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CAPTULO V
INTRODUCCIN A LAS
SEPARACIONES
CROMATOGRAFICAS
A+B
Columna de
relleno
t0 t1 t2 t3 t4
A B
t0 t1 t2 t3 t4
Tiempo
Luego que el analito llega al detector, se representa su seal en funcin del tiempo (o
del volumen de fase mvil aadido), de esta manera se obtienen una serie de picos (como se
muestra en la parte inferior de la Figura 1); obteniendo un grfico denominado cromatograma,
el cual es til tanto para el anlisis cualitativo como cuantitativo.
Parmetros cromatogrficos:
tR
tM
Tiempo
c. La velocidad de migracin del soluto; factor de retencin (k): Se utiliza para describir
las velocidades de migracin de los analitos en las columnas. Para una especie A, el
factor de capacidad kA est relacionado con la velocidad a la cual A migra a travs de
una columna. Es la cantidad de tiempo que pasa un soluto en la fase estacionaria en
relacin con el tiempo que pasa en la fase mvil. Se expresa como:
kA = KA VS o k= tr tM
VM tM donde tR y tM se pueden obtener a partir de un
cromatograma.
Cuando el factor de capacidad para una especie es mucho menor que la unidad, la
elucin tiene lugar tan rpidamente que es difcil determinar con exactitud los tiempos de
retencin. Cuando el factor de capacidad es del orden de 20 a 30 o tal vez mayor, los
tiempos de retencin son demasiado largos. Idealmente, las separaciones se realizan en
unas condiciones en las que los factores de capacidad para las especies de una mezcla
oscilan entre 1 y 5.
= (k)B - tM
(k)A - tM
Ensanchamiento de banda:
Eficiencia de la columna:
Dos trminos afines se utilizan con frecuencia como medidas cuantitativas de la eficiencia de
una columna cromatogrfica: a) la altura de plato H y b) el nmero de platos tericos N.
Los dos estn relacionados por la ecuacin: N = L/H donde L es la longitud (normalmente en
centmetros, si es cromatografa lquida y en metros si es cromatografa gaseosa) del relleno
de la columna.
La eficiencia de la columna cromatogrfica aumenta cuanto mayor es el
nmero de platos tericos y cuanto menor es la altura de platos tericos
Relacin entre la altura de plato y las variables que afectan la eficiencia de la columna:
La eficiencia de las columnas cromatogrficas puede evaluarse por la expresin:
RS = 2 [(tR)B (tR)A]
W A + WB
A partir de la figura 3 se observa que una resolucin de 1,5 permite una separacin
esencialmente completa de los dos componentes, mientras que no es as con una
resolucin de 0,75. Con una resolucin de 1,0 la zona de A contiene aproximadamente
un 4 % de B, y la zona de B contiene una cantidad similar de A.
Con una resolucin de 1,5 el solapamiento es del orden de un 0,3 %.
Para una fase estacionaria dada, la resolucin puede mejorarse alargando la columna,
aumentando as el nmero de platos. Sin embargo, una consecuencia adversa del
aumento del nmero de platos es un aumento del tiempo necesario para la separacin.
Calibracin y patrones
El mtodo ms sencillo para el anlisis cromatogrfico cuantitativo implica la preparacin
de una serie de disoluciones de patrn de composicin igual a la de la muestra. A
continuacin se obtienen los cromatogramas de los patrones y se representan las alturas
o reas de pico en funcin de la concentracin. La representacin de los datos debera
originar una lnea recta que pasara por el origen de coordenadas; los anlisis se basan en
esta grfica. Para una mayor exactitud es necesaria una reestandarizacin frecuente.
Coeficiente de distribucin:
Factor de selectibidad :
Resolucin:
Nmero de platos:
Tiempo de retencin:
Volumen de retencin:
Gas portador
Entre los gases portadores, que deben ser qumicamente inertes, se encuentran el helio,
argn, nitrgeno, dixido de carbono y el hidrgeno.
Como se indicar posteriormente, la eleccin del gas est con frecuencia determinada por
el tipo de detector que se utiliza. Con el suministro del gas se encuentran asociados los
reguladores de presin, manmetros y medidores de flujo. Adems, el sistema de gas
portador contiene generalmente un tamiz molecular para eliminar el agua u otras
impurezas.
De hecho, no hay detector que rena todas las caractersticas, y tampoco parece probable
que pueda llegar a disearse nunca.
Se describirn los utilizados ms frecuentemente.
Existen cuatro tipos bsicos de cromatografa en los que la fase mvil es un lquido:
(1) cromatografa de reparto;
(2) cromatografa de adsorcin, o lquido-slido;
(3) cromatografa inica;
(4) cromatografa de exclusin por tamaos, o en geles.
En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografa de lquidos, los cientficos se
dieron cuenta que se podan conseguir grandes aumentos en la eficacia de la columna
disminuyendo el tamao de las partculas de los rellenos. Sin embargo, no fue sino hasta
finales de los aos sesenta cuando se desarroll la tecnologa adecuada para producir y
utilizar rellenos de tamao de partcula del orden de los 3 o 10 m. Esta tecnologa requiere
una instrumentacin sofisticada, que contrasta con las simples columnas de vidrio de la
cromatografa de lquidos clsica.
Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamao de
partcula entre 3 y 10 m, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografa de
lquidos; se requieren presiones de algunos cientos de kilos por centmetro cuadrado. Como
consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser ms
sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografa. La Figura 5 muestra un
esquema de los componentes fundamentales de un cromatgrafo de lquidos de alta
resolucin tpico.
Aplicacin de HPLC
GUA TERICA
INTRODUCCIN A LA SEPARACIONES CROMATOGRFICAS
Cromatografa de
lquidos
(LC)
Fase mvil: lquida
Cromatografa de gases
(GC)
Fase mvil: gas
Constante de distribucin:
Resolucin (Rs):
6) Complete el siguiente cuadro estableciendo las diferencias entre las diferentes tcnicas
cromatogrficas:
CROMATOGRAFA GASEOSA CROMATOGRAFA LQUIDA
Fase mvil
Volumen de
inyeccin
Inyector
Jeringas
Temperatura
Descripcin
Tamao
Columnas
(long., diam.
Interno)
Fase
estacionaria
Temperatura
Detectores
Caractersticas de
los analitos
Aplicaciones
TRABAJO PRCTICO N 4
CROMATOGRAFA
Introduccin
Las tcnicas cromatrogrficas son tcnicas de separacin. Tienen como finalidad la
separacin de mezclas de solutos que, disueltas en un solvente, son fraccionadas en sus
distintos componentes, en funcin de la diferente afinidad de stos por dos fases.
La separacin cromatogrfica se produce entre dos fases: la fase mvil, un flujo lquido o
gaseoso en el cual estn los solutos que se van a separar, y la fase estacionaria, que es el
lecho a travs del cual va a fluir la fase mvil, la fase estacionaria puede ser un slido inerte o
una fina partcula de lquido que pinta la columna.
Los distintos componentes de la mezcla se van a separar en funcin de su distribucin entre
la fase mvil y la fase estacionaria, en virtud de un proceso en equilibrio. De esta forma, un
compuesto que tenga ms afinidad que otro por la fase estacionaria, se retrasar en su avance
a travs de sta ms que aquel que tiene menor afinidad, que la atravesar antes. El reparto
entre las fases se fundamenta en las diferencias fsicas y/o qumicas de los componentes de la
muestra.
Una vez que todos los componentes de la mezcla han atravesado la fase estacionaria, salen
separados unos de otros, lo cual puede ser empleado con fines de identificacin, cuantificacin
o concentracin, para posteriores estudios.
Como se puede observar en el esquema anterior, los mtodos en columna se emplean para
varios tipos de cromatografa. Se emplea tanto para cromatografa lquida como para
cromatografa gaseosa, y tanto con fases estacionarlas liquidas como solidas.
Dependiendo de la naturaleza de las fases mvil y estacionaria, los mecanismos en virtud de
los cuales se producen la separacin son de dos tipos: adsorcin, cuando la fase estacionaria
es slida, y particin, cuando la fase estacionaria es lquida.
Las columnas con las que se trabaja en estas cromatografas estn formadas por un tubo de
longitud y ancho variables que lleva empaquetado en su interior un soporte slido. Este
soporte slido puede ser la propia fase estacionaria, o bien ir asociado a un lquido que
constituye la fase estacionaria.
La fase mvil es un solvente que se hace pasar a travs de la columna en la cromatografa
lquida, o un gas en la cromatografa gaseosa.
La muestra se introduce en la columna junto con la fase mvil. Las fases mvil y estacionaria
se encuentran en equilibrio, de manera que la separacin de los componentes de la muestra
se lleva a cabo por su distribucin entre las dos fases.
Despus de la separacin en la columna, los componentes de la muestra son eludos fuera
de sta, de forma que se obtienen distintas fracciones de fase mvil que contienen
concentraciones aumentadas de los distintos componentes.
Se efectan lecturas sobre el eludo que se va obteniendo, de manera que se tiene un
registro en el cual los diferentes componentes se detectan separados entre s con distinto
ancho y altura dependientes de su concentracin y de la eficacia de la separacin. En la
actualidad, las tcnicas de cromatografa en columna ms empleadas son:
Fig 2: Cromatograma caracterstico de una mezcla de dos componentes. El pico pequeo de la izquierda representa
una especie que no se retiene en la columna y alcanza el detector inmediatamente despus de la elucin.
h. La velocidad de migracin del soluto; factor de capacidad (k): Se utiliza para describir
las velocidades de migracin de los analitos en las columnas. Para una especie A, el
factor de capacidad kA se expresa como:
kA = KA VS o k= tr tM
VM tM donde tR y tM se pueden obtener a partir de un cromatograma.
Cuando el factor de capacidad para una especie es mucho menor que la unidad, la
elucin tiene lugar tan rpidamente que es difcil determinar con exactitud los tiempos de
retencin. Cuando el factor de capacidad es del orden de 20 a 30 o tal vez mayor, los
tiempos de retencin son demasiado largos. Idealmente, las separaciones se realizan en
unas condiciones en las que los factores de capacidad para las especies de una mezcla
oscilan entre 1 y 5.
= (k)B - tM
(k)A - tM
Es la distancia entre el centro de ambos picos dividido por el ancho promedio de la base
columna
Se requiere un valor de R de 1,5 o mayor para considerar que una separacin cromatogrfica
es buena. Si R es menor de 0,4 entonces la forma del pico no mostrar claramente fa
presencia de dos componentes.
La resolucin depende, al fin, de dos parmetros: el ancho del pico y la distancia de su
mximo al punto de origen.
CROMATOGRAFA GASEOSA
En esta cromatografa la fase mvil es un gas inerte portador (carrier) que circula a una
temperatura adecuada para que las molculas de la muestra fluyan por la columna en fase
vapor.
El gas portador circula en forma continua a lo largo de la columna y en un momento
determinado se introduce la muestra a analizar en fase vapor. Segn las afinidades de los
constituyentes de la mezcla con la fase estacionaria, tendrn distintas velocidades y eluirn de
la columna a tiempos diferentes, separados por molculas del gas carrier, presentando picos
en el cromatograma a tiempos de retencin diferentes.
Columnas:
Existen las columnas empacadas o de relleno que admiten muestras grandes, pero las ms
empleadas y las de mayor resolucin son las columnas capilares. Estas son ms modernas y
permiten lograr separaciones de hasta 3.000.000 platos tericos ms.
Estas columnas se pueden fabricar en acero inoxidable, vidrio o slice fundida, tienen un
dimetro de 0,25 a 0,5 mm y longitudes de 25 a 50m.
Su superficie interna est recubierta con una fina capa estacionaria lquida, las ms
modernas estn construdas de slice fundida y se las hace resistentes mediante un
revestimiento externo de poliamida siendo bastante flexibles y fuertes pudiendo doblarse en
espirales de pocas pulgadas de dimetro.
Para realizar la corrida con tiempos de retencin reproducibles es necesario controlar la
temperatura de la columna. Por este motivo la columna enrollada se coloca en un horno
termostatizado. La temperatura ptima depende del punto de ebullicin de los componentes de
la muestra, llegando algunos hasta 450C Temperatura Isotrmica: Es decir constante
durante toda la corrida,se utiliza para muestras con punto de ebullicin muy prximos, a veces
no produce una buena separacin pues de bajo punto de ebullicin salen al principio todos
juntos y sto provoca que se superpongan.
Temperatura Programada: Significa un aumento lineal de la temperatura de la columna con
el tiempo, es muy til para muestras con punto de ebullicin muy distintos. Permite una mejor
resolucin, es importante tenerlo en cuenta al comprar el equipo.
Detectores :
A medida que los compuestos salen de la columna entran en el detector. Este tiene que
responder rpidamente a bajas concentraciones de soluto, respuesta lineal, estable, universal
( para una gran variedad de compuestos qumicos) o bien de respuesta selectiva ( grupo
limitado de solutos).
Los ms usados en cromatografia gaseosa son:
ionizacin de llama (FID), el de captura de electrones (DCE) y el de conductividad trmica.
Todos stos se basan en distintos principios pero todos manifiestan un cambio en la seal
cuando atraviesa por ellos slo el gas portador y cuando lo hace un compuesto determinado.
La eleccin del detector debe hacerse en funcin de la naturaleza de los compuestos a
determinar, del gas portador a utilizar y de la sensibilidad que necesitemos para nuestro
anlisis.
Aplicaciones:
Analiza todas aquellas sustancias que presentan punto de ebullicin menor a 350 400 C.
Deben ser voltiles y termoresistentes. Es difcil tratar compuestos inicos, compuestos de
elevada polaridad y compuestos de peso molecular mayor a 600, por esto solo gases y
aproximadamente el 15% de los compuestos orgnicos pueden ser analizados.
Ejemplos: pesticidas (suelos , cultivos y aguas); composicin y separacin de hidrocarburos;
cidos grasos; aceites escenciales.
CROMATOGRAFA LQUIDA
Inyeccin de la muestra :
Si bien existen varios puertos , la vlvula de inyeccin es una de las ms usadas, vienen de
distintos tamaos y volmenes fijos entre 2 y 1000 microlitros.
Columnas :
Las columnas son generalmente se acero inoxidable, de unos 30 cm de largo rellenas de
material inerte, el ms comn es el gel de slice, tambin se usa la almina, la celulosa, el
carbn activado y el florisil que es un coprecipitado de xido de magnesio y slice, todos estos
materiales se encuentran en tamaos de partculas muy pequeos con dimetros de 5 a 10
milimicrones.
Generalmente todas las columnas de cromatografa tienen antes de la columna analtica una
precolumna o columna guardia con la misma fase estacionaria que aquella para prevenir la
contaminacin de la misma.
Algunas columnas se mantienen a temperatura ambiente, pero en otros equipos la columna
se coloca en un horno cuya temperatura puede regularse entre 30 y 100C.
Al aumentar la temperatura de la columna disminuye la viscosidad del solvente y por lo tanto
se requiere menos presin para que el fase mvil circule adecuadamente por la columna.
Detectores:
El detector ideal es aquel que es sensible a bajas concentraciones del compuesto ,que da
una respuesta lineal es decir una seal proporcional a la concentracin del analito y en
cromatografa lquida tambin debe ser insensible a los cambios de temperatura y de
composicin del solvente. Los ms usados son: ultravioleta, ndice de refraccin,
electroqumico, fluorescencia.
Cada uno de ellos tiene un principio particular de deteccin pero podemos decir que todos
envan una seal cuando pasa el los solventes slos y otra seal cuando pasa la fase mvil
con el compuesto disuelto en ella. La eleccin de uno u otro depende del compuesto que
vamos a determinar, de la fase mvil y de la sensibilidad que necesitemos.
Aplicaciones:
Los.mtodos utilizados en cromatografia de gases son ms rpidos y sensibles, el
instrumental ms sencillo y en general menos costosos, la lquida no es tan sencilla ni tan
rpida pero su espectro de aplicacin es ms amplio, si bien el instrumental es
considerablemente ms caro.
No hay competencia entre cromatografa gaseosa y lquida pues ambas tcnicas se
complementan.
En cromatografa lquida se requiere que la muestra sea soluble en la fase mvil, y sto hace
posible el anlisis de compuestos de muy alto peso molecular, orgnicos e inorgnicos, inicos
y covalentes, lo que si es imprescindible es encontrar la fase estacionaria adecuada que
separe selectivamente la muestra lo cual en teoria es posible, pero en la prctica puede
resultar difcil.
Ejemplos: vitaminas; aminocidos; protenas; colorantes; conservadores; aflatoxinas;
pesticidas (carbamatos); compuestos inicos; azcares; miel; cidos grasos; estimulantes;
edulcorantes; aromatizantes artificiales, hormonas, aceites esenciales de alto peso molecular.
El desarrollo de la HPLC es el resultado de contar con un sistema de separacin en fase
lquida, que sea complementario de la cromatografa en fase gaseosa (GC).
Una diferencia fundamental entre GC y HPLC es la influencia de la fase mvil en la
separacin. En la GC, la fase mvil es un simple transportador del soluto y prcticamente no
influye en la separacin. Por el contrario, en HPLC la fase mvil es el parmetro fundamental
que gobierna la separacin. En consecuencia en GC se necesitan muchas columnas para
abarcar el rango de separaciones posibles, mientras que en HPLC con una sola columna es
posible separar sustancias polares, inicas y no polares simplemente modificando la
composicin de la fase mvil, que si interacta con la muestra para su separacin.
Captulo V Introduccin a las Separaciones Cromatogrficas 25 |
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL
Carreras: Bromatologa Licenciatura en Bromatologa
EXPERIENCIAS A REALIZAR
Objetivos:
Actividades:
b- Cromatografa en columna
Tipo
INYECTOR
T
Longitud
Dametro
COLUMNA
Fase
estacionaria
Tipo
DETECTOR
T
FASE MVIL
PRESIN
T HORNO
SISTEMA DE COLECCCIN DE
DATOS
APLICACIONES
Coeficiente de distribucin:
Factor de selectibidad :
Resolucin:
Nmero de platos:
Tiempo de retencin:
Volumen de retencin:
Consiste en referir el contenido del analito al total de reas en el cromatograma, es muy difundido para
cromatografa gaseosa pero no se utiliza en HPLC. Se calcula:
Pi =% del componente en la muestra
Ai =rea del componente
Ai =sumatoria de todas las reas del cromatograma.
Luego corregir las reas multiplicando cada una por el factor de respuesta correspondiente.
Ventajas Limitaciones
Necesita que los componentes de la mezcla se
Evita las incertidumbres de la inyeccin de la
separen
muestra.
por el mtodo cromatogrfico elegido.
Se requiere que todos los componentes tengan el
No requiere estndar de referencia
mismo factor respuesta.
Ejemplos:
EJERCICIOS A RESOLVER
1- a. Una columna cromatogrfica de longitud 10,3 cm y dimetro interno 4,61 cm, esta empaquetada
con una fase estacionaria que ocupa el 61,0% de su volumen. Si el caudal es de 113 mL por min, hallar
la velocidad lineal de flujo en cm/min. (Volumen del cilindro: 3,14 x r2 x h)
b. Cunto tiempo tarda el disolvente (que es el mismo que tarda un soluto no retenido) en atravesar
la columna?
c. Hallar el tr de un soluto que tiene un factor de capacidad de 10,0.
R= a) 17,43 cm min-1 b) 0,591 min c) 6,50 min
2- En una columna de 30,0 cm, las sustancias A y B tienen un tiempo de retencin de 16,40 y de 17,63
min. Las anchuras de pico (en la base) para A y B son 1,11 y 1,21 min, respectivamente. Calcular:
a. La resolucin de la columna
b. El nmero promedio de platos de la columna
c. La altura del plato
d. La longitud de la columna necesaria para conseguir una resolucin de 1,5
e. La altura de plato necesaria para una resolucin de 1,5 utilizando la columna original de 30,0 cm
y en el tiempo dado originalmente.
R=a) 1,06 b) 3445 c) 8,71x10-3 cm d) 60 cm e) 4,35x10-3 cm
3- En una columna de 122 cm de longitud, operada a 160 C, se obtuvieron stos tiempos de retencin
(en minutos): pico de aire 0,90; heptano 1,22 y octano 1,43. Los anchos de las bases fueron 0,14 para el
heptano y 0,20 para el octano cul es la retencin relativa (factor de selectividad) y la resolucin para
estas bandas?
R= = 1,66 R= 1,23
4- Las reas de pico, obtenidas por cromatografa de gases en una determinacin de colesterol fueron:
Oxidos del colesterol Areas
19- hidroxicolesterol 22504
7-alfa hidroxi colesterol 7813
7- beta hidroxicolesterol 8572
alfa- epoxicolesterol 2054
beta- epoxicolesterol 8655
Triol 637
20- hidroxicolesterol 926
Suponiendo que las respuestas de deteccin son iguales, calcular el porcentaje de cada compuesto que
contiene el colesterol.
R= 43,99% 15,27% 16,75% 4,01% 16,92% 1,24% 1,81%
5- De acuerdo con estudios de distribucin, se sabe que las especies Z y X tienen contantes de
distribucin agua/hexano de 6,01 y 6,2 respectivamente. Las dos especies tienen que ser separadas por
elucin con hexano. La relacin Vs/Vm para la columna es 0,422. Calcular:
a) factor de retencin para cada soluto.
b) factor selectividad
c) nmero de platos tericos para obtener una resolucin de 1,5
d) longitud de la columna si la altura de platos tericos es de 2,2x10-3 cm.
Columna 1 Columna 2
Catequina Resveratrol Catequina Resveratrol
tr (min) 5,91 6,19 17,35 18,6
W
(min) 0,19 0,21 0,9 1,21