Laboratorio de

Microbiologia
Tincin de Gram
INTRODUCCIN
De gran importancia en Microbiologa porque permite
diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-
), segn se comporten ante esta tincin. El fundamento radica
en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos:
las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano
en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa
de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica
externa. Tras la tincin con el primer colorante (Cristal
violeta) se efecta un lavado conetanol que arrastrar al
colorante slo en las Gram (-), mientras que en lasGram (+)
elcolorante queda retenido y las clulas permanecern
azules. Las clulas Gram (-) se teirn despus con un
colorante de contraste (safranina) para que puedan
observarse.
Objetivos
Utilizacin de tcnicas sencillas para la observacin de
microorganismos
Conocer o manejo del microscopio ptico para la
observacin de bacterias (importancia del objetivo de
inmersin)
Conocer y manejar las unidades de medida de las clulas y
establecer comparaciones entre tamaos de procariotas y
de eucariotas
 Reconocer los distintos modelos de pared bacteriana.

Materiales
Mechero Bunsen o de Alcohol
Asa de Siembra o aguja enmangada
Pinzas
Portaobjetos
Muestras bacterianas de origen natural: Yogur, Sarro
Dental, Suelo, etc.
Palillos
Microscopios
Aceite de inmersin
Soporte de Tinciones
Goteros
Pinzas
Agua destilada
Colorantes para Tincin: Solucin de cristal Violeta
Lugol Safranina Etanol 95%
Procedimiento
I. prepara las muestras siguiendo estos pasos:
1. En unas gotas de agua colocadas sobre un portaobjetos,
disuelve una pequea cantidad de yogur con ayuda de un
palillo higinico. Haz lo mismo con la muestra de sarro dental
extrado de la boca de alguien.2. Prepara una fina extensin
(frotis), en otros portas, dejndolos secar.3. Fija este frotis
dndole varios pases a los portas sobre la llama del mechero,
con la muestra hacia arriba.
II Tie ahora los frotis fijados mediante los siguientes
pasos:
1. Cubre ambos frotis con cristal violeta durante 3 min. Se
retirar el colorante mediante un suave lavado con agua,
deslizando el agua sobre el porta, para non desprender la
muestra. Se 2. cubrir ahora con Lugol durante 1 min., y
despus se realizar otro lavado suave. Todas las clulas se
teirn de violeta.2. Se retirar el colorante con etanol,
gotendolo por el portaobjetos, hasta que las gotas que salen
no tengan casi color. Las clulas Gram- pierden el colorante
violeta y quedarn incoloras. Las Gram + seguiran violeta.3.
Aade una gota de agua a la preparacin y cubre las
preparaciones 2 min. con safranina (colorante de
contraste).Finalmente, lava el colorante con agua. Este
colorante slo entrar en las bacterias Gram , que quedarn
rojas. Las Gram + seguirn violetas.
Seca las preparaciones sobre papel de filtro y obsrvalas
con microscopio utilizando el objetivo de inmersin. En
esta tincin diferencial las bacterias Gram aparecen
rojas y las Gram + violeta. Observar (100). Lugol
Tincin negativa
1. colocar una pequea gota de tinta china en el extremo de
un portaobjeto, colocar una gota de muestra2. realizar frtis,
3. dejar secar.
Resultados
Preguntas de anlisis
1) Cules son las fuentes de errores ms comunes de error
en la Tincin de gram.
Los peores obstculos de la Tincin, que impiden conseguir
el resultado perseguido, son los errores del tcnico. Para
evitarlos hay que elegir bien los reactivos y ser muy
cuidadosos al ejecutar la tcnica. A continuacin describimos
algunas de las fuentes de error: Impurezas en los reactivos
de Tincin.
Concentracin inadecuada de los reactivos de tincin.
pH inadecuado.
El colorante se fija a la clula por mecanismos fsico-
qumicos, que se alteran si el Ph no es el apropiado.
Los colorantes pueden ser cidos, bsicos o neutros.
Tiempo de Tincin incorrecto.
Temperatura suficiente.
2) Explique qu reaccin de Gram darn las
levaduras. Estos tendrn la misma importancia que para
las bacterias.
El color depende de la composicin de la pared celular de la
levadura y no tiene tanta importancia como las bacterias ya
que en ellas existe toda una clasificacin por medio del gram
lo que no sucede con las levaduras.
3) Explique el fundamento de la Tincin negativa
realizada en la prctica. Qu tipo de informacin se
obtiene.
La Tincin negativa es el reverso del procedimiento de
tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se colorea en
cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el
perfil de las clulas. La Tincin negativa es un modo
satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la
microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la
presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.
4) Investigue otra tcnica de Tincin selectiva que
permita observar otras estructuras bacterianas.
Las Tinciones Selectivas nos permiten observar estructuras de
las clulas gracias a su mayor afinidad por los colorantes
utilizados.
5) A qu se debe el distinto comportamiento de las
bacterias segn sean Gram+ o Gram-?
El distinto comportamiento en la Tincin se piensa que es
debido a las diferentes capas superficiales o paredes de las dos
bacterias (Tipos de Clulas).
6) Para que se necesita el aceite de inmersin ?
El aceite de inmersin tiene un indice de refraccin similar al
del vidrio (1,5 aprox.) y se utiliza para el objetivo de 100X.

Conclusin
Aunque las bacterias no aparecen en diferentes medio que las
rodea, difieren mucho qumicamente esta
diferencia qumica es los que permite distinguir las bacterias
por Tincin, pues generalmente, el colorante reacciona con
la clula bacteriana, pero no reacciona con su medio exterior.
Debido a eso la Tincin es importante para
la microbiologa debido a que:
Proporciona contraste entre el microorganismo y el
medio que lo rodea, permitiendo diferenciar varios
tipos morfolgicos.
 Permite el estudio de las estructuras internas de
la clula bacteriana, tales como paredes celulares, vacuolas
o cuerpos celulares.
Permite el empleo de mayores amplificaciones.