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BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM

cido D-Lctico/L-Lctico Enzymatic BioAnalysis/Food Analysis

Mtodo UV Para uso in vitro solamente Almacenar a 2-8 C


Para la determinacin de cido D- y L-lctico Esta traduccin en espaol has sido realizada por RBiopharm
en alimentos y otros materiales Latinoamrica con el objeto de ayudar a los usuarios a entender el
procedimiento, pero no se actualizan regularmente por lo que no
pueden remplazar las instrucciones en ingls. Las instrucciones de
uso que son vlidas, son aquellas incluidas en cada kit en Alemn y
Cat. No. 11 112 821 035 en Ingls, dado que estn escritas e impresas por el fabricante
(Roche). Refirase siempre a las instrucciones incluidas en cada kit.
Test-Combinado para 30 determinaciones c/u

Principio (Ref. A1)


En presencia de D-lactato deshidrogenasa (D-LDH), el cido D- Procedimiento
1
lctico (D-lactato) se oxida a piruvato por medio de la nicotinamida Longitud de onda : 340 nm, Hg 365 nm Hg 334 nm
2
adenina dinucletido (NAD). La oxidacin de cido L-lctico requiere Cubeta de vidrio : 1.00 cm de paso de luz
la presencia de la enzima L-lactato deshidrogenasa (L-LDH) (1,2). Temperatura: 20-25C
Volumen final: 2.240 ml (cido D-lctico)
+ D-LDH +
(1) D-lactato + NAD piruvato + NADH + H 2.260 ml (cido L-lctico)
Leer contra aire (sin cubeta en el paso de luz), contra
3
+ L-LDH + agua contra blanco
(2) L-lactato + NAD piruvato + NADH + H
Soluc. de muestra: 0.3-35 ug de cido D- y L-lctico/
4
El equilibrio de estas reacciones est en el lado del lactato. El ensayo (en 0.100-1.000 ml de volumen
equilibrio puede desplazarse a favor del piruvato y NADH, atrapando de muestra)
piruvato en una reaccin subsiguiente catalizada por la enzima
Pipetear en la cubeta Blanco Muestra
Glutamato piruvato transaminasa (GPT) en presencia de L-glutamato
(3) solucin 1 1.000 ml 1.000 ml
solucin 2 0.200 ml 0.200 ml
GTP
(3) Piruvato + L-glutamato L-alanina + 2-oxoglutarato suspensin 3 0.020 ml 0.020 ml
sol. muestra* - 0.100 ml
La cantidad de NADH formado en las reacciones precedentes es
estequiomtrica con la cantidad de cido D-lctico y de cido L- agua bidestilada 1.000 ml 0.900 ml

lctico respectivamente. El aumento en NADH se mide por medio de Mezclar **, leer las absorbancias de las soluciones (A1) luego de aprox. 5 min. Iniciar la
reaccin con:
su absorbancia a 334, 340 365 nm.
solucin 4 0,020 ml 0,020 ml
El test combinado contiene Mezclar **, luego de finalizada la reaccin (aprox. 30 min.) leer las absorbancias de las
1. Botella 1 con aprox. 30 ml de solucin de: soluciones una inmediatamente despus de la otra (A2) (ver Pto. 2.4). Agregar
Buffer glicilglicina, pH aprox. 10.0; cido L-glutmico, 440 mg. solucin 5 0,020 ml 0,020 ml
2. Botella 2 con aprox. 210 mg de NAD liofilizado. Mezclar **, luego de finalizada la reaccin (aprox. 30 min.) leer las absorbancias de las
3. Botella 3 con aprox. 0.7 ml de suspensin de glutamato piruvato soluciones una inmediatamente despus de la otra (A3)
transaminasa, aprox. 1100 U.
* Enjuagar el tip de la pipeta con solucin de muestra antes de dispensar la solucin de
4. Botella 4 con aprox. 0.7 ml de solucin de D-lactato muestra.
deshidrogenasa, aprox. 3800 U. ** Por ejemplo, con una esptula plstica por agitacin despus de cubrir la cubeta con
5. Botella 5 con aprox. 0.7 ml de solucin de L-lactato Parafilm (marca registrada de la American Can Company, Greenwich, Ct., USA).
deshidrogenasa, aprox. 3800 U.
Determinar la diferencia de absorbancias (A2 A1) para el blanco y
6. Solucin de D-lactato para control del ensayo (la medicin de la
las muestras. Sustraer la diferencia de absorbancia del blanco de la
solucin control no es necesaria para el clculo de los resultados del
diferencia de absorbancia de la muestra correspondiente, para
ensayo). Utilice la solucin control sin diluir (fecha de vencimiento:
obtener de esta manera A cido D-lctico.
ver etiqueta)
Determinar la diferencia de absorbancias (A3 A2) para el blanco y
7. Solucin de L-lactato para control del ensayo (la medicin de la
las muestras. Sustraer la diferencia de absorbancia del blanco de la
solucin control no es necesaria para el clculo de los resultados del
diferencia de absorbancia de la muestra correspondiente, para
ensayo). Utilice la solucin control sin diluir (fecha de vencimiento:
obtener de esta manera A cido L-lctico.
ver etiqueta)
Las diferencias en las medidas de absorbancia debe, como regla,
Preparacin de las soluciones
ser al menos de 0.100 unidades de absorbancia para obtener
1. Usar los contenidos de las botellas 1, 3, 4 y 5 sin diluir.
suficiente precisin en los resultados (ver Instrucciones para el
2. Disolver el contenido de la Botella 2 con 6 ml de agua destilada.
rendimiento del ensayo y Sensibilidad y lmite de deteccin, punto
Estabilidad de los reactivos 4).
Los contenidos de las Botellas 1, 3, 4 y 5 son estables a 2-8C (ver
Clculos
etiqueta).
De acuerdo a la ecuacin general del clculo de las concentraciones:
Llevar la Solucin 1 a 20-25C antes de su uso.
El contenido de la botella 2 es estable a 2-8C (ver etiqueta). V x MW
La solucin 2 es estable por 3 semanas a 2-8C y por 2 meses de - c = --------------------------- x A (g/l)
15 a -25C. x d x v x 1000

V = volumen final (ml)


v = volumen de muestra (ml)
MW = peso molecular de la sustancia a ensayar (g/mol)
d = paso de luz (cm)
= coeficiente de extincin del NADH a:
-1 -1
340 nm = 6.3 (l x mmol x cm )
-1 -1
1 La absorcin mxima de NADH es a 340 nm. En espectrofotmetros las mediciones se Hg 365 nm = 3.4 (l x mmol x cm )
-1 -1
toman a la mxima absorcin, si se utilizan fotmetros espectrales equipados con lmpara Hg 334 nm = 6.18 (l x mmol x cm )
de vapor de mercurio, las mediciones se toman a 365 nm 334 nm.
2 Si se desea se pueden utilizar cubetas descartables en lugar de cubetas de vidrio.
3 Por ejemplo cuando se usa un fotmetro de doble haz.
4 Ver instrucciones para el rendimiento del kit

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Corresponde para cido D-lctico: primero. Se debe utilizar el volumen total correspondiente
(V) para el clculo de los resultados.
2.240 x 90.1 2.018 en paralelo en ensayos independientes, ej. cuando la
c = ------------------------------ x A = ------------ x A (g D-lctico. / l relacin entre L-lactato y D-lactato, viceversa, es mayor
x 1.00 x 0.100 x 1000 sol. de muestra) que 5 a 1. En dicho caso, la solucin de muestra debe
prepararse de modo que la diferencia de absorbancias se
Corresponde para cido L-lctico: lo suficientemente grande (ej. > 0.100) para obtener
resultados lo suficientemente precisos. Alternativamente,
2.260 x 90.1 2.036
la solucin de muestra puede diluirse el volumen de
c = ------------------------------ x A = ------------ x A (g L-lctico. / l
muestra puede aumentarse.
x 1.00 x 0.100 x 1000 sol. de muestra)
2.6. El cido lctico comercial puede contener formas estero-
Si la muestra se ha diluido durante la preparacin, los resultados isomricas en una relacin 1:1. Adems, el cido lctico libre forma
deben multiplicarse por el factor de dilucin F. parcialmente el dmero lactil-lactato que no reacciona en el ensayo
enzimtico. Por ello, no debe utilizarse cido lctico libre para
Cuando se analizan muestras slidas semislidas que se pesan preparar una solucin control del ensayo. Las sales de litio y de
para la preparacin de la muestra, los resultados se calculan a partir calcio son apropiadas para usarse como control.
de la cantidad pesadas:
3. Especificidad (Ref. 1)
c D-lctico (g/l de sol. ) El mtodo es especfico para cido D- y L-lctico.
Contenido D-lctico = -------------------------------------- x 100 (g / 100g) En el anlisis de D-lactato de litio comercial (PM 96.0), se esperan
peso muestra en g/l sol. resultados de aprox. 99%, en el anlisis de L-lactato de litio
comercial, se esperan resultados de aprox. 98%.
c L-lctico (g/l de sol. )
Contenido L-lctico = --------------------------------------- x 100 (g / 100g) 4. Sensibilidad y lmite de deteccin (Ref. 1)
peso muestra en g/l sol. La mnima diferencia en absorbancia para el procedimiento es de
0.005 unidades de absorbancia. Este valor corresponde a una
1. Instrucciones para el funcionamiento del kit concentracin de cido D- L-lctico de 0.15 mg/l de solucin de
La cantidad de cido D- y L-lctico presente en el ensayo debe ser muestra con un volumen mximo de muestra v = 1.000 ml y
entre 0.5 ug y 35 ug (medidos a 365 nm) 0.3 ug y 20 ug (medidos a medicin a 340 nm (si se utiliza un v = 0.100 ml, esto corresponde a
340, 334 nm) respectivamente. Para obtener una diferencia de 1.5 mg/l por litro de solucin de muestra).
absorbancias suficiente, la solucin de muestra debe diluirse para El lmite de deteccin de 0.3 mg/l deriva de la diferencia de
dar una concentracin de cido D- y L-lctico entre 0.06 y 0.35 g/l absorbancia de 0.010 (medida a 340 nm) y un mximo de volumen
0.03 y 0.2 g/l respectivamente. de muestra de v = 1.000 ml.
Tabla de dilucin 5. Linealidad
Cantidad estimada de cido D- Dilucin con Dilucin La linealidad de la determinacin es desde aproximadamente 0.3 ug
y L-lctico por litro agua factor F de cido lctico /ensayo (0.3 mg cido lctico / l de solucin de
muestra, volumen de muestra v = 1.000 ml) hasta 35 ug de cido
medido a
lctico /ensayo (0.35 g de cido lctico /l de solucin de muestra,
340 334 nm 365 nm
volumen de muestra v = 0.100 ml).
< 0.2 g < 0.35 g - 1
0.2-2.0 g 0.5-3.5 g 1+9 10 6. Precisin
2.0-20.0 g 3.5-35 g 1 + 99 100 En una determinacin por duplicado utilizando una nica solucin de
> 20g >35g 1 + 999 1000 muestra, pueden obtenerse diferencias de 0.005 a 0.010 unidades
de absorbancia. Con un volumen de muestra de v = 0.100 ml y
Si las diferencias de absorbancia medidas (A) son muy pequeas medido a 340 nm, esto corresponde a una concentracin
(ej. < 0.100), la solucin de muestra debe prepararse nuevamente aproximada de cido lctico de 1.5-3 mg/l. (Si la muestra se diluye
(pesar mas muestra diluir menos) se puede aumentar el volumen durante la preparacin, el resultado debe multiplicarse por el factor
se muestra en la pipeta hasta 1.000 ml. El volumen de agua de dilucin F. Si la muestra se pesa durante la preparacin, ej. usar
agregado debe, por lo tanto, disminuirse para tener el mismo 1 g de muestra /100 ml = 10 g/l, se puede esperar una diferencia de
volumen final para blanco y muestra. El nuevo volumen de muestra v 0.015-0.03 g/100 g).
debe tenerse en cuenta en el clculo. En la literatura se han publicado los siguientes datos:
2. Informacin tcnica Acido D-Lctico:
2.1. La transpiracin de las manos contiene cido L-lctico. Debe CV = 1.96 % medio de cultivo (Ref. 1.5)
tenerse cuidado de no tocar los tips de las pipetas con las manos. Yogur: x = 0.3 g/100 g r = 0.03 g/100 g R = 0.05 g/100 g
2.2. Al hacer los clculos, debe indicarse claramente si los Leche polvo: x = 0.07 g/100 g r = 0.0008 g/100 g R = 0.003 g/100
resultados se van a expresar como cido L-lctico (masa molar 90.1 g
g/mol) como lactato (masa molar 89.1 g/mol). (En las mediciones Para ms datos ver referencia (Ref. 2.1)
enzimticas, tambin se mide el ion lactato).
2.3. Al evaluar los resultados analticos, debe tenerse en cuenta que Acido L-Lctico
en la determinacin acidimtrica del cido total calculado como CV = 2.3 % Sol. L-lactato de litio (Ref. 1.3)
cido L-lctico, se miden protones y que en la determinacin Yogur: x = 0.6 g/100 g r = 0.05 g/100 g R = 0.07 g/100 g
enzimtica se miden los iones L-lactato. Es por ello que no se Leche polvo: x = 0.112 g/100 g r = 0.008 g/100 g R = 0.015 g/100 g
pueden comparar dichos resultados directamente. Huevo entero en polvo:
2.4. Puede haber una reaccin creep dependiente de los reactivos x = 240 mg/kg r = 62.8 mg/kg s(r) = 22.2 mg/kg
en A2 luego de la conversin cuantitativa del cido D-lctico. No es R = 89.1 mg/kg s(R) = 31.5 mg/kg
necesario hacer una extrapolacin al tiempo de adicin de la Para ms datos ver referencia (Ref. 2.1)
solucin 4 (D-LDH) cuando las absorbancias de las muestras y el Vino: r = 0.02 + 0.07 xi R = 0,05 + 0,125 xi
blanco se leen inmediatamente una despus de la otra. xi = conc. cido L-lctico en g/l
Si hay una reaccin creep adicional dependiente de la muestra, (Ref. 2.14, 2.15)
debe determinarse el valor correcto de A2 para el clculo de cido D-
lctico por extrapolacin de las absorbancias al tiempo de adicin de 7. Interferencias / fuentes de error
la solucin 4 (D-LDH). La presencia de trazas de glutamato deshidrogenasa (GIDH) en la
Para el clculo de Acido L-lctico deben utilizarse la ltima medicin de GPT puede resultar en reacciones creep dependientes de los
A2 y A3 que se determinaron por extrapolacin, de ser necesario, de reactivos. No se necesita extrapolar los valores medidos de A2 si las
las absorbancias al momento de la adicin de la solucin 5 (L-LDH). absorbancias del blanco y de las muestras se leen inmediatamente
2.5. La determinacin de las formas estero-isomricas del cido una despus de la otra y si no hay reaccin creep dependiente de
lctico se realizan la muestra. Ver tambin Pto. 2.4.
una tras la otra, en donde la forma del lactato que se
encuentra en menos concentracin en la muestra se mide 8. Reconociendo interferencias durante el desarrollo del ensayo

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8.1 Si la conversin de cido D- y L-lctico se completa de acuerdo cantidad suficiente de muestra dentro del recipiente graduado de 100
al tiempo estipulado en Procedimiento, se puede concluir, ml que contenga aproximadamente 60 ml de agua bidestilada.
generalmente, que no han ocurrido interferencias. Seguidamente agregar con mucho cuidado 5 ml de solucin de
8.2 Al finalizar la reaccin, la determinacin puede reiniciarse Carrez-I (hexacianoferrato de potasio (II) (ferrocianuro), 85 mM =
agregando cido D- y L-lctico D- y L-lactato (cualitativa 3.60 g K4[Fe(CN)6] 3 H2O/100 ml) y 5 ml de solucin de Carrez-II
cuantitativamente): si la absorbancia se altera subsecuentemente a (sulfato de zinc, 250 mM = 7.20 g ZnSO4 7 H2O/100 ml). Ajustar a
la adicin del material estndar, es tambin indicio que no han pH 7.5-8.5 con solucin de hidrxido de sodio (0.1 M; ej. 10 ml).
ocurrido interferencias. Mezclar luego de cada adicin. Llevar el volumen a 100 ml, mezclar
8.3 Se pueden reconocer errores de operatividad interferencia de y filtrar.
la determinacin por la presencia de sustancias presentes en la
muestra realizando una doble determinacin utilizando dos 11. Ejemplos de aplicacin
volmenes diferentes (ej. 0.100 ml y 0.200 ml): las diferencias Determinacin de cido D- y L-lctico en jugos de fruta y
medidas de absorbancia deben ser proporcionales a los volmenes vegetales y bebidas similares
de muestra utilizados. Filtrar los jugos turbios y diluir hasta obtener una concentracin de
Cuando se analizan muestras slidas, se recomienda pesar cido D- y L-lctico de aprox. 0.03 a 0.35 g/l. La solucin diluida se
diferentes cantidades (ej. 1 g y 2 g) en recipientes de 100 ml. Las puede utilizar en el ensayo auque sea levemente coloreada.
diferencias medidas de las absorbancias y los pesos de las muestras Solamente los jugos fuertemente coloreados se deben decolorar si
utilizados deben ser proporcionales para volmenes idnticos de van a utilizarse sin diluir para el ensayo. En dichos casos, proceder
muestra. como sigue: Mezclar 10 ml de jugo con aprox. 0.1 g de poliamida en
8.4 Se pueden reconocer posibles interferencias en la muestra polvo polivinilpolipirrolidona (PVPP), agitar por 1 min., y filtrar. Usar
causadas por sustancias contenidas en ella utilizando estndares la solucin clara, ligeramente coloreada para el ensayo.
internos como control: adems de la determinacin de la muestra, Es posible usar la clarificacin de Carrez para la preparacin de la
blanco y estndar, se debe llevar a cabo una determinacin con muestra:
muestra y solucin control del ensayo en la misma largada. La Pesar con exactitud aprox. 1 a 10 g de muestra en un recipiente de
recuperacin debe luego calcularse a partir de las diferencias de 100 ml, pipetear 1 a 10 ml de muestra, agregar aprox. 60 ml de
absorbancias medidas. agua y mezclar. Para la clarificacin, agregar 5 ml d solucin de
8.5 Se pueden reconocer posibles prdidas durante la determinacin Carrez-I (3.60 g hexaferrocianato de potasio (II), K4[Fe(CN)6] 3
llevando a cabo ensayos de recuperacin: la muestra debe H2O/100 ml), 5 ml de solucin de Carrez-II (7.20 g sulfato de zinc,
prepararse y analizarse con y sin el material estndar. La cantidad ZnSO4 7 H2O/100 ml) y 10 ml NaOH (0.1 M), agitar luego de cada
adicionada debe recuperarse cuantitativamente con el mismo rango adicin, llevar a volumen con agua y filtrar. Usar la solucin clara,
de error que el mtodo. levemente turbia para el ensayo y diluir si es necesario.

9. Riesgo de los reactivos Determinacin de cido D- y L-lctico libre en vino


Los reactivos utilizados en la determinacin de cido D- y L-lctico La determinacin de cido D- y L-lctico libre en vino blanco y tinto
no son materiales riesgosos de acuerdo a las Regulaciones de puede hacerse usualmente sin dilucin ni decoloracin previa.
Sustancias Peligrosas, las Leyes Qumicas la Regulacin
Determinacin de cido D- y L-lctico libre y esterificado en vino
67/548/EEC de la CEE y subsecuentes Guas de alteraciones,
Para determinar el contenido total de cido D- y L-lctico, calentar 20
suplementos y adaptaciones. An as, deben cumplirse todas las
ml de vino y 2 ml de hidrxido de sodio (2 M) por 15 min bajo
medidas de seguridad generales que se aplican a todas las
condensador de reflujo, dejar enfriar a 20-25C y neutralizar con
sustancias qumicas.
cido sulfrico (1 M, usar papel indicador). Transferir la solucin
Luego de su utilizacin, los reactivos deben desecharse con el
cuantitativamente a un recipiente de 50 ml, llevar a volumen con
descarte del laboratorio, pero deben observarse siempre las
agua y mezclar. Usar la muestra para el ensayo de acuerdo al
regulaciones locales. El material de empaque puede desecharse en
procedimiento estndar. Vinos con alto contenido de azcar deben
recipientes destinados al reciclado.
calentarse con agua en vez de NaOH en condensador de reflujo por
10. Informacin general sobre la preparacin de muestra 15 min.
Al llevar a cabo el ensayo:
Determinacin de cido D- y L-lctico en cerveza
Usar muestras lquidas lmpidas, incoloras y prcticamente
Para eliminar el cido carbnico revolver aprox. 5-10 ml de cerveza
neutras directamente luego de diluirlas de acuerdo a la tabla de
por aprox. 1 min con una varilla de vidrio y filtrar. La muestra libre de
dilucin, y usar un volumen hasta 1.000 ml.
CO2 puede usarse directamente para el ensayo.
Filtrar soluciones turbias;
Desgasear muestras que contengan dixido de carbono (ej. por Determinacin de cido D- y L-lctico en lquidos que contienen
filtracin); vinagre
Ajustar muestras cidas que se van a utilizar sin diluir a un pH Usar 0.100 ml de vinagre de vino jugo de picle de pepino
aproximado de 8-10 por el agregado de una solucin de hidrxido de directamente para el ensayo. El alto contenido de cido actico
sodio de potasio; inhibe el ensayo. Por lo tanto hay que esperar a que finalice la
Ajustar muestras cidas y levemente coloreadas a pH 8-10 por el reaccin (30-40 min.) antes de leer las absorbancias.
agregado de una solucin de hidrxido de sodio de potasio e
incubacin por 15 min; Determinacin de cido D- y L-lctico en jugo de chucrut
Medir la muestras coloreadas (si es necesario ajustar el pH a 8- Transferir 1.00 ml de jugo de chucrut en un recipiente de 100 ml,
10) contra blanco de muestra (= buffer agua destilada + muestra), llevar a volumen con agua y mezclar. Usar la solucin diluida (1 +
ajustar el fotmetro a 0.000 con el blanco en la cubeta, 99) para el ensayo.
especialmente si hay reacciones creep antes de la adicin de la
solucin 4 (D-LDH); Determinacin de cido D- y L-lctico en yogur (leche)
Tratar las muestras altamente coloreadas que se usan sin diluir Mezclar 2 g de yogur (leche) con 98 ml de agua (usar un
en grandes volmenes con polivinilpolipirrolidona (PVPP) con homogeneizador elctrico); filtrar y usar 0.100 ml del filtrado para el
poliamida, ej. 1g/100ml; ensayo.
Moler homogeneizar las muestras slidas semislidas, extraer
Determinacin de cido D- y L-lctico en queso
con agua caliente disolver en agua y filtrar si es necesario; remover
Moler aprox. 10 g de queso y mezclar. Pesar con exactitud aprox. 1
turbidez y precipitados por clarificacin de Carrez.
g de la muestra en un recipiente de 100 ml, agregar aprox. 80 ml de
Desproteinizar las muestras que contengan protenas con cido
agua y calentar por 15 min. a 60 C con agitacin ocasional. Dejar
perclrico; alternativamente clarificar con reactivos de Carrez:
enfriar a 20-25C y llevar a volumen con agua. Para separar la
Extraer las muestras con grasa con agua caliente (la temperatura
grasa, mantener el recipiente en fro (refrigerador bao de hielo)
de extraccin debe superar el punto de fusin de la grasa
por 15 min., filtrar la solucin. Usar 0.100 ml (queso duro) 0.500 ml
involucrada). Enfriar para permitir que la grasa se separe, llevar a
(queso blando) del filtrado claro para el ensayo.
volumen. Colocar el recipiente en bao de hielo por 15 min. y filtrar;
alternativamente clarificar con Soluciones de Carrez luego de la Determinacin de cido D- y L-lctico en productos crnicos
extraccin con agua caliente. Pesar aprox. 5 g de muestra homogeneizada en un
homogeneizador, agregar aprox. 20 ml de cido perclrico (1 M) y
Clarificacin de Carrez:
homogeneizar por 10 min. Transferir el contenido en un recipiente
Pipetear la muestra lquida en un recipiente graduado de 100 ml que
con aprox. 40 ml de agua. Ajustar el pH a 10-11 con hidrxido de
contenga aproximadamente 60 ml de agua destilada, pesar una

2015-03 3/5
potasio (2 M) con agitacin continua (agitador magntico). Transferir 2.7. Ministero dell' Agricoltura e delle Foreste (1986) Approvazione dei "Metodi ufficiali di
analisi per i mosti, i vini, gli agri di vino (aceti) e i sottoprodotti della vinificazione". Gazzetta
el contenido cuantitativamente a un recipiente volumtrico de 100 ml Ufficiale della Repubblica Italiana, n. 161 del 14 luglio 1986
con agua. Llevar a volumen con agua teniendo en cuenta que la fase 2.8 Ministero dell' Agricoltura e delle Foreste (1986) Approvazione dei "Metodi ufficiali di
lipdica est sobre la marca y la fase acuosa en la marca. Agitar la analisi per i formaggi". Gazzetta Ufficiale della Repubblica Italiana, n. 229 del 2 ottobre 1986
2.9 Niederlande: Warenwet, Uitvoeringsvoorschriften (C II-6) Regeling
mezcla. Para la separacin de la capa lipdica y para la precipitacin Onderzoekingsmethoden voor brood; Methode 17: De Bepaling van Melkzuur (Oktober
de perclorato de potasio, refrigerar por 20 min. Luego filtrar. 1986); Dit voorschrift betrift een methode voor de bepaling van melkzuur (lactaten) in het in
Descartar los primeros mililitros. Usar la solucin clara, algo turbia brood verwerkte meel
2.10 International Dairy Federation, International IDF Standard 69B (1987) Dried Milk,
para el ensayo, diluida si es necesario. Determination of Lactic Acid and Lactates Content, Enzymatic Method
2.11 RSK-Values, The Complete Manual, Guide Values and Ranges of Specific Numbers for
12. Determinacin de steres de cido lctico Fruit Juices and Nectars, Including the Revised Methods of Analysis (1987), 1st ed., Verlag
(ej. ster glicrido de cido lctico, emulsionantes) Flssiges Obst/Liquid Fruit, D-56370 Eschborn, pp. 107-111
2.12 Deutsche Norm DIN 10335 (Juni 1987) Bestimmung des Gehaltes an L- und D-
El cido lctico unido a steres mono y diglicridos de cido lctico Milchsure (L- und D-Lactat) in Milch und Milchprodukten, Enzymatisches Verfahren
tambin puede ser determinado simultneamente con el cido lctico 2.13 Council Directive of 20 June 1989 on hygiene and health problems affecting the
libre (lactato), por extraccin de la muestra con cloroformo y production and the placing on the market of egg products (89/437/EEC), Official Journal No.
L 212, 22/07/89 p. 0087
saponificacin posterior de los steres con solucin de hidrxido de 2.14 Recueil des mthodes internationales d'analyse des vins et des mots, Complment n
potasio. Proceder como sigue: 1 l'dition officielle de juin 1990, OFFICE INTERNATIONAL DELA VIGNE ET DU VIN, S.
Hervir la muestra pulverizada y homogeneizada conteniendo hasta 179-182
2.15 Official Journal of the European Communities L 272 (3 October 1990), Legislation:
200 mg de steres monoglicridos de cido lctico (ej. monooleil Commission Regulation (EEC) No 2676/90 of 17 September 1990 determining Community
lactil gliceril ster, PM aprox. 445) hasta 250 mg de steres methods for the analysis of wines (pp. 97-100)
diglicridos de cido lctico (ej. dioleil lactil gliceril ster, PM aprox. 2.16 Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten,
VDLUFA (1993) Methodenbuch Band VI, C8.6
535) con aprox. 50 ml de cloroformo por 2 horas en recipiente de 250 2.17 Deutsche Norm DIN EN 12631 (April 1999) Frucht- und Gemsesfte: Enzymatische
ml con Bestimmung des Gehaltes an D- und L-Milchsure (Lactat)
condensador de reflujo. Filtrar y lavar el precipitado con cloroformo. 2.18 Europische Norm / European Standard EN 12631 (April 1999) Frucht- und
Gemsesfte: Enzymatische Bestimmung des Gehaltes an D- und L-Milchsure (Lactat) -
Evaporar el cloroformo en evaporador rotatorio. Hervir el residuo, Spektralphotometrische Bestimmung von NAD (Fruit and vegetable juices Enzymatic
evaporado casi a sequedad, con 25 ml de KOH metanlico (1 M) por determination of D- and L-lactic acid (lactate) content - NAD spectrometric method)
10 min bajo condensador de reflujo. Dejar enfriar a 20-25C y 2.19 Standard der Russischen Fderation / Standard of the Russian Federation /
GOSSTANDART ROSSII GOST R 51196-98 (1998) Dried milk. Method for determination of
neutralizar acidificar ligeramente con aprox. 5 ml de HCL (5 M). lactic acid and lactates
Transferir cuantitativamente a un recipiente de 100 ml, llevar a 3.1 Duran, M., van Biervliet, J.P.G.M., Kamerling, J.P. & Wadman, S. K. (1977) D-Lactic
volumen con agua, mezclar y filtrar. Usar la solucin relativamente aciduria, an inborn error of metabolism? Clin. Chim. Acta 74, 297-300
3.2 Kandler, O. (1982) Grungsmechanismen bei Milchsurebakterien, Forum Mikrobiologie
clara para el ensayo. Para dicha determinacin debe tomarse en 5, 16-22 3.3 Giesecke, D., Stangassinger, M. & Henle, K. (1985) D(-)-Milchsure - ein
cuenta el peso molecular del glicrido presente. Stoffwechselproblem, Zeitschrift fr Ernhrungswissenschaft 24, 172-186
3.4 Barth, C. A. & de Vrese, M. (1984) D-Lactat im Stoffwechsel des Menschen Fremdstoff
13. Otras aplicaciones oder physiologischer Metabolit? Kieler Milchwirtschaftliche Forschungsberichte 36, 155-161
3.5 de Vrese, M., Koppenhoefer, B. & Barth, C.A. (1990) D-Lactic acid metabolism after an
El mtodo tambin puede ser utilizado para analizar cosmticos oral load of DL-lactate, Clinical Nutrition
(Ref. 5.1), papel, frmacos en investigacin para anlisis de 3.6 Bssler, K.H. (1988) Die physiologische Rolle von Laktat im Licht neuerer Erkenntnisse,
muestras biolgicas. Para detalles de muestreo, tratamiento y Ernhrungs-Umschau 35, 71-74
4.1 Mayer, K. & Pause, G. (1969) Enzymatische Milchsurebestimmung in Weinen, Mitt.
estabilidad de la muestra ver Ref. 1.3, 1.4. Geb. Lebensm. Unters. Forsch. 60, 230-233
4.2 Postel, W. Drawert, F. & Hagen, W. (1973) Enzymatische Untersuchungen ber den
Determinacin de cido L-lctico en muestras de fermentacin y Gehalt an L(+)- und D(-)-Lactat in Weinen, Z. Lebensm.-Unters. u. Forsch. 150, 267-273
medio de cultivo de clulas 4.3 Bandion, F. & Valenta, M. (1977) Zur Beurteilung des D(-)- und L(+)-Milchsuregehalts
in Wein, Mitt. Klosterneuburg 27, 4-10
Colocar la muestra (luego de centrifugar si es necesario) en un bao 4.4 Drawert, F. & Hagen, W. (1970) Enzymatische Analysenmethoden zur Bestimmung von
de agua a 80C por 15 min para detener las reacciones enzimticas. Wrze- und Bier-Inhaltsstoffen, I. Bestimmung von L(+)- und D(-)-Milchsure in Bier,
Centrifugar y utilizar el sobrenadante (diluido de acuerdo a la tabla Brauwissenschaft 23, 1-6
4.5 Piendl, A. & Wagner, I. (1983) Physiologische Eigenschaften der organischen Suren
de dilucin si es necesario) para el ensayo. Alternativamente se des Bieres; 3. L(+)-Lactat und D(-)-Lactat, Brauindustrie 68,1520-1528
puede desproteinizar con cido perclrico con reactivos de Carrez. 4.6 Steffen, Chr. (1971) Methoden zur Bestimmung der Gesamtmilchsure und der
Ver los ejemplos mencionados anteriormente. Lactatkonfiguration in Kse und Milch, Schweiz.Milchzeitung 97, 1073-1078
4.7 Steffen, Ch., Nick, B. & Blanc, B. H. (1973) Konfiguration der Milchsure verschiedener
Homogeneizar medio gelatinoso de agar con agua y proseguir el Milchsurebakterienstmme in Abhngigkeit fabrikationstechnischer Bedingungen, Schweiz.
tratamiento como se ha descrito Milchw. Forsch. 2, 37-52
4.8 Zaadhof, K.-J., Kohler, J. & Terplan, G. (1975) Erhebungen ber den L(+)- und D(-)-
Referencias Lactat- sowie Pyruvatgehalt in Trockenmilchprodukten, Deutsche Molkerei-Zeitung F.9, 228-
1.1 Gutmann, I. & Wahlefeld, A.W. (1974) in Methoden der enzymatischen Analyse 233
(Bergmeyer, H.U., Hrsg.) 3. Aufl., Bd. 2, 1510-1514; Verlag Chemie, Weinheim, and (1974) 4.9 Kielwein, G. & Daun, U. (1979) Vorkommen und Bedeutung von D(-)-Milchsure in
in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 2nd ed., vol. 3, pp. 1464-1468; fermentierten Milcherzeugnissen unter besonderer Bercksichtigung von Mischerzeugnissen
Verlag Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc., New York and London auf Joghurtbasis, Deutsche Molkerei-Zeitung 30, 290-293
1.2 Noll, F. (1966) Methode zur quantitativen Bestimmung von L(+)-Lactat mittels Lactat- 4.10 Jager, H.H. & Tschager, E. (1980) Die enzymatische Bestimmung von L-Milchsure,
Dehydrogenase und Glutamat-Pyruvat-Transaminase, Biochem. Z. 346, 41-49 DMilchsure, Glutaminsure, Essigsure und Brenztraubensure im Kse,
1.3 Noll, F. (1974) in Methoden der enzymatischen Analyse (Bergmeyer, H. U., Hrsg.) 3. Milchwirtschaftliche Berichte 64, 235-240
Aufl., Bd. 2, S. 1521-1525; Verlag Chemie, Weinheim, and (1974) in Methods of Enzymatic 4.11 Schiweck, H. & Bsching, L. (1972) Die Bildung von D- und L-Milchsure whrend des
Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 2nd ed., vol. 3, pp. 1475-1479; Verlag Chemie, Weinheim/ Fabrikationsprozesses, Zucker 25, 7-12
Academic Press, Inc., New York and London 4.12 van der Poel, P. W. (1975) Die mikrobiologische berwachung des Extraktionssystems
1.4 Noll, F. (1984) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 3rd ed., vol. VI, durch die Milchsurebestimmung, Zucker 28, 295-298
pp. 582-588, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach/Florida, Basel 4.13 Kubadinow, N. & Rsner, G. (1977) Die enzymatische Bestimmung von D- und L-
1.5 Gawehn, K. & Bergmeyer, H. U. (1974) in Methoden der enzymatischen Analyse Milchsure in Betriebssften der Zuckerproduktion, ZUCKER 30, 420-426
(Bergmeyer, H. U., Hrsg.) 3. Aufl., Bd. 2, S. 1538-1541; Verlag Chemie, Weinheim, and 4.14 Sinell, H.-J. & Luke, K. (1979) D(-)-Lactat als Parameter fr die mikrobielle Belastung
(1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 2nd ed., vol. 3, pp. 1492- von vakuumverpacktem Brhwurstaufschnitt, Fleischwirtschaft 59, 547-550
1495; Verlag Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc., New York and London 4.15 Schneider, W., Hildebrandt, G. & Sinell, H.-J. (1983) D(-)-Lactat-Konzentration als
1.6 Gawehn, K. (1984) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 3rd ed., Parameter fr die Bewertung des Frischezustandes vorverpackter, hitzebehandelter
vol. VI, pp. 588-592, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach/Florida, Basel Fleischerzeugnisse, Fleischwirtschaft 63, 1198-1205
2.1 Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach 35 LMBG; Untersuchung von 4.16 Spicher, G. & Rabe, E. (1981) Die Mikroflora des Sauerteigs (XII. Mitteilung), Z.
Lebensmitteln: Bestimmung von L- und D-Milchsure (L- und D-Lactat) in Lebensm. Unters. Forsch. 172, 20-25
Fleischerzeugnissen, 07.00-15 (November 1981); Bestimmung von L- und D-Milchsure 4.17 Klopper, W. J., Angelino, S.A.G.F., Tuning, B. & Vermeire, H.A. (1986) Organic acids
(Lund D-Lactat) in Wurstwaren, 08.00-17 (November 1981); Bestimmung von L- und and glycerol in beer, J.Inst.Brew. 92, 225-228
Dmilchsure (L- und D-Lactat) in Milch und Milchprodukten, 01.00-26 (Juni 1987); 4.18 Stoya, W., Wachendrfer, G., Kary, I., Siebentritt, P. & Kaiser, E. (1987) Milchsure als
Bestimmung von L- und D-Milchsure (L- und D-Lactat) in Milchprodukten, 02.00-16 (Juni Therapeutikum gegen Varroatose und ihre Auswirkung auf den Honig, Deutsche
1987); Bestimmung von L-Milchsure, Bernsteinsure und D-3-Hydroxybuttersure in Ei und Lebensmittel-Rundschau 83, 283-286
Eiprodukten, 05.00-2 (November 1987) 4.19 Liepe, H.-U. (1987) Milchsaure Gemsesfte mit Starterkulturen, Flssiges Obst 54,
2.2 Schweizerisches Lebensmittelbuch, Kapitel 61B (Enzymatische Bestimmungen)/3.3. 380-381
(1981), Kapitel 1 (Milch)/5.2 (1995), Kapitel 2B (Sauermilchprodukte)/18 (1980), Kapitel 4 4.20 Littmann-Nienstedt, S. & Beutler, H.-O. (1988) Auswertung des Ringversuches der
(Milchdauerwaren)/10.4 (1993), Kapitel 28A (Frucht- und Gemsesfte u.a.)/7.5 (1988), Arbeitsgruppe Ei-Analytik" zur Bestimmung von L(-)-Milchsure, 3-Hydroxybuttersure und
Kapitel 30A (Wein aus Trauben)/6.4 (1993), Kapitel 34 (Grungsessig)/4.4 (1994) Bernsteinsure in Eiprodukten, Deutsche Lebensmittel-Rundschau 84, 320-322 4.21
2.3 Gombocz, E., Hellwig, E., Vojir, F. & Petuely, F. (1981) Deutsche Lebensmittel- Franzke, Cl. & Kroll, J. (1980) Zur enzymatischen Milchsure-Bestimmung in Emulgatoren,
Rundschau 77, 6-7 Die Nahrung 24, 89-90
2.4 Brautechnische Analysenmethoden, Band III, S. 572-576 (1982), Methodensammlung 4.22 Schlimme, E., Lorenzen, P. Chr., Martin, D. & Thormhlen, K. (1996) Analytical
der Mitteleuropischen Brautechnischen Analysenkommission (MEBAK), herausgegeben differentiation of butter types by specific compositional parameters of the aqueous butter
von F. Drawert im Selbstverlag der MEBAK, Freising phase, Milchwissenschaft 51, 139-143
2.5 International Federation of Fruit Juice Producers (IFU, Methods of Analysis, no. 53- 5.1 Henniger, G. & Boos, H. (1978) Anwendung der enzymatischen Analyse bei der
1983) ; contained in "Code of Practice for Evaluation of Fruit and Vegetable Juices" (1996) Untersuchung kosmetischer Prparate - dargestellt an einigen Beispielen, Seifen - le
edited by Association of the Industry of Juices and Nectars from Fruits and Vegetables of Fette - Wachse 104, 159-164
the European Economic Community (A.I.J.N.)
2.6 International Standard ISO 8069 (Juni 1986) Dried milk - Determination of lactic acid and
lactates content - Enzymatic method

2015-03 4/5
Soluciones control de cido D-lctico y L-lctico
Concentraciones: ver etiqueta de las botellas 3. Estndar interno:
Las Soluciones control de cido D-lctico y de cido L-lctico son Las soluciones control del ensayo pueden utilizarse como
soluciones acuosas estabilizadas de cido D-lctico y de cido L- estndares internos para controlar el correcto funcionamiento del
lctico. Sirven como soluciones control del ensayo enzimtico para la ensayo (errores groseros) y para ver si la solucin de muestra est
determinacin de cido D-lctico y de cido L-lctico en alimentos y libre de sustancias interferentes.
otros materiales.
Pipetear dentro Muestra +
Blanco Muestra Estndar
Aplicacin: de la cubeta estndar
1. Adicin de la solucin control de cido D-lctico L-lctico a la Solucin 1 1.000 ml 1.000 ml 1.000 ml 1.000 ml
mezcla de reaccin: Solucin 2 0.200 ml 0.200 ml 0.200 ml 0.200 ml
La solucin control se utiliza en el ensayo en lugar de la solucin de Suspensin 3 0.020 ml 0.020 ml 0.020 ml 0.020 ml
muestra para el ensayo (0.100 ml de solucin control de cido D- Solucin - 0.100 ml - 0.050 ml
lctico 0.100 ml de solucin control de cido L-lctico). muestra - - 0.100 ml 0.050 ml
2. Reiniciar la reaccin, cuantitativamente: Control ensayo 1.000 ml 0.900 ml 0.900 ml 0.900 ml
Luego de finalizada la reaccin con la solucin de muestra y la Agua destilada
medicin de A3, agregar 0.050 ml de solucin control del ensayo a la Mezclar y leer las absorbancias de las soluciones (A1) luego de
mezcla de reaccin. Leer la absorbancia A4 luego de finalizada la aprox. 5 min. Continuar como se describe el esquema de pipeteo
reaccin (aprox. 30 min.). Calcular la concentracin de la diferencia bajo Procedimientos. Seguir las instrucciones descriptas en
(A4-A3) de acuerdo a la ecuacin general para el clculo de la Instrucciones para el desarrollo del ensayo y en las notas al pie.
concentracin. Debe tomarse en cuenta la variacin en el volumen
total. Aunque hay una dilucin de la mezcla de reaccin por el La recuperacin del estndar se calcula de acuerdo a la siguiente
agregado de la solucin control del ensayo, los resultados no difieren frmula:
significativamente de los datos estipulados en la etiqueta de la 2 x A muestra + estndar - A muestra
botella. recuperacin = ----------------------------------------------- x 100 (%)
A estndar

Tambin disponible
Test combinado Acido L-Lctico Cat. Nro. 0 139 084

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