de glndulas
endcrinas foi investigada por Yousef et al. (1995) em coelhos e encontraram
declnio no volume de ejaculao e na concentrao do esperma. Estes
investigadores sugeriram que tais efeitos poderiam ser devido ao efeito citotxico
direto do glifosato na espermatognese e/ou indiretamente, via sistema endcrino.
Apesar do mecanismo de ao do glifosato em mamferos no ser ainda
totalmente esclarecido esse composto pode atuar em alguns outros mecanismos
enzimticos. O produto formulado Roundup inibiu a sntese de esteroides por
38

desregulao da expresso da protena StAR em cultivo de clulas testiculares de


camundongo da linhagem tumoral Leydig MA-10. No mesmo trabalho, outros testes
foram realizados, mas tais efeito no foram evidenciados quando apenas o glifosato
(principio ativo) foi utilizado (WALSH et al., 2000). Arbuckle, Lin e Mery (2001)
associaram o glifosato ao aumento da incidncia de abortos entre a 12 e a 19
semana de gravidez em mulheres de fazendeiros expostas a esse composto e
outros agrotxicos. Utilizando apenas clulas mononucleares de sangue perifrico
humano, Martnez, Reyes e Reyes (2007) evidenciaram que, tanto o glifosato grau
tcnico, quanto o produto formulado Roundup foram citotxicos, e esse efeito foi
proporcional ao tempo de exposio e concentrao. O Roundup apresentou
maior citotoxicidade quando comparado ao glifosato grau tcnico.
Estudos em clulas endoteliais de veia umbilical humana, clulas de rim
embrionrio e clulas placentrias JEG3 humanas mostraram que quatro
formulaes de Roundup, diludas 100.000 vezes, foram capazes de causar
apoptose nessas clulas. Cumpre ressaltar que estas diluies continham nveis
inferiores aos dos resduos encontrados em alimentos cultivados com glifosato
(BENACHOUR e SRALINI, 2008).
Paz-Y-Mio et al. (2007) utilizaram o teste cometa como parmetro de
avaliao do efeito genotxico em indivduos expostos ocupacionalmente ao
glifosato. O teste cometa um mtodo simples para medir quebras na fita de DNA
(cido desoxirribonucleico) de clulas eucariticas, sendo uma tcnica padro para
avaliao de danos no DNA e, consequentemente, de genotoxicidade. Os resultados
do teste mostraram maior incidncia de leso no DNA no grupo exposto quando
comparado ao grupo controle no exposto ocupacionalmente. Estes investigadores
sugeriram que a aplicao do glifosato na forma de spray resulta em uma exposio
que causa o efeito genotxico. Maas et al (2009a, 2009b) comprovaram a ao
genotxica do glifosato e de seu metablito AMPA pelo teste cometa e teste do
microncleo em culturas de linfcitos Hep-2 expostos por 4 horas ao glifosato.
Gasnier et al. (2009) avaliaram os efeitos txicos de quatro formulaes
contendo glifosato, em clulas hepticas humanas da linhagem HepG2. Foram
testadas concentraes bem inferiores s utilizadas comumente na agricultura e
efeitos txicos foram obtidos a partir de 5 ppm e ao como desruptor endcrino a
partir de 0,5 ppm. Neste estudo foi demonstrado o primeiro estgio de leso do
39

DNA, causado por nveis residuais de formulaes a base de glifosato, em clulas


humanas.
Benachour e Sralini (2008) confirmaram o efeito citotxico do glifosato em
clulas humanas de embries, placenta e cordo umbilical, com doses muito abaixo
das utilizadas em campos de soja. Foi observada a morte celular em poucas horas
e, mesmo em doses diludas 1000 vezes, o Roundup estimulou a morte das
clulas de embries humanos, o que poderia provocar malformaes, abortos,
problemas hormonais, genitais ou de reproduo, alm de diversos tipos de
cnceres. Um estudo publicado pelo mesmo autor levantou preocupaes acerca da
potencial toxicidade do milho geneticamente modificado (NK603) com e sem o
herbicida glifosato. Dados bioqumicos confirmaram significativas deficincias renais
crnicas em ratos com 76% dos parmetros renais alterados. Sugeriram que tais
resultados poderiam ser explicados pelas desregulao endcrina causada pelo
Roundup, mas tambm pelo aumento da expresso do transgene no Organismo
Geneticamente Modificado (OGM) e suas consequncias metablicas (SRALINI et
al., 2012).
Apesar deste alerta, a European Food Safety Authority (EFSA) concluiu que o
estudo como foi publicado no impacta no curso da reavaliao do glifosato, no
vendo tambm necessidade de reabrir a avaliao de segurana existente no milho
NK603 ou outros relacionados (EFSA, 2012).
Um estudo epidemiolgico conduzido nos Estados Unidos no conseguiu
mostrar a associao da incidncia de cncer e o uso de glifosato, mas De Roos
(2005) sugeriu uma provvel associao do glifosato com a incidncia de mieloma
mltiplo, sendo necessrios maiores estudos para essa concluso.
Rodrigues et al. (2009) descreveram os sintomas de intoxicao aguda de
glifosato em humanos, a partir de uma reviso da literatura de casos de exposio
por via oral. Os sintomas incluram dores abdominais, vmitos, excesso de lquido
nos pulmes, dores de cabea, perda de conscincia, destruio de clulas
vermelhas do sangue, palpitaes cardacas, dormncia facial, coceiras,
formigamento, entre outros. Alm desses sintomas, foram evidenciadas alteraes
no eletrocardiograma, leses nos rins, pulmes e trato gastrointestinal, riscos de
ocorrncia de linfoma no-Hodgkin.
O glifosato no foi classificado sobre sua carcinogenicidade pela International
Agency for Research on Cancer (IARC). J a agncia de proteo ambiental dos
40

Estados Unidos (United States Environmetal Protection Agency - US EPA)


classificou o glifosato como pertencente ao Grupo E: Sem evidncia de
carcinogenicidade em humanos, apesar de estudos mostrarem associao do
glifosato, ou sua formulao comercial, com linfoma no-Hodgkins, mieloma
mltiplo, leso do DNA, leucemia e abortos espontneos (IARC, 2013; US EPA,
1993; WATTS, 2009; HARDELL, ERIKSSON e NORDSTRM, 2002; MINK ET al.,
2012).

2.2.2 Glifosato em alimentos

No Brasil, o glifosato utilizado principalmente nas culturas de soja, milho,


arroz, caf, cacau e cana-de-acar, alm do uso no controle de plantas aquticas
com seu uso regulamentado pela ANVISA. A Tabela 6 apresenta as culturas, nas
quais o glifosato pode ser utilizado, bem como o Limite Mximo de Resduo (LMR)
para cada uma.
Alm do uso controlado e permitido, deve-se preocupar com o uso ilegal do
glifosato pois, com frequncia, as formulaes contrabandeadas so mais txicas
que o produto puro. O glifosato no assimilado metabolicamente pela soja
transgnica, muito utilizada na alimentao humana e de animais, podendo
acumular no vegetal e em seus gros, o que torna imprescindvel o desenvolvimento
de estudos e monitoramento deste herbicida nos gros e derivados (ABREU,
MATTA e MONTAGNER, 2008).
Ingesto Diria Aceitvel (IDA) estipulada para o glifosato de 0,042 mg/kg
de peso corporal. Isso significa que esse valor a quantidade mxima de glifosato
que, ingerida diariamente durante toda a vida, parece no oferecer risco aprecivel
sade, luz dos conhecimentos atuais (ANVISA, 2013b). No entanto, sabe-se que
os surfactantes usados nas preparaes tcnicas podem ser mais txicos que o
princpio ativo, alm de que nos alimentos ainda podem ser encontrados mais de um
principio ativo, sendo esse sinergismo desconhecido.
41

Tabela 6 - Limites mximos de resduos (LMR) e intervalo de segurana de glifosato de


Limites mximos
acordodecom
resduos para o onde
a cultura glifosato, segundo .a cultura
aplicado
Modalidade de Intervalo de
Cultura LMR (mg/kg)
Emprego (Aplicao) Segurana (Dias)
(1)
Algodo Ps-Emergncia 3,00
Ameixa Ps-Emergncia 0,20 17
(1)
Arroz Ps-Emergncia 0,20
Aveia Preta Dessecante 20,00 4
Azevm Dessecante 10,00 4
Banana Ps-Emergncia 0,02 30
Cacau Ps-Emergncia 0,10 30
Caf Ps-Emergncia 1,00 15
Cana-de-acar Maturador 1,00 30
(1)
Cana-de-acar Ps-Emergncia 1,00
Citrus Ps-Emergncia 0,20 30
Coco Ps-Emergncia 0,10 15
Eucalipto Ps-Emergncia Uso No Alimentar
(1)
Feijo Ps-Emergncia 0,05
Fumo Ps-Emergncia Uso No Alimentar
Ma Ps-Emergncia 0,20 15
Mamo Ps-Emergncia 0,10 3
(1)
Milho Ps-Emergncia 1,00
Nectarina Ps-Emergncia 0,20 30
Pra Ps-Emergncia 0,20 15
Pssego Ps-Emergncia 0,20 30
Pinus Ps-Emergncia Uso No Alimentar
Seringueira Ps-Emergncia Uso No Alimentar
Soja Dessecante 10,00 7
(1)
Soja Ps-Emergncia 10,00
(1)
Trigo Ps-Emergncia 0,05
Uva Ps-Emergncia 0,20 17
(1) (1) O intervalo de segurana para a cultura no determinado quando o
O intervalo de segurana para a cultura no determinado quando o agrotxico for
agrotxico for aplicado em ps-emergncia das plantas infestantes e pr-emergncia da
aplicado em ps-emergncia das plantas infestantes e pr-emergncia da cultura.
cultura. Fonte: ANVISA, 2013b.

Nos ltimos anos, a questo dos agrotxicos no Brasil vem ganhando


contornos cada vez mais preocupantes. H uma grande presso das multinacionais
que dominam o mercado, sobre o rgo regulador para liberao de alguns produtos
e/ou aumento de seu LMR. Em fevereiro de 2004, foi publicada a Resoluo n 33
da ANVISA aumentando o LMR de glifosato na soja de 0,2 para 10,0 mg/kg, devido
s demandas referentes ao plantio da soja transgnica. Paralelamente a essa
iniciativa, ocorreu a liberao da soja geneticamente modificada Roundup Ready
(RR), da Monsanto que visava a comercializao legal do gro (ANVISA, 2004;
PACHECO e SCHOTTZ, 2005).
A anlise de glifosato e AMPA feita em soja transgnica (GMRR BRS 244
RR) mostrou que os resduos dessas molculas nos gros ultrapassam o LMR
pela legislao brasileira, mesmo seguindo o manejo correto e o tempo de carncia
42

recomendado. Isso enfatiza a necessidade de monitorizao desses resduos nos


alimentos consumidos, principalmente na soja (BOHM et al., 2008).
Em 2010, o Brasil manteve e reforou a sua posio como o segundo maior
produtor mundial de culturas geneticamente modificadas, sendo ento, responsvel
por 17% de toda a produo mundial. Dos 25,4 milhes de hectares de culturas
transgnicas cultivadas no Brasil em 2010, mais de 70% da rea plantada foi da soja
RR (JAMES, 2010).
Segundo a Cleres (empresa de consultoria especializada no agronegcio
brasileiro) na safra 2010/11, lavouras de milho transgnico do Paran, resistentes a
insetos e tolerante a herbicidas, demandaram 24,7% menos defensivos na safra de
vero do que um plantio convencional (4,5 quilos e no mais 6,2 quilos por hectare,
como anteriormente) (FREITAS-JNIOR, 2012).
Contudo, as lavouras transgnicas de soja (cultura que demanda sozinha,
48% de todos os agrotxicos vendidos no pas) utilizam agrotxicos de forma mais
intensa do que as que no adotam essa tecnologia. No Paran, por exemplo, as
lavouras com a tecnologia RR, da Monsanto, empregaram, em mdia, 3,6 quilos
de agroqumicos por hectare, o que equivale a 16,2% de aumento em relao aos
3,1 quilos consumidos em lavouras convencionais. A vantagem do uso de glifosato
para o produtor est no manejo, pois nas lavouras RR, vrios herbicidas so
substitudos por um nico produto, o glifosato, em dosagem maior (FREITAS-
JNIOR, 2012).

2.2.3 Aspectos analticos do glifosato

Os mtodos analticos para determinao de glifosato tm sido desenvolvidos


principalmente em alimentos e gua, mas tambm em matrizes mais complexas
como solo, soro sanguneo e urina. A determinao do teor de glifosato nestas
matrizes serve para produzir informaes a respeito da exposio humana a esse
produto, contaminao do ambiente e estudos de cintica em animais e no prprio
homem.
43

A molcula do glifosato apresenta baixo peso molecular, alta polaridade,


quatro stios de ionizao e nenhum grupo cromforo para sua visualizao por
detectores simples. Por apresentarem baixa volatilidade, compostos como o
glifosato necessitam de uma etapa de derivao pr-coluna para a obteno de um
derivado voltil a ser analisado em cromatografia gasosa (MARTINS-JNIOR et al.,
2009), mas atualmente, poucos pesquisadores utilizam tal tcnica.
Alferness e Iwata (1994) desenvolveram um mtodo para anlise de glifosato
e AMPA em gua, solo e matrizes vegetais e de origem animal que tinha como
derivatizantes o cido trifluoroactico anidro (TFAA) e heptafluorobutanol (HFB). Os
analitos derivatizados foram quantificados usando cromatografia gasosa acoplado a
detector de massas em modo SIM (Selected Ion Monitoring).
Tsuji, Ariyama e Yano (1997) desenvolveram um mtodo para determinao
simultnea de glifosato, glifosinato e seus respectivos metablitos em solo e trigo
utilizando como derivatizantes cido actico e trimetilorto-acetato (TMOA), sendo os
analitos posteriormente analisados por cromatografia gasosa acoplada a detector
fotomtrico de chama (Flame Photometric Detector - FPD).
Stalikas e Pilidis (2000) otimizaram um mtodo para extrao e anlise de
glifosato e AMPA (dentre outros agrotxicos do grupo) em gua tambm utilizando
como derivatizantes cido actico e TMOA. Tais analitos foram posteriormente
analisados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas em
modo SIM.
Brjesson e Torstensson (2000), tendo como matrizes guas subterrneas e
solo, aps derivatizao de glifosato e AMPA com TFAA e trifluoroetanol (TFE),
analisaram os produtos derivatizados por cromatografia gasosa acoplada a
espectrometria de massas.
Embora tenhamos trabalhos utilizando a cromatografia gasosa, a
cromatografia lquida tem sido a tcnica mais comum para determinao do glifosato
e AMPA com derivatizao pr ou ps-coluna, transformando-os em derivados
fluorescentes ou apenas aumentando sua massa. A derivatizao ps-coluna
utilizando orto-ftalaldedo (OPA) aps separao em coluna de troca catinica foi
primeiramente proposta por Moye, Miles e Schere (1983). Outros derivatizantes
tambm so citados na literatura (ABAKERLI e FAY, 2003; HEGENDOORN et al.,
1999; KRUVE et al., 2011) sendo o cloroformato de 9-fluorenil-metoxicarbonil
(FMOC-Cl) atualmente o mais utilizado para anlise de glifosato e AMPA por
44

cromatografia lquida, principalmente devido sua especificidade de reao com


aminas primrias e secundrias. Apesar de haver diferentes condies de reao
descritas na literatura, todas apresentam elevadas concentraes de FMOC-CI
devido alta reatividade deste composto que em meio aquoso reage formando
hidrxido de 9-fluorenil-metoxicarbonil (FMOC-OH) (MARTINS-JNIOR, 2005).
Bernal et al. (2010), pesquisando a toxicocintica do glifosato e AMPA em
plasma de rato, inicialmente utilizaram cromatografia lquida e deteco por
fluorescncia aps derivao ps-coluna com FMOC-Cl, mas como a tcnica no foi
suficientemente sensvel, eles melhoraram sua sensibilidade acoplando um
quadrupolo simples (ESI-MS), analisando no modo SIM. Sendo assim, alm do
processo de derivatizao necessrio tambm selecionar bem o mtodo de
deteco para os fins pretendidos, muitas vezes sendo ainda necessrio mtodos de
purificao.
Ghanem et al. (2007) utilizaram um mtodo de anlise de glifosato e AMPA
em lamas de depurao com derivatizao com FMOC-Cl, purificao com resina de
troca aninica e concentrao em coluna SPE Oasis HLB sendo posteriormente
analisado por cromatografia lquida acoplada a espectrometria de massas em
tandem com ionizao em eletrospray (LC/ESI-MS/MS), para atingir a sensibilidade
necessria e retirada de interferentes.
Martins-Jnior et al. (2009) desenvolveram um mtodo simples e especfico
para anlise de glifosato e AMPA em soja utilizando LC/ESI-MS/MS, sem
necessidade de qualquer tipo de derivatizao ou purificao.
Tambm sem derivatizao, mas utilizando outro tipo de analisador de
massas (Ion-Trap), Li et al. (2009) desenvolveram um mtodo para anlise direta de
resduos de glifosato e glifosinato visando controle de qualidade de produtos como
melo, batata, tomate e espinafre, dentre outros. Nesse caso a derivatizao no foi
necessria para alcanar baixos nveis de deteco, j que a tcnica analtica de
deteco apresentou sensibilidade necessria para a anlise.
45

2.3 Milho

O milho considerado um alimento energtico para a dieta humana e animal,


devido sua composio predominantemente de carboidratos e lipdeos. A
composio mdia do milho em base seca 72% de amido, 9,5% protenas, 9%
fibra e 4% de leo (PAES, 2006).
Em todas as regies brasileiras consumidoras de milho, as principais formas
de aquisio domiciliar ainda so: o milho em gro, o milho em espiga ou enlatado, o
creme de milho, os flocos de milho, o fub (farinha de milho) e o po de milho.
Portanto, os produtos ou derivados obtidos por meio da moagem seca do milho so
os mais apreciados, tendo participao efetiva como componente bsico na dieta
alimentar, especialmente das camadas mais pobres da populao. O milho pode
suprir as necessidades nutricionais do organismo, alm de ser excelente
complemento alimentar, mas ele no possui apenas aplicao alimentcia, o uso dos
seus derivados feito tambm pelas indstrias qumica, farmacutica, de papis,
txtil, alm de outros usos ainda mais nobres (PAES, 2006).
O milho a cultura de maior destaque da agricultura mundial. A safra
2012/2013 de milho no mundo est estimada em 839 milhes de toneladas, com
uma rea plantada de 175,2 milhes de hectares. O Brasil o terceiro maior
produtor mundial, responsvel pela produo de 70 milhes de toneladas, em uma
rea de 16 milhes de hectares, estando atrs apenas de Estados Unidos e China,
responsveis respectivamente pela produo de 271 e 200 milhes de toneladas.
Sua produo mundial est concentrada nos Estados Unidos, China, Brasil, Unio
Europeia e Argentina, que juntos respondem por 56,2% e 74,4% da rea plantada e
da produo mundial, respectivamente (USDA, 2012).
A produo nacional do milho relativamente dispersa no pas. No entanto,
os principais estados produtores, Paran e Mato Grosso concentram quase a
metade (43,4%) da produo nacional (Tabela 7).
46

Tabela 7 Produo brasileira de milho ano safra 2012/2013, por Estado


Milho Ano Safra 2012/2013 %

Produo Nacional 71.936,40 100


Mil Toneladas
Principais Estados Produtores
Paran 16.626,90 23,1
Mato Grosso 14.588,30 20,3
Minas Gerais 7.452,00 10,4
Gois 7.356,30 10,2
Mato Grosso do Sul 5.666,10 7,9
Rio Grande do Sul 4.838,50 6,7
So Paulo 4.748,60 6,6
Santa Catarina 3.234,50 4,5
Bahia 2.181,20 3,0

Outros 5.244,00 7,3


Fonte: CONAB, 2012

2.4 Soja

A soja fonte de protenas, ferro, vitamina B, fibras e isoflavona e o


alimento com maior teor de protena entre os vegetais. Apresenta 40% de protenas,
20% de lipdios, 5% de minerais e 34% de carboidrato, e os alimentos a base de
soja, em forma de leite, sucos, carnes ou mesmo bolos, substituem refeies de
pessoas com restries alimentares, como alergia a laticnios, ou opcionais, como
vegetarianismo (APROSOJA, 2012).
A soja uma importante cultura da agricultura mundial. A safra 2012/2013 de
soja no mundo est estimada em 264,3 milhes de toneladas, com uma rea
plantada de 108,5 milhes de hectares, sendo o Brasil, maior produtor mundial desta
oleaginosa, responsvel pela produo de 81,0 milhes de toneladas, em uma rea
de 27,5 milhes de hectares (USDA, 2012).
A produo mundial de soja est concentrada em trs pases Brasil, Estados
Unidos e Argentina, que juntos respondem por 71,7% e 80,6% da rea plantada e da
produo mundial da oleaginosa, respectivamente (USDA, 2012). O Brasil
apresenta, contudo, a maior capacidade de crescimento da atual produo, tanto
47

pelo aumento da produtividade, quanto pelo potencial de expanso da rea cultivada


(VENCATO et al., 2010).
Atualmente a produo de soja no Brasil liderada pelos estados de Mato
Grosso, Paran, Rio Grande do Sul e Gois que produzem 72,8% da soja nacional.
Mas a produo de soja est evoluindo tambm para novas reas como Maranho,
Tocantins e Piau, as quais respondem atualmente por 5,8% da produo Brasileira
(Tabela 8).

Tabela 8 Produo brasileira de soja ano safra 2012/2013, por Estado.


Soja Ano Safra 2012/2013 %

Produo Nacional 82.627,60 100


Mil
Toneladas
Principais Estados Produtores
Mato Grosso 23.803,70 28,8
Paran 15.207,40 18,4
Rio Grande do Sul 11.955,60 14,5
Gois 9.159,10 11,1
Mato Grosso do Sul 6.243,20 7,6
Bahia 3.755,70 4,5
Minas Gerais 3.321,00 4,0
Maranho 1.682,40 2,0
Tocantins 1.649,70 2,0
Piau 1.477,30 1,8

Outros 4.372,50 5,3


Fonte: CONAB, 2012
48

3 OBJETIVO GERAL

Desenvolver e validar metodologia para determinao de glifosato e AMPA e Avaliar


parmetros hematolgicos e bioqumicos de trabalhadores expostos a agrotxicos.

3.1. Objetivos especficos

Desenvolver e validar metodologia para determinao do glifosato e AMPA


em soja e milho, utilizando cromatografia lquida acoplada a espectrometria
de massas (LC/ESI-MS/MS) sem derivatizao;
Avaliar a prevalncia de resduos de glifosato e AMPA em amostras de milho
coletadas no comrcio;
Caracterizar o trabalhador rural da agricultura familiar quanto a dados
epidemiolgicos, estilo de vida;
Caracterizar os tipos de agrotxicos utilizados pelos trabalhadores quanto
classe toxicolgica e mecanismo de ao;
Caracterizar a exposio dos trabalhadores rurais quanto utilizao de
EPIs, preocupao com a toxicidade das substncias e tempo de exposio;
Avaliar parmetros hematolgicas e bioqumicos em trabalhadores da
agricultura familiar expostos a agrotxicos.
49

4 VALIDAO DA METODOLOGIA ANALTICA PARA DETERMINAO DE


GLIFOSATO E AMPA EM SOJA E MILHO (FUB)

A validao de um mtodo analtico a confirmao por exame e fornecimento


de evidncia objetiva de que os requisitos especficos para um determinado uso
pretendido so atendidos. Um mtodo deve ser validado quando no for
normalizado, for desenvolvido pelo prprio laboratrio, quando os mtodos
normalizados forem usados fora dos escopos para os quais so concebidos ou
quando forem feitas ampliaes e modificaes nos mtodos normalizados.
fundamental que os laboratrios disponham de meios e critrios objetivos para
demonstrar, atravs da validao, que os mtodos de ensaio utilizados conduzam a
resultados confiveis e adequados qualidade pretendida (INMETRO, 2010).

4.1 Materiais e Mtodos

4.1.1 Amostragem

Amostras de gros de soja orgnica foram utilizadas como branco nos


experimentos de recuperao. Estas amostras foram adquiridas em um
supermercado de Belo Horizonte. As amostras foram trituradas em moinho
refrigerado e acondicionadas em sacos plsticos de polipropileno congeladas a -20
10C, at a realizao das anlises.
Amostras de fub orgnico foram utilizadas como branco nos experimentos de
recuperao. Estas amostras foram adquiridas em um supermercado de Belo
Horizonte. As amostras foram acondicionadas em sacos plsticos de polipropileno
congeladas a -20 10C, at a realizao das anlises.
50

4.1.2 Reagentes e Padres

Os padres primrios dos compostos Glifosato e AMPA utilizados so marca Dr.


Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Alemanha). gua purificada foi obtida em um
sistema Milli-Q Gradient (Millipore, Bedford, USA). Os reagentes utilizados foram de
padro analtico (p.a.), de grau HPLC ou para anlise de resduos (p.a.r.). Os
solventes orgnicos utilizados foram: metanol grau HPLC (J.T. Baker, Phillipsburg,
USA), diclorometano p.a.r. (Macron/JT Baker, Phillipsburg, USA), hidrxido de
amnio p.a. (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil), formiato de amnio p.a. (Vetec, Rio de
Janeiro, Brasil) e cido frmico 98% p.a. (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil).
Solues estoque dos analitos foram preparadas separadamente, em gua Milli-
Q, na concentrao de 447,27 ng/L para Glifosato e 819,00 ng/L para AMPA. As
solues foram acondicionadas em tubos de polipropileno de 50,0 mL, envoltos com
papel alumnio, sob temperatura de refrigerao entre 2C e 8C.
Todas as solues padro utilizadas foram preparadas em gua Milli-Q por
diluies adequadas das solues estoque, sendo utilizadas duas solues
intermedirias constitudas da mistura dos dois analitos. Na primeira soluo
intermediria (SI-1) as concentraes de glifosato e AMPA so 4,0 ng/L e 80,0
ng/L respectivamente. Na segunda soluo intermediria (SI-2) as concentraes
de glifosato e AMPA foram de 0,275 ng/L e 5,5 ng/L respectivamente. Tais
solues foram acondicionadas em tubos de polipropileno de 15 mL sob temperatura
de refrigerao entre 2C e 8C. Os testes de recuperao utilizaram a SI-1 e as
curvas foram obtidas a partir da SI-2.

4.2 Equipamentos

Os principais equipamentos utilizados foram: balana analtica marca Scientech


modelo SA210; balana semi-analtica marca Sartorius modelo TE612; centrfuga
refrigerada marca Jouan modelo CR3i; microcentrfuga refrigerada marca Eppendorf
51

modelo 5415R; agitador de tubos marca IKA modelo MS3 basic; banho de ultrassom
marca UltraCleaner Unique modelo 1400A.

4.3 Procedimentos de Extrao

Foram pesados, em tubos de polipropileno de 50 mL, 2,00 0,03 g de amostra


sendo conduzidos estudos de recuperao em amostras fortificadas. A extrao dos
analitos foi realizada com 20,00 mL de gua purificada acidificada com 0,1% v/v de
cido frmico em ultrassom por 10 minutos com agitao anterior em vortex por
aproximadamente 15 segundos para homogeneizao. Aps essa primeira extrao
foi adicionado 5 mL de diclorometano, sendo repetido o processo em ultrassom por
10 minutos com agitao em vortex por aproximadamente 15 segundos repetindo-se
por mais 5 minutos em ultrassom.
Aps a extrao, as amostras foram centrifugadas a 3000 rpm durante 15,0
minutos a 15 C. Uma alquota de 500L do sobrenadante foi transferida para um
tubo eppendorf de 1,5 mL, em seguida, adicionou-se 500L de metanol. Verteu-se o
tubo 3 vezes para a precipitao de protenas, centrifugando novamente a 13000
rpm durante 15,0 minutos a 8 C. Aps a centrifugao, 100,0 L da amostra foram
transferidos para vial cromatogrfico de 2,0 mL e foram adicionados 900,0 L de
gua para injeo no sistema LC/ESI-MS/MS.
52

Pesar 2,00 g de amostra

Adicionar 20,00 mL de H2O 0,1% v/v


cido frmico

Agitar 15 s em vortex e extrair por


ultrassom por 10 min

Adicionar 5 mL de CH2Cl2

Agitar 15 s em vortex e extrair por


ultrassom por 10 min

Agitar 15 s em vortex e extrair por


ultrassom por 5 min

Centrifugar
(3000 rmp por 15 min a 15C)

Transferir 500,0 L do sobrenadante e


adicionar 500,0 L de metanol em
eppendorf

Verter 3x o frasco e centrifugar a


13000rpm por 15 min a 8C

Diluir 100,0 L da amostra com 900,0 L


de H2O em vial cromatogrfico de 2 mL

Injetar 40 L no
LC/ESI-MS/MS
Figura 7 Fluxograma do processo de extrao
53

4.4 Espectrometria de massas

O espectrmetro de massas um instrumento composto basicamente por trs


unidades fundamentais: fonte de ons com a finalidade de gerar os ons a serem
analisados na fase gasosa a partir das amostras de interesse; analisador ou filtro de
massas que emprega combinaes entre campos eltricos e magnticos para
separar os ons gerados na fonte de ionizao de acordo com as suas razes
massa/carga (m/z) e detector que tem a finalidade de quantificar os ons
provenientes do analisador de massas (MARTINS JR., 2005; KUSSUMI, 2007).
A espectrometria de massas em tandem a rea da espectrometria de
massas interessada em estudar a gerao de ons produtos formados por colises
de um on precursor previamente selecionado. Este processo de fragmentao de
um on de m/z especfica requer o isolamento deste on, seguido da fragmentao
do mesmo e da anlise dos ons produtos formados por outro analisador de massas
(HOFFMANN and STROOBANT, 2007; MARTINS JR., 2009).
Um sistema triploquadrupolar composto por trs analisadores quadrupolares
dispostos em srie. Neste sistema, o primeiro quadrupolo (Q1) e o terceiro
quadrupolo (Q3) funcionam como filtro de massas. O segundo quadrupolo (q2)
operado como cela de coliso, onde, reaes de dissociao de ons de interesse
so realizadas (Figura 8) (MARTINS JR., 2009).

Figura 8 - Diagrama de um instrumento triploquadrupolo. Q1 e Q3 so espectrmetros de


massas e o quadrupolo do meio (q2) a clula de coliso.
54

4.5 Condies do sistema de cromatografia

Foi utilizado em um sistema LC/ESI-MS/MS composto de um espectrmetro de


massas triploquadrupolo LC 6460 (Agilent Technologies, Waldbronn, AL) equipado
com fonte de ionizao API-ESI com tecnologia Agilent JetStream (electrospray),
conjunto compressor de ar / gerador de nitrognio NG15 Atlas Copco com tecnologia
Pressure Swing Adsorption e reservatrio de 200 litros (Atlas Copco, Sucia). O
espectrmetro de massas foi acoplado a um cromatgrafo lquido srie Agilent Serie
1200 SL (Agilent Technologies) equipado com bomba binria, sistema micro-
degaseificador online a vcuo, amostrador automtico com controle de temperatura
e capacidade para 54 + 54 frascos de amostra de 2,0 mL e forno para coluna
analtica. O sistema de controle, aquisio e tratamento dos dados foram realizados
com o software Agilent MassHunter Workstation verso B.03.02.
O espectrmetro de massas foi calibrado nos modos de ons positivos e
negativos com uma soluo de padro (Low Concentration Tuning Mix). O nitrognio
obtido pelo gerador foi utilizado como gs nebulizante, gs secante e gs de
dessolvatao na fonte. Como gs de coliso foi utilizado um Nitrognio UltraPuro
6.0 da White Martins. As tabelas 9 e 10 apresentam, respectivamente, os valores
otimizados para a fonte JetStream e para anlise de glifosato e AMPA em soja e
milho.

Tabela 9 - Parmetros da fonte de ionizao JetStream empregados nas anlises.


Parmetro Polaridade (+) Polaridade (-)

GasTemp 345 C 345 C


DryingGasFlow 12 L/min 12 L/min
NebulizerGas 50 psi 50 psi
SheathGasTemp 350 C 350 C
SheathGasFlow 12 L/min 12 L/min
CapillaryVoltage +5500 V -4500 V
NozzleVoltage 500 V 500 V
55

Tabela 10 - Parmetros otimizados para anlise de glifosato e AMPA em amostras de soja e


milho.
Energia
Transio Dwell Polaridade
Composto Propsito Fragmentor de
(m/z) time (ESI)
Coliso
Glifosato 170>88 Quantificao 250ms 62 2 Positiva
Glifosato 170>60 Confirmao 250ms 62 14 Positiva
AMPA 110>63 Confirmao 250ms 77 14 Negativa
AMPA 110>79 Quantificao 250ms 77 22 Negativa

4.6 Seleo da fase mvel

O glifosato e seu metablito AMPA apresentam elevada polaridade, grande


tendncia em formar espcies inicas e comportamento zwiterinico. No caso dos
compostos mencionados, os grupos fosfato e carboxlico tm maior carter cido
que o amnio. Sendo assim, os eletrlitos adicionados fase mvel participam dos
processos de associao e dissociao dos analitos, isto porque, apesar dos
analitos j estarem ionizados em fase lquida e por possurem diferentes stios
ionizveis, a carga dos compostos em fase lquida varia em funo do pH da
soluo, devendo-se atentar a isso j que a transio pesquisada para cada
composto leva em considerao a relao massa/carga (m/z) que ser caracterstica
em uma faixa de pH, relacionado s constantes de dissociao, que no caso do
glifosato so pK1 = 0,8; pK2 = 2,2; pK3 = 5,4 e pK4 = 10,2, conforme Figura 9.
56

Figura 9 Constantes de ionizao do glifosato e AMPA. Fonte: CIKALO, 1996

De acordo com o trabalho de Martins-Jnior (2005) os melhores picos foram


obtidos com o emprego de aditivos de pH alto, neste caso, carbonato de amnio e
hidrxido de amnio sabendo-se que o aumento do pH da soluo que contribui
para o processo de dissociao dos analitos j na fase lquida. No presente trabalho
optou-se pela seleo de um nico aditivo que se adequasse aos modos de
ionizao positivo e negativo, uma vez que o glifosato e o AMPA apresentaram
maior sensibilidade em modos de ionizao de polaridade diferente. Empregou-se
como aditivo o formiato de amnio 5 mmol/L e hidrxido de amnio 0,1 % v/v.
Empregou-se como fase mvel Soluo A aquosa contendo formiato de amnio
5mmol/L e hidrxido de amnio 0,1 % v/v (pH 9) e Soluo B metanol. A proporo
das fases foi de 85 % da fase A e 15 % da fase B (sem gradiente), com fluxo de 0,3
mL/min. A coluna utilizada foi uma Agilent Zorbax SB-C18 2,1 x 50 mm x 1,8 m,
mantendo-se o forno a 35 C.
57

4.7 Parmetros de Validao

Validaes intralaboratoriais correspondem a estudos analticos que


envolvem um nico laboratrio, utilizando um mesmo mtodo, para analisar mesma
ou diferentes amostras, sob diferentes condies, em um intervalo de tempo
justificado (EC, 2011). Tais processos de validao permitem avaliar no somente a
exatido e a preciso de um mtodo, mas tambm outros importantes parmetros
tpicos de desempenho como linearidade da curva de calibrao, faixa de trabalho,
sensibilidade, seletividade, efeitos de matriz, limites de deteco e de quantificao
(SOUZA, 2007; THOMPSON, ELLISON e WOOD, 2002).
O documento SANCO n 12495/2011 um guia especfico para laboratrios
oficiais envolvidos no controle de resduos de agrotxicos em alimentos da Unio
Europeia e descreve mtodos de validao e controle de qualidade de modo a
padronizar e garantir a qualidade e comparabilidade dos resultados obtidos.
Segundo tal documento, a validao de mtodo intralaboratorial deve ser realizada
para fornecer evidncia de que um mtodo adequado ao propsito para o qual
ser utilizado (EC, 2011).
Sendo assim, a validao do mtodo foi baseada em parmetros da EUROPEAN
COMISSION (2002) e documento n SANCO/12495/2011 (EC, 2011). Os testes
estatsticos e as premissas associadas a esses testes foram baseados em Souza
(2007). Foi conduzida por dois tcnicos treinados na tcnica, seguindo
procedimentos baseados na NBR ISO/IEC 17025: 2005, executada em dias
diferentes. O delineamento experimental incluiu curvas do analito em solvente e em
matriz, amostras brancas e adicionadas. Os parmetros analisados foram
seletividade, linearidade, efeito de matriz, exatido, preciso, limite de deteco e
quantificao e incerteza.
Para a validao, foram escolhidos soja e milho por apresentarem culturas
representativas, com teor de leo diferentes, alto consumo de glifosato e grande
produo brasileira. A cultura de soja foi a principal consumidora de agrotxicos do
Brasil, em 2011, segundo dados do SINDAG, e o milho uma das quatro culturas
que mais impulsionaram o aumento de quase 30% do uso de agrotxicos no
primeiro trimestre do Brasil, quando se compara os anos de 2011 e 2012 (IEA, 2012;
58

SINDAG, 2012). O procedimento escolhido para extrao foi adaptado dos trabalhos
de Martins-Jnior (2005) e Kruve et al. (2011).

4.7.1 Linearidade e Curva de calibrao

A linearidade a capacidade de um mtodo analtico gerar resultados


diretamente proporcionais concentrao da espcie em anlise, dentro de uma
faixa analtica especificada. A equao matemtica que descreve esta dependncia
conhecida como curva de calibrao e o ajuste desta equao geralmente feito
pelo mtodo dos mnimos quadrados ordinrios (MMQO). Exceto quando ocorrem
grandes erros no preparo das curvas, os erros devidos calibrao correspondem
aos menores componentes na compilao da incerteza total.
A curva de calibrao de um mtodo analtico o intervalo entre os menores
e maiores nveis (incluindo estes) que tenham demonstrado preciso, exatido e
linearidade utilizando o mtodo pretendido. Dentro dessa faixa de trabalho a
resposta do sinal ter uma relao linear com o analito ou valor da propriedade. A
curva de calibrao deve cobrir a faixa de aplicao para a qual o ensaio vai ser
usado e a concentrao mais esperada da amostra deve, sempre que possvel, se
situar no centro da faixa de trabalho (HUBER, 1998; INMETRO, 2010; THOMPSON,
ELLISON e WOOD, 2002).
A linearidade foi avaliada baseando-se no procedimento descrito por Souza e
Junqueira (2005). Foram preparadas curvas de calibrao com oito nveis de
concentrao e trs replicatas independentes, buscando-se selecionar apenas 6
nveis para os testes estatsticos de linearidade. As curvas foram injetadas de modo
aleatrio.
O modelo , em que representa as respostas dos picos, no caso foi
utilizado as reas e as concentraes dos padres dos analitos. O mtodo dos
mnimos quadrados ordinrios (MMQO) foi utilizado para estimar os parmetros da
regresso e O teste de resduos padronizados Jacknife foi aplicado para a
deteco de valores dispersos (outliers). As premissas da anlise de regresso
foram previamente verificadas utilizando testes de Ryan-Joiner, Brown-Forsythe e
59

Durbin-Watson para verificar, respectivamente, normalidade, homoscedasticidade e


independncia dos resduos. Anlise de varincia foi utilizada para verificar a
adequao do ajuste ao modelo linear (SOUZA, 2007; THOMPSON et al., 2002).
As curvas foram preparadas em bales volumtricos de 5 mL, com trs replicatas
independentes de cada ponto de calibrao para testes de linearidade e efeito de
matriz. Os volumes dos bales foram completados com gua Milli-Q. As faixas de
concentrao foram de 0,0025 a 0,060 ng/L para glifosato e 0,050 a 1,00 ng/L
para AMPA. Estas solues foram preparadas com frequncia diria.

4.7.2 Seletividade e Efeitos de matriz

A seletividade um parmetro de desempenho relacionado capacidade do


mtodo de determinar especificamente o analito de interesse na presena de outros
componentes da matriz, ou mesmo outros analitos, sob condies determinadas
(EURACHEM, 1998; SOUZA, 2007).
A European Commission (EC) define como especificidade a capacidade de
um mtodo distinguir o analito de outra substncia, pertencente da matriz ou no,
sendo esta caracterstica depende essencialmente da tcnica de medio descrita
(EC, 2002). Entretanto, segundo a IUPAC (VESSMAN et al., 2001), este conceito
expressa a seletividade do mtodo.
Estudos dos efeitos de matriz correspondem um tipo especfico de estudo de
seletividade que objetiva averiguar possveis interferncias causadas por elementos
diversos que compem a matriz amostral (THOMPSON, ELLISON e WOOD, 2002).
A matriz pode conter compostos que podem interferir na medida feita pelo detector
selecionado. Dependendo de como a identidade do analito estabelecida,
interferentes podem inibir a deteco distorcendo o sinal proveniente do analito,
inibindo a ionizao da substncia de interesse, por exemplo. Diferentemente, os
interferentes tambm podem contribuir para o sinal atribudo ao analito, com efeito
de aumentar a concentrao do mesmo (EURACHEM, 1998).
A ausncia de resultados falso-positivos para as amostras brancas em adio
combinao da tcnica de cromatografia lquida acoplada a espectrometria de
60

massa (LC-MS/MS) obtm-se uma seletividade que raramente comprometida


devido ao fornecimento simultneo do tempo de reteno, relao entre os ons,
abundncia do analito, separao e deteco (VESSMAN et al., 2001).
Para a avaliao do efeito de matriz foi empregado o mtodo de adio de
padro. Para comparao da inclinao, duas curvas de calibrao exatamente
iguais em concentrao foram preparadas em trs replicatas independentes,
injetadas em ordem aleatria, no mesmo dia. A curva em solvente foi preparada
conforme descrito nos experimentos de avaliao da linearidade, utilizando-se 100
L de gua Milli-Q adicionada de 900 L de cada pondo da curva, partindo-se dos
bales volumtricos de 5 mL. Para o preparo da curva em matriz utilizou-se de 100
L do extrato de amostras brancas adicionada de 900 L de cada ponto da curva,
provenientes dos bales volumtricos de 5 mL.

4.7.3 Exatido

A exatido o grau de concordncia entre o valor mdio de uma srie de


resultados de ensaios e o valor de referncia aceito, sendo assim, expressa os erros
sistemticos ou tendncias (EC, 2002; THOMPSON, ELLISON e WOOD, 2002).
Segundo Huber (1998), exatido se define como a extenso na qual os resultados
gerados por um mtodo e os valores verdadeiros concordam. Para avaliao da
exatido de um mtodo so utilizados materiais de referncia certificados (MRC),
materiais de referncia (MR), mtodos de referncia ou ensaios de
adio/recuperao (THOMPSON, ELLISON e WOOD, 2002).
Segundo o documento n SANCO/12495/2011, o mtodo analtico deve ser
capaz de fornecer valores mdios de recuperao para cada nvel adicionado na
faixa de 70 a 120%, com RSD (desvio padro relativo) de repetitividade 20%, para
todos os compostos pesquisados usando o mtodo (EC, 2011).
Os resultados de recuperao obtidos foram analisados quanto presena de
valores dispersos pelo teste de Grubbs. As premissas de normalidade (teste de
Ryan-Joiner) e homoscedasticidade dos resduos (teste de Brown-Forsythe) dos
61

resultados de recuperao, utilizados na anlise de varincia, foram previamente


testadas como proposto por Souza (2007).
Exatido foi pesquisada por meio das mdias de recuperao obtida em ensaios
com amostras de milho (fub) e soja brancas adicionadas de padro
correspondentes aos nveis 1, 2, 3 e 7 da curva de calibrao, sendo doze replicatas
independentes de cada nvel (EC, 2011). As concentraes de glifosato e AMPA nas
amostras analisadas foram calculadas utilizando-se das curvas de calibrao nas
respectivas matrizes.

4.7.4 Preciso

A preciso diz respeito distribuio dos erros aleatrios de um sistema de


medio. Indica o grau de disperso de diversos valores individuais em torno do
valor mais provvel, sendo ento o grau de concordncia entre resultados de
ensaios independentes obtidos em condies pr-estabelecidas especficas.
Normalmente calcula-se sob a forma de um desvio padro do resultado do ensaio,
sendo dependente da concentrao do analito. Uma menor preciso indicada
atravs de um elevado desvio padro (EC, 2002; EURACHEM, 1998; INMETRO,
2010; THOMPSON, ELLISON e WOOD, 2002).
As condies mais comuns para obteno da preciso so repetitividade e
reprodutibilidade. A repetitividade avalia a variabilidade encontrada quando
resultados independentes so obtidos utilizando o mesmo mtodo, em um mesmo
laboratrio, com o mesmo analista, usando o mesmo equipamento em um curto
intervalo de tempo. A reprodutibilidade representa a variabilidade encontrada
quando resultados so obtidos utilizando o mesmo mtodo, em laboratrios
diferentes, com diferentes analistas e usando equipamentos diferentes. A preciso
intermediria ou reprodutibilidade parcial refere-se preciso avaliada utilizando o
mesmo mtodo, no mesmo laboratrio, mas variando condies como: diferentes
analistas; diferentes equipamentos; diferentes tempos. reconhecida como a mais
representativa da variabilidade dos resultados em um nico laboratrio (EC, 2002;
EURACHEM, 1998; INMETRO, 2010; THOMPSON, ELLISON e WOOD, 2002).
62

Segundo o documento n SANCO/12495/2011, o mtodo analtico deve ser


capaz de fornecer valores mdios de recuperao com os desvios padro relativos
de repetitividade (DPRr) e os desvios padro de reprodutibilidade parcial (DPRR)
20% para todos os compostos pesquisados usando o mtodo (EC, 2011).
Preciso (sob condies de repetitividade e reprodutibilidade parcial), foi
expressa em termos de desvios-padro relativos e estimada por anlise de varincia
dos resultados de recuperao obtidos, sendo pesquisados em ensaios com
amostras de milho (fub) e soja brancas adicionadas de padro em nveis
correspondentes aos nveis 1, 2, 3 e 7 da curva de calibrao, sendo doze replicatas
independentes de cada nvel. As amostras foram divididas em quatro lotes com trs
replicatas de cada nvel, analisados em dois diferentes dias por dois analistas
diferentes: dias 1 e 2 pelo analista 1 e dias 3 e 4 pelo analista 2 (EC, 2011; SOUZA,
2007). As concentraes de glifosato e AMPA nas amostras analisadas foram
calculadas utilizando-se das curvas de calibrao na matriz respectiva.

4.7.5 Limite de Quantificao e Limite de Deteco

O Limite de Deteco (LD) a menor concentrao do analito presente em


uma amostra que pode ser detectada pelo mtodo, porm, no necessariamente
corretamente quantificada, devido presena de um erro muito grande. Pode ser
definido tambm como a menor concentrao do analito detectada em amostras
adicionadas, mas no necessariamente quantificada e distinguida de zero
(sinal/rudo 3) ou tambm como a mdia mais trs desvios padro das respostas
obtidas para as amostras brancas (HUBER, 1998; SOUZA e JUNQUEIRA, 2005;
THOMPSON, ELLISON e WOOD, 2002).
O Limite de Quantificao (LQ) a menor concentrao de uma substncia
que pode ser quantificada com exatido e preciso aceitveis nas condies
estipuladas do teste (EC, 2002) ou a concentrao abaixo da qual o mtodo analtico
no pode operar com preciso e exatido aceitveis (THOMPSON, ELLISON e
WOOD, 2002).
63

O LQ foi estabelecido como a menor concentrao estudada na qual o


mtodo operou com exatido e preciso aceitveis, ou seja, valores mdios de
recuperao obtidos para as replicatas de amostras adicionadas, sendo considerado
o menor nvel de concentrao estudado que atendeu os requisitos estipulados. para
cada nvel adicionado na faixa de 70 a 120%, com RSD (desvio padro relativo) de
repetitividade 20%, para o composto pesquisado (SOUZA, 2007; EC, 2011).
O LD foi estabelecido como a concentrao abaixo da qual o mtodo no
pode operar com exatido e preciso aceitveis de acordo com Souza (2007), sendo
a menor concentrao detectada em todas as amostras adicionadas, mas no
necessariamente quantificada, diferente de zero, tendo um sinal-rudo pelo menos
3. No presente trabalho, baseando-se tambm no mtodo visual, considerando a
concentrao mnima adicionada confirmada e detectada com pelo menos com trs
replicatas independentes com adio de padro neste nvel foi considerado o nvel
logo abaixo do nvel de LQ.

4.7.6 Incerteza da medio

A incerteza da medio definida internacionalmente como o parmetro


associado ao resultado de uma medida que caracterstico da disperso dos
valores que pode ser razoavelmente atribudo medida. O intervalo a 2u
representa um nvel de confiana de 95% que se encontrar o valor real, sendo a o
valor medido e 2u a incerteza expandida (CODEX, 2004).
No um dos parmetros de validao, mas um requisito imprescindvel da
norma ISO/IEC 17025:2005, tendo como conceito a faixa que engloba o resultado
reportado no qual o valor verdadeiro encontrado em uma probabilidade especfica
(nvel de confiana usualmente utilizado de 95%). Dados de incerteza podem ser
calculados utilizando exatido e reprodutibilidade, ou seja, a partir de dados de
validao (EC, 2011).
De acordo com a norma ISO/IEC 17025:2005, todo laboratrio de ensaio
devem ter procedimentos para a estimativa das incertezas de medio. Nos casos
onde a natureza do mtodo de ensaio impedir o clculo rigoroso (a anlise de
64

resduos se enquadra nesse caso), o laboratrio deve pelo menos tentar identificar
todos os componentes de incerteza e fazer uma estimativa razovel, baseada no
conhecimento do desempenho do mtodo e no escopo da medio, devendo fazer
uso de experincia e dados de validao (ABNT, 2005).
A quantificao da incerteza da medio associada ao resultado de ensaio
realizado neste trabalho foi baseada no conhecimento do desempenho do mtodo e
no escopo da medio, utilizando dados provenientes de processos de validao de
mtodos. No campo da incerteza de medio, o desvio padro experimental
denomina-se incerteza padro de medio. Desse modo, neste trabalho, os
parmetros de desempenho do mtodo, avaliados em ambiente intralaboratorial,
foram adotados para estimativa da incerteza.

4.8 Resultados e Discusso

4.8.1 Seleo da fase mvel

Baseado na pesquisa de Martins-Jnior (2005) escolheu-se trabalhar com


fase mvel bsica, devido a uma melhor ionizao tanto do glifosato em modo
positivo quanto do AMPA em modo negativo. Os testes iniciais foram com o
carbonato de amnio, mas logo nos primeiros ensaios houve entupimento do capilar
de entrada do detector de massas. Alm disso, o preparo dessa soluo foi bastante
trabalhoso, com grande precipitao do slido.
Aps a manuteno corretiva no aparelho, optou-se por utilizar soluo de
hidrxido de amnio, sendo esta muito voltil, foi utilizado o sal de formiato de
amnio para formao de um tampo que estabilizasse a fase mvel e,
consequentemente, os compostos analisados.
A escolha do metanol tambm foi baseada na pesquisa de Martins-Jnior
(2005), devido baixa solubilidade glifosato e do AMPA em acetonitrila somada
maior praticidade do uso do metanol levando-se em considerao que este j fazia
parte da rotina de outras metodologias utilizadas no laboratrio.
65

4.8.2 Linearidade e Curva de calibrao

Valores dispersos foram detectados e retirados pelo teste de resduos


padronizados Jacknife sendo excludos um para o AMPA e quatro para o glifosato
(Figura 10a e 10b).
A curva de calibrao analtica obtida para cada um dos analitos
apresentada na Tabela 11 e Figuras 11 e 12. Foi confirmado que os resduos da
regresso seguem a distribuio normal, so independentes e homoscedsticos,
permitindo a utilizao dos testes de hipteses de t e de F, alm do emprego da
anlise de varincia para estimativa da significncia da regresso e do desvio da
linearidade. Os dados obtidos foram avaliados como bem ajustados ao modelo
linear. A significncia da regresso (p < 0,01) e os desvios de linearidade no
significativos (p > 0,05) indicaram linearidade nas faixas de concentrao estudadas
para cada analito. Os grficos apresentados referem-se testes de linearidade em
solvente, para o AMPA e em matriz milho para Glifosato.

Tabela 11 Faixa de operao analtica validada para glifosato e AMPA.


Faixa de operao validada
Analito
(ng/L) (mg/kg)
Glifosato 0,005 a 0,05 1,0 a 10,0
AMPA 0,10 a 1,0 20,0 a 200,0

Figura 10 - Grficos exploratrios dos resduos da regresso de glifosato e AMPA no ensaio


de avaliao da linearidade com indicao dos respectivos valores extremos diagnosticados
pelo teste de resduos padronizados Jacknife. ei = resduo da regresso, = valor extremo, ----
= t(1-/2;n-2)sres
66

Figura 11 Curva de calibrao obtidas nos ensaios de avaliao da linearidade para


Glifosato.

Figura 12 Curva de calibrao obtidas nos ensaios de avaliao da linearidade para AMPA.

Abakerli e Fay (2003) obtiveram uma linearidade do equipamento na faixa de


concentrao de 0,01 a 10,0 g/mL com um coeficiente de correlao de 0,99. J
Martins-Jnior (2005) obteve uma linearidade na faixa entre 0,1 a 3,0 g/L para
anlise em soja com coeficiente de correlao maior que 0,999 para ambos.
Segundo Granby, Johannesen e Vahl (2003) a faixa linear de operao foi de 0,02 a
2,50 mg/kg de glifosato em cereais (correspondente a 0,0015 a 0,15 ng/L), com
coeficiente de determinao de 0,999121. Li Bo et al (2007) validaram uma faixa
linear de 0,20 a 10,0 g/L para alimentos.
importante ressaltar a grande variedade de unidades utilizadas para
verificao da linearidade. Tal variao proveniente da sensibilidade do
equipamento, do tipo de anlise (direta ou com derivatizante), da massa de amostra
67

extrada e do mtodo de extrao utilizado, sendo que o mais til seria informar a
linearidade em mg/kg, unidade esta utilizada nos limites determinados pela ANVISA.
Apenas Granby, Johannesen e Vahl (2003) informam claramente a correspondncia
entre os valores da curva quanto comparados aos limites obtidos. Nos outros, deve-
se observar os fatores de diluio da amostra para fazer essa correspondncia.
Martins-Jnior (2005) utiliza 1000 como fator de diluio da amostra. No presente
trabalho, o fator obtido foi 200. Deve-se observar tambm que a grande maioria dos
trabalhos utiliza apenas o coeficiente de determinao (R2) para verificar a
linearidade da curva, sendo que um valor prximo de um no necessariamente
resultado de uma relao linear.

4.8.3 Seletividade e Efeito de matriz

A cromatografia clssica tem como um dos parmetros principais a separao


dos analitos de interesse por tempo de reteno. Tal parmetro no tem tanta
significncia quando se trata de espectrometria de massas sequencial ou
triploquadrupolar, j que os agrotxicos, neste caso, so detectados e quantificados
baseados nas transies caractersticas de cada um e na proporo entre as
transies. De acordo com o documento SANCO, so necessrias apenas duas
transies de m/z para autoconfirmao do resultado (EC, 2011).
As Figuras 13 e 14 referem-se s amostras brancas (sem presena de
agrotxicos) e mostram o perfil de cada matriz. O cromatograma do branco de soja
indica um possvel interferente do AMPA. Na transio de quantificao foi
detectado um pico com TR bem prximo ao do padro, mas quando foi analisada a
proporo entre as transies, verificou-se que se encontram fora dos parmetros
de aceitabilidade estipulados de tolerncia mxima da relao entre os ons de
20% (EC, 2011).
As Figuras 15 e 16 mostram que apesar dos analitos de interesse
apresentam tempos de reteno (TR) muito prximos (AMPA: TR 0,509 minutos e
Glifosato: TR: 0,516 minutos), cada um apresenta pelo menos duas transies
caractersticas de cada composto, sendo que nesse estudo, cada um foi analisado
68

em uma polaridade diferente (AMPA: ionizao negativa; Glifosato: ionizao


positiva). Desse modo, o mtodo foi capaz de identificar e quantificar isoladamente
os compostos pesquisados.
Foram feitos testes utilizado colunas C8 e C18. Como os analitos no
apresentaram reteno em nenhuma delas optou-se por utilizar uma C18
objetivando-se maior reteno dos interferentes.

Figura 13 - Cromatogramas mostrando branco de soja. (A) Transio de quantificao do


AMPA; (B) Relao entre as transies de Quantificao e Qualificao do AMPA; (C) on pai
com os dois ons filhos para o AMPA; (D) Transio de quantificao do Glifosato; (E) Relao
entre as transies de Quantificao e Qualificao do Glifosato; (F) on pai com os dois ons
filhos para o Glifosato.

Figura 14 - Cromatogramas mostrando branco de milho. (A) Transio de quantificao do


AMPA; (B) Relao entre as transies de Quantificao e Qualificao do AMPA; (C) on pai
com os dois ons filhos para o AMPA; (D) Transio de quantificao do Glifosato; (E) Relao
entre as transies de Quantificao e Qualificao do Glifosato; (F) on pai com os dois ons
filhos para o Glifosato.
69

Figura 15 Cromatogramas de soluo padro de glifosato na concentrao de 1,0 mg/kg e


soluo padro de AMPA na concentrao de 20,0 mg/kg em soja. (A) Transio de
quantificao do AMPA; (B) Relao entre as transies de Quantificao e Qualificao do
AMPA; (C) on pai com os dois ons filhos para o AMPA; (D) Transio de quantificao do
Glifosato; (E) Relao entre as transies de Quantificao e Qualificao do Glifosato; (F) on
pai com os dois ons filhos para o Glifosato.

Figura 16 Cromatogramas de soluo padro de glifosato na concentrao de 0,50 mg/kg e


soluo padro de AMPA na concentrao de 10,0 mg/kg em milho. (A) Transio de
quantificao do AMPA; (B) Relao entre as transies de Quantificao e Qualificao do
AMPA; (C) on pai com os dois ons filhos para o AMPA; (D) Transio de quantificao do
Glifosato; (E) Relao entre as transies de Quantificao e Qualificao do Glifosato; (F) on
pai com os dois ons filhos para o Glifosato.
70

Figura 17 - Supresso de sinal da soja e milho.

Na Figura 17 est exemplificado um dos testes de supresso de sinal por


mtodo de infuso ps-coluna, onde uma amostra de um branco da matriz injetada
ao mesmo tempo em que adicionado um fluxo de infuso de um padro
concentrado do analito, analisa-se as possveis perturbaes que podem ocorrer na
linha de base gerada pelo sinal do analito sob fluxo de infuso constante.
O sinal em linha vermelha o padro sem matriz, em azul o padro com
infuso de extrato branco de milho, em marrom, o sinal do padro infundido com
branco de soja. Percebe-se claramente como h uma supresso de sinal quando h
competio da matriz pela ionizao dos compostos, devido ao menos sinal do
padro, quando infundido com a matriz. Tal exemplo pode ser melhor visualizado
com a comparao das curvas (Figuras 18 e 19):

Efeito de matriz - Glifosato


7000
6000
5000
4000
rea

3000
2000
1000
0
0,0000 0,0100 0,0200 0,0300 0,0400 0,0500 0,0600 0,0700
Concentrao (ng/L)

Curva Matriz Milho Curva Matriz Soja Curva em solvente

Figura 18 Efeito de matriz para glifosato em soja e milho.


71

Efeito de matriz - AMPA


4000
3500
3000
2500
rea

2000
1500
1000
500
0
0,0000 0,2000 0,4000 0,6000 0,8000 1,0000 1,2000 1,4000
Concentrao (ng/L)

Curva Matriz Milho Curva Matriz Soja Curva em solvente

Figura 19 Efeito de matriz para AMPA em soja e milho.

Para esse tipo de verificao do efeito de matriz, foram realizadas anlises no


mesmo dia e com concentraes idnticas, trs curvas, uma em solvente, uma em
milho e outra em soja. Quanto mais complexa a matriz, maior ser seu efeito. Neste
caso claramente observada a supresso do sinal (diminuio da rea), quando se
compara padres de mesma concentrao.
De acordo com o trabalho de Martins-Jnior (2005), somente no houve efeito
de matriz, quando utilizou uma diluio da amostra maior que 1000 vezes. Algumas
vantagens de trabalhar sem efeitos de matriz a utilizao das solues padro de
uso em solvente para curva de calibrao, diminuindo gastos com obteno e
preparo de amostras sem presena de agrotxico, menos gastos com manuteno
do aparelho devido a problemas de interferentes gerados pela matriz e anlise de
matrizes variadas utilizando a mesma curva de quantificao. Mas como
desvantagens, a diluio excessiva da amostra aumenta a incerteza e diminui a
sensibilidade do mtodo.
Os testes iniciais do presente estudo foram realizados em um aparelho da
APPLIED API 4000 ION TRAP, utilizando-se uma coluna C8, obtendo-se uma
sensibilidade capaz de utilizar uma diluio da amostra de at 2000 mas, devido s
questes relacionadas rotina dos laboratrios envolvidos, optou-se por trabalhar
com uma coluna C18, em um aparelho da Agilent, com uma diluio menor para
atingir o LQ de 1 mg/kg, utilizando, para isso, curva em matriz para correo do
efeito de matriz presente.
72

Kruve et al. (2011) estudaram o efeito de matriz na anlise de glifosato em


cereais (trigo e centeio) tambm utilizando ionizao por eletrospray e deteco por
LC/ES-MS/MS. De acordo com esses pesquisadores, o efeito de matriz (no caso, a
supresso de sinal) dependente do tamanho da partcula do cereal utilizada para a
extrao, sendo que quanto menor a partcula, maior ser a supresso de sinal.
Tambm encontraram que a supresso dependente da matriz, sendo que o
centeio tem maior supresso quando comparado ao trigo, mesmo considerando que
sejam matrizes com caractersticas parecidas.
As Figuras 20 e 21 exemplificam o efeito matriz relacionado ao fator de
diluio da amostra vinculado ao processo de extrao, enfatizando sua importncia.
Quanto maior a quantidade de amostra no extrato final de injeo, menor o fator
utilizado e maior ser o efeito matriz resultante dela, ou seja, menor ser a rea.
Amostras mais diludas apresentam menor efeito matriz, aproximando-se da
inclinao da curva em solvente.

Efeito de Matriz relacionado ao fator de


diluio da amostra - Glifosato
6000

5000

4000
rea

3000

2000

1000

0
0,0000 0,0100 0,0200 0,0300 0,0400 0,0500 0,0600 0,0700
Concentrao (ng/L)

Curva em Solvente Curva Milho Fator 200 Curva Milho Fator 20

Figura 20 Efeito de matriz relacionado ao fator de diluio da amostra- Glifosato em milho.


73

Efeito de Matriz relacionado ao fator de


diluio da amostra - AMPA
4000

3500

3000

2500
rea

2000

1500

1000

500

0
0,0000 0,2000 0,4000 0,6000 0,8000 1,0000 1,2000 1,4000
Concentrao (ng/L)

Curva em Solvente Curva Milho Fator 200 Curva Milho Fator 20

Figura 21 Efeito de matriz relacionado ao fator de diluio da amostra- AMPA em milho.

4.8.4 Exatido

Os resultados de recuperao obtidos para Glifosato e AMPA nas duas


matrizes estudadas foram analisados quanto presena de valores dispersos pelo
teste de Grubbs, tendo sido retirado um valor no nvel 20,0 mg/kg para AMPA em
milho, um valor no nvel 0,50 mg/kg para glifosato em milho e um no nvel 10,0
mg/kg para glifosato em soja (Tabelas 12 e 13). Observa-se que os valores obtidos
esto dentro dos parmetros estabelecidos para exatido, estando todas as mdias
de recuperao, para cada nvel testado, dentro da faixa de 70 a 120%. Sendo
invivel testar todos os nveis da curva, foram escolhidos os dois pontos mais
baixos, principalmente para a escolha do limite de quantificao e o ponto mais alto
da curva obtida aps testes de linearidade.
74

4.8.5 Preciso

Exceto para o nvel de 0,50 mg/kg de glifosato em milho, os resultados de


recuperao obtidos apresentaram distribuio normal (p > 0,10) e
homoscedasticidade (p > 0,05), permitindo a estimativa de desvios padro relativos
de repetitividade e de reprodutibilidade parcial por anlise de varincia sem
ponderao (Tabelas 12 e 13).

Tabela 12-Concentraes das recuperaes, mdias de recuperao, desvios padro


relativos sob condies de repetitividade e de reprodutibilidade parcial para matriz Milho

Concentrao DPRr DPRR


Analito MR(%) ANOVA
(mg/kg) (%) (%)

0,50 106,8 p>0,05* 10,39 13,27


Glifosato 1,00 102,9 P<0,05 7,19 10,41
10,00 104,0 p<0,001 5,44 5,44
20,0 117,4 p>0,05* 14,25 15,66
AMPA 40,0 117,7 p<0,01 8,46 17,75
200,0 117,0 p<0,001 5,80 15,07
MR= mdia de recuperao; DPRr = desvio padro relativo sob condies de repetitividade; DPR R =
desvio padro relativo sob condies de reprodutibilidade parcial.
* a distribuio da varivel no segue a normal, no permitindo o emprego de ANOVA para estimativa
da preciso

Tabela 13 - Concentraes das recuperaes, mdias de recuperao, desvios padro


relativos sob condies de repetitividade e de reprodutibilidade parcial para matriz Soja

Concentrao DPRr DPRR


Analito MR(%) ANOVA
(mg/kg) (%) (%)

1,00 105,1 p<0,001 7,76 30,52


Glifosato 2,00 96,0 p<0,001 4,85 12,47
10,00 86,5 p>0,05* 5,44 5,44
20,0 85,4 p<0,001 27,98 79,70
AMPA 40,0 88,9 p<0,01 16,66 35,13
200,0 114,2 p>0,05* 10,84 11,52
MR= mdia de recuperao; DPRr = desvio padro relativo sob condies de repetitividade; DPR R =
desvio padro relativo sob condies de reprodutibilidade parcial.
* a distribuio da varivel no segue a normal, no permitindo o emprego de ANOVA para estimativa
da preciso
75

A Tabela 12 resume os testes para anlise de milho e mostra que os valores


das MR esto dentro da faixa estabelecida para a exatido. Apesar de todos os
valores tambm estarem dentro do valor estabelecido ( 20% para preciso como
repetitividade e reprodutibilidade), nos pontos mais baixos testados para glifosato e
AMPA, a distribuio da varivel observada no seguiu a normalidade, o que no
permitiria o emprego de ANOVA para estimativa da preciso. Dessa forma, esses
nveis no foram considerados para anlise posterior do limite de quantificao.
A Tabela 13 apresenta os resumos das anlises de soja e mostra que os
valores de todas as MR esto dentro da faixa estabelecida para a exatido. Na
anlise de preciso, o ponto mais baixo testado para o glifosato apresentou uma
variao em reprodutibilidade maior que a aceita, sendo que na anlise do AMPA
isso foi observado nos dois nveis mais baixo testados. Dessa forma, esses nveis
no foram considerados para anlise posterior do limite de quantificao. Alm
disso, a distribuio da varivel observada em ambos os agrotxicos no nvel mais
alto testado para cada um no seguiu a normalidade, o que no permitiria emprego
de ANOVA para estimativa da preciso.

4.8.6 Limite de Quantificao e Limite de Deteco

O LQ foi estabelecido como a menor concentrao estudada com valores


mdios de recuperao obtidos para as replicatas de amostras adicionadas na faixa
de 70 a 120% e desvio padro relativo de repetitividade (DPRr) 20%, para o
composto pesquisado (SOUZA, 2007; EC, 2011).
No foi considerado nenhum valor de LQ para o AMPA em soja, uma vez que
nenhum dos testes realizados para os valores mais baixos da curva passou na
avaliao estatstica aceita e definida para o trabalho e novos testes com valores
mais altos perderiam seu valor em anlise de resduos de agrotxicos, ou seja, uma
anlise de resduos. Tais dados foram confirmados considerando a alta incerteza
calculada para anlise de AMPA em soja, nos pontos mais baixos da curva (Tabelas
14 e 15). Mesmo o valor de LQ obtido para o AMPA em milho considerado um
valor alto, observando que a legislao brasileira no estipula limites para resduos
76

de AMPA em alimentos e o LMR para glifosato (produto que pode originar o AMPA)
em milho e soja de 1,0 e 10,0 mg/kg, respectivamente. Dessa forma, devido aos
baixos valores estabelecidos pela legislao brasileira, novos testes devero ser
realizados para aumentar a sensibilidade do mtodo de modo a quantificar e
detectar nveis reduzidos de resduos.
O LD para o glifosato foi estabelecido como o primeiro ponto da curva logo
abaixo do valor do LQ e para o APMA, como a menor concentrao do analito
detectada em amostras adicionadas e distinguida de zero (sinal/rudo 3).

Tabela 14 - Limites de deteco e quantificao de Glifosato e AMPA para Soja e Milho.


LD (mg/kg) LQ (mg/kg)
Soja Milho Soja Milho
Glifosato 1,0 0,5 2,0 1,0
AMPA 40,0 20,0 NE 40,0
NE: No estabelecido

Nos principais estudos da literatura, os limites de glifosato e AMPA foram


muito prximos, mas no presente trabalho, a sensibilidade do AMPA cerca de 200
vezes menor quando comparada ao glifosato. Apesar de ambos os padres serem
do mesmo fornecedor e estarem dentro da data de validade, a nica explicao
plausvel seria a m qualidade do padro de AMPA. Para o uso inicial dos padres
analticos foram feitas duas solues estoques de cada analito e estas foram
comparadas entre si, de modo a evitar qualquer erro proveniente do preparo desta
soluo.
Abakerli e Fay (2003) obtiveram um LQ 0,08 mg/kg de glifosato e 0,8 mg/kg
de AMPA em milho e 0,2 mg/kg de ambos em soja. No caso da anlise de milho,
percebe-se tambm uma grande diferena de resposta entre o glifosato e AMPA,
apesar de no ser to grade quanto encontrada no presente trabalho. Mesmo
assim, observa-se pelo limite mais baixo, que a matriz milho uma matriz menos
complexa quanto comparada soja. Martins-Jnior (2005) obteve valores de LQ em
soja bem prximos para glifosato (0,30 mg/kg) e AMPA (0,34 mg/kg). Tais valores
tambm se aproximam do LQ para soja determinado por Abakerli e Fay (2003).
De acordo com Chen et al. (2012) para anlise de vegetais, o LQ para o
glifosato e AMPA foi de 5 g/kg e 50 g/kg respectivamente, com LD de 1,2g/kg
77

para glifosato e 15,0 g/kg para AMPA. Neste caso a sensibilidade conseguida foi
muito alta, obtendo-se com isso valores muito baixos de LQ. Mas tambm se
observa uma diferena de sensibilidade entre glifosato e AMPA quando observamos
o LD obtido. Hogendoorn et al. (1999) obteve um LQ de 0,5 mg/kg de glifosato para
cereais e Li Bo et al (2007) 0,05mg/kg em alimentos em geral.
Andersen, Bille e Granby (2007) fizeram um estudo de comparao entre seis
laboratrios para determinao de glifosato (dentre outros) em trigo. Os LQ dos
laboratrios variaram de 0,01 mg/kg a 0,15 mg/kg com porcentagem de recuperao
variando de 29 a 109%. Tal variao tambm foi observada nos resultados obtidos
pelos laboratrios participantes do estudo, indicando necessidade de otimizao dos
mtodos de anlise utilizados.

4.8.7 Incerteza da medio

Visando a ampliao do escopo de acreditao do LRP/Funed frente ao


INMETRO, todas as anlises utilizaram reagentes com certificado de pureza,
vidrarias, pipetas e balanas com certificado de calibrao, padres rastreveis e
quaisquer outras exigncias do INMETRO para acreditao do mtodo validado,
levando-se em considerao a rastreabilidade e valores de incerteza de cada
equipamento ou instrumento.
A estimativa da incerteza de medio levou em considerao as contribuies
de parmetros da validao e da metodologia com exatido, preciso, valores de
pipetagem, diluies e preparo da curva. Os valores das incertezas expandidas para
cada um dos pontos calculados esto descritos na Tabela 15.
78

Tabela 15 Valores de incertezas expandidas relativas de Glifosato e AMPA.

Analito Matriz Nvel Incerteza


expandida relativa
Glifosato Milho 1 mg/kg 22%
Glifosato Milho 10 mg/kg 24%
Glifosato Soja 1 mg/kg 31%
Glifosato Soja 10 mg/kg 27%
AMPA Milho 20 mg/kg 24%
AMPA Milho 40 mg/kg 26%
AMPA Soja 20 mg/kg 93%
AMPA Soja 40 mg/kg 59%

Baseado em testes de proficincia, a Unio Europeia utiliza como referncia


uma incerteza expandida de 50% (que corresponde a um nvel de confiabilidade de
95% com um fator de abrangncia de 2), sendo seu uso recomendado para tomada
de deciso das autoridades regulatrias. Mas a permisso de utilizar tal valor nos
resultados tem como pr-requisito a determinao pelo laboratrio de sua prpria
incerteza expandida devendo esta ter um valor menor que 50% (EC, 2011).
Os valores de incerteza calculados para anlise de AMPA em soja foram
elevados quando comparados aos outros calculados, demonstrando que o mtodo
no atende requisitos para quantificao deste analito nas amostras testadas,
provavelmente por problemas do prprio padro utilizado. Sero necessrios novos
estudos com novo padro para validao do AMPA em milho e soja.
Como a natureza do mtodo de ensaio para resduos de agrotxicos impede
o clculo rigoroso da incerteza, neste trabalho foram identificados os possveis e
mais provveis componentes de incerteza de modo a fazer uma estimativa razovel,
sendo estes exemplificados nas Figuras, 22a, 22b, 23a e 23b.
79

Figura 22 - Peso de alguns componentes da incerteza associada anlise de glifosato em


milho e soja respectivamente.

Figura 23 - Peso de alguns componentes da incerteza associada anlise de AMPA em


milho e soja respectivamente.

Observa-se um elevado valor de incerteza relacionado ao preparo da curva


de glifosato possivelmente devido grande diluio utilizada na metodologia
somada s baixas concentraes obtidas na validao. J na anlise do AMPA, os
maiores valores de incerteza esto relacionados exatido e repetitividade do
mtodo utilizado, confirmados pelos altos valores de incerteza.

4.9 Anlise das Amostras de milho (fub)

A escolha das matrizes para a validao foi baseada no SANCO (EC, 2011),
optando-se por uma matriz do grupo de Alto Teor de leo (Gro de Soja) e uma do
grupo de Alto Teor de Amido e/ou Protena e Baixo Teor de gua e Gordura (Gro
80

de milho como fub). Aps a colcluso da validao do mtodo, foram feitas


anlises em amostras reais obtidas do comrcio. Apenas o milho foi escolhido para
esta anlise, por ser, alm de uma nova cultura do programa PARA, uma cultura
interessante para a realizao da anlise de glifosato e AMPA.
Foram analisadas 75 amostras de fub ou farinha de milho fina, de diversas
marcas do mercado, coletados pelas vigilncias sanitrias de cada Estado do Brasil,
seguindo os procedimentos do Programa PARA/ANVISA. A quantidade de amostra
coletada foi de 1 kg de diversas marcas.
As extraes, preparos dos padres, curva de calibrao em matriz, as
deteces e quantificaes foram baseadas no mtodo validado.
O glifosato no foi detectado em nenhuma das amostras analisadas. No
entanto, foram encontrados resduos de pirimifs metlico, bifentrina, cipermetrina,
lambda-cialotrina, esfenvarelato e clorpirifs metlico em 54,7% do fub, quando
realizada anlise de multirresduos pelo mesmo laboratrio, nas mesmas amostras.
Uma provvel explicao para o resultado negativo para glifosato nas
anlises realizadas deve-se a no resistncia ao glifosato das culturas de milho
utilizadas. Apesar da maioria (72%) apresentar o smbolo de transgnico na
embalagem, essa alterao gentica refere-se resistncia a insetos e no para o
glifosato, sendo assim, seu uso poderia comprometer a cultura. A alterao gentica
mais comum no caso do milho a introduo de genes da bactria Bacillus
thuringiensis, capaz de produzir incluses proteicas cristalinas, denominadas
protenas Cry, obtendo ao inseticida a determinados tipos de insetos como
lagartas de borboletas e mariposas, besouros e moscas (MONNERAT e BRAVO,
2000). Vale ressaltar que apesar da modificao gentica para resistncia a insetos,
todos os resduos encontrados em anlise de multirresduos foram de inseticidas
(organofosforados e piretrides).
GRAMBY et al. (2003) pesquisaram glifosato anualmente em
aproximadamente 50 amostras de cereais (cevada, aveia, centeio e trigo) durante os
anos de 1998 a 2001 na Dinamarca. Os maiores valores foram encontrados em
farelo de trigo (1,62 mg/kg) e cevada (1,25 mg/kg). Aps uma proibio do uso de
glifosato nos gros usados para produo de po, no ano de 2001 no foi
encontrado resduos de glifosato em amostras de trigo ou centeio com exceo de
uma amostra de trigo em gro importado.
81

Dados recentemente publicados pelo MAPA, compreendendo um nmero


restrito de amostras, relacionados ao monitoramento do Programa Nacional de
Controle de Resduos e Contaminantes (PNCRC) referentes safra 2010/2011 para
glifosato mostram que em 2011, foram analisadas 26 amostras de milho e 25 de
soja, com deteco de apenas uma no conformidade para milho e 8 para soja,
sendo que em nenhum caso a no conformidade foi devido a resduos de glifosato
(BRASIL. MAPA, 2009; BRASIL. MAPA, 2011).
82

5 AVALIAO DE PARMETROS HEMATOLGICOS E BIOQUMICOS DE


TRABALHADORES RUAIS EXPOSTOS A AGROTXICOS

5.1 Avaliao da Exposio Ocupacional a Agrotxicos

A monitorizao da exposio a agrotxicos consiste em uma rotina de


avaliao peridica e sistemtica com a finalidade de detectar os possveis riscos
sade, antes que uma doena (intoxicao) se instale. A exposio pode ser
avaliada pela medida da concentrao do agente qumico em amostras ambientais,
como o ar (monitorizao ambiental), ou pela determinao de parmetros
biolgicos (monitorizao biolgica) (AMORIM, 2003).
O conceito de monitorizao biolgica pode ser estendido para incluir tambm
a deteco precoce de efeitos no adversos e reversveis, cujos parmetros so
denominados como biomarcadores. A monitorizao biolgica da exposio aos
agentes qumicos propriamente ditos significa a medida da substncia ou seus
metablitos (biomarcadores) em vrios meios biolgicos de modo a avaliar a
intensidade da exposio e o risco sade, devendo existir uma correlao com a
intensidade da exposio e/ou com o efeito biolgico da substncia (AMORIM,
2003).
Pesquisas relacionadas monitorizao biolgica da exposio atravs da
medio do agrotxico ou dos seus metabolitos em matrizes biolgicas fornecem
uma medida quantitativa da dose interna, apesar de serem pouco usuais como
monitorizao por demandarem exames caros e pouco disponveis principalmente
quando se trata de sade pblica, devido ao alto custo dos equipamentos e
reagentes, alm da necessidade de pessoal treinado (BAKER et al., 2000). Dentre
os biomarcadores de efeito relacionados exposio a agrotxicos, regulamentado
pelo Ministrio do Trabalho destaca-se a utilizao da atividade das colinesterases
sanguneas, com ndice Biolgico Mximo Permitido (IBMP) uma inibio da
atividade da AChE, plasmtica ou eritrocitria, em 50% (OGA, 2003). Infelizmente
esse biomarcador abrange somente as classes dos anticolinestersicos
(organofosforados e carbamatos), sendo que para as demais classes de agrotxicos
83

(como piretrides, benzimidazis, ditiocarbamatos, dentre muitas outras) ainda no


foram estabelecidos indicadores biolgicos de exposio que sejam tcnica e
economicamente factveis e que proporcionam boa correlao entre a exposio
externa, a dose interna e os efeitos nocivos.
O monitoramento biolgico de exposio a agrotxicos, em geral, envolve a
amostras de urina, sendo determinado o composto alvo ou um dos seus metabolitos
conhecidos em seres humanos. A cintica da excreo humana do composto deve
ser conhecida, e quando isso no possvel, pode-se considerar dados
provenientes de animais, sendo importante conhecer a frao da dose administrada
que ser excretada na urina na forma do composto ou seu metablito (APREA,
2012).
Schummer et al. (2012) pesquisaram 50 agrotxicos em amostras de cabelo
de trabalhadores rurais, que forneceram as amostras durante o perodo de aplicao
de agrotxicos, e o mtodo desenvolvido por esses pesquisadores foi sensvel para
monitorar tanto intoxicao ocupacional quanto ambiental.
Curwin et al. (2006) estudaram a exposio a agrotxicos em famlias rurais e
urbanas atravs da pesquisa dos agrotxicos e seu metablitos na urina. Dentre os
agrotxicos pesquisados, o nvel de glifosato detectado foi similar entre os dois
grupos provavelmente por ser usado por ambos. Um estudo alemo testou a
contaminao glifosato em uma populao urbana, encontrado contaminao
significativa em todas as amostras de urina com nveis 5 a 20 vezes acima do limite
legal para a gua potvel (BRNDLI e REINACHER, 2012)
Acquavella et al. (2004) tambm fizeram o biomonitoramento do glifosato em
trabalhadores rurais e suas famlias. Eles pesquisaram o herbicida na urina, tendo
como referncia que o glifosato, aps absorvido, eliminado na forma inalterada por
via renal. No dia seguinte aps a aplicao, foi detectado glifosato em 6% dos
fazendeiros com concentraes variando de 3 a 233 ppb, em 4% das esposas, com
valores mximos de 3 ppb e 12% dos filhos, com concentrao mxima de 29 ppb.
Tal estudo indicou a necessidade de se minimizar a exposio a agrotxicos.
Yoshioka et al. (2011) desenvolveram um mtodo para determinar
simultaneamente herbicidas e seus maiores metablitos (dentre eles glifosato e
AMPA) em soro humano principalmente voltado para casos de ingesto voluntria,
mas que tambm poderia ser usado como biomonitorizao de exposio.
84

Sintomas no especficos presentes em diversas patologias como dor de


cabea, vertigens e dificuldade para dormir freqentemente so as nicas
manifestaes de intoxicao por agrotxicos, razo pela qual raramente se
estabelece esta suspeita diagnstica (YONAMINE, 2005). As caractersticas clnicas
das intoxicaes por agrotxicos no refletem uma relao simples entre o produto e
a pessoa exposta. Fatores relacionados s caractersticas toxicolgicas do produto,
fatores relativos ao indivduo e as condies de exposio participam de sua
determinao. A monitorizao da exposio um procedimento que consiste em
uma rotina de avaliao e interpretao de parmetros biolgicos de modo a
detectar os possveis riscos sade. Assim, sobretudo nos casos crnicos, o
diagnstico da intoxicao por agrotxicos, quando feito, normalmente
determinado pelo conjunto do histrico e quadro clnico do paciente, exames
bioqumicos e hematolgicos (AMORIM, 2003; LONDRES, 2011 RODRIGUES,
2011).

5.2 Parmetros hematolgicos, plaquetrios e bioqumicos

Embora os efeitos txicos agudos sejam facilmente reconhecidos, os efeitos


resultantes da exposio a longo prazo, a doses baixas, so muitas vezes difceis de
serem reconhecidos em seu estgio inicial. Dessa forma, a determinao da
toxicidade crnica por anlises laboratorias muito mais difcil quando comparada
toxicidade aguda (ASTIZ et al., 2011). A exposio a nveis reduzidos de agrotxicos
produz uma variedade de alteraes bioqumicas, sendo que alguns desses efeitos
incluem induo ou ativao enzimtica. Tais alteraes bioqumicas podem ser
detectadas antes do efeito adverso ocorra (BANERJEE et al., 1999).
O sangue o fluido corporal mais frequentemente utilizado para fins
analticos. O hemograma avalia os elementos celulares do sangue sendo um dos
exames mais solicitado na clnica mdica. Constitui importante exame de auxlio
diagnstico para doenas hematolgicas e sistmicas (LIMA, 2001).
O fgado, alm da grande importncia para manuteno do metabolismo,
tambm o rgo responsvel pela desintoxicao e excreo da maioria dos
85

compostos endgenos e exgenos, sendo o local de biotransformao, diminuindo a


toxicidade de compostos exgenos. Esta atividade pode resultar em
hepatotoxicidade, levando em aumento srico de muitos biomarcadores,
principalmente enzimas hepticas. As transaminases hepticas so enzimas
responsveis pelo catabolismo de biossntese de aminocidos, sendo consideradas
indicadores especficos de leso heptica. A alanina aminotrasferase (ALT) uma
enzima citoslica responsvel por auxiliar no metabolismo de protenas. A aspartato
aminotrasferase (AST) uma enzima mitocondrial, predominantemente encontrada
no fgado, msculo esqueltico e rins. Danos hepticos esto associados com
necrose celular e aumento da peroxidao lipdica tissular, sendo que ALT mais
especfica para danos hepticos quando comparada AST. A gama glutamil
transferase (GGT) encontra-se ligada membrana plasmtica de clulas com alta
capacidade excretora ou absortiva, como hepatcitos ou tbulos renais proximais.
Dessa forma, tais enzimas podem ser usadas como biomarcadores de leses
hepticas provenientes do efeito da exposio prolongada a mltiplos agrotxicos
(PRIYANKA, PRIYANKA, PRADEEP, 2012; PALIWAL, GURJAR, SHARMA, 2009;
SHAMSUDIN e YAP, 2011).
Os rins so crticos para a eliminao de produtos de degradao que so
ingeridos ou produzidos pelo metabolismo incluindo as substncias txicas que
devem ser retiradas do organismo. A alterao da funo renal frequentemente
resulta da toxicidade tanto de medicamentos quanto de outras substncias como os
agrotxicos (HENRY, 2008).
A ureia o principal metablito nitrogenado derivado da degradao de
protenas pelo organismo, sendo 90% excretados pelos rins. A determinao
conjunta de ureia e a creatinina de grande utilidade clnica. A razo
ureia/creatinina sricas pode indicar estados patolgicos diferentes. A anlise dessa
razo elevada pode ser feita de forma dicotomizada com a creatinina dentro do valor
de referncia, indicando processos que levam a diminuio do fluxo sanguneo
renal, aumento na ingesto protica, ou sangramento gastrintestinal. Por outro lado,
quando a creatinina est acima do valor normal, sugere processos obstrutivos ps-
renais, como tumores ou estenose de vias urinrias (SODR, COSTA e LIMA 2007).
A creatinina um produto residual da creatina, e sua produo depende da
massa muscular, no apresentando grandes variaes dirias em um mesmo
indivduo. A creatinina filtrada livremente no glomrulo e ao contrrio da ureia,
86

ativamente secretada em uma pequena parcela. Esta quantidade secretada


diariamente no constante e depende do indivduo e da concentrao plasmtica
dessa, dificultando a determinao de uma constante de secreo. Apesar de
superestimar a taxa de filtrao glomerular (TFG) e depender da massa muscular, o
clearance de creatinina continua sendo um dos marcadores mais usados na
avaliao da funo renal (SODR, COSTA e LIMA 2007). Devido a essa
constncia na taxa de formao e excreo da creatinina, tanto seus nveis
plasmticos quanto urinrios tm sido utilizados como marcadores de funo renal.
No entanto, sua avaliao isolada consitui um parmetro pouco sensvel e pode
ocorrer comprometimento de at 50% da funo renal sem que sejam detectadas
alteraes em sua concentrao (HENRY, 2008).
Cumpre ressaltar que, apesar dos avanos cientficos, h limites tcnicos
para as avaliaes toxicolgicas e ambientais que implicam em diversos graus de
incertezas e insuficincia de informaes, que no permitem uma anlise de risco
perfeitamente conclusiva. Alm disso, diferenas individuais ou nas condies de
exposio, ocupacional e ambiental, tambm podem alterar o risco de intoxicao
(FARIA, FASSA e FACCHINI, 2007).

5.2 Materiais e Mtodos

O presente estudo foi previamente aprovado, sob o ponto de vista tico e


formal, pelo Comit de tica em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais
(CAAE-0573.0.203.000-11) em 30 de novembro de 2011 (Anexo 1).
Os objetivos da pesquisa foram esclarecidos pelos pesquisadores a todos os
participantes, utilizando-se linguagem clara e accessvel e a assinatura do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) foi obtida em todos os casos (Anexo 2).
Foi tambm feita uma entrevista, e utilizando um formulrio prprio (Anexo 3) foram
coletados dados pessoais, de anamnese e de exposio ocupacional, importantes
para anlise dos resultados. Uma palestra foi ministrada antes da abordagem dos
voluntrios, explicando os efeitos dos agrotxicos sade, riscos de seu uso,
utilizao de equipamentos de proteo individual (EPIs), dentre outros assuntos.
87

5.3 Casustica

Este estudo tem carter exploratrio e visou o levantamento da caracterstica


populacional e epidemiolgica do trabalhador rural da agricultura familiar,
caracterizando tambm a exposio desses trabalhadores quanto utilizao de
EPIs, preocupao com a toxicidade das substncias, tempo de exposio, tipo de
substncias utilizadas, preocupao com a toxicidade dos produtos, dentre outras
perguntas. Por fim, foi feito uma avaliao superficial de alguns parmetros
hematolgicos e bioqumicos dos trabalhadores envolvidos no estudo.
A mobilizao dos voluntrios foi feita por representantes da Associao dos
Produtores da Agricultura Familiar de Divinpolis (APRAFAD) e do Sindicato dos
Trabalhadores Rurais de Divinpolis nas comunidades rurais de Lopes e Passagem
(regies ao norte e ao sul da cidade respectivamente).
O grupo de estudos foi composto por 49 trabalhadores rurais expostos
ocupacionalmente a agrotxicos, integrantes da APRAFAD, Minas Gerais. Foi
considerado como exposio ocupacional o manuseio para preparo da soluo a ser
aplicada nas plantaes, assim como a aplicao propriamente dita. Nem todos os
trabalhadores responderam ao questionrio ou tiveram o sangue analisado, podendo
variar o nmero amostral em cada etapa do estudo.
O municpio de Divinpolis, cidade polo do Centro-Oeste mineiro, tem uma
rea de 716 km e est entre os dez principais municpios do estado, sendo a 5
cidade com melhor IDH (ndice de Desenvolvimento Humano) de Minas Gerais. De
acordo com dados do ltimo censo do IBGE, em 2010, apresentava uma populao
total de 213.076 habitantes, sendo apenas 5.503 (2,58%) na zona rural
(PREFEITURA DE DIVINPOLIS, 2012).
Atualmente, a agricultura familiar gera mais de 80% da ocupao no setor
rural e responde no Brasil por sete de cada dez empregos no campo e por cerca de
40% da produo agrcola, fornecendo a maior parte dos alimentos que abastecem
a mesa dos brasileiros. Em 2009, cerca de 60% dos alimentos que compuseram a
cesta alimentar distribuda pela CONAB originaram-se da Agricultura Familiar
(CONAB, 2013).
A APRAFAD uma associao de produtores da agricultura familiar fundada
em maio de 2007 no municpio de Divinpolis/MG visando integrar todos os
88

produtores rurais que tem a agricultura familiar como fonte de subsistncia,


aumentando a produo agrcola do municpio. Atualmente, no municpio, mais de
40% dos gneros alimentcios da alimentao escolar proveniente da agricultura
familiar, incentivada por programas do governo federal de aquisio de alimentos da
agricultura familiar como o Programa de Aquisio de Alimentos (PAA) e o Programa
Nacional de Alimentao Escolar (PNAE) (APRAFAD, 2012).

5.3.1 Critrios de incluso

Trabalhadores da agricultura familiar da cidade de Divinpolis/MG;


Trabalhadores expostos ocupacionalmente a agrotxicos;
Ambos os sexos;
Maiores de 18 anos;
Qualquer etnia.

5.3.2 Critrios de excluso

Menores de 18 anos
Portadores de anemias de carter hereditrio,
Portadores de neoplasias.
Uso de medicamentos que provocam hepato ou nefrotoxicidade

5.4 Anlise Estatstica

Os dados obtidos foram comparados faixa de referncia de cada exame e


metodologia, sendo determinados como porcentagens desses valores considerados
normais.
89

5.5 Amostra biolgica

As amostras foram coletadas nos dias 21 e 22 de maro de 2012. No dia 21,


a coleta de sangue de 27 voluntrios foi feita a partir das 19 horas, e os participantes
foram previamente orientados a fazer a ltima refeio at s 14 horas. No segundo
dia a coleta foi feita pela manh e os 22 voluntrios foram orientados a comparecer
ao local em jejum.
Foram coletados de cada participante do estudo, 10 mL de sangue, sendo 5
mL em EDTA e 5 mL sem anticoagulante, diretamente em tubos do sistema
Vacutainer (Becton Dickinson), devidamente identificados. Foram utilizados tubos e
agulhas descartveis. As amostras de sangue foram imediatamente centrifugadas, o
plasma e o soro foram transferidos para tubos eppendorfs que foram
acondicionados em caixas de isopor contendo gelo e posteriormente transportados
ao laboratrio de Hematologia Clnica da Faculdade de Farmcia da Universidade
Federal de Minas Gerais. Dois filmes sanguneos foram feitos em lminas de
microscopia imediatamente aps a coleta do sangue e transportado ao mesmo
laboratrio para colorao e exame microscpio.

5.6 Caractersticas da populao

As caractersticas da populao estudada foram investigadas por meio de


entrevista utilizando um formulrio prprio (Anexo 3 Ficha de coleta de dados). Os
tpicos foram abordados pelo entrevistador de modo claro e fcil entendimento,
sendo respondidos pelo agricultor e qualquer dvida sobre o questionamento era
solucionado rapidamente, com sinnimos compreendidos por estes participantes.
90

5.7 Caractersticas da exposio

As caractersticas da exposio do grupo estudado foram investigadas por


meio de perguntas contidas no formulrio utilizado na entrevista sobre a exposio
ocupacional e suas prticas de uso dos agrotxicos como quais produtos so mais
utilizados, ltima vez que manipularam as misturas e fizeram a aplicao, utilizao
de EPIs, dentre outras.

5.8 Metodologias para as determinaes dos parmetros hematolgicos e


bioqumicos

O hemograma e a contagem de plaquetas foram feitos utilizando o contador


automtico Coulter T-890. Os resultados encontrados foram comparados com os
valores de referncia (Carvalho e Silva, 1988).
As determinaes das atividades de AST e ALT (Analisa) e GGT (Labtest)
foram feitas pelo mtodo cintico-UV. A determinao de creatinina foi feita pelo
mtodo colorimtrico-ponto final (Analisa) e de ureia, pelo mtodo enzimtico
(Analisa). Para monitorar o desempenho dos mtodos analticos utilizados foram
empregadas amostras controle de diferentes concentraes (controlador).

5.9 Resultados e Discusso

5.9.1 Caractersticas da populao

As caractersticas da populao estudada foram obtidas a partir do


questionrio aplicado, sendo que trs trabalhadores (dos 49 participantes) no
91

responderam ao questionrio. No foi relatado por nenhum participante problemas


que os enquadrassem nos critrios de excluso, sendo ainda perguntado sobre
consumo regular de carnes e vegetais, retirada de bao e sintomas relacionados a
problemas de coagulao.
Todos os entrevistados participantes eram do sexo masculino, com faixa
etria mdia de 41,7 11,6 anos, tendo o participante mais novo, 20 anos e o mais
velho, 69 anos.
Em um estudo semelhante, desenvolvido por Arajo et al. (2007), no
municpio de Nova Friburgo/RJ, a mdia de idade dos participantes foi de 34,82
11,15, tendo sido includo seis adolescentes entre 13-18 anos (com a anuncia dos
respectivos responsveis) e 25% de mulheres. Em outro estudo envolvendo
trabalhadores rurais em dois municpios do Piau, todos os participantes foram do
sexo masculino e a faixa etria foi 34,3 13,1 anos (RODRIGUES, 2011).
No presente estudo, dos 45 trabalhadores que responderam ao questionrio,
15 (33,3%) trabalhadores estudaram apenas at o 4 ano primrio, 14 (31,1%)
trabalhadores terminaram o primeiro grau, um (2,3%) trabalhador parou os estudos
sem completar o segundo grau e 15 (33,3%) concluram o segundo grau. Desse
modo, mais de 64% dos trabalhadores estudaram somente at o primeiro grau ou
menos, indicando a baixa escolaridade dessa parcela da populao, como mostra a
Figura 24.

Escolaridade

11 anos 4 anos
33% 34%

5 a 8 anos
31%
9 a 10 anos
2%

Figura 24 Tempo de estudo dos trabalhadores rurais de Divinpolis pesquisados.


92

Dados semelhantes foram obtidos por Arajo et al. (2007) onde cerca de 76%
dos participantes tinha no mximo sete anos completos de estudo. Da mesma
forma, observa-se a baixa escolaridade dos agricultores no estudo de Leite e Torres
(2008) onde 85,7% dos participantes tinham sete anos de estudo ou menos,
incluindo alguns analfabetos. Outro estudo incluindo 300 agricultores de cinco
comunidades do distrito de Mag/RJ tambm revelou predomnio do nvel baixo de
escolaridade sendo encontrados 36% de analfabetos ou semi-analfabetizados e
35% com at seis anos de escolaridade (OLIVEIRA-SILVA et al., 2001). Em outro
estudo envolvendo trabalhadores rurais do estado do Rio de Janeiro, realizado em
1999, 80% dos entrevistados estudou at a 4 srie ou era analfabeto (CASTRO,
1999).
Os dados do presente estudo e os encontrados na literatura mostram o
predomino da baixa escolaridade entre os trabalhadores rurais.
Com relao ao tabagismo dentre os participantes do presente estudo,
apenas 3 (6,5%) eram fumantes e 3 (6,5%) eram ex-fumantes. Para o etilismo, 18
(39,1%) participantes informaram que no consomem bebidas alcolicas, 20 (43,5%)
informaram que consomem muito pouco (apenas nas festividades) e 8 (17,4)
consomem moderadamente (nos finais de semana e comemoraes). Estes dados
divergiram daqueles apresentados em outros estudos no Brasil. Arajo et al. (2007)
relataram que 60,8%, do grupo de agricultores estudados faziam uso constante de
etanol sendo 45,2% deles com consumo elevado. Rodrigues (2011) verificou que
41,7% dos entrevistados tinham o hbito de fumar e 73,3% consumiam bebidas
alcolicas regularmente.
O consumo de medicamentos de uso contnuo foi verificado entre 13 (28,3%)
participantes, sendo os mais comuns aqueles para controle de presso arterial. O
histrico de cncer na famlia foi informado por 45,7% dos participantes. No entanto,
cumpre destacar que no presente estudo havia muitos membros da mesma famlia
(pais e filhos, primos, tios).
Com relao forma de uso e aplicao de agrotxicos, noo dos possveis
riscos, utilizao de EPIs e aes aps a aplicao mais de 61% dos trabalhadores
informaram que utilizam EPI completo (Tabela 16). Quando o trabalhador informou
que utiliza como EPI equipamentos inadequados como blusa de manga comprida e
cala jeans, ou apenas luvas e botas, foi considerado como no uso de EPI.
93

Apesar do consenso que o agrotxico prejudicial sade, 20% dos


trabalhadores afirmaram no terem medo de utilizar tal produto. Quase 23% dos
entrevistados relataram que j sentiram mal logo aps a aplicao das misturas de
agrotxicos. Os sintomas de intoxicao mais comuns relatados foram ardncia nos
olhos, dor de cabea e tontura.

Tabela 16 Dados relacionados aplicao e uso das misturas de agrotxicos


No Sim n
Informao
n % n % Total
Utiliza receiturio agronmico 14 31,8% 30 68,2% 44
Treinamento de como utilizar agrotxico 15 34,1% 29 65,9% 44
L os rtulos das formulaes 9 20,5% 35 79,5% 44
Segue as informaes contidas no rtulo 11 25,0% 33 75,0% 44
Usa EPI 17 38,6% 27 61,4% 44
Troca de roupa logo aps a aplicao 4 9,1% 40 90,9% 44
Acredita que o agrotxico faz mal sade 0 0,0% 45 100,0% 45
Tem medo de usar o agrotxico 9 20,0% 36 80,0% 45
Sentiu mal logo aps aplicar agrotxico 34 77,3% 10 22,7% 44

O uso correto de EPIs fundamental. Oliveira-Silva et al. (2001) revelaram


que 70% dos entrevistados faziam uso de EPIs mas somente 63% recebe
assistncia tcnica especializada.
Os trabalhadores envolvidos neste estudo dispes das orientaes de um
engenheiro agrnomo e um tcnico da EMATER para auxili-los na correta
utilizao de agrotxicos como quantidade a ser usada, tempo de carncia,
agrotxicos recomendados para determinada praga em cultura especfica, utilizao
de EPIs, descarte de embalagens, dentre outras dvidas da rotina agrcola. A
grande maioria teve treinamento especfico e participa de reunies nas propriedades
onde suas demandas sobre agrotxicos podem ser solucionadas.
No entanto, o percentual elevado de trabalhadores que relataram ter sentido
mal aps a aplicao de agrotxicos (22,7%) sugere que nem sempre esses
trabalhadores colocam em prtica o conhecimento adquirido.
94

5.9.2 Caractersticas da exposio

Mais da metade (54,3%) dos trabalhadores entrevistados informou que faz


uso do glifosato na agricultura. Embora a agricultura familiar no seja grande
produtora de gros, culturas que normalmente tm permisso de uso para tal
substncia. O glifosato provavelmente tem sido utilizado pelos trabalhadores
envolvidos no presente estudo para fazer capina qumica e limpar o terreno para a
plantao de outras culturas.
Quando perguntados sobre a ltima vez que manipularam as misturas, 63%
dos entrevistados relataram que entraram em contato com agrotxicos em menos de
30 dias da pesquisa. Desses, 17 trabalhadores informaram que tinham utilizado
algum tipo de agrotxico a menos de uma semana e 12 que utilizaram a menos de
um ms (Figura 25). No estudo de Arajo et al. (2007) o uso contnuo de misturas
de formulaes proveniente do mito de que aplicar vrios produtos simultneos
leva a um risco menor de perda da safra, isso associado presso de vendedores
de agrotxicos que fora o uso intermitente dessas substncias.

ltimo contato com agrotxico

> 6 meses
< 1 semana 26%
37%
1 a 6 meses
1a4 11%
semanas
26%

Figura 25 Informao sobre a ltima vez que o trabalhador entrou em contato com algum
tipo de formulao de agrotxicos.

Em relao classificao toxicolgica do agrotxico, a grande maioria


pertence s classes III e IV, que so os menos txicos. Entretanto o uso de
95

agrotxicos mais txicos (classes I e II) ainda representativo (38%). Apesar de


mais da metade dos trabalhadores ter informado o uso do herbicida glifosato, a
classe mais utilizada por eles de inseticidas (43%), seguida pelos herbicidas (31%)
e fungicidas (26%), como mostram as Figuras 26 e 27 e a Tabela 17. Esse
resultado semelhante ao de Oliveira-Silva et al. (2001), que tambm encontrou
maior utilizao de inseticidas (71%), em relao aos herbicidas (22%) e fungicidas
(7%). Segundo esses autores, o maior uso de inseticidas explicado pelas espcies
mais cultivadas na regio pesquisada.

Figura 26 - Percentual dos agrotxicos utilizados pelos trabalhadores rurais de Divinpolis


segundo classe/modo de ao.

Classificao toxicolgica - ANVISA

IV I
13% 18%

II
20%
III
49%

Figura 27 - Classificao toxicolgica dos agrotxicos utilizados pelos trabalhadores rurais


de Divinpolis.
96

Tabela 17 Produtos formulados utilizados pelos trabalhadores rurais de Divinpolis


Classificao
Nome comercial Principio Ativo Grupo Qumico toxicolgica
IMA ANVISA
Prend 2,4-D cido ariloxialcanico I I
Abamectin Abamectina Avermectinas III I
Vertimec Abamectina Avermectinas III I
Mospilan Acetamiprido neonicotinide III III
Atrazina Atrazina Triazina III III
Azoxistrobina +
Amistar Estrobilurina + Triazol III I
Difenoconazole
Orthocide Captana Dicarboximida I I
Cartap Cartap Bis(tiocarbamato) II III
Pirate Clorfenapir Anlogo de Triazol III II
Daconil Clorotalonil Isoftalonitrila I III
Cuprogarb Cobre Inorgnico IV II
Decis Deltametrina Piretride IV III
Diuron Diuron Ureia III III
Advance Diuron + Hexazinona Uria + Triazinona III III
Velpa Diuron + Hexazinona Uria + Triazinona III III
Fortex Diuron + MSMA Organoarsnico III II
Sumidan Esfenvarelato Piretride I II
Safety Etofemprox ter Difenlico III IV
Danimen Fempropatrina Piretride I II
cido
Podium Fenoxaprop-p Etlico III II
ariloxifenoxipropinico
Roundap Glifosato Glicina Substituda IV IV
Confidor Imidaclorpido Neonicotinide IV III
Evidence Imidaclorpido Neonicotinide IV III
Rovral Iprodione Dicarboximida III IV
Provence Isoxaflutol Isoxazol I III
Karate L-cialotrina Piretride III III
Malathion Malation Organofosforado III III
Alquilenobis
Dithane Mancozebe I III
(ditiocarbamato)
Alquilenobis
Manzate Mancozebe III III
(ditiocarbamato)
Ridomil Metalaxil-M + Mancozebe Acilalaninato III II
Tamaron Metamidofs Organofosforado I I
Sencor Metribuzim Triazinona II III
Volcane MSMA Organoarsnico II II
Gramoxone Paraquat Bipiridlio I I
Sialex Procimidona Dicarboximida II IV
Folicur Tebuconazole Triazol III IV
Actara Tiametoxan Neonitocinide III III
Tiofanato Metlico + Benzimidazol (precursor) +
Cerconil I III
Clorotalonil Isoftalonitrila
Arrow Trifluralina Dinitroanilina I III
Triatox* Amitraz Bis(arilformamidina) --- ---
Piretride +
Colosso* Cipermetrina + Clorpirifs --- ---
Organofosforado
Avermectinas + Benzoilfenil
Contratack* Ivermectina + Fluazuron --- ---
ureia
*No so usados como agrotxicos, so usados para tratamento de parasita em gado.
Fonte: IMA, 2013; ANVISA, 2013b.
97

Tais resultados divergem dos dados da SINDAG (Tabela 18) quando se


observa que quase metade das vendas de agrotxicos como produto comercial so
herbicidas. Enfatizando que tal informao refere-se a toda comercializao de
agrotxicos do pais sendo o Brasil o maior produtor de soja e um dos maiores de
milho e outros gros sendo tais culturas aos grande consumidores de herbicidas.
Divergem tambm dos dados obtidos no estudo de RODRIGUES (2011), onde
81,1% dos produtos utilizados eram de herbicidas e 16,3% de inseticidas. Neste
caso, a grande utilizao de herbicidas foi relacionado s culturas da regio
pesquisada, dentre elas arroz de sequeiro, cana de acar e feijo. Mais de 70%
dos trabalhadores informara fazer uso de produtos a base de glifosato.

Tabela 18 Venda de agrotxicos por classe em 2011 no Brasil


PRODUTO INGREDIENTE VALOR - US$
CLASSES COMERCIAL (t) ATIVO (t) 1.000
TOTAL: 826.683 % 352.048 % 8.487.944 %
HERBICIDAS 403.620 48,8 188.745 53,6 2.743.000 32,3
FUNGICIDAS 174.194 21,1 63.858 18,1 2.315.188 27,3
INSETICIDAS 170.932 20,7 61.169 17,4 2.944.726 34,7
OUTRAS 77.937 9,4 38.276 10,9 485.030 5,7
Fonte: SINDAG, 2012.

5.9.3 Parmetros hematolgicos e bioqumicos

As mdias e desvios-padro dos parmetros do hemograma (contagem de


hemcias, concentrao de hemoglobina, percentual do hematcrito, ndices
hematimtricos, global de leuccitos) e da contagem de plaquetas esto
apresentadas na Tabela 19 e nas Figuras 28 a 30. As alteraes hematolgicas
foram discretas e consistiram em diminuio da hemoglobina em 4% dos indivduos,
plaquetopenia (em 4%), neutrofilia (em 8,2%) e eosinofilia (em 10,5% dos
indivduos).
Abbassy e Mossa (2012), em estudos com piretrides, obtiveram um
significante decrscimo na contagem de hemcias e na concentrao de
hemoglobina comparando o grupo de indivduos expostos a cipermetrina e
deltametrina e o grupo controle. A diminuio do nmero de hemcias, sengundo
98

estes investigadores, poderia estar relacionada maior instabilidade dessas clulas


e/ou reduo de sua sntese, devido ao efeito txico dos agrotxicos nas
membranas celulares ou mesmo na medula ssea. Banerjee (1999) props que
enzimas ligadas ao sistema antioxidante celular foram afetadas aps a exposio a
agrotxicos, levando susceptibilidade de hemcias e linfcitos ao estresse
oxidativo devido exposio a agrotxicos.

Tabela 19 - Parmetros hematolgicos dos trabalhadores rurais expostos a agrotxicos.


Global de
Hemcia Hemoglobina Hematcrito 3
6 3 MCH (pg) leuccitos Plaquetas (mm )
(x10 mm ) (g/dL) (%) 3
(mm )

n 49 49 49 49 49 49
MDP 5,16 0,40 15,36 1,12 44,42 2,80 29,84 1,48 8167 1747 210348 33265
Min-Max (4,16 - 5,99) (12,6 - 17,6) (37,1 - 49,9) (24,8 - 33,4) (4800 - 12500) (134000 - 271000)
VR 4,50 a 6,00 13 a 17,5 40 a 54 27 a 32 4000 a 11000 150000 a 450000
Valores expressos como mdia desvio padro. Entre parnteses, os valores mnimos e mximos.
VR: faixa de referncia de acordo com CARVALHO, 1988

Hemoglobina
18,0
17,0
Concentrao (g/dL)

16,0
15,0
14,0
13,0
12,0
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46
n de cada participante do estudo

Hb - Limite inferior Hemoglobina (g/dL) Hb - Limite superior

Figura 28 - Representao grfica da determinao da concentrao de hemoglobina nos


trabalhadores rurais expostos a agrotxicos.
99

Plaquetas
300.000

250.000
n/mm3

200.000

150.000

100.000
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49
n de cada participante do estudo
Plaquetas - Limite inferior Plaquetas (mm3)

Figura 29 - Representao grfica da determinao do nmero de plaquetas nos


trabalhadores rurais expostos a agrotxicos.

Global de Leuccitos
14.000

12.000

10.000
n/mm3

8.000

6.000

4.000

2.000
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49
n de cada participante do estudo

Limite inferior Global de leuccitos (mm3) Limite superior

Figura 30 - Representao grfica da determinao da global de leuccitos nos


trabalhadores rurais expostos a agrotxicos.

As mdias e desvios-padro da contagem diferencial de leuccitos esto


apresentadas na Tabela 20. Um aumento do nmero de eosinfilos foi verificado em
10,5% dos trabalhadores. Alergias drmicas causadas pelos agrotxicos poderiam
explicar a eosinofilia observada nos trabalhadores. No entanto, no se pode
descartar outras causas associadas ao aumento de eosinfilos circulantes.
100

Tabela 20 Diferencial de leuccitos dos trabalhadores rurais expostos a agrotxicos.


Valores absolutos (mm3)
Neutrfilos Neutrfilos
Eosinfilos Basfilos Linfcito Moncitos
Bastonetes Segmentados

n 49 49 49 49 49 49
MDP 104 122 4347 1348 278 293 68 74 2905 759 452 206
Min-Max (0 - 500) (1914 - 7504) (0 - 1207) (0 - 288) (1254 - 4600) (68 - 1250)
VR at 550 2000 a 7500 40 a 400 at 162 800 a 4950 200 a 800
Valores expressos como mdia desvio padro. Entre parnteses, os valores mnimos e mximos.
VR: faixa de referncia.

As mdias e desvios-padro dos marcadores de funo heptica (AST, ALT e


GGT) e renal (ureia e creatinina) esto apresentadas na Tabela 21.

Tabela 21 Avaliao dos parmetros bioqumicos em trabalhadores rurais expostos a


agrotxicos.
Ureia Creatinina
AST (U/L) ALT (U/L) GGT (U/L)
(mg/dL) (mg/dL)
n 47 49 49 49 47
MDP 26,23 8,92 19,03 9,64 32,50 27,25 40,07 9,41 1,63 0,53
Min-Max (9,55-47,55) (8,35-60,53) (9,24-147,84) (25,18-75,66) (0,72-2,96)
VR 15 a 40 10 a 40 10 a 50 15 a 40 0,7 a 1,20
Valores expressos como mdia desvio padro. Entre parnteses, os valores mnimos e mximos.
VR: faixa de referncia.

Os resultados revelaram que 19,1% dos trabalhadores tiveram alterao de


AST, 16,3% de ALT, 14,3% de GGT como mostram as Figuras 31 a 34. No foi
possvel quantificar a AST em dois trabalhadores e um deles apresentou uma
alterao expressiva de ALT e dois de GGT. Os resultados so similares com os
observados no estudo de Almeida e Martins (2008) onde 10% dos trabalhadores
pesquisados apresentaram elevao da AST e 16% apresentaram elevao da ALT.
Apesar das alteraes encontradas no serem significativas, estando muitas
vezes relacionadas a doenas comuns, no se pode excluir a possibilidade de tais
alteraes resultarem de exposio a agrotxicos, considerando que o fgado o
principal rgal responsvel pela biotransormao de substncias exgenas. Vrios
trabalhos demonstraram diferenas entre os valores das enzimas hepticas e
101

parmetros hematolgicos, quando comparados o grupo de estudo e grupo controle,


tanto em estudos com animais ou em humanos (PATIL, PATIL e GOVINDWAR,
2003; ZAMA et al., 2005; YOUSEF, AWAD e MOHANEDM, 2006; ASTIZ, 2011;
JOSEPH and RAJ, 2011; SHAMSUDIN and YAP, 2011; MOSSA and ABBASSY,
2012; PRIYANKA, PRIYANKA and PRADEEP, 2012; REDDY e KANOJIA, 2012)
Sabe-se tambm que alteraes nas enzimas hepticas possivelmente esto
associadas ao alcoolismo e tabagismo que dificultam ainda mais o diagnstico de
intoxicao crnica por agrotxicos. No entanto, a grande maioria dos trabalhadores
declarou no fazer uso de lcool (82,6%) e cigarro (93,5%). Contrariamente, outros
estudos sugeriram um consumo abusivo de lcool dentre os trabalhadores rurais.
Arajo et al. (2007) revelaram que mais de um quarto dos entrevistados consumiam
bebida alcolica diariamente ou pelo menos trs vezes por semana. Rodrigues
(2011) revelou que 73,3% dos entrevistados ingeriam bebida alcolica
semanalmente e 41,7% tm o hbito de fumar.
Foi sugerido um acompanhamento dos trabalhadores que tiveram alteraes
hematolgicas e bioqumicas, mesmo que os resultados desses exames no
permitam estabelecer nexo causal com a exposio ocupacional aos agrotxicos.
No estudo de Hernandz et al. (2006) os resultados revelaram associao
entre exposio a agrotxicos e alterao de enzimas sricas, dentre elas a AST
(com aumento da atividade) e componentes do soro como a creatinina e fsforo
(diminuio e aumento dos nveis sricos, respectivamente) so influenciados por
exposio a agrotxicos, sugerindo que disfunes bioqumicas sutis resultam de
algum nvel de citotoxicidade.
102

AST
50,00

40,00
Concentrao (U/L)

30,00

20,00

10,00

0,00
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49
n de cada participante

AST - Limite inferior AST (U/L) AST - Limite superior

Figura 31 - Representao grfica da determinao da concentrao de AST srica nos


trabalhadores rurais expostos a agrotxicos.

ALT
70,00

60,00
Concentrao (U/L)

50,00

40,00

30,00

20,00

10,00

0,00
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49
n de cada participante do estudo

ALT - Limite inferior ALT (U/L) ALT - Limite superior

Figura 32 - Representao grfica da determinao da concentrao de ALT srica nos


trabalhadores rurais expostos a agrotxicos.
103

Transaminases hepticas
65,00

55,00
Concentreo (U/L)

45,00

35,00

25,00

15,00

5,00
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49
n de participantes do estudo

Limite inferior AST (U/L) ALT (U/L) Limite superior

Figura 33 - Representao grfica das transaminases hepticas nos trabalhadores rurais


expostos a agrotxicos.

GGT
160,00
140,00
Concenetrao (U/L)

120,00
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49
n de cada participante do estudo

GGT - Limite inferior GGT (U/L) GGT - Limite superior

Figura 34 - Representao grfica da determinao da concentrao de GGT srica nos


trabalhadores rurais expostos a agrotxicos.

Os dois trabalhadores que tiveram aumento expressivo de GGT relataram que


no tiveram contato recente com mistura de agrotxicos, no consumiram etanol nas
ltimas 72h, no fumaram ou fizeram uso recente de qualquer medicamento capaz
de induzir esta alterao.
104

Sabe-se que as caractersticas clnicas das intoxicaes por agrotxicos no


refletem uma relao simples entre o uso desses e a pessoa exposta. So vrios os
fatores que participam deste processo, dentre ele os fatores relativos s
caractersticas qumicas e toxicolgicas do produto, fatores relativos ao indivduo
exposto e s condies de exposio (RODRIGUES, 2011).
Embora os resultados obtidos neste estudo no permitam estabelecer nexo
causal entre alterao heptica e exposio ocupacional aos agrotxicos, um
acompanhamento dos trabalhadores que apresentaram tais alteraes necessrio.
A orientao para procurar um clnico com os resultados dos exames foi feita aos
representantes do Sindicato Rural, aos quais foi solicitado que repassassem aos
trabalhadores em questo.
Com relao aos marcadores de funo renal, os resultados mostraram que
92,5% que tiveram o sangue coletado aps a jornada de trabalho ( noite) e 50%
dos que coletaram sangue pela manh apresentaram valores de creatinina
superiores ao limite mximo do intervalo de referncia (1,2 mg/dL). Esse valor
representa 76,6% dos trabalhadores pesquisados com aumento de creatinina srica.
(Figura 35).

Creatinina
3,50

3,00
Concentrao (mg/dL)

2,50

2,00

1,50

1,00

0,50
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49
n de cada participante do estudo
Creatinina - Limite inferior Creatinina (mg/dL) Creatinina - Limite superior

Figura 35 - Representao grfica da determinao da concentrao de creatinina srica nos


trabalhadores rurais expostos a agrotxicos.
105

A creatinina um produto residual da creatina oriunda do metabolismo


muscular e da ingesto de carne. gerada no msculo a partir de uma reao no
enzimtica da creatina e fosfocreatina. A produo e liberao de creatinina pelo
msculo so praticamente constantes e diretamente proporcional massa muscular
(BURTIS & ASHWOOD, 1999).
A quase totalidade dos trabalhadores que tiveram o sangue coletado noite,
apresentou nveis elevados de creatinina, o que sugere que o somatrio da massa
muscular e do esforo fsico contribuiu para esse resultado. No grupo que teve o
sangue coletado aps repouso, ou seja, pela manh, o percentual de trabalhadores
com nveis elevados de creatinina foi de 50% e pode ser associado massa
muscular. Todos os trabalhadores envolvidos neste estudo apresentavam
musculatura proeminente, que provavelmente reflete a atividade laboral diria.
Este resultado refora a necessidade do laboratrio orientar corretamente o
cliente sobre a interferncia da atividade fsica antes da coleta de sangue para
determinao de creatinina srica. Alm disso, o clnico deve considerar a massa
muscular do indivduo ao interpretar o resultado desse exame laboratorial. No
entanto, uma busca no site dos principais laboratrios do pas revelou que nenhuma
instruo relativa ao exame creatinina no sangue fornecida ao cliente.
A avaliao completa da funo renal exige a coletada simultnea de urina de
12 ou 24 horas e amostras de sangue para determinao de creatinina e ureia
sricas e urinrias. No entanto, a coleta de urina por 12 ou 24 horas difcil de ser
obtida em trabalhadores rurais, durante sua jornada diria.
No presente trabalho, os nveis de ureia foram discretamente aumentados em
8,2% dos trabalhadores, com exceo de um que apresentou um aumento
acentuado (Figura 36).
106

Ureia
80,00
70,00
Concentrao (mg/dL)

60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49
n de cada participante do estudo

Ureia - Limite inferior Ureia (mg/dL) Ureia - Limite superior

Figura 36 - Representao grfica da determinao da concentrao de ureia srica nos


trabalhadores rurais expostos a agrotxicos.

Reddy e Kanojia (2012) relataram que a ureia srica apresentou resultados


significativamente maiores em trabalhadores expostos a agrotxicos quando
comparada ao grupo controle, o que indicaria uma leso renal. No entanto, estes
dados verificados isoladamente so insuficientes para inferir sobre incio da leso
renal, necessitando, desse modo, de exames complementares. Nesse mesmo
estudo, outros parmetros hematolgicos e hepticos (como contagem de hemcias,
hematcrito, enzimas hepticas ALT e AST) apresentaram valores significativamente
diferentes quando comparados ao grupo controle.
Astiz et al. (2011) fizeram a comparao entre aplicadores de agrotxicos e
um grupo controle, e obtiveram dentre os trabalhadores expostos a agrotxicos,
valores de biomarcadores hematolgicos, renais e hepticos dentro da faixa de
referncia estabelecidas para a populao em geral, incluindo a atividade da
colinesterase. No entanto, a anlise estatstica revelou diferenas significativas entre
os dois grupos. Como concluso estes pesquisadores relataram que os testes
laboratoriais de triagem no poderiam ser totalmente sensveis para a deteco de
exposio sub-clnica a agrotxicos e sugeriram que biomarcadores de estresse
oxidativo deveriam ser utilizados conjuntamente em protocolos de vigilncia
sanitria.
107

6 CONCLUSES

O procedimento utilizado foi adequado, possibilitando a validao intralaboratorial


do mtodo de anlise para glifosato e AMPA em soja e milho sem derivatizao, por
cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massas em tandem, sendo que
os resultados obtidos atenderam aos limites regulamentados pela ANVISA nas duas
matrizes.
Foi evidenciado efeito de matriz dependente do fator de diluio e da prpria
matriz sendo necessria a construo de curva analtica com extratos de amostras
orgnicas, precedida de extrao slido-lquido com partio em diclorometano e
precipitao de protenas com metanol.
O mtodo apresentou exatido e preciso aceitveis na faixa do LQ para o
glifosato em ambas as matrizes e para AMPA em milho. No houve preciso nos
nveis de adio estudados para AMPA em soja.
No foram encontrados resduos de glifosato e AMPA em nenhuma das
amostras analisadas de milho (fub).
Os resultados dos parmetros hematolgicos e bioqumicos pesquisados
revelaram alteraes hepticas e hematolgicas em alguns trabalhadores. No
entanto, difcil estabelecer o nexo causal com a exposio ocupacional aos
agrotxicos, o que torna necessria uma avaliao clnica e laboratorial mais
detalhada.
Os dados obtidos para as alteraes hematolgicas e bioqumicas em alguns
trabalhadores includos neste estudo no so conclusivas, considerando que os
percentuais obtidos no tem valor estatstico suficiente para confirmar os efeitos de
nefro e hepatotoxicidade, o que torna necessria uma avaliao clnica e laboratorial
mais detalhada.
A atividade fsica associada massa muscular alterou de forma mais evidente a
concentrao plasmtica da creatinina.
108

7 LIMITAES DO ESTUDO

So poucos os estudos sobre toxicidade do glifosato, seja em humanos ou


animais. Somando-se a isso, pouco se sabe sobre dados de toxicidade de mistura
de agrotxicos, no Brasil e no mundo. Alm disso, a toxicidade no se resume
necessariamente soma das toxicidades individuais de cada produto, pois as
interaes entre as substncias podem levar aos efeitos de sinergismo e
potencializao. Sabe-se que o uso de mistura de agrotxico resulta num controle
mais eficiente das pragas, no est claro se o efeito sinrgico ser apenas para os
organismos-alvo (TOMITA e BEYRUTH, 2002).
Recentemente, Demur et al. (2013) investigaram o impacto da exposio
alimentar a doses reduzidas de misturas de agrotxicos, utilizando camundondos
como modelo. Relataram que a exposio alimentar a uma mistura de agrotxicos
diferiram entre os grupos estudados. Concluram que o efeito final da mistura destes
produtos nem sempre pode ser previsto partindo do efeito isolado de cada um dos
compostos constituintes, ou seja, que, alm da alimentao, diferenas individuais
ou nas condies de exposio, ocupacional e ambiental, podem tambm alterar o
risco de intoxicao.
Uma das limitaes do desenho do presente estudo refere-se avaliao da
hepatotoxicidade e nefrotoxicidade (parmetros bioqumicos e hematolgicos), por
se tratar apenas de um estudo exploratrio e os resultados obtidos para os
parmetros laboratoriais avaliados foram comparados com os valores de referncia
dos mesmos. Outra limitao est associada dificuldade na coleta da amostra de
sangue, especialmente pelo fato dos trabalhadores rurais encontrarem-se em
comunidades isoladas, com pouca ou nenhuma ateno sade, sendo muitas
vezes difcil parar a rotina de trabalho e justificou o nmero reduzido de
trabalhadores avaliados. Finalmente a ltima limitao refere-se a no composio
de um grupo controle para outras anlises estatsticas apropriadas dos parmetros
hematolgicos e bioqumicos para a avaliao da hepato e nefrotoxicidade.
109

8 PERSPECTIVAS DE ESTUDOS

Elaborar uma agenda de estudos sobre o glifosato que possam tratar dos
seguintes temas:

Pesquisar o sinergismo e a potenciao dos efeitos toxicolgicos do glifosato


e outras das classes de agrotxicos;
Implementar aes de vigilncia da exposio ambiental e ocupacional ao
glifosato visando conhecer a real magnitude dessa exposio;
Estabelecer estratgias para estudos e pesquisas visando conhecer os
possveis efeitos na sade decorrente do uso de agrotxicos em populaes
expostas, que possam ser teis para tomadas de deciso no mbito da sade
pblica;
Realizao novos testes para estipular o LQ de AMPA em soja;
Realizar novos testes visando aumentar a sensibilidade analtica de glifosato
e AMPA para anlise em outras matrizes como trigo e feijo;
Incluir o glifosato e o AMPA no Programa de Anlise de Resduos de
Agrotxicos em Alimentos PARA, de modo a identificar e quantificar seus
nveis de resduos nos alimentos, mapear sua distribuio e subsidiar sua
avaliao de risco e reavaliao;
Incluir o glifosato e o AMPA nas anlises ambientais de gua, visando
identificar e quantificar seus nveis de resduos, mapear sua distribuio e
atender aos parmetros da portaria n 2914/2011.
110

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10 ANEXO

10.1 Anexo 1 Aprovao pelo COEP/UFMG


127

10.2 Anexo 2 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido


128

10.3 Anexo 3 Ficha de coleta de dados


129
130

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