Objetivos.

Realizar una curva de calibracin de biomasa, que permita relacionar la concentracin

celular (g/L) con la absorbancia de la muestra.

Realizar una curva de calibracin de azcares, que permita relacionar la concentracin de

azcares reductores con la absorbancia

Conocer los fundamentos de cada uno de los mtodos llevados a cabo en la prctica.

Introduccin.

Las tcnicas ms utilizadas para determinar la concentracin microbiana en un cultivo lquido de

microorganismos son el recuento de clulas al microscopio o de colonias en cajas de Petri. Tambin
es posible la determinacin de la masa celular mediante peso seco y posteriormente realizar
correlaciones utilizando la absorbancia de la muestra. Este ltimo es uno de los ms empleados, ya
que permite expresar la concentracin celular en trminos de masa seca celular por unidad de
volumen. Cuando se realiza una fermentacin se busca obtener un producto bien sea biomasa o
algn metabolito especfico. El mtodo para determinar dicho metabolito, vara segn el tipo de
producto. El consumo de sustrato se puede realizar por el mtodo de azcares reductores mediante
el uso del cido dinitrosaliclico (DNS) (1). Este mtodo se basa en la hidrlisis de la sacarosa para
producir una molcula de glucosa y una de fructosa, y la posterior medicin de los azcares
reductores libres por medio de la reduccin del cido dinitrosaliclico. Se forma un compuesto
nitrogenado amarillo, cuya densidad ptica es proporcional a la concentracin de grupos reductores
(2)
.

Marco Terico

Biorreactor
Es un recipiente, equipo o envase diseado para que en su interior se lleven a cabo reacciones
qumicas gracias a un sistema que mantiene un ambiente biolgicamente activo, Usando
microorganismos como bacterias o levaduras suspendidos en un lquido en lo que mejor podra
asemejarse a una cmara de fermentacin para que as esta sustancia sea capaz de encaminar estos
procesos biotecnolgicos, Esta serie de etapas pueden ser aerbicas o anaerbicas. Estos
biorreactores son comnmente cilndricos, variando en tamao desde algunos mililitros hasta
metros cbicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable. Adems de tener sujetos a este una
variedad de dispositivos que permiten la vigilancia y el control de cual sea el mtodo que estemos
empleando.

Se habita el uso de estos aparatos porque simplifica el mantener y custodiar ciertas condiciones
propicias (pH, temperatura, concentracin de oxgeno, etctera) al organismo o sustancia qumica
que se cultiva. En funcin de los flujos de entrada y salida, siendo las siguientes tcnicas las que
han demostrado integra eficacia:

Lote (batch)
Lote alimentado (fed-batch)
Continuo o quimiostato(3).

Mtodo DNS

El mtodo DNS (Mtodo de Miller) es un tcnica analtica basada en la colorimetra que utiliza
acido 3.5 dinitrosalicilico para la hidrlisis de polisacridos contenidos en una muestra, est tcnica
suele ser muy til en procesos fermentativos ya que suministra la concentracin de azcar
consumida (azcar reductor) adicionalmente cuantifica los productos de una reaccin enzimtica, el
DNS reacciona nicamente con azucares reductores. La sacarosa es un disacrido no reductor pero
tras la hidrlisis en medio cido se libera glucosa y fructuosa los cuales si son azcares reductores y
reaccionan con el DNS generando un producto coloreado. La intensidad de color presente en cada
una de las muestras es proporcional a la concentracin de sacarosa; para llevar a cabo este mtodo
se debe conocer la concentracin inicial del azcar que hay en el medio de cultivo, a medida que la
fermentacin avanza se toman muestras a determinados tiempos para posteriormente medir a cada
una de estas la absorbancia en un espectrofotmetro a 540 nm, con cada punto obtenido se
construye la curva de calibracin, en esta representacin grfica el eje Y es la absorbancia obtenida
y el eje x la concentracin (4).

Cintica de biomasa

Existen numerosos mecanismos de reaccin y diversos productos relacionados a la descomposicin

trmica de la biomasa, lo cual se debe a la complejidad de la naturaleza fisicoqumica de estas: los
mecanismos de reaccin y las expresiones que se crean de velocidad son el fundamento de todos los
procesos de pirolisis para comprender los fenmenos elementales de la etapa de desvolatinizacion
para as disear reactores ms eficientes (5).
Transformaciones lineales

La curva de saturacin de sustrato no es implementada para la representacin grfica de Km y

Vmax debido a que la aproximacin de Vmax se realiza de manera asinttica y no es lo
suficientemente precisa, por lo que dicha representacin se hace utilizando el inverso de Vmax en
funcin del inverso del sustrato tomados de la ecuacin de Michaelis y Menten.
1
Km+ S
1 Vmax
=
Vo S

Siguiendo la ecuacin de la lnea recta y=mx+ b obtenemos la ecuacin de Linneweaver-

Burk

Km
1
1 Vmax 1
= +
Vo S Vmax

A partir de la ecuacin anterior (Lineweaver-Burk) es posible obtener otro metodo mas de

representacin lineal V frente a V/[S],el cual sigue la siguiente ecuacin
(6)
KmV
V= +Vmax
S
Figura 1. Representacin de Lineweaver-Burk y Eadie Hofstee para el clculo de parmetros
cinticos