BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM

cido D-Lctico/L-Lctico Enzymatic BioAnalysis/Food Analysis

Mtodo UV Para uso in vitro solamente Almacenar a 2-8 C

Para la determinacin de cido D- y L-lctico Esta traduccin en espaol has sido realizada por RBiopharm
en alimentos y otros materiales Latinoamrica con el objeto de ayudar a los usuarios a entender el
procedimiento, pero no se actualizan regularmente por lo que no
pueden remplazar las instrucciones en ingls. Las instrucciones de
uso que son vlidas, son aquellas incluidas en cada kit en Alemn y
Cat. No. 11 112 821 035 en Ingls, dado que estn escritas e impresas por el fabricante
(Roche). Refirase siempre a las instrucciones incluidas en cada kit.
Test-Combinado para 30 determinaciones c/u

Principio (Ref. A1)

En presencia de D-lactato deshidrogenasa (D-LDH), el cido D- Procedimiento
1
lctico (D-lactato) se oxida a piruvato por medio de la nicotinamida Longitud de onda : 340 nm, Hg 365 nm Hg 334 nm
2
adenina dinucletido (NAD). La oxidacin de cido L-lctico requiere Cubeta de vidrio : 1.00 cm de paso de luz
la presencia de la enzima L-lactato deshidrogenasa (L-LDH) (1,2). Temperatura: 20-25C
Volumen final: 2.240 ml (cido D-lctico)
+ D-LDH +
(1) D-lactato + NAD piruvato + NADH + H 2.260 ml (cido L-lctico)
Leer contra aire (sin cubeta en el paso de luz), contra
3
+ L-LDH + agua contra blanco
(2) L-lactato + NAD piruvato + NADH + H
Soluc. de muestra: 0.3-35 ug de cido D- y L-lctico/
4
El equilibrio de estas reacciones est en el lado del lactato. El ensayo (en 0.100-1.000 ml de volumen
equilibrio puede desplazarse a favor del piruvato y NADH, atrapando de muestra)
piruvato en una reaccin subsiguiente catalizada por la enzima
Pipetear en la cubeta Blanco Muestra
Glutamato piruvato transaminasa (GPT) en presencia de L-glutamato
(3) solucin 1 1.000 ml 1.000 ml
solucin 2 0.200 ml 0.200 ml
GTP
(3) Piruvato + L-glutamato L-alanina + 2-oxoglutarato suspensin 3 0.020 ml 0.020 ml
sol. muestra* - 0.100 ml
La cantidad de NADH formado en las reacciones precedentes es
estequiomtrica con la cantidad de cido D-lctico y de cido L- agua bidestilada 1.000 ml 0.900 ml

lctico respectivamente. El aumento en NADH se mide por medio de
su absorbancia a 334, 340 365 nm.
El test combinado contiene
1. Botella 1 con aprox. 30 ml de solucin de:
Buffer glicilglicina, pH aprox. 10.0; cido L-glutmico, 440 mg.
2. Botella 2 con aprox. 210 mg de NAD liofilizado.
3. Botella 3 con aprox. 0.7 ml de suspensin de glutamato piruvato
transaminasa, aprox. 1100 U.
4. Botella 4 con aprox. 0.7 ml de solucin de D-lactato
deshidrogenasa, aprox. 3800 U.
5. Botella 5 con aprox. 0.7 ml de solucin de L-lactato
deshidrogenasa, aprox. 3800 U.
6. Solucin de D-lactato para control del ensayo (la medicin de la
solucin control no es necesaria para el clculo de los resultados del
ensayo). Utilice la solucin control sin diluir (fecha de vencimiento:
ver etiqueta)
7. Solucin de L-lactato para control del ensayo (la medicin de la
solucin control no es necesaria para el clculo de los resultados del
ensayo). Utilice la solucin control sin diluir (fecha de vencimiento:
ver etiqueta)
Preparacin de las soluciones
1. Usar los contenidos de las botellas 1, 3, 4 y 5 sin diluir.
2. Disolver el contenido de la Botella 2 con 6 ml de agua destilada.
Estabilidad de los reactivos
Los contenidos de las Botellas 1, 3, 4 y 5 son estables a 2-8C (ver
etiqueta).
Llevar la Solucin 1 a 20-25C antes de su uso.
El contenido de la botella 2 es estable a 2-8C (ver etiqueta).
La solucin 2 es estable por 3 semanas a 2-8C y por 2 meses de -
15 a -25C.
Mezclar **, leer las absorbancias de las soluciones (A1) luego de aprox. 5 min. Iniciar la
reaccin con:
solucin 4 0,020 ml 0,020 ml
Mezclar **, luego de finalizada la reaccin (aprox. 30 min.) leer las absorbancias de las
soluciones una inmediatamente despus de la otra (A2) (ver Pto. 2.4). Agregar
solucin 5 0,020 ml 0,020 ml
Mezclar **, luego de finalizada la reaccin (aprox. 30 min.) leer las absorbancias de las
soluciones una inmediatamente despus de la otra (A3)
* Enjuagar el tip de la pipeta con solucin de muestra antes de dispensar la solucin de
muestra.
** Por ejemplo, con una esptula plstica por agitacin despus de cubrir la cubeta con
Parafilm (marca registrada de la American Can Company, Greenwich, Ct., USA).
Determinar la diferencia de absorbancias (A2 A1) para el blanco y
las muestras. Sustraer la diferencia de absorbancia del blanco de la
diferencia de absorbancia de la muestra correspondiente, para
obtener de esta manera A cido D-lctico.
Determinar la diferencia de absorbancias (A3 A2) para el blanco y
las muestras. Sustraer la diferencia de absorbancia del blanco de la
diferencia de absorbancia de la muestra correspondiente, para
obtener de esta manera A cido L-lctico.
Las diferencias en las medidas de absorbancia debe, como regla,
ser al menos de 0.100 unidades de absorbancia para obtener
suficiente precisin en los resultados (ver Instrucciones para el
rendimiento del ensayo y Sensibilidad y lmite de deteccin, punto
4).
Clculos
De acuerdo a la ecuacin general del clculo de las concentraciones:
V x MW
c = --------------------------- x A (g/l)
x d x v x 1000

V = volumen final (ml)

v = volumen de muestra (ml)
MW = peso molecular de la sustancia a ensayar (g/mol)
d = paso de luz (cm)
= coeficiente de extincin del NADH a:
-1 -1
340 nm = 6.3 (l x mmol x cm )
-1 -1
1 La absorcin mxima de NADH es a 340 nm. En espectrofotmetros las mediciones se Hg 365 nm = 3.4 (l x mmol x cm )
-1 -1
toman a la mxima absorcin, si se utilizan fotmetros espectrales equipados con lmpara Hg 334 nm = 6.18 (l x mmol x cm )
de vapor de mercurio, las mediciones se toman a 365 nm 334 nm.
2 Si se desea se pueden utilizar cubetas descartables en lugar de cubetas de vidrio.
3 Por ejemplo cuando se usa un fotmetro de doble haz.
4 Ver instrucciones para el rendimiento del kit

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Corresponde para cido D-lctico:
2.240 x 90.1 2.018
c = ------------------------------ x A = ------------ x A (g D-lctico. / l
x 1.00 x 0.100 x 1000 sol. de muestra)
Corresponde para cido L-lctico:
2.260 x 90.1 2.036
c = ------------------------------ x A = ------------ x A (g L-lctico. / l
x 1.00 x 0.100 x 1000 sol. de muestra)
Si la muestra se ha diluido durante la preparacin, los resultados
deben multiplicarse por el factor de dilucin F.
Cuando se analizan muestras slidas semislidas que se pesan
para la preparacin de la muestra, los resultados se calculan a partir
de la cantidad pesadas:
c D-lctico (g/l de sol. )
Contenido D-lctico = -------------------------------------- x 100 (g / 100g)
peso muestra en g/l sol.
c L-lctico (g/l de sol. )
Contenido L-lctico = --------------------------------------- x 100 (g / 100g)
peso muestra en g/l sol.
1. Instrucciones para el funcionamiento del kit
La cantidad de cido D- y L-lctico presente en el ensayo debe ser
entre 0.5 ug y 35 ug (medidos a 365 nm) 0.3 ug y 20 ug (medidos a
340, 334 nm) respectivamente. Para obtener una diferencia de
absorbancias suficiente, la solucin de muestra debe diluirse para
dar una concentracin de cido D- y L-lctico entre 0.06 y 0.35 g/l
0.03 y 0.2 g/l respectivamente.
Tabla de dilucin
Cantidad estimada de cido D- Dilucin con Dilucin
y L-lctico por litro agua factor F
medido a
340 334 nm 365 nm
< 0.2 g < 0.35 g - 1
0.2-2.0 g 0.5-3.5 g 1+9 10
2.0-20.0 g 3.5-35 g 1 + 99 100
> 20g >35g 1 + 999 1000
Si las diferencias de absorbancia medidas (A) son muy pequeas
(ej. < 0.100), la solucin de muestra debe prepararse nuevamente
(pesar mas muestra diluir menos) se puede aumentar el volumen
se muestra en la pipeta hasta 1.000 ml. El volumen de agua
agregado debe, por lo tanto, disminuirse para tener el mismo
volumen final para blanco y muestra. El nuevo volumen de muestra v
debe tenerse en cuenta en el clculo.
2. Informacin tcnica
2.1. La transpiracin de las manos contiene cido L-lctico. Debe
tenerse cuidado de no tocar los tips de las pipetas con las manos.
2.2. Al hacer los clculos, debe indicarse claramente si los
resultados se van a expresar como cido L-lctico (masa molar 90.1
g/mol) como lactato (masa molar 89.1 g/mol). (En las mediciones
enzimticas, tambin se mide el ion lactato).
2.3. Al evaluar los resultados analticos, debe tenerse en cuenta que
en la determinacin acidimtrica del cido total calculado como
cido L-lctico, se miden protones y que en la determinacin
enzimtica se miden los iones L-lactato. Es por ello que no se
pueden comparar dichos resultados directamente.
2.4. Puede haber una reaccin creep dependiente de los reactivos
en A2 luego de la conversin cuantitativa del cido D-lctico. No es
necesario hacer una extrapolacin al tiempo de adicin de la
solucin 4 (D-LDH) cuando las absorbancias de las muestras y el
blanco se leen inmediatamente una despus de la otra.
Si hay una reaccin creep adicional dependiente de la muestra,
debe determinarse el valor correcto de A2 para el clculo de cido D-
lctico por extrapolacin de las absorbancias al tiempo de adicin de
la solucin 4 (D-LDH).
Para el clculo de Acido L-lctico deben utilizarse la ltima medicin de
A2 y A3 que se determinaron por extrapolacin, de ser necesario, de
las absorbancias al momento de la adicin de la solucin 5 (L-LDH).
2.5. La determinacin de las formas estero-isomricas del cido
lctico se realizan
una tras la otra, en donde la forma del lactato que se
encuentra en menos concentracin en la muestra se mide
primero. Se debe utilizar el volumen total correspondiente
(V) para el clculo de los resultados.
en paralelo en ensayos independientes, ej. cuando la
relacin entre L-lactato y D-lactato, viceversa, es mayor
que 5 a 1. En dicho caso, la solucin de muestra debe
prepararse de modo que la diferencia de absorbancias se
lo suficientemente grande (ej. > 0.100) para obtener
resultados lo suficientemente precisos. Alternativamente,
la solucin de muestra puede diluirse el volumen de
muestra puede aumentarse.
2.6. El cido lctico comercial puede contener formas estero-
isomricas en una relacin 1:1. Adems, el cido lctico libre forma
parcialmente el dmero lactil-lactato que no reacciona en el ensayo
enzimtico. Por ello, no debe utilizarse cido lctico libre para
preparar una solucin control del ensayo. Las sales de litio y de
calcio son apropiadas para usarse como control.
3. Especificidad (Ref. 1)
El mtodo es especfico para cido D- y L-lctico.
En el anlisis de D-lactato de litio comercial (PM 96.0), se esperan
resultados de aprox. 99%, en el anlisis de L-lactato de litio
comercial, se esperan resultados de aprox. 98%.
4. Sensibilidad y lmite de deteccin (Ref. 1)
La mnima diferencia en absorbancia para el procedimiento es de
0.005 unidades de absorbancia. Este valor corresponde a una
concentracin de cido D- L-lctico de 0.15 mg/l de solucin de
muestra con un volumen mximo de muestra v = 1.000 ml y
medicin a 340 nm (si se utiliza un v = 0.100 ml, esto corresponde a
1.5 mg/l por litro de solucin de muestra).
El lmite de deteccin de 0.3 mg/l deriva de la diferencia de
absorbancia de 0.010 (medida a 340 nm) y un mximo de volumen
de muestra de v = 1.000 ml.
5. Linealidad
La linealidad de la determinacin es desde aproximadamente 0.3 ug
de cido lctico /ensayo (0.3 mg cido lctico / l de solucin de
muestra, volumen de muestra v = 1.000 ml) hasta 35 ug de cido
lctico /ensayo (0.35 g de cido lctico /l de solucin de muestra,
volumen de muestra v = 0.100 ml).
6. Precisin
En una determinacin por duplicado utilizando una nica solucin de
muestra, pueden obtenerse diferencias de 0.005 a 0.010 unidades
de absorbancia. Con un volumen de muestra de v = 0.100 ml y
medido a 340 nm, esto corresponde a una concentracin
aproximada de cido lctico de 1.5-3 mg/l. (Si la muestra se diluye
durante la preparacin, el resultado debe multiplicarse por el factor
de dilucin F. Si la muestra se pesa durante la preparacin, ej. usar
1 g de muestra /100 ml = 10 g/l, se puede esperar una diferencia de
0.015-0.03 g/100 g).
En la literatura se han publicado los siguientes datos:
Acido D-Lctico:
CV = 1.96 % medio de cultivo (Ref. 1.5)
Yogur: x = 0.3 g/100 g r = 0.03 g/100 g R = 0.05 g/100 g
Leche polvo: x = 0.07 g/100 g r = 0.0008 g/100 g R = 0.003 g/100
g
Para ms datos ver referencia (Ref. 2.1)
Acido L-Lctico
CV = 2.3 % Sol. L-lactato de litio (Ref. 1.3)
Yogur: x = 0.6 g/100 g r = 0.05 g/100 g R = 0.07 g/100 g
Leche polvo: x = 0.112 g/100 g r = 0.008 g/100 g R = 0.015 g/100 g
Huevo entero en polvo:
x = 240 mg/kg r = 62.8 mg/kg s(r) = 22.2 mg/kg
R = 89.1 mg/kg s(R) = 31.5 mg/kg
Para ms datos ver referencia (Ref. 2.1)
Vino: r = 0.02 + 0.07 xi R = 0,05 + 0,125 xi
xi = conc. cido L-lctico en g/l
(Ref. 2.14, 2.15)
7. Interferencias / fuentes de error
La presencia de trazas de glutamato deshidrogenasa (GIDH) en la
GPT puede resultar en reacciones creep dependientes de los
reactivos. No se necesita extrapolar los valores medidos de A2 si las
absorbancias del blanco y de las muestras se leen inmediatamente
una despus de la otra y si no hay reaccin creep dependiente de
la muestra. Ver tambin Pto. 2.4.
8. Reconociendo interferencias durante el desarrollo del ensayo
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8.1 Si la conversin de cido D- y L-lctico se completa de acuerdo
al tiempo estipulado en Procedimiento, se puede concluir,
generalmente, que no han ocurrido interferencias.
8.2 Al finalizar la reaccin, la determinacin puede reiniciarse
agregando cido D- y L-lctico D- y L-lactato (cualitativa
cuantitativamente): si la absorbancia se altera subsecuentemente a
la adicin del material estndar, es tambin indicio que no han
ocurrido interferencias.
8.3 Se pueden reconocer errores de operatividad interferencia de
la determinacin por la presencia de sustancias presentes en la
muestra realizando una doble determinacin utilizando dos
volmenes diferentes (ej. 0.100 ml y 0.200 ml): las diferencias
medidas de absorbancia deben ser proporcionales a los volmenes
de muestra utilizados.
Cuando se analizan muestras slidas, se recomienda pesar
diferentes cantidades (ej. 1 g y 2 g) en recipientes de 100 ml. Las
diferencias medidas de las absorbancias y los pesos de las muestras
utilizados deben ser proporcionales para volmenes idnticos de
muestra.
8.4 Se pueden reconocer posibles interferencias en la muestra
causadas por sustancias contenidas en ella utilizando estndares
internos como control: adems de la determinacin de la muestra,
blanco y estndar, se debe llevar a cabo una determinacin con
muestra y solucin control del ensayo en la misma largada. La
recuperacin debe luego calcularse a partir de las diferencias de
absorbancias medidas.
8.5 Se pueden reconocer posibles prdidas durante la determinacin
llevando a cabo ensayos de recuperacin: la muestra debe
prepararse y analizarse con y sin el material estndar. La cantidad
adicionada debe recuperarse cuantitativamente con el mismo rango
de error que el mtodo.
9. Riesgo de los reactivos
Los reactivos utilizados en la determinacin de cido D- y L-lctico
no son materiales riesgosos de acuerdo a las Regulaciones de
Sustancias Peligrosas, las Leyes Qumicas la Regulacin
67/548/EEC de la CEE y subsecuentes Guas de alteraciones,
suplementos y adaptaciones. An as, deben cumplirse todas las
medidas de seguridad generales que se aplican a todas las
sustancias qumicas.
Luego de su utilizacin, los reactivos deben desecharse con el
descarte del laboratorio, pero deben observarse siempre las
regulaciones locales. El material de empaque puede desecharse en
recipientes destinados al reciclado.
10. Informacin general sobre la preparacin de muestra
Al llevar a cabo el ensayo:
Usar muestras lquidas lmpidas, incoloras y prcticamente
neutras directamente luego de diluirlas de acuerdo a la tabla de
dilucin, y usar un volumen hasta 1.000 ml.
Filtrar soluciones turbias;
Desgasear muestras que contengan dixido de carbono (ej. por
filtracin);
Ajustar muestras cidas que se van a utilizar sin diluir a un pH
aproximado de 8-10 por el agregado de una solucin de hidrxido de
sodio de potasio;
Ajustar muestras cidas y levemente coloreadas a pH 8-10 por el
agregado de una solucin de hidrxido de sodio de potasio e
incubacin por 15 min;
Medir la muestras coloreadas (si es necesario ajustar el pH a 8-
10) contra blanco de muestra (= buffer agua destilada + muestra),
ajustar el fotmetro a 0.000 con el blanco en la cubeta,
especialmente si hay reacciones creep antes de la adicin de la
solucin 4 (D-LDH);
Tratar las muestras altamente coloreadas que se usan sin diluir
en grandes volmenes con polivinilpolipirrolidona (PVPP) con
poliamida, ej. 1g/100ml;
Moler homogeneizar las muestras slidas semislidas, extraer
con agua caliente disolver en agua y filtrar si es necesario; remover
turbidez y precipitados por clarificacin de Carrez.
Desproteinizar las muestras que contengan protenas con cido
perclrico; alternativamente clarificar con reactivos de Carrez:
Extraer las muestras con grasa con agua caliente (la temperatura
de extraccin debe superar el punto de fusin de la grasa
involucrada). Enfriar para permitir que la grasa se separe, llevar a
volumen. Colocar el recipiente en bao de hielo por 15 min. y filtrar;
alternativamente clarificar con Soluciones de Carrez luego de la
extraccin con agua caliente.
Clarificacin de Carrez:
Pipetear la muestra lquida en un recipiente graduado de 100 ml que
contenga aproximadamente 60 ml de agua destilada, pesar una
2015-03
cantidad suficiente de muestra dentro del recipiente graduado de 100
ml que contenga aproximadamente 60 ml de agua bidestilada.
Seguidamente agregar con mucho cuidado 5 ml de solucin de
Carrez-I (hexacianoferrato de potasio (II) (ferrocianuro), 85 mM =
3.60 g K4[Fe(CN)6] 3 H2O/100 ml) y 5 ml de solucin de Carrez-II
(sulfato de zinc, 250 mM = 7.20 g ZnSO4 7 H2O/100 ml). Ajustar a
pH 7.5-8.5 con solucin de hidrxido de sodio (0.1 M; ej. 10 ml).
Mezclar luego de cada adicin. Llevar el volumen a 100 ml, mezclar
y filtrar.
11. Ejemplos de aplicacin
Determinacin de cido D- y L-lctico en jugos de fruta y
vegetales y bebidas similares
Filtrar los jugos turbios y diluir hasta obtener una concentracin de
cido D- y L-lctico de aprox. 0.03 a 0.35 g/l. La solucin diluida se
puede utilizar en el ensayo auque sea levemente coloreada.
Solamente los jugos fuertemente coloreados se deben decolorar si
van a utilizarse sin diluir para el ensayo. En dichos casos, proceder
como sigue: Mezclar 10 ml de jugo con aprox. 0.1 g de poliamida en
polvo polivinilpolipirrolidona (PVPP), agitar por 1 min., y filtrar. Usar
la solucin clara, ligeramente coloreada para el ensayo.
Es posible usar la clarificacin de Carrez para la preparacin de la
muestra:
Pesar con exactitud aprox. 1 a 10 g de muestra en un recipiente de
100 ml, pipetear 1 a 10 ml de muestra, agregar aprox. 60 ml de
agua y mezclar. Para la clarificacin, agregar 5 ml d solucin de
Carrez-I (3.60 g hexaferrocianato de potasio (II), K4[Fe(CN)6] 3
H2O/100 ml), 5 ml de solucin de Carrez-II (7.20 g sulfato de zinc,
ZnSO4 7 H2O/100 ml) y 10 ml NaOH (0.1 M), agitar luego de cada
adicin, llevar a volumen con agua y filtrar. Usar la solucin clara,
levemente turbia para el ensayo y diluir si es necesario.
Determinacin de cido D- y L-lctico libre en vino
La determinacin de cido D- y L-lctico libre en vino blanco y tinto
puede hacerse usualmente sin dilucin ni decoloracin previa.
Determinacin de cido D- y L-lctico libre y esterificado en vino
Para determinar el contenido total de cido D- y L-lctico, calentar 20
ml de vino y 2 ml de hidrxido de sodio (2 M) por 15 min bajo
condensador de reflujo, dejar enfriar a 20-25C y neutralizar con
cido sulfrico (1 M, usar papel indicador). Transferir la solucin
cuantitativamente a un recipiente de 50 ml, llevar a volumen con
agua y mezclar. Usar la muestra para el ensayo de acuerdo al
procedimiento estndar. Vinos con alto contenido de azcar deben
calentarse con agua en vez de NaOH en condensador de reflujo por
15 min.
Determinacin de cido D- y L-lctico en cerveza
Para eliminar el cido carbnico revolver aprox. 5-10 ml de cerveza
por aprox. 1 min con una varilla de vidrio y filtrar. La muestra libre de
CO2 puede usarse directamente para el ensayo.
Determinacin de cido D- y L-lctico en lquidos que contienen
vinagre
Usar 0.100 ml de vinagre de vino jugo de picle de pepino
directamente para el ensayo. El alto contenido de cido actico
inhibe el ensayo. Por lo tanto hay que esperar a que finalice la
reaccin (30-40 min.) antes de leer las absorbancias.
Determinacin de cido D- y L-lctico en jugo de chucrut
Transferir 1.00 ml de jugo de chucrut en un recipiente de 100 ml,
llevar a volumen con agua y mezclar. Usar la solucin diluida (1 +
99) para el ensayo.
Determinacin de cido D- y L-lctico en yogur (leche)
Mezclar 2 g de yogur (leche) con 98 ml de agua (usar un
homogeneizador elctrico); filtrar y usar 0.100 ml del filtrado para el
ensayo.
Determinacin de cido D- y L-lctico en queso
Moler aprox. 10 g de queso y mezclar. Pesar con exactitud aprox. 1
g de la muestra en un recipiente de 100 ml, agregar aprox. 80 ml de
agua y calentar por 15 min. a 60 C con agitacin ocasional. Dejar
enfriar a 20-25C y llevar a volumen con agua. Para separar la
grasa, mantener el recipiente en fro (refrigerador bao de hielo)
por 15 min., filtrar la solucin. Usar 0.100 ml (queso duro) 0.500 ml
(queso blando) del filtrado claro para el ensayo.
Determinacin de cido D- y L-lctico en productos crnicos
Pesar aprox. 5 g de muestra homogeneizada en un
homogeneizador, agregar aprox. 20 ml de cido perclrico (1 M) y
homogeneizar por 10 min. Transferir el contenido en un recipiente
con aprox. 40 ml de agua. Ajustar el pH a 10-11 con hidrxido de
3/5
potasio (2 M) con agitacin continua (agitador magntico). Transferir
el contenido cuantitativamente a un recipiente volumtrico de 100 ml
con agua. Llevar a volumen con agua teniendo en cuenta que la fase
lipdica est sobre la marca y la fase acuosa en la marca. Agitar la
mezcla. Para la separacin de la capa lipdica y para la precipitacin
de perclorato de potasio, refrigerar por 20 min. Luego filtrar.
Descartar los primeros mililitros. Usar la solucin clara, algo turbia
para el ensayo, diluida si es necesario.
12. Determinacin de steres de cido lctico
(ej. ster glicrido de cido lctico, emulsionantes)
El cido lctico unido a steres mono y diglicridos de cido lctico
tambin puede ser determinado simultneamente con el cido lctico
libre (lactato), por extraccin de la muestra con cloroformo y
saponificacin posterior de los steres con solucin de hidrxido de
potasio. Proceder como sigue:
Hervir la muestra pulverizada y homogeneizada conteniendo hasta
200 mg de steres monoglicridos de cido lctico (ej. monooleil
lactil gliceril ster, PM aprox. 445) hasta 250 mg de steres
diglicridos de cido lctico (ej. dioleil lactil gliceril ster, PM aprox.
535) con aprox. 50 ml de cloroformo por 2 horas en recipiente de 250
ml con
condensador de reflujo. Filtrar y lavar el precipitado con cloroformo.
Evaporar el cloroformo en evaporador rotatorio. Hervir el residuo,
evaporado casi a sequedad, con 25 ml de KOH metanlico (1 M) por
10 min bajo condensador de reflujo. Dejar enfriar a 20-25C y
neutralizar acidificar ligeramente con aprox. 5 ml de HCL (5 M).
Transferir cuantitativamente a un recipiente de 100 ml, llevar a
volumen con agua, mezclar y filtrar. Usar la solucin relativamente
clara para el ensayo. Para dicha determinacin debe tomarse en
cuenta el peso molecular del glicrido presente.
13. Otras aplicaciones
El mtodo tambin puede ser utilizado para analizar cosmticos
(Ref. 5.1), papel, frmacos en investigacin para anlisis de
muestras biolgicas. Para detalles de muestreo, tratamiento y
estabilidad de la muestra ver Ref. 1.3, 1.4.
Determinacin de cido L-lctico en muestras de fermentacin y
medio de cultivo de clulas
Colocar la muestra (luego de centrifugar si es necesario) en un bao
de agua a 80C por 15 min para detener las reacciones enzimticas.
Centrifugar y utilizar el sobrenadante (diluido de acuerdo a la tabla
de dilucin si es necesario) para el ensayo. Alternativamente se
puede desproteinizar con cido perclrico con reactivos de Carrez.
Ver los ejemplos mencionados anteriormente.
Homogeneizar medio gelatinoso de agar con agua y proseguir el
tratamiento como se ha descrito
Referencias
1.1 Gutmann, I. & Wahlefeld, A.W. (1974) in Methoden der enzymatischen Analyse
(Bergmeyer, H.U., Hrsg.) 3. Aufl., Bd. 2, 1510-1514; Verlag Chemie, Weinheim, and (1974)
in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 2nd ed., vol. 3, pp. 1464-1468;
Verlag Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc., New York and London
1.2 Noll, F. (1966) Methode zur quantitativen Bestimmung von L(+)-Lactat mittels Lactat-
Dehydrogenase und Glutamat-Pyruvat-Transaminase, Biochem. Z. 346, 41-49
1.3 Noll, F. (1974) in Methoden der enzymatischen Analyse (Bergmeyer, H. U., Hrsg.) 3.
Aufl., Bd. 2, S. 1521-1525; Verlag Chemie, Weinheim, and (1974) in Methods of Enzymatic
Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 2nd ed., vol. 3, pp. 1475-1479; Verlag Chemie, Weinheim/
Academic Press, Inc., New York and London
1.4 Noll, F. (1984) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 3rd ed., vol. VI,
pp. 582-588, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach/Florida, Basel
1.5 Gawehn, K. & Bergmeyer, H. U. (1974) in Methoden der enzymatischen Analyse
(Bergmeyer, H. U., Hrsg.) 3. Aufl., Bd. 2, S. 1538-1541; Verlag Chemie, Weinheim, and
(1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 2nd ed., vol. 3, pp. 1492-
1495; Verlag Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc., New York and London
1.6 Gawehn, K. (1984) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 3rd ed.,
vol. VI, pp. 588-592, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach/Florida, Basel
2.1 Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach 35 LMBG; Untersuchung von
Lebensmitteln: Bestimmung von L- und D-Milchsure (L- und D-Lactat) in
Fleischerzeugnissen, 07.00-15 (November 1981); Bestimmung von L- und D-Milchsure
(Lund D-Lactat) in Wurstwaren, 08.00-17 (November 1981); Bestimmung von L- und
Dmilchsure (L- und D-Lactat) in Milch und Milchprodukten, 01.00-26 (Juni 1987);
Bestimmung von L- und D-Milchsure (L- und D-Lactat) in Milchprodukten, 02.00-16 (Juni
1987); Bestimmung von L-Milchsure, Bernsteinsure und D-3-Hydroxybuttersure in Ei und
Eiprodukten, 05.00-2 (November 1987)
2.2 Schweizerisches Lebensmittelbuch, Kapitel 61B (Enzymatische Bestimmungen)/3.3.
(1981), Kapitel 1 (Milch)/5.2 (1995), Kapitel 2B (Sauermilchprodukte)/18 (1980), Kapitel 4
(Milchdauerwaren)/10.4 (1993), Kapitel 28A (Frucht- und Gemsesfte u.a.)/7.5 (1988),
Kapitel 30A (Wein aus Trauben)/6.4 (1993), Kapitel 34 (Grungsessig)/4.4 (1994)
2.3 Gombocz, E., Hellwig, E., Vojir, F. & Petuely, F. (1981) Deutsche Lebensmittel-
Rundschau 77, 6-7
2.4 Brautechnische Analysenmethoden, Band III, S. 572-576 (1982), Methodensammlung
der Mitteleuropischen Brautechnischen Analysenkommission (MEBAK), herausgegeben
von F. Drawert im Selbstverlag der MEBAK, Freising
2.5 International Federation of Fruit Juice Producers (IFU, Methods of Analysis, no. 53-
1983) ; contained in "Code of Practice for Evaluation of Fruit and Vegetable Juices" (1996)
edited by Association of the Industry of Juices and Nectars from Fruits and Vegetables of
the European Economic Community (A.I.J.N.)
2.6 International Standard ISO 8069 (Juni 1986) Dried milk - Determination of lactic acid and
lactates content - Enzymatic method
2.7. Ministero dell' Agricoltura e delle Foreste (1986) Approvazione dei "Metodi ufficiali di
analisi per i mosti, i vini, gli agri di vino (aceti) e i sottoprodotti della vinificazione". Gazzetta
Ufficiale della Repubblica Italiana, n. 161 del 14 luglio 1986
2.8 Ministero dell' Agricoltura e delle Foreste (1986) Approvazione dei "Metodi ufficiali di
analisi per i formaggi". Gazzetta Ufficiale della Repubblica Italiana, n. 229 del 2 ottobre 1986
2.9 Niederlande: Warenwet, Uitvoeringsvoorschriften (C II-6) Regeling
Onderzoekingsmethoden voor brood; Methode 17: De Bepaling van Melkzuur (Oktober
1986); Dit voorschrift betrift een methode voor de bepaling van melkzuur (lactaten) in het in
brood verwerkte meel
2.10 International Dairy Federation, International IDF Standard 69B (1987) Dried Milk,
Determination of Lactic Acid and Lactates Content, Enzymatic Method
2.11 RSK-Values, The Complete Manual, Guide Values and Ranges of Specific Numbers for
Fruit Juices and Nectars, Including the Revised Methods of Analysis (1987), 1st ed., Verlag
Flssiges Obst/Liquid Fruit, D-56370 Eschborn, pp. 107-111
2.12 Deutsche Norm DIN 10335 (Juni 1987) Bestimmung des Gehaltes an L- und D-
Milchsure (L- und D-Lactat) in Milch und Milchprodukten, Enzymatisches Verfahren
2.13 Council Directive of 20 June 1989 on hygiene and health problems affecting the
production and the placing on the market of egg products (89/437/EEC), Official Journal No.
L 212, 22/07/89 p. 0087
2.14 Recueil des mthodes internationales d'analyse des vins et des mots, Complment n
1 l'dition officielle de juin 1990, OFFICE INTERNATIONAL DELA VIGNE ET DU VIN, S.
179-182
2.15 Official Journal of the European Communities L 272 (3 October 1990), Legislation:
Commission Regulation (EEC) No 2676/90 of 17 September 1990 determining Community
methods for the analysis of wines (pp. 97-100)
2.16 Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten,
VDLUFA (1993) Methodenbuch Band VI, C8.6
2.17 Deutsche Norm DIN EN 12631 (April 1999) Frucht- und Gemsesfte: Enzymatische
Bestimmung des Gehaltes an D- und L-Milchsure (Lactat)
2.18 Europische Norm / European Standard EN 12631 (April 1999) Frucht- und
Gemsesfte: Enzymatische Bestimmung des Gehaltes an D- und L-Milchsure (Lactat) -
Spektralphotometrische Bestimmung von NAD (Fruit and vegetable juices Enzymatic
determination of D- and L-lactic acid (lactate) content - NAD spectrometric method)
2.19 Standard der Russischen Fderation / Standard of the Russian Federation /
GOSSTANDART ROSSII GOST R 51196-98 (1998) Dried milk. Method for determination of
lactic acid and lactates
3.1 Duran, M., van Biervliet, J.P.G.M., Kamerling, J.P. & Wadman, S. K. (1977) D-Lactic
aciduria, an inborn error of metabolism? Clin. Chim. Acta 74, 297-300
3.2 Kandler, O. (1982) Grungsmechanismen bei Milchsurebakterien, Forum Mikrobiologie
5, 16-22 3.3 Giesecke, D., Stangassinger, M. & Henle, K. (1985) D(-)-Milchsure - ein
Stoffwechselproblem, Zeitschrift fr Ernhrungswissenschaft 24, 172-186
3.4 Barth, C. A. & de Vrese, M. (1984) D-Lactat im Stoffwechsel des Menschen Fremdstoff
oder physiologischer Metabolit? Kieler Milchwirtschaftliche Forschungsberichte 36, 155-161
3.5 de Vrese, M., Koppenhoefer, B. & Barth, C.A. (1990) D-Lactic acid metabolism after an
oral load of DL-lactate, Clinical Nutrition
3.6 Bssler, K.H. (1988) Die physiologische Rolle von Laktat im Licht neuerer Erkenntnisse,
Ernhrungs-Umschau 35, 71-74
4.1 Mayer, K. & Pause, G. (1969) Enzymatische Milchsurebestimmung in Weinen, Mitt.
Geb. Lebensm. Unters. Forsch. 60, 230-233
4.2 Postel, W. Drawert, F. & Hagen, W. (1973) Enzymatische Untersuchungen ber den
Gehalt an L(+)- und D(-)-Lactat in Weinen, Z. Lebensm.-Unters. u. Forsch. 150, 267-273
4.3 Bandion, F. & Valenta, M. (1977) Zur Beurteilung des D(-)- und L(+)-Milchsuregehalts
in Wein, Mitt. Klosterneuburg 27, 4-10
4.4 Drawert, F. & Hagen, W. (1970) Enzymatische Analysenmethoden zur Bestimmung von
Wrze- und Bier-Inhaltsstoffen, I. Bestimmung von L(+)- und D(-)-Milchsure in Bier,
Brauwissenschaft 23, 1-6
4.5 Piendl, A. & Wagner, I. (1983) Physiologische Eigenschaften der organischen Suren
des Bieres; 3. L(+)-Lactat und D(-)-Lactat, Brauindustrie 68,1520-1528
4.6 Steffen, Chr. (1971) Methoden zur Bestimmung der Gesamtmilchsure und der
Lactatkonfiguration in Kse und Milch, Schweiz.Milchzeitung 97, 1073-1078
4.7 Steffen, Ch., Nick, B. & Blanc, B. H. (1973) Konfiguration der Milchsure verschiedener
Milchsurebakterienstmme in Abhngigkeit fabrikationstechnischer Bedingungen, Schweiz.
Milchw. Forsch. 2, 37-52
4.8 Zaadhof, K.-J., Kohler, J. & Terplan, G. (1975) Erhebungen ber den L(+)- und D(-)-
Lactat- sowie Pyruvatgehalt in Trockenmilchprodukten, Deutsche Molkerei-Zeitung F.9, 228-
233
4.9 Kielwein, G. & Daun, U. (1979) Vorkommen und Bedeutung von D(-)-Milchsure in
fermentierten Milcherzeugnissen unter besonderer Bercksichtigung von Mischerzeugnissen
auf Joghurtbasis, Deutsche Molkerei-Zeitung 30, 290-293
4.10 Jager, H.H. & Tschager, E. (1980) Die enzymatische Bestimmung von L-Milchsure,
DMilchsure, Glutaminsure, Essigsure und Brenztraubensure im Kse,
Milchwirtschaftliche Berichte 64, 235-240
4.11 Schiweck, H. & Bsching, L. (1972) Die Bildung von D- und L-Milchsure whrend des
Fabrikationsprozesses, Zucker 25, 7-12
4.12 van der Poel, P. W. (1975) Die mikrobiologische berwachung des Extraktionssystems
durch die Milchsurebestimmung, Zucker 28, 295-298
4.13 Kubadinow, N. & Rsner, G. (1977) Die enzymatische Bestimmung von D- und L-
Milchsure in Betriebssften der Zuckerproduktion, ZUCKER 30, 420-426
4.14 Sinell, H.-J. & Luke, K. (1979) D(-)-Lactat als Parameter fr die mikrobielle Belastung
von vakuumverpacktem Brhwurstaufschnitt, Fleischwirtschaft 59, 547-550
4.15 Schneider, W., Hildebrandt, G. & Sinell, H.-J. (1983) D(-)-Lactat-Konzentration als
Parameter fr die Bewertung des Frischezustandes vorverpackter, hitzebehandelter
Fleischerzeugnisse, Fleischwirtschaft 63, 1198-1205
4.16 Spicher, G. & Rabe, E. (1981) Die Mikroflora des Sauerteigs (XII. Mitteilung), Z.
Lebensm. Unters. Forsch. 172, 20-25
4.17 Klopper, W. J., Angelino, S.A.G.F., Tuning, B. & Vermeire, H.A. (1986) Organic acids
and glycerol in beer, J.Inst.Brew. 92, 225-228
4.18 Stoya, W., Wachendrfer, G., Kary, I., Siebentritt, P. & Kaiser, E. (1987) Milchsure als
Therapeutikum gegen Varroatose und ihre Auswirkung auf den Honig, Deutsche
Lebensmittel-Rundschau 83, 283-286
4.19 Liepe, H.-U. (1987) Milchsaure Gemsesfte mit Starterkulturen, Flssiges Obst 54,
380-381
4.20 Littmann-Nienstedt, S. & Beutler, H.-O. (1988) Auswertung des Ringversuches der
Arbeitsgruppe Ei-Analytik" zur Bestimmung von L(-)-Milchsure, 3-Hydroxybuttersure und
Bernsteinsure in Eiprodukten, Deutsche Lebensmittel-Rundschau 84, 320-322 4.21
Franzke, Cl. & Kroll, J. (1980) Zur enzymatischen Milchsure-Bestimmung in Emulgatoren,
Die Nahrung 24, 89-90
4.22 Schlimme, E., Lorenzen, P. Chr., Martin, D. & Thormhlen, K. (1996) Analytical
differentiation of butter types by specific compositional parameters of the aqueous butter
phase, Milchwissenschaft 51, 139-143
5.1 Henniger, G. & Boos, H. (1978) Anwendung der enzymatischen Analyse bei der
Untersuchung kosmetischer Prparate - dargestellt an einigen Beispielen, Seifen - le
Fette - Wachse 104, 159-164
2015-03 4/5
Soluciones control de cido D-lctico y L-lctico
Concentraciones: ver etiqueta de las botellas 3. Estndar interno:
Las Soluciones control de cido D-lctico y de cido L-lctico son Las soluciones control del ensayo pueden utilizarse como
soluciones acuosas estabilizadas de cido D-lctico y de cido L- estndares internos para controlar el correcto funcionamiento del
lctico. Sirven como soluciones control del ensayo enzimtico para la ensayo (errores groseros) y para ver si la solucin de muestra est
determinacin de cido D-lctico y de cido L-lctico en alimentos y libre de sustancias interferentes.
otros materiales.
Pipetear dentro Muestra +
Blanco Muestra Estndar
Aplicacin: de la cubeta estndar
1. Adicin de la solucin control de cido D-lctico L-lctico a la Solucin 1 1.000 ml 1.000 ml 1.000 ml 1.000 ml
mezcla de reaccin: Solucin 2 0.200 ml 0.200 ml 0.200 ml 0.200 ml
La solucin control se utiliza en el ensayo en lugar de la solucin de Suspensin 3 0.020 ml 0.020 ml 0.020 ml 0.020 ml
muestra para el ensayo (0.100 ml de solucin control de cido D- Solucin - 0.100 ml - 0.050 ml
lctico 0.100 ml de solucin control de cido L-lctico). muestra - - 0.100 ml 0.050 ml
2. Reiniciar la reaccin, cuantitativamente: Control ensayo 1.000 ml 0.900 ml 0.900 ml 0.900 ml
Luego de finalizada la reaccin con la solucin de muestra y la Agua destilada
medicin de A3, agregar 0.050 ml de solucin control del ensayo a la Mezclar y leer las absorbancias de las soluciones (A1) luego de
mezcla de reaccin. Leer la absorbancia A4 luego de finalizada la aprox. 5 min. Continuar como se describe el esquema de pipeteo
reaccin (aprox. 30 min.). Calcular la concentracin de la diferencia bajo Procedimientos. Seguir las instrucciones descriptas en
(A4-A3) de acuerdo a la ecuacin general para el clculo de la Instrucciones para el desarrollo del ensayo y en las notas al pie.
concentracin. Debe tomarse en cuenta la variacin en el volumen
total. Aunque hay una dilucin de la mezcla de reaccin por el La recuperacin del estndar se calcula de acuerdo a la siguiente
agregado de la solucin control del ensayo, los resultados no difieren frmula:
significativamente de los datos estipulados en la etiqueta de la 2 x A muestra + estndar - A muestra
botella. recuperacin = ----------------------------------------------- x 100 (%)
A estndar

Tambin disponible
Test combinado Acido L-Lctico Cat. Nro. 0 139 084

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