Antioxydants

Evaluation biologique du stress oxydant

Application en routine clinique
Loxygne,indispensable la vie,est capable sous forme depces oxygnes actives (EOA)
de ragir avec de nombreuses molcules et de provoquer des dgts cellulaires. La
diffrence entre le potentiel dltre de loxygne sous toutes ses formes et les
mcanismes de dfenses antioxydantes de lorganisme constitue le stress oxydant, Mots cls :
bien connu des scientifiques. La relation du stress oxydant avec lapparition de Stress oxydant, Espces oxygnes
pathologies chroniques telles les maladies cardiovasculaires, dgnratives ou actives, Antioxydants, Mesure
le cancer stimule massivement les chercheurs. Un large faisceau darguments des biomarqueurs, Standardisation
scientifiques converge vers un lien de cause effet.Les praticiens souhaitent aujourdhui des protocoles, Pratique clinique
tre en mesure dvaluer le stress oxydant et de le prendre en charge dun point
de vue thrapeutique,mais galement prventif.Diffrentes mthodes de mesure sont
actuellement utilisables en routine clinique mme si des efforts de standardisation sont encore ncessaires
pour effectuer des comparaisons inter-laboratoires .

J. Pincemail (1), C. Le Goff (2), C. Charlier (3), P. Gillion (4), JP. Cheramy-Bien (1), E. Van Honacker (5),
JP. Chapelle (2) et JO. Defraigne (1) - Universit de Lige CHU Sart Tilman (Lige, Belgique)
(1)
Dpartement de Chirurgie Cardiovasculaire et CREDEC ; (2) Laboratoire de Biologie Clinique ; (3)
Service de Toxicologie (4) Clinique St Luc, Service de Biologie Clinique (Bouge, Belgique) ; (5) Mdecin
gnraliste (Ecaussinnes, Belgique)

50 ans de recherche sur loxygne...
Au milieu des annes 1950, Gerschman montre que
loxygne, molcule pourtant indispensable la vie,
prsente galement une toxicit pour lorganisme (1).
Harman propose ensuite la free radical theory of
ageing (2) : sous forme de radicaux libres (entits chi-
miques trs instables et ractionnelles suite la pr-
sence dun lectron libre dans leur structure), loxygne
est lorigine du processus de vieillissement cellulaire.
Lanne 1969 marque ensuite un tournant dans lhistoire
des radicaux libres avec la dcouverte et la purification
de la superoxyde dismutase (SOD) par les Amricains
McCord et Fridovich (3). Cette enzyme prsente dans les
globules rouges, est en effet capable dliminer le radical
anion superoxyde, pre m i re entit radicalaire issue de
loxygne. Peu de personnes, mme parmi les scientifi-
ques, savent ainsi que nous ftons cette anne les 40 ans
de cette importante dcouverte. Ce travail fondamental
montre indirectement que des radicaux libres peuvent
tre bel et bien produits dans notre organisme et quil
existe des systmes antioxydants qui rgulent leur produc-
tion. Trs vite, les scientifiques laborent de multiples
expriences in vitro qui dmontrent la toxicit des radi-
caux libres et dautres espces oxygnes actives (EOA)
comme le peroxyde dhydrogne ou loxygne singulet.
Ceux-ci sont en effet responsables de dgts cellulaires
importants lorigine du dveloppement potentiel de
diverses pathologies : cassures et mutations au sein de
lADN, inactivation denzymes, modification des structu-
res protiques, oxydation des sucres et induction de la
peroxydation lipidique.

Il est indniable que les recherches scientifiques sur la

Lvaluation du stress oxydant peut savrer utile en pratique
clinique, condition dtre associe de bonnes conditions
de prlvement et en respectant les rgles dor
dun bon traitement pr-analytique.
toxicit de loxygne, et par voie de fait sur le stress oxy-
dant, ont acquis maintenant leurs lettres de noblesse. Un
relev des articles scientifiques, ralis en 2007 sur
Pubmed indique que 48 790 articles ont t publis sur
les EOA, 36 995 sur la peroxydation lipidique, plus de
10 000 sur les antioxydants et au moins 18 000 sur la
relation entre le stress oxydant et les maladies card i o v a s-
culaires, le cancer et le vieillissement.

16 Nutritions & Endocrinologie Dcembre 2009 Special antioxydant


Depuis quelques annes, le stress oxydant a donc
dpass le simple cadre de la recherche scientifique et
de plus en plus de mdecins gnralistes ont pris
conscience de limportance dune bonne rgulation du
stress oxydant en mdecine prventive. Il convient donc
que les scientifiques soient lcoute de la demande
des professionnels de sant et puissent leur apporter les
meilleurs outils danalyse permettant dvaluer ltat de
stress oxydant dun individu.
Le stress oxydant ... en deux mots
Lorganisme dispose dun vaste rseau de dfense - les
antioxydants - qui empchent les EOA dexercer leurs
effets dltres.
Il existe deux sources de dfenses antioxydantes :
lune est apporte par lalimentation via les fruits et
lgumes, sources de vitamines C, E, carotnodes, ubi-
quinone, polyphnols ou acide lipoque.
lautre est endogne et se compose de molcules de
petite taille (glutathion, acide urique), denzymes (SOD,
glutathion peroxydase, catalase) ou de protines (ferri-
tine, transferrine, cruloplasmine, albumine, protines
de choc thermique, hme oxygnase).
A cela sajoutent quelques oligo-lments comme le
slnium, le cuivre et le zinc qui sont des cofacteurs
importants pour lactivit de certaines enzymes antioxy-
dantes.
Le stress oxydant se dfinira comme tant un dsquili-
bre de la balance entre la production dEOA et les sys-
tmes de dfenses antioxydantes, en faveur des premi-
res (4). Le stress oxydant est potentiellement impliqu
dans le vieillissement ou le dveloppement de patholo-
gies associes (maladies cardiovasculaires et neuro-
dgnratives, cancer, diabte). Il peut avoir diverses
origines : mauvaise alimentation, phnomnes inflam-
matoires chroniques ou aigus, habitudes de vie non
adquates (tabagisme, consommation dalcool), prise
de la pilule contraceptive et de mdicaments, exercice
physique intense ou mal gr, exposition inconsidre
de grandes sources productrices dEOA (soleil, irra-
diations), interventions chiru rgicales (transplantation
dorganes, pontages coronariens), surcharge en fer,
Comment mettre en vidence un tat
de stress oxydant ?
Un des problmes majeurs auquel les scientifiques ont
trs vite t confronts fut la dmonstration de lexis-
tence relle des radicaux libres (leur dure de vie tant
de 10 - 9 secondes) et de leurs effets in vivo. Au tout
dbut des annes 1990, cette incertitude a t leve de
faon irrfutable grce lutilisation de la technique de
la rsonance paramagntique lectronique (RPE) asso-
cie au spin trapping (pigeur de spin) dans des
modles de stress oxydant in vivo comme la pratique
dun exercice physique (Fig. 1), la transplantation
Nutritions & Endocrinologie Dcembre 2009 Special antioxydant
Antioxydants
dorganes ou langioplastie (5-7). De faon rsume, il
sagit dune technique spectroscopique qui met en vi-
dence le champ magntique dvelopp par llectron
libre clibataire qui caractrise les radicaux libres.
Ceux-ci sont stabiliss par un pigeur de spin qui aug-
mente suffisamment leur dure de vie pour tre dcels
dans un puissant champ magntique. Cette mthode
ncessite un appareillage lourd, complexe et coteux et
qui ne peut tre confi qu des personnes bien formes
dans ce domaine. Toutefois, les fabricants ont com-
menc depuis peu le dveloppement de RPE de table
performantes, sensibles et dutilisation aise. Quelques
annes seront encore ncessaires avant que cette tech-
nique de pointe ne soit utilise en routine clinique.
A dfaut de mettre directement en vidence les EOA
dune manire simple, les recherches se sont alors
orientes sur 4 axes avec :
1) la mise en vidence des dommages oxydatifs
quelles peuvent engendrer au niveau des lipides, de
lADN ou des protines ;
2) lvaluation des antioxydants ;
3) la mesure des oligolments ;
4) lidentification des sources de production des EOA.
Loxydation endommage les macromolcules
Lipides : AGPI et cholestrol en 1re ligne (Tab. 1)
Les acides gras polyinsaturs (RH) comme les acides
linolique ou arachidonique sont les cibles privilgies
des EOA et plus particulirement, des radicaux libres.
Il en rsulte, dans un 1er temps, la formation de dines
conjugus dont la particularit est dabsorber dans la
rgion de lultra-violet (234 nm). Leur dtection peut se
Figure 1 - Spectres de rsonance paramagntique
lectronique (RPE) de radicaux libres dorigine
lipidique pigs par le spin trap PBN (alpha-phenyl
N-tert-butyl nitrone) obtenus dans le sang de sujets
sains avant et aprs un exercice physique (7).
La hauteur du signal est directement proportionnelle
la quantit de radicaux libres
dans lchantillon sanguin.
17
 Antioxydants

faire dans du plasma mais avec une spcificit relative-
ment mdiocre (8). Cette analyse est aujourdhui tom-
be en dsutude.
Une fois forms, les dines conjugus ragissent avec
loxygne pour former des peroxydes lipidiques
(ROOH ou hydroperoxydes) qui peuvent tre mesurs
au niveau plasmatique par une mthode de chromato-
graphie liquide haute performance (HPLC) couple
la luminescence. Divers kits commerciaux utilisant la
spectrophotomtrie comme mthode de dtection ont vu
le jour voici quelques annes de sorte que lanalyse des
peroxydes lipidiques est aujourdhui facilement ralisa-
ble en routine clinique.

Tableau 1 Biomarqueurs du stress oxydant : les drivs oxyds des macromolcules

MTHODE DE MESURE SPCIFICIT DE LA PRDICTION UTILISATION EN ROUTINE
DU STRESS OXYDANT CLINIQUE

RADICAUX LIBRES Rsonance Excellente Potentielle

paramagntique
lectronique (RPE)

DRIVS OXYDS DES LIPIDES

Dines conjugus Spectrophotomtrie (234 nm) Mauvaise Abandonne

Peroxydes lipidiques HPLC + luminescence Bonne Facile
Spectrophotomtrie Bonne Facile
TBARS (thiobarbituric acid Spectrophotomtrie Mauvaise Facile
reactive substances)
MDA HPLC Mauvaise Difficile
4-hydroxynonnal (HNE) HPLC Bonne Difficile
+ spectromtrie de masse
Mtabolite HNE Spectrophotomtrie Bonne Facile
Ethane et pentane Chromatographie gazeuse Moyenne Difficile
Hydroxydes (HODE) Spectrophotomtrie Bonne Potentielle
(+ anticorps)
Oxystrols HPLC Bonne Difficile
+ spectromtrie de masse
F2-isoprostanes Chromatographie gazeuse Excellente Difficile et coteuse
+ spectromtrie de masse
Kit ELISA Faible Facile
LDL oxydes Kit ELISA Bonne Facile
ou leurs anticorps
Taille des LDL* Electrophorse Bonne Facile

DRIVS OXYDS DES PROTINES `

Protines carbonyles Spectrophotomtrie Mauvaise Impossible
AOPP (advanced Spectrophotomtrie Moyenne Facile
oxydation protein products

DRIVS OXYDS DE LADN

8-OHdG Kit ELISA Moyenne Facile

HPLC + spectromtrie Excellente Difficile
de masse
Cassures de lADN Electrophorse Excellente Facile
+ fluorescence (COMET)

* Les LDL des classes 4 7 sont petites (diamtre < 25,1 nm) et denses alors que les LDL des classes 1 3 sont plus grandes (diamtre >
25,5 nm) et moins denses. En raison de leur plus grande oxydabilit, les LDL de petite taille prsentent un caractre athrogne (84).

18 Nutritions & Endocrinologie Dcembre 2009 Special antioxydant


Par ailleurs, une autre approche consiste rduire ces
hydroperoxydes en hydroxydes avec du borohydrure
de sodium. Loxydation de lacide linolique conduit
ainsi la formation de lacide hydroperoxyoctadca-
dinoque (HPODE) qui, aprs rduction, se transforme
en un hydroxyde, lacide hydroxyoctadcadinoque
(HODE), dcelable par mthode spectrophotomtrique
ou par HPLC (9). Toutefois, ce type de dosage se fait
essentiellement dans le cadre de la recherche et nest
pas utilis en routine clinique.
Sous laction de mtaux de transition (fer, cuivre), les
peroxydes lipidiques se dcomposent ensuite en toute
une srie de sousproduits dont font partie les aldhy-
des et des hydrocarbures caractre volatil (thane,
pentane). Ds le dbut des recherches in vivo sur le
stress oxydant, le test des TBARS (ThioBArbituric
Reactive Substances) a t dvelopp comme mar-
queur du processus de peroxydation lipidique (10).
Cette mthode simple dutilisation mesure par voie colo-
rimtrique le produit de la raction de lacide thiobar-
biturique (TBA) avec le malondialdhyde (MDA),
sousproduit des lipides oxyds. Toutefois, cette
mthode reste peu spcifique (dosage par dfaut ou
par excs) car dautres substances, comme le glucose
par exemple, peuvent interagir avec le TBA. Dautre
part, le MDA peut tre form in vivo au cours de pro-
cessus compltement indpendants du phnomne de
peroxydation lipidique comme la synthse du throm-
boxane (11). Enfin, la mthode en elle-mme est lie
de trs nombreux artfacts exprimentaux qui la ren-
dent peu fiable (12). Elle est donc proscrire. Par la
suite, il est devenu possible de mesurer le MDA seul par
HPLC. Toutefois, il faut savoir que lestimation du taux
de MDA reste un indice assez peu reprsentatif de la
prsence dune peroxydation lipidique puisquelle ne
reprsente que 1 % des produits de dcomposition des
peroxydes lipidiques (13).
Plus sensible et plus spcifique est la mesure dun autre
aldhyde, le 4hydroxynonnal (HNE), provenant de la
dgradation des peroxydes dacides gras de la famille
6 (14). Cette analyse se pratique essentiellement dans
des laboratoires de recherche spcialiss car elle fait
appel des mthodes de chromatographie en phase
gazeuse couple la spectromtrie de masse. A lheure
actuelle, il nexiste pas de kit commercial permettant de
dvelopper cette analyse en routine clinique.
Rcemment, des groupes de chercheurs ont mis au
point un test immunoassay pour le dosage dun mtabo-
lite urinaire du HNE (15, 16) : lacide mercapturique
1,4 dihydroxynonane (DHN-MA).
Parmi les autres sous-produits de la peroxydation lipidi-
que figurent les hydrocarbures volatils que sont lthane
et le pentane (17). Leur mise en vidence est extrme-
ment complique dans la mesure o il faut recueillir les
Nutritions & Endocrinologie Dcembre 2009 Special antioxydant
Antioxydants
gaz expirs dun sujet, les concentrer sur du charbon
de bois puis les analyser par chromatographie en
phase gazeuse. Cette analyse demande normment
de temps de sorte quelle est de moins en moins utilise
en recherche.
Le cholestrol, entit lipidique trs abondante dans le
plasma, est aussi sujet loxydation par les EOA. Il en
rsulte la formation doxystrols comme le 7-hydroxy-
cholestrol et le 7 ctocholestrol (18,19). Leur dtec-
tion se fait par chromatographie gazeuse couple
une spectromtrie de masse, ce qui rend leur utilisation
difficile en routine clinique.
Au dbut des annes 90, un groupe de chercheurs a
dmontr la formation de F2-isoprostanes (eicosonodes
cycliques) rsultant spcifiquement et directement de
lattaque des EOA sur lacide arachidonique (20,21).
Quatre grandes sries (5, 8, 12, 15) de composs de
la famille F ont t identifies.
Le plus populaire de ces composs est incontestablement
le 15-F2t- i s o p rostane initialement connu sous le nom de
8 - i s o p rostaglandine F2a, qui se re t rouve aussi bien dans
le plasma ou les urines. Au fil des annes, ce marqueur
est devenu un vritable gold standard pour lvalua-
tion dun stress oxydant in vivo (22), plus particulire-
ment dans le domaine des maladies cardiovasculaires
(23). A titre dexemple, ltude CARDIA, ralise chez 2
850 jeunes adultes, a montr la prsence de calcifica-
tions des art res coro n a i res chez 10 % des sujets. Les
taux plasmatiques de F2- i s o p rostanes taient corrls
la prsence de ces calcifications, confirmant ainsi que la
p e roxydation lipidique pouvait avoir un rle initiateur
dans le dveloppement prcoce de la plaque dath-
rome (24). Dautres isoprostanes de la famille E ont t
identifis mais en quantit nettement moindre que ceux
de la famille F. Rcemment, il a t montr que loxyda-
tion de lacide docosahxanoque (C22:6 de la famille
3) conduit la formation de F4-neuro p rostanes ainsi
appels en raison de la prsence en trs grande quan-
tit de lacide docosahxanoque dans le cerveau (25).
La dtection du 15-F2t- i s o p rostane peut se faire de deux
manires : spectromtrie de masse couple la chro m a-
tographie gazeuse ou kit commercial ELISA. Des deux
mthodes, cest la pre m i re qui est la plus approprie et
recommande car les anticorps utiliss dans les kits
ELISA manquent singulirement de spcificit. Malgr
tout leur intrt, le dosage des isoprostanes nest toute-
fois pas encore dactualit en routine clinique en raison
notamment dun cot danalyse trs lev. Rcemment,
des quipes ont propos le dosage des isoprostanes
dans les gaz expirs (26).
Le dysfonctionnement endothlial est la premire tape
du processus dathrosclrose (27). Lorsquun endoth-
lium est ls, les lipoprotines de faible densit circulan-
19
 Antioxydants
tes (low density lipoproteins ou LDL) et les monocytes
sanguins saccumulent dans lespace sous-endothlial.
Les monocytes se diffrencient trs rapidement en
macrophages. Par ailleurs, les EOA produites par len-
dothlium ls conduisent loxydation des LDL (tant
dans leur partie protique que lipidique). Ces LDL modi-
fies sont reconnues par les macrophages au sein des-
quels elles saccumulent en formant des cellules spumeu-
ses (foam cells). Les LDL oxydes circulantes se mesu-
rent trs facilement laide de kits ELISA. Les LDL oxy-
des peuvent aussi engendrer des ractions auto-immu-
nes comme en tmoigne la prsence danticorps circu-
lants spcifiquement dirigs contre ces molcules immu-
nes. Plusieurs travaux ont montr que des taux levs de
LDL oxydes mais aussi danticorps contre les LDL oxy-
des (mesurs galement laide de kits ELISA) sont
des marqueurs prdictifs indpendants de la progres-
sion de la maladie athromateuse (28, 29). Trs intres-
sante est aussi cette tude prospective chez 326 sujets
en bonne sant gs de 58 ans (30). Si leur taux de
LDL oxydes au dbut de ltude se situait dans un ter-
tile haut, les sujets prsentaient dans les 3 ans une aug-
mentation plus importante de lpaisseur intimamdia
de lartre coronaire (25 m par anne) que les sujets
ayant des taux dans le tertile bas (3 m par anne,
p = 0,003). Une autre tude portant sur 2 524 person-
nes en bonne sant a rcemment montr que le mode
de vie peut galement avoir une influence sur le taux de
LDL oxydes (31).
Difficile de doser les protines oxydes (Tab. 1)
Les modifications des structures primaire, secondaire et
tertiaire des protines par les EOA sont la base de la
formation de drivs protiques carbonyls via plu-
sieurs mcanismes incluant la fragmentation et loxyda-
tion des acides amins. En prsence de dinitrophnyl-
hydrazone (DNPH), ces drivs carbonyls peuvent
tre mis en vidence dans des chantillons biologiques
par spectrophotomtrie ou technique HPLC. La prpara-
tion analytique est cependant particulirement dlicate
de sorte que lutilisation de cette mthode est impossi-
ble en routine clinique. Il y a quelques annes, des cher-
cheurs australiens ont mis au point une mthode ELISA
qui ne sest toutefois pas impose dans le monde scien-
tifique. Rcemment, des kits commerciaux ont t mis
au point pour raliser la mesure colorimtrique des pro-
duits avancs de loxydation des protines (Advanced
Oxidation Protein Products ou AOPP). Il sagit de toxi-
nes urmiques formes par la raction des protines
plasmatiques et plus particulirement lalbumine, avec
des oxydants de nature chlore (acide hypochloreux,
chloramines). Ces oxydants sont produits spcifique-
ment par la myloperoxydase (MPO) secrte par les
neutrophiles activs (32). La concentration en AOPP est
particulirement augmente chez les patients souffrant
de problmes rnaux (33). Cette mthode semble toute-
20 Nutritions & Endocrinologie Dcembre 2009 Special antioxydant
fois sujette des artfacts lors du traitement de lchan-
tillon sanguin.
Loxydation de lADN gnre des mutations (Tab. 1)
La guanosine, une des quatre bases qui constituent
lADN, est sensible lattaque des EOA et se trans-
forme en 8-hydroxy2 doxyguanosine (8-OHdG) Lors
de la rplication de lADN, la 8-OHdG se couple avec
ladnine, ce qui provoque une mutation G-T dans le
brin fille de lADN. Il existe des systmes de rparation
efficaces qui permettent dliminer par voie urinaire
cette forme indsirable de lADN (implique dans le
dveloppement du cancer). La mesure de la 8-OHdG
urinaire laide de kits ELISA, ou encore mieux de de
la HPLC couple spectromtrie de masse, reflte plus
un taux doxydation de lADN que sa concentration
relle. Une valeur haute en 8-OHdG indique que lADN
a bien subi une oxydation mais quil est, ce stade,
bien protg par des systmes de rparation perfor-
mants. La cratinine est utilise en tant que facteur de
normalisation comme tant le reflet de la fonction mta-
bolique gnrale de lorganisme.
Dans le milieu des annes 90, divers groupes de cher-
cheurs ont dvelopp lessai COMET qui permet de
mesurer les cassures dans lADN de simples cellules
comme les lymphocytes (34). Aprs avoir t dposes
sur un gel dagarose, les cellules sont lyses avec un
dtergent puis traites avec une solution haute
concentration en sels. Ces oprations permettent de for-
mer des nuclotides, ce qui a pour consquence que
lADN contenant des cassures et soumis une lectro-
phorse migrera vers une anode sous la forme dune
queue de comte. Aprs coloration, les gels sont exami-
ns en microscopie fluorescente. Lintensit relative de
la fluorescence mesure dans la queue de la comte est
directement proportionnelle la frquence de cassures
dans lADN (Fig. 2). Ce procd danalyse commence
tre utilis petit petit en routine dautant plus que la
mthode a rcemment t adapte pour une analyse sur
du sang complet congel. Des dommages oxydatifs au
niveau de lADN ont t mis en vidence chez des
fumeurs laide de cette mthode adapte (35). Cette
technique a galement permis de visualiser chez le rat les
effets protecteurs dune complmentation en antioxydants
Figure 2 - Analyse de lADN dans des lymphocytes
humains par lessai COMET. LADN contenant des
cassures et soumis une lectrophorse migre vers
une anode sous la forme dune queue de comte.
 Antioxydants

Tableau 2 Biomarqueurs du stress oxydant : les systmes antioxydants

MTHODE DE MESURE SPCIFICIT DE LA PRDICTION UTILISATION EN ROUTINE
DU STRESS OXYDANT CLINIQUE

Vitamine C Spectrophotomtrie Excellente Facile

ou HPLC Excellente Facile
Vitamine E HPLC Excellente Facile
( et tocopherol)
Carotnodes HPLC Excellente Facile (-carotne)
Coenzyme Q10 HPLC Excellente Facile
Glutathion rduit et oxyd HPLC Excellente Difficile
HPLC+ lectro-
phorse capillaire Excellente Difficile
Kits commerciaux Excellente Facile
Protines thiols Spectrophotomtrie Bonne Facile
Superoxyde dismutase Kits commerciaux Excellente Facile
Glutathion peroxydase Kits commerciaux Excellente Facile
Capacit antioxydante Spectrophotomtrie Mauvaise Facile
totale (TAS,FRAP,TRAP,ORAC)
Polyphnols HPLC Bonne Potentielle
Paraoxonase Spectrophotomtrie Bonne Potentielle
Oligo-lments Spectromtrie de masse Excellente Facile
(Slenium, Cuivre, Zinc) plasma

des doses nutritionnelles sur les dommages oxydatifs de
lADN (36).
Les antioxydants protgent des EOA (Tab. 2)
La vitamine C se mesure aisment par spectrophotom-
trie ou par HPLC. Comme elle est particulirement
labile, il est ncessaire de stabiliser le plasma avec de
lacide mtaphosphorique 10 % (v/v) avant de
congeler lchantillon. Trs peu de laboratoires sont
ainsi mme de proposer cette analyse. Plusieurs tu-
des ont montr que des taux plasmatiques en vitamine
C infrieurs 6 g/mL sont associs un facteur de ris-
que accru de dvelopper des maladies cardiovasculai-
res (37, 38). La vitamine C est un relativement bon mar-
queur de la consommation de fruits (39).
La vitamine E, un puissant inhibiteur de la peroxydation
lipidique, se dose sous les formes de ses deux isomres
( et -tocophrol) par une mthode HPLC couple un
dtecteur une diode array. De par sa nature lipophile,
sa mesure doit toujours tre rapporte celle dun
lipide de rfrence, en loccurrence le cholestrol.
Vitamines C et E agissent en synergie pour neutraliser
les EOA. La synergie daction implique lexistence des
rapports de concentrations plasmatiques ou tissulaires
bien dfinis entre ces divers antioxydants. Dans une
vaste tude portant sur une cohorte de 12 populations
europennes et mene linitiative de lOffice Mondial
de la Sant (WHO/Monica study), il a t montr que
la valeur du rapport de concentrations entre les vitami-
nes C et E apparat comme un facteur prdictif de lap-
parition de pathologies cardiovasculaires. Une valeur
du rapport comprise entre 0,24 et 0,32 correspond
un risque cardiovasculaire 2 3 fois plus lev quune
valeur du rapport suprieure 0,53 (38).
Une mthode HPLC est valide et utilise pour la dter-
mination quantitative dans le plasma des carotnodes
provitamine A que sont la zaxanthine, lchinnone, le
lycopne, l -carotne et le -carotne. Toutefois, en
pratique clinique, cest surtout lanalyse du -carotne
qui est la plus utilise. En termes de prvention, il a t
montr que des taux plasmatiques infrieurs
0,22 mg/L sont associs un facteur de risque accru
de dveloppement de cancer (38). Le taux sanguin en
-carotne est un bon marqueur de la consommation de
lgumes (39).
Lubiquinone ou Coenzyme Q10 (CoQ10) est un antioxy-
dant trs particulier. Au niveau de la protection contre
loxydation des lipides membranaires en gnral, le
CoQ10 agit en synergie daction avec les vitamines C et

Nutritions & Endocrinologie Dcembre 2009 Special antioxydant 21

 Antioxydants
Schma
refaire
Figure 3 - Rle central du glutathion rduit dans la
rgnration des autres antioxydants (vitamine C,
vitamine E et CoQ10) sous leur forme naturelle.
En pigeant les radicaux lipidiques, la vitamine E
devient un radical libre (Vit E) qui est neutralis
par la vitamine C, qui devient son tour
un radical libre (Vit C). Le glutathion rduit (GSH)
neutralise ce dernier en se transformant en glutathion
oxyd (GSSG), entit non radicalaire.
E et le glutathion rduit (Fig. 3). Toutefois cest aussi une
molcule capitale dans la production dnergie par la
mitochondrie (phosphorylation oxydative) et donc dans
le fonctionnement normal de la cellule. Situ au niveau
de la membrane interne de la mitochondrie, le CoQ10
agit en effet comme transporteur dlectrons entre les
complexes I et II et le complexe III de la chane respira-
toire mitochondriale, tape essentielle pour la synthse
dATP par la mitochondrie. Dun point de vue chimique,
le CoQ10 est en quilibre entre 3 formes : rduite, oxy-
de et radicalaire. La forme rduite CoQ10H2 est aussi
appele ubiquinol-10 ; la forme oxyde correspond au
CoQ10 ou ubiquinone-10 ; la forme intermdiaire se
prsente sous laspect du radical libre ubisemiquinone.
Son dosage sous sa forme totale (rduit + oxyd) se fait
par une mthode HPLC classique utilisable en routine.
Moyennant des techniques plus sophistiques et coteu-
ses, il est possible de mesurer sparment les deux for-
mes. Une diminution importante du CoQ10 (autour de
40 %) est frquemment observe chez des patients sous
statines (40) ou chez des sujets souffrant de cardiomyo-
pathie dilate (41). Dans le premiers cas, cet effet sex-
plique par le fait que les statines inhibent lactivit de la
HMGCoA rductase qui est ltape commune de syn-
thse du cholestrol et du CoQ10. La diminution de
CoQ10 semble tre une des explications lapparition
de douleurs musculaires chez les sujets sous statines.
Dans le deuxime cas, il est intressant de noter quune
complmentation approprie permettant daugmenter
le taux plasmatique jusqu une valeur de 2,5
3 g/mL amliore la fonction cardiaque (fraction
22 Nutritions & Endocrinologie Dcembre 2009 Special antioxydant
djection du ventricule gauche) de faon trs significa-
tive (42).
Le glutathion rduit (GSH) est le point central de lactivit
de toute une srie denzymes antioxydantes comme les
glutathion peroxydases, la glutathion rductase, les thio-
rdoxines et les peroxyrdoxines. Par ailleurs, il rgnre
les autres antioxydants que sont les vitamines C et E et
lubiquinone sous leur forme initiale aprs que ceux-ci
aient ragi avec les radicaux libres (Fig. 3). Enfin, le GSH
possde une activit antioxydante qui lui est pro p re .
Aprs avoir ragi avec des EOA, il se transforme en glu-
tathion oxyd (GSSG). Une valeur basse du rapport
GSH/GSSG est considre comme tant un excellent
marqueur de la prsence dun stress oxydant (43). Le
dosage des deux formes du glutathion peut se raliser par
HPLC et spectromtrie de masse couple une lectro-
phorse capillaire ou en utilisant des kits commerciaux
trs fiables, ce qui rend, dans ce dernier cas, ces analy-
ses trs faciles raliser en routine clinique.
La superoxyde dismutase (SOD) et la glutathion peroxy-
dase (GPx) sont les deux premires lignes de dfense
enzymatiques pour contrer les effets dltres des EOA.
Ces deux enzymes localises dans les globules rouges
se mesurent aisment dans le sang complet laide de
kits commerciaux trs performants. La SOD est particu-
lirement diminue chez les sujets alcooliques. La dtec-
tion de la GPx savre dune grande utilit chez les
sujets sportifs pour dterminer le seuil dadaptation
un exercice physique modr ou intense (44).
Dans le cas dun stress oxydant, chaque antioxydant est
affect des degrs divers. Plutt que de mesurer cha-
cun dentre eux, certains auteurs ont propos dvaluer
la capacit antioxydante globale ou totale dun chan-
tillon biologique. Divers essais ont t proposs : TRAP
(Total Radical Antioxidant Potential), TAS (Total
Antioxidant Status), ORAC (Oxygen Radical
Antioxidant Capacity) (45). La technique consiste met-
tre en contact un systme in vitro gnrant des EOA
avec une cible (acide gras, sonde fluorescente) dont la
destruction oxydative est suivie en fonction du temps
par spectrophotomtrie ou par luminescence. Si cette
raction est ralise en prsence dun chantillon de
plasma, les antioxydants prsents dans celui-ci vont
interagir avec les EOA. Ce nest donc quaprs leur
consommation complte que loxydation de la cible
pourra dmarrer. Le temps de latence (temps avant le
dmarrage de loxydation) sera donc thoriquement
proportionnel la quantit dantioxydants prsents
dans lchantillon plasmatique.
Sur des globules rouges, il est aussi possible dvaluer
leur rsistance un stress oxydant in vitro en les soumet-
tant un systme produisant des EOA de manire

Figure 4 - Contribution des protines dans la capacit
antioxydante totale du plasma mesure par le test
ORAC (Oxygen Radical Antioxidant Capacity).
La dprotinisation de lchantillon entrane
une diminution de prs de 90 % de la capacit
antioxydante totale. (Daprs Machado A et al Determination
and validation of the ORAC assay using the Fluoroskan
Ascent FL in a clinical laboratory of the C.H.U. of Lige, Belgium.)
constante (46). A intervalles rguliers, le taux dhmo-
lyse est mesur comme marqueur in vitro du dommage
oxydatif. Le temps de latence avant le dmarrage de
lhmolyse sera directement proportionnel la quantit
dantioxydants prsents dans les rythrocytes.
Si ces techniques apparaissent sur le papier comme
intressantes, elles nen sont pas moins fortement sujet-
tes caution. Dabord ces mthodes ne mesurent en
aucun cas les antioxydants de type enzymatique
comme la SOD ou la GPx. Il faut galement savoir que
les protines plasmatiques reprsentent elles seules
entre 60 et 90 % de la capacit antioxydante totale de
lchantillon (47) (Fig. 4). Une dprotinisation de
lchantillon est envisageable mais cette procdure
entrane aussi la prcipitation de certains antioxydants
comme les polyphnols. Dans ces systmes, il a aussi
t bien montr que lacide urique est un lment qui
contribue largement la capacit antioxydante totale
du plasma (48). La vitamine C, les carotnodes et les
autres antioxydants ne reprsentent finalement quune
partie trs infime de la capacit antioxydante totale du
plasma. Cette mthode est donc prendre avec toutes
les prcautions dusage dans son utilisation et son inter-
prtation (49) et elle ne peut en aucun cas servir de base
la dcision de prendre une complmentation en anti-
oxydants.
Les oligo-lments, partenaires des dfenses
antioxydantes ? (Tab. 2)
Dans le cadre du stress oxydant, lattention se porte tout
particulirement sur trois oligo-lments : le cuivre, le zinc
et le slnium. A concentration physiologique, le cuivre
et le zinc agissent comme antioxydants en tant les
Nutritions & Endocrinologie Dcembre 2009 Special antioxydant
Antioxydants
deux co-facteurs responsables de la bonne activit de la
SOD. A haute concentration (> 1,55 mg/L), le cuivre
devient toutefois un pro-oxydant trs puissant en favori-
sant, tout comme le fer, la production dEOA (raction de
Fenton).
Le zinc, autre co-facteur de la SOD, est impliqu dans
la synthse des mtallothionines antioxydantes. Il joue
galement un rle important dans le maintien dune
bonne immunit. De surcroit, il est capable dinhiber la
production des EOA induite par le cuivre. Ltude du
rapport de concentration entre le cuivre et le zinc
(Cu/Zn) est dun trs grand intrt. En condition physio-
logique, la valeur du rapport est proche de 1. Toute
modification la hausse devra tre interprte comme
tant un signe de la prsence dun stress oxydant (50).
Comme nous lavons dmontr dans lEtude Ligeoise
sur les Antioxydants (tude ELAN), une lvation de ce
rapport est tout particulirement observe chez les fem-
mes prenant un contraceptif oral (51). De plus, nous
avons dmontr quil existait une corrlation positive
parfaite entre la valeur du rapport et le taux de lipides
oxyds circulants.
Le slnium est le co-facteur de la GPx qui favorise lli-
mination des lipides oxyds. Il joue aussi un rle primor-
dial dans le maintien dune bonne immunit tout en tant
le co-facteur dautres enzymes impliques dans le fonc-
tionnement de la thyrode. Des taux de slnium infrieurs
45 g/L sont associs des risques accrus de dvelop-
per des maladies cardiovasculaires (52). Ces trois oligo-
lments se dosent aisment en biologie clinique laide
dune technique dabsorption atomique ou de la spectro-
scopie de masse plasma, mme si ces quipements pr-
sentent le dsavantage dtre trs coteux.
Quelles conditions sont propices la produc-
tion dEOA ? (Tab. 3 et 4)
En prsence de fer, le glucose soxyde entranant la
gnration dEOA, mais aussi la production de la
forme aldhyde du glucose, le glyoxal. Cette molcule
se fixe rapidement sur les protines dans lesquelles
apparat un rsidu carboxymthyllysine (CML) dcela-
ble par mthode HPLC. En captant facilement le cuivre,
ce groupement, induit une augmentation de la produc-
tion de radicaux libres et, par voie de fait, de la peroxy-
dation lipidique (53). Ce mcanisme pourrait expliquer
pourquoi le diabte est souvent associ des complica-
tions cardiovasculaires.
Par ailleurs, le glucose peut galement se fixer sur lh-
moglobine qui se transforme en hmoglobine glyque
ou glycosyle (HbA1c). Son dosage est ais et pro p o s
depuis de nombreuses annes dans la pratique clinique.
Le glucose se lie aussi facilement avec les groupements
amines libres des protines pour former des produits
dAmadori qui se dgradent en produits avancs de la
23
 Antioxydants

Tableau 3 Biomarqueurs du stress oxydant : les systmes pro-oxydants

MTHODE DE MESURE SPCIFICIT DE LA PRDICTION UTILISATION EN ROUTINE
DU STRESS OXYDANT CLINIQUE

SOURCES DOXYDATION
Glucose, hmoglobine Spectrophotomtrie Excellente Facile
glycosyle
Produits AGE (pentosidine) HPLC Bonne Difficile
Rcepteurs AGE Kit ELISA Bonne Potentielle
(RAGE)
Myloperoxydase Kit ELISA Excellente Facile

Homocystine HPLC Excellente Facile

Kits ELISA Excellente Facile

MTABOLISME DU Fe Spectrophotomtrie Excellente Facile

MTABOLISME DU NO spectrophotomtrie,
RPE, microarray Bonne Potentielle

EXPRESSION DE GNES
ANTIOXYDANTS Microarray Moyenne Difficile

glycation (AGE) dont la pentosidine est le chef de file
(54, 55). Sa concentration slve avec lge, dans le
diabte, la rtinopathie, les maladies rnales en phase
terminale et larthrite rhumatode.
Cette molcule reste assez difficile doser de sorte que
sa mesure ne sest pas encore impose dans le milieu
mdical. Une fois forms, les AGE plasmatiques peu-
vent se lier des rcepteurs (RAGE) prsents sur les cel-
lules endothliales, les cellules glomrulaires et les
macrophages et diminuer ainsi leur concentration plas-
matique (56). Des tudes rcentes ont montr que le
taux circulant de RAGE qui est aisment mesur laide
dun kit ELISA tait fortement diminu chez des patients
atteints de polyarthrite rhumatode en comparaison
avec des sujets sains (57).
Les neutrophiles qui subissent un processus dactivation
augmentent leur consommation doxygne (flambe res-
piratoire) denviron 400 % avec comme consquence
une production massive dEOA dans lorganisme.
Mettre en vidence cette activation sera donc une faon
indirecte de prouver la formation dEOA. Une fois acti-
vs, les neutrophiles secrtent galement dans le milieu
extracellulaire diverses enzymes (dgranulation) dont la
fameuse myloperoxydase (MPO). Comme expliqu ci-
dessus, celle-ci est lorigine de la formation doxy-
dants chlors trs puissants comme lacide hypochlo-
reux ou les chloramines (58). La mesure de la MPO
(comme tmoin de la production dEOA par les neutro-
philes activs) se fait facilement dans le plasma laide
de kits ELISA. Chez des patients souffrant dangine de
poitrine, des tudes rcentes ont montr que ceux qui se
prsentaient ladmission des soins intensifs avec des
valeurs situes dans un tertile suprieur (30 - 60 ng/mL)
avaient un facteur de risque 4 fois plus lev de dve-
lopper dans les 30 jours un vnement cardiaque
majeur (infarctus du myocarde, revascularisation,
dcs) par rapport aux patients ayant des taux situs
dans un tertile infrieur (< 18 ng/mL) (59).
Lhomocystine est un acide amin contenant du soufre
qui provient du mtabolisme de la mthionine.
Lhomocystine est dgrade en cystine sous laction
de la vitamine B6 et de lacide folique. Un dficit en ces
lments conduit donc une augmentation de lhomo-
cystine dans le plasma. Le taux normal de lhomocys-
tine dans le plasma jeun est compris entre 5 et
15 M. Lhyperhomocystinmie est modre quand
elle est situe entre 16 et 30 M et considre comme
svre si elle dpasse 200 M. Plusieurs travaux ont
montr quune hyperhomocystinmie mme modre
est lorigine dune augmentation du risque de surve-
nue daccident cardiovasculaire mais il convient toute-
fois de tenir compte de la fonction rnale de lindividu
(60). Si elle nest pas dgrade, lhomocystine
soxyde trs vite en formant des EOA qui oxydent leur
tour les LDL. Le dosage de lhomocystine totale (HCyt)
par HPLC ou kit ELISA avec une bonne corrlation entre
les deux mthodes est devenu trs courant en biologie
clinique.

24 Nutritions & Endocrinologie Dcembre 2009 Special antioxydant


Le fer, au cur dquilibres dlicats
Le fer doit tre finement rgul pour viter lapparition
de situations pathologiques comme les surcharges
gntiques en fer (source de stress oxydant), ou bien
loppos des carences en fer, particulirement celles
associes aux inflammations chroniques. Un bilan com-
plet incluant la mesure du fer srique, de la ferritine, de
la transferrine et de la capacit de fixation en fer de la
transferrine permettra de distinguer ces deux types de
situations anormales.
La ncessaire standardisation
des protocoles
Enorme variabilit des valeurs de rfrence
Une des raisons principales en est que ltude du stress
oxydant est reste longtemps confine au sein des labo-
ratoires universitaires.
De nombreuses quipes ont ainsi dvelopp leurs pro-
pres tests ensuite repris par dautres chercheurs qui y
ont intgr diverses variantes. Ainsi, par exemple, plus
dune centaine de protocoles tous diffrents les uns des
autres ont t dvelopps rien que pour la mesure des
TBARS initialement dcrite par Yagi et al (10). La dtec-
tion de la vitamine E par HPLC a fait lobjet de trs nom-
breuses modifications. Pour la mesure des isoprostanes,
pourtant considre comme un gold standard pour
valuer la prsence dune peroxydation lipidique in
vivo, des taux urinaires moyens allant de 55 1600
pg/mg cratinine ont t dcrits en raison de diffren-
ces dans la mthodologie (61). Le programme euro-
pen ESCODD (European Standard Committee on
Oxidative DNA Damage) a eu pour but de raliser une
comparaison interlaboratoire de la mesure du produit
doxydation de lADN de lymphocytes humains. En uti-
lisant la technique HPLC, la concentration mdiane de
la 8-oxo-7, 8 dihydro-2-dsoxyguanosine est de 2,78
pour 106 guanines contre seulement 0,50 pour 106 gua-
Tableau 4 Conditions propices la Surproduction dEOA
CONDITIONS PATHOLOGIQUES
Diabte, rtinopathie, nphropathie,
polyarthrite rhumatode
Infection (dgranulation des neutrophiles),
angine de poitrine
Carence en vitamine B6 ou acide folique,
maladie cardiovasculaire
Surcharge gntique en fer
Maladies cardiovasculaires
Prise de pilule contraceptive
Nutritions & Endocrinologie Dcembre 2009 Special antioxydant
Antioxydants
nines avec des techniques enzymatiques (62). Ces trs
grandes disparits dans les valeurs sont toujours lies
au protocole danalyse en lui-mme mais aussi au choix
(et au nombre) des sujets inclus pour ltude.
Pour certaines analyses comme les LDL oxydes, les
anticorps anti-LDL oxydes, les peroxydes lipidiques, le
glutathion ou les SOD et GPx, des kits commerciaux res-
pectant des normes prcises de fabrication ont t mis
au point. Ceci devrait thoriquement permettre une
meilleure harmonisation inter-laboratoire dans les nor-
mes de rfrence. Toutefois, des diffrences significati-
ves sont encore releves selon le type dadaptation de
lanalyse sur les robots automatiques. Certains probl-
mes peuvent aussi tre lis la conservation et la stabi-
lit des standards destins tablir la courbe de rf-
rence. Enfin, les laboratoires privs tablissent leurs nor-
mes sur la base de leur population de sujets qui sont,
par dfinition, malades. Par ailleurs, le traitement pr-
analytique (voir plus loin) est souvent peu respect
puisquun chantillon sanguin peut trs bien rester 3
4 heures temprature ordinaire chez le mdecin
avant que le prlvement ne soit achemin vers le labo-
ratoire. Dans ces conditions, il est vident que les nor-
mes proposes sont difficilement comparables et sou-
vent peu crdibles.
Notre groupe du CHU de Lige en Belgique a rcem-
ment propos des normes de rfrence (ou usuelles)
pour un grand nombre de paramtres sanguins du
stress oxydant en tablissant des critres trs stricts de
prlvement comme dcrits plus loin (63). Ces normes
ont t tablies sur des populations de 60 120 sujets
en bonne sant apparente (pas dantcdents de can-
cers ou de maladies cardiovasculaires), dge compris
entre 20 et 60 ans et ne prenant pas de complments
en antioxydants (Tab. 5). Les habitudes de vie taient
galement parfaitement connues : consommation de
MARQUEUR BIOCHIMIQUE AU TAUX AUGMENT
Glyoxal, carboxymthyllisine, hmoglobine glyque, AGE
Myloproxydase
homocystine
Fer total
Peroxydes lipidiques, LDL oxydes, anticorps contre LDL oxydes,
taille LDL, paraoxonase, vitamines C et E
Proxydes lipidiques, cuivre, zinc, -carotne
25
 Antioxydants
fruits et lgumes, tabagisme, activit physique. Enfin,
une parit homme/femme 50/50 a toujours t respec-
te. Ces normes ont servi de base ltablissement du
profil de stress oxydant dun chantillon de 897 person-
nes ges de 40 60 ans vivant en Province de Lige,
Belgique (51). Ceci nous a aussi permis dvaluer dans
quelle mesure le mode de vie pouvait influencer les taux
plasmatiques en vitamine C et -carotne (64).
Homogniser la prparation
des chantillons sanguins
A bonnes conditions, bons prlvements
Ltablissement de normes de rfrence ne peut senvi-
sager que si les chantillons sanguins sont prlevs
dans de bonnes conditions.
Le systme de prlvement utilis doit ainsi viter au
maximum la formation de tout phnomne dhmolyse
qui peut engendrer des artfacts au niveau de lanalyse
plasmatique de certains paramtres (lipides oxyds,
vitamine C, slnium,...).
Les prises de sang doivent toujours se faire entre 8 et
10 heures du matin. Il existe en effet des cycles circa-
diens qui modifient considrablement certains param-
tres, comme la concentration en glutathion rduit ou en
isoprostanes (65).
Les sujets doivent tre jeun depuis la veille au soir. A
titre dexemple, il faut un minimum de 6h 8h pour que
sattnue laugmentation temporaire de la vitamine C
lie la simple absorption dun jus dorange.
Les sujets doivent viter toute activit sportive la veille
du prlvement puisque lexercice physique induit un
stress oxydant auquel lorganisme rpond temporaire-
ment en sur-exprimant ses dfenses antioxydantes.
Idalement, les sujets doivent aussi sastreindre ne
pas fumer (une source importante de production
dEOA) dans les heures qui prcdent la prise de sang.
Figure 5 - Stabilit de la vitamine C selon les
conditions de conservation de lchantillon
plasmatique. Colonne 4 : stabilisation du plasma par
de lacide mtaphosphorique 10 % (v/v).
26 Nutritions & Endocrinologie Dcembre 2009 Special antioxydant
Dans le cadre du cycle menstruel chez la femme, il est
ncessaire de faire la prise de sang dans la phase fol-
liculaire ou lutale, car la production du 17 -stra-
diol, maximale au moment du pic ovulatoire est asso-
cie avec une augmentation denviron 20 % du sl-
nium et de la glutathion peroxydase (66).
Enfin, il faut tenir compte du fait quil peut aussi exister
des variations relativement importantes dun jour lau-
tre de la concentration de certains marqueurs, comme
les isoprostanes par exemple (67).
Les rgles dor du traitement pr-analytique
Au niveau du traitement pr-analytique de lchantillon
sanguin, deux rgles dor doivent toujours tre de mise :
- centrifugation immdiate des tubes sanguins
- et conglation des chantillons de plasma une temp-
rature comprise entre -40 et -80C jusqu leur analyse.
Dans certains cas (vitamine C, glutathion oxyd), des
stabilisateurs doivent tre ajouts.
Ces prcautions qui relvent des bonnes pratiques de
laboratoire sont bases sur les 3 considrations suivantes.
Pre m i rement, les antioxydants agissent dans le sang en
synergie (systme redox) et la concentration de lun
dpendra donc de celle de lautre. Sachant que la vita-
mine C et le glutathion rduit (GSH), deux antioxydants
majeurs de ce rseau complexe, sont bien connus pour
leur caractre labile une fois le sang prlev (Fig. 5), il
convient donc de figer au plus tt ce rseau afin davoir
le meilleur reflet possible de ce qui se passe in vivo.
Deuximement, il est connu depuis longtemps que
beaucoup de marqueurs doxydation (notamment au
niveau des lipides) se dgradent trs vite en sous-pro-
duits dans le tube sanguin.
Troisimement, les globules blancs, qui produisent natu-
rellement et en permanence des EOA, peuvent tre
suractivs par certains anti-coagulants comme lhpa-
rine, ce qui reprsente donc une source ex vivo non
dsirable de production dEOA dans le tube sanguin
(68). Dans ce contexte, imaginons donc ce qui pourrait
se passer au niveau de la concentration en antioxy-
dants chez un patient prsentant un phnomne inflam-
matoire et dont lchantillon sanguin ne serait trait que
plusieurs heures aprs le prlvement...
Afin de garantir un rsultat de qualit, il est indispensa-
ble de sensibiliser au maximum le personnel de labora-
toire tous ces problmes. Un stress oxydant ne se
mesure pas comme un simple cholestrol !
Pourquoi mesurer le stress oxydant ?
Sur le plan prventif, les professionnels de sant pren-
nent de plus en plus conscience du rle primordial de
la nutrition au sein de laquelle les antioxydants tiennent
une place de choix. Lengouement actuel pour les anti-
oxydants naturels et synthtiques ne doit pas nous faire
 Antioxydants

oublier que beaucoup de recherches seront encore

ncessaires pour comprendre leurs mcanismes dac-
tion ainsi que leurs effets rels en terme de protection
des fonctions vitales de lorganisme.
Des analyses sanguines du stress oxydant, condition
quelles soient ralises dans des conditions ad hoc,
devraient permettre aux mdecins de rpondre, en
pratique plusieurs questions :
Mon patient prsente-t-il rellement des dficits en anti-
oxydants ou oligo-lments (par rapport des normes de
rfrence ou usuelles tablies selon les meilleurs critres
scientifiques et de qualit et en accord avec les donnes
de la littrature) ? Toutes les tudes montrent que plus le
statut en antioxydants dun individu est bas, plus il pr-
sente un risque de dvelopper des maladies cardiovascu-

Tableau 5 Valeurs de rfrence des marqueurs sanguins du stress oxydant tablies

par le CHU de Lige, Belgique (61).
MARQUEURS MODE DACTION ET INTRT VALEURS DE RFRENCE
DU DOSAGE CHU-LIGE
ANTIOXYDANTS
Vitamine C pigeur de radicaux libres H : 6,21 15,18 g / ml
marqueur de la consommation de fruits F : 8,6 18,83 g / ml
valeur plasmatique basse associe
avec l'apparition de diverses pathologies
tocophrol inhibiteur de la peroxydation lipidique 8 15 mg / litre
action de synergie avec la vitamine C
(rapport idal de concentration)
-tocophrol valeur plasmatique basse plus prdictive que
l'-tocophrol 0,28 2,42 mg / litre
dans la survenue de pathologies cardiovasculaires
et de cancer de la prostate
Vitamine A pigeur de radicaux libres - implication dans la vision 1200 3700 UI / litre
-carotne marqueur de la consommation de lgumes 0,05 0,68 mg / litre
pigeur de l'oxygne singulet (--> photoprotecteur)
inhibition forte concentration de mcanismes
physiologiques de dfense
Glutathion rduit marqueur de la prsence d'un stress oxydant 717 1110 mol/litre
Glutathion oxyd action de synergie avec la vitamine C et l'-tocophrol 1,17 5,32 mol/litre
rapport GSH/GSSG 156 705
Capacit antioxydante 11 000 - 16 000 M
totale test global de screening (ne peut tre interprt seul) Equiv Trolox
(Test ORAC) (plasma non dprotinis)
Ubiquinone inhibiteur de la peroxydation lipidique 0,3 1,39 mg / litre
implication dans la chane respiratoire mitochondriale
Acide urique antioxydant possdant la plus forte ractivit H < 70 mg / litre
avec les radicaux libres - reflet de la prsence
de phnomnes d'ischmie - reperfusion F < 60 mg / litre
Vitamines B6, B9 rgulatrices de la concentration plasmatique B9 : 2,2 17,5 ng / ml
et B12 en homocystine
implication dans la synthse de l'ubiquinone B12 > 200 pg / ml
Superoxyde
dismutase (SOD) limination de l'anion superoxyde 785 1570 UI / g Hb
Glutathion limination du peroxyde d'hydrogne et
peroxydase (GPx) des peroxydes lipidiques H : 20-56 UI / g Hb
reflet d'une adaptation au stress oxydant F : 26-58 UI / g Hb
facteur de risque cardiovasculaire

Nutritions & Endocrinologie Dcembre 2009 Special antioxydant 27

 Antioxydants

Tableau 5 suite
OLIGOELEMENTS
Slnium co - facteur des diffrentes GPx - rle dans l'immunit 94-130 g/litre
Cuivre co - facteur de la SOD F : 0,8-1,55 mg/litre
facteur prooxydant forte concentration H : 0,7-1,40 mg/litre
Zinc co - facteur de la SOD 0,7-1,20 mg/litre
inhibe les ractions d'oxydation induites par le cuivre
rle dans l'immunit
Rapport Cu/Zn marqueur de la prsence d'un stress oxydant 1 - 1,17
corrlation positive avec le taux plasmatique
de peroxydes lipidiques
MARQUEURS d'OXYDATION
Peroxydes lipidiques marqueur des dommages oxydatifs au niveau des lipides 10-400 mol/litre
implication dans le dveloppement de l'athrosclrose
LDL oxydes facteur de risque cardiovasculaire 0 - 500 ng/ml
(LDL petites et denses plus susceptibles l'oxydation)
Anticorps contre rponse de l'organisme la production de LDL oxydes 200-600 UI/litre
les LDL oxydes facteur de risque cardiovasculaire
Isoprostanes marqueur spcifique de la peroxydation lipidique en dveloppement
8 hydroxy marqueur d'oxydation de l'ADN 0-16 g/litre
- doxyguanosine facteur de risque de dveloppement de cancer 0-20 g / g creatinine
Protasome systme de rgulation des protines oxydes
sensible la production des radicaux libres
Advanced glycated marqueur de la glycolisation des protines
endproducts (AGE) dans le diabte, l'athrosclrose,
(pentosidine) et les maladies rnales et l'arthrite rhumatode
rcepteurs des AGE
SOURCES d'OXYDATION
fer libre fer toxique conduisant une augmentation accrue 0
de radicaux libres
fer srique surcharge en fer H 8-33, F 6-31 mol/litre
ferritine H 30-400, F 15-150 ng/ml
coefficient H 0,2-0,4 , F 0,2-0,5
de sauration en fer
de la transfrrine
homocystine facteur de risque cardiovasculaire indpendant < 60 ans : 5-15 mol/litre
du cholestrol - contribue l'oxydation des LDL > 60 ans : 5-20 mol/litre
myloperoxydase marqueur de l'inflammation (source de production 10 75 ng/ml
de radicaux libres) - facteur de risque cardiovasculaire
glucose amplifie la peroxydation lipidique 0,6-1,1 g/litre
implication dans la glycation des protines

TAvec laimable permission de la Revue Mdicale de Lige.

28 Nutritions & Endocrinologie Dcembre 2009 Special antioxydant


laires et des cancers. En revanche, rien ne permet daffir-
mer quun sujet ayant un statut en antioxydants dans les
normes soit mieux protg en prenant des complments
en antioxydants. Ainsi, en-dessous dune valeur plasmati-
que de dpart en slnium de 106 g/L, une complmen-
tation journalire en cet oligo-lment raison de 200 g
par jour savre efficace aprs 8 ans pour la prvention
de lapparition du cancer de la prostate chez lhomme.
Cependant, au-del de 121 g/L, cette mme compl-
mentation est lorigine dun risque accru de dvelopper
ce type de cancer (69). Dans le mme ordre dide,
ltude SUVIMAX montre mme que chez les femmes dont
le statut initial en antioxydants est meilleur que celui des
hommes, leffet de lintervention en antioxydants doses
nutritionnelles pendant une longue priode (8 ans) nest
pas dcelable et saccompagne mme dans certains cas
dun effet dfavorable pour le cancer de la peau (70).
Si oui, quelle sera alors la meilleure stratgie pour cor-
riger un statut en antioxydants non optimal ? Une alimen-
tation riche en fruits et lgumes (au moins 5 par jour) doit
dabord et avant tout tre privilgie. Quinze jours dun
rgime enrichi en fruits et lgumes (5 vs moins de 3 par
jour) permettent daugmenter le taux plasmatique en vita-
mine C de 50 % et celui en - c a rotne de 30 % (71).
Quels sont les effets rels de cette correction sur la
concentration plasmatique en antioxydants et des mar-
queurs du stress oxydant ? La complmentation ven-
tuelle en antioxydants et en oligo-lments ne conduit-
elle pas des valeurs sanguines dpassant les normes
de rfrence ou usuelles ? En effet il ne faut pas oublier
- et ceci est souvent ignor du monde des praticiens -
que les EOA ont un rle physiologique important
jouer (rgulation de lapoptose, dfense immunitaire).
Par consquent, des antioxydants pris de faon irrai-
sonne ( des mgadoses et sur plusieurs annes) peu-
vent potentiellement inhiber des dfenses primordiales
pour lorganisme et mme augmenter la mortalit (72).
Lexemple suivant montre comment la rgulation du
stress oxydant est un phnomne particulirement com-
plexe et quil est donc ncessaire davoir des analyses
sanguines pour ne pas travailler laveugle en matire
de complmentation en antioxydants. Une tude dun
trs grand intrt pratique montrant comment la prise
dun complment en vitamine E permet de rguler la
concentration en isoprostanes plasmatiques (73). Cette
tude montre que des doses journalires de vitamine E
(sous forme d-tocophrol) comprises entre 0 et 134
mg nentranent aucune modification de la concentra-
tion en isoprostanes aprs 16 semaines de traitement.
Avec 298 mg par jour, une diminution non significative
de 20 % est observe. Ce nest que pour des mgado-
ses en vitamine E comprises entre 600 et 2388 mg que
des diminutions significatives (30 - 60 %) sont mises en
vidence. Nanmoins, une autre tude a dmontr que
Nutritions & Endocrinologie Dcembre 2009 Special antioxydant
Antioxydants
ces doses en vitamine E (sous forme
d-tocophrol) qui dpassent donc trs largement lap-
port journalier recommand en vitamine E (10 mg)
entranent en seulement 1 semaine une diminution de
50% de son isomre -tocophrol (74).
Mon patient prsente-t-il des facteurs de risques cardio-
vasculaires autres que le classique cholestrol et qui sont
lis la formation excessive dEOA (e.g. LDL oxydes,
anticorps contre les LDL oxydes, peroxydes lipidiques) ?
Quelles sont les origines possibles de la prsence
dun stress oxydant (anomalies dans le mtabolisme du
fer, inflammation, glycmie, hyperhomocystinmie,
mauvais quilibre entre les acides gras 6 et 3) et
comment les corriger ?
Affiner lanalyse pour orienter
les dcisions cliniques
Le stress oxydant est un phnomne beaucoup trop
complexe pour pouvoir tre mis en vidence par un seul
marqueur aussi simple (comme la mesure de la capa-
cit antioxydante totale) ou labor (expression gni-
que par array) soit-il.
Il est donc ncessaire de combiner entre elles un ensem-
ble danalyses qui refltent diffrents aspects du stress
oxydant. En voici un exemple type : habitudes alimen-
taires en relation avec la consommation de fruits et
lgumes (vitamine C et -carotne), origine de la pro-
Lavis dun mdecin gnraliste
Dr Van Honacker, Ecaussinnes, Belgique
Les valuations du stress oxydant apportent incontesta-
blement un plus dans notre pratique clinique de mde-
cin gnraliste.
En prvention primaire, ces valuations permettent de
mieux apprhender ltat de sant de nos patients et de
mieux quantifier leur niveau de protection par rapport aux
affections cardiovasculaires et cancreuses, notamment.
Dans le cadre daffections aussi courantes que lhyperten-
sion artrielle, lhypercholestrolmie, lobsit, le dia-
bte et le syndrome mtabolique, ces mesures du stress
oxydant aident aussi prciser ltat des ressources anti-
oxydantes de nos patients.
Enfin, ces valuations permettent dtablir un pont entre la
mdecine gnrale et la mdecine nutritionnelle car elles
dbouchent souvent sur la mise en place de nouvelles habi-
tudes alimentaires, voire sur des propositions de compl-
mentations pharmacologiques raisonnes, doses physio-
logiques. Nous vitons ainsi les cueils des complmenta-
tions sauvages utilisant, laveugle, des doses supra-phy-
siologiques dont nous connaissons les dangers (83).
29
 Antioxydants
duction dEOA (cuivre, zinc, rapport Cu/Zn), prsence
dun stress oxydant (glutathion rduit et oxyd) et fac-
teur de risque cardiovasculaire associ au stress oxy-
dant (peroxydes lipidiques ou LDL oxydes). Une anam-
nse complte doit venir complter ces donnes afin de
raliser une interprtation correcte des rsultats.
Dautres analyses comme celle des polyphnols - ces
antioxydants uniques prsents dans de nombreux ali-
ments comme les fruits, les lgumes, le th, le chocolat,
le vin - seront bientt disponibles et permettront daffi-
ner encore plus le statut de stress oxydant dun individu.
Il importera aussi de connatre sil existe des corrlations
entre les diffrents paramtres mesurs ou avec les don-
nes cliniques. Ainsi, nous avons bien montr la corr l a-
tion significative entre la valeur du rapport Cu/Zn et le
taux de peroxydes lipidiques circulants(51). La concen-
tration plasmatique en slnium est corrle positivement
la GPx rythro c y t a i re, mais ceci uniquement pour des
valeurs de slnium en-dessous de 80 g/L. Dans une
tude de suivi portant sur 27 ans (615 hommes de 50
ans en bonne sant), il a galement t montr que le
taux de slnium permettait de prdire le taux disopro s-
tanes (75). Des tentatives de scoring dvaluation du
stress oxydant ont t rcemment proposes dans diff -
rentes situations pathologiques (76-78). Au niveau clini-
que, le taux urinaire disoprostanes reflte bien ltendue
et la svrit des maladies de lartre coronaire (79). Un
taux lev disoprostanes chez des patients admis aux
soins intensifs est un bon facteur pronostique dune issue
fatale chez ces patients (80).
Par ailleurs, nous esprons avoir bien convaincu le lec-
teur que de mauvaises conditions de prlvement et de
traitement des chantillons sanguins modifient consid-
rablement les valeurs obtenues. Il importe aussi que les
mdecins intresss par les bilans de stress oxydant
soient bien au courant (ce qui est rarement le cas) de la
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30 Nutritions & Endocrinologie Dcembre 2009 Special antioxydant
faon dont les normes de rfrence prsentes par les
laboratoires danalyse ont t effectues.
Enfin, de gros efforts de standardisation dans les mtho-
des danalyses doivent encore tre raliss afin de pou-
voir faire des comparaisons inter-laboratoires, ce qui
est loin dtre le cas aujourdhui. Pour diverses raisons
(facilit danalyse, cot, ), certains laboratoires utili-
sent les isoprostanes comme marqueur de la peroxyda-
tion lipidique alors que dautres se sont orients vers le
MDA ou les lipides oxyds. Bien quils soient censs
valuer le mme phnomne, il ny a toutefois que trs
peu de corrlations entre ces divers marqueurs (81).
Dans ltat actuel des choses, il nous semble plus logi-
que, pour la mise en vidence dune peroxydation lipi-
dique, de combiner lanalyse de plusieurs marqueurs.
Ainsi le CHU de Lige prconise le dosage simultan
des peroxydes lipidiques, des LDL oxydes et des anti-
corps contre les LDL oxydes, avec si possible la dter-
mination des isoprostanes urinaires ou plasmatiques. A
cela peut sajouter lvaluation de la taille des LDL (voir
commentaires tableau 1) ainsi que le dosage de la
paraoxonase (PON), enzyme lie aux HDL et ayant la
proprit dliminer les LDL oxydes (82). Si des valeurs
anormales individuelles sont releves pour chacun de
ces paramtres, alors la prsence dune oxydation lipi-
dique est bien objective.
Il nous importe tous de vivre le plus longtemps possi-
ble tout en restant en bonne sant. Dans cette optique,
le stress oxydant et les antioxydants ont incontestable-
ment un grand rle jouer malgr le scepticisme
encore affich par certains. Il faut reconnatre que la
mdecine prventive dans ce domaine en est encore
ses balbutiements. Toutefois, les scientifiques ne peuvent
pas ignorer cet tat de fait et doivent sortir des sentiers
battus afin de proposer aux mdecins de terrain de plus
en plus intresss par le sujet tous les atouts pour dve-
lopper au mieux ce type de mdecine.
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