MTODOS Y TCNICAS DE ESTUDIO MICROBIOLGICO

TINCIN SIMPLE
La mayora de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados de
las anilinas, sales orgnicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrn.
Se denominan colorantes bsicos si el cromforo (porcin coloreada) de la molcula est
cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno son colorantes bsicos.
Otros colorantes de esta categora utilizados con frecuencia en bacteriologa son safranina,
fucsina bsica y verde malaquita. Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte
de los procariotas tienen un pH interno prximo a la neutralidad (pH 7.0) y una superficie
celular cargada negativamente, as los colorantes bsicos son los ms eficaces. Colorantes
cidos con rojo Congo, rosa de bengala, eosina y fucsina cida tiene un cromforo cargado
negativamente y son utilizados para teir positivamente ciertos componentes como las
protenas.

Para observar las bacterias teidas es necesario, en primer lugar, hacer un frotis de las bacterias y
fijarlo:
Frotis: cuando se parte de un cultivo de bacterias en medio lquido, se toma una o varias
cargas directamente con el asa y se extienden sobre el portaobjetos. Si se parte de un
cultivo en medio slido, debe depositarse previamente una gota de agua sobre el
portaobjetos. A continuacin, se toma con el asa una pequea parte de la colonia y se
dispersa en la gota de agua, realizndose la extensin como en el caso anterior.
Fijacin: tiene por objeto provocar modificaciones en la composicin fsico-qumica de
la bacteria (coagulacin de las protenas, etc.) de forma que sta conserve definitivamente
una estructura similar a la que tena en vivo, sin deformarse como consecuencia de los
tratamientos a que se ver sometida durante la tincin. Por otra parte la fijacin impide el
arrastre de los microorganismos al quedar estos adheridos al portaobjetos y hace que la
pared celular sea ms permeable a los colorantes.
Para la fijacin pueden utilizarse agentes qumicos (formol, metanol) o el calor. Nosotros
emplearemos el calor, y para ello el frotis, una vez seco, se pasa dos o tres veces sobre la llama,
con la preparacin hacia arriba, para no quemarla.

MATERIAL NECESARIO

Cultivos bacterianos de Staphylococcus aureus y Micrococcus luteus

Mechero (Alcohol o Bunsen)
Marcador
Soporte
Colorantes (safranina y cristal violeta)
Asa de siembra
Aceite de inmersin
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PROCEDIMIENTO

1. Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequea alcuota de un cultivo
bacteriano con el asa de siembra estril.
2. Hacer el frotis, formando una pelcula homognea sobre el portaobjetos con el asa de
siembra. Dejar secar.
3. Fijar la preparacin, pasando a travs de la llama del mechero el portaobjetos.
4. Cubrir con una pelcula de colorante (cristal violeta o safranina) durante 1 minuto.
5. Lavar el exceso de colorante con agua.
6. Dejar secar al aire.
7. Aadir una gota de aceite de inmersin.
8. Observar con objetivo de inmersin (100 x).

La tincin simple nos proporciona exclusivamente informacin acerca de la forma, tamao y

tipo de agrupacin de los microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de ser un mtodo
muy sencillo y rpido.

Tincin simple con cristal violeta de

Staphylococcus aureus.
Microscopio ptico de campo claro
(100x)
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Tincin simple con safranina de Micrococcus luteus.

Microscopio ptico de campo claro (100x)

TINCIN DIFERENCIAL
Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiologa; consisten en la
aplicacin de dos colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso intermedio que
provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas clulas
dentro de una poblacin. La diferenciacin puede ser provocada por un agente qumico o
fsico, permitiendo observar dos tipos de respuestas diferentes a la tincin en una misma
muestra. Las dos tinciones diferenciales ms utilizadas en bacteriologa son la Tincin De
Gram y la Tincin De cido-Alcohol Resistencia.

TINCIN DE GRAM

Esta tincin diferencial fue propuesta por el medico dans Christian Gram (1884)
(TORTORA et al., 2007) que examinando tejido pulmonar de enfermos fallecidos por
neumona observ que la bacteria Streptococcus pneumoniae, presente en los pulmones,
retena el colorante conocido como marrn Bismark (sustituido posteriormente por el cristal
violeta), mientras que el tejido pulmonar no era capaz de retener el colorante.
Es la tincin diferencial ms utilizada de forma rutinaria y prcticamente la primera prueba a
la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una
informacin esencial, adems de sobre la forma, tamao y agrupacin celular, como es el tipo
y composicin de la pared que presentan las bacterias. La tincin de Gram divide a las
bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo
gram positiva y bacterias con pared de tipo gram negativa.

La tincin de Gram requiere cuatro soluciones:

1. Primer colorante. Es un colorante bsico que en contacto con las clulas cargadas
negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El ms utilizado es el cristal
violeta.
2. Solucin mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las
clulas. Los mordientes empleados suelen ser sales metlicas, cidos o bases, como,
por ejemplo, una solucin diluida de yodo.
3. Agente decolorante. Es un disolvente orgnico, por ejemplo, alcohol-acetona (1:1).
4. Colorante de contraste. Es un colorante bsico de distinto color que el primer
colorante, como, por ejemplo, la safranina.
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MATERIAL NECESARIO

Cultivos de bacterias:
o Gram positivas: Staphylococcus sp.
o Gram negativas: Escherichia coli

Mechero (Alcohol o Bunsen) Cristal violeta

Marcador Safranina
Soporte Lugol
Portaobjetos Alcohol-acetona
Asa de siembra Aceite de inmersin

PROCEDIMIENTO

1. Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequea alcuota de un cultivo
bacteriano con el asa de siembra estril.
2. Hacer el frotis, formando una pelcula homognea sobre el portaobjetos con el asa de
siembra. Dejar secar.
3. Fijar la preparacin, pasando a travs de la llama del mechero el portaobjetos.
4. Cubrir con unas gotas de cristal violeta durante 1 minuto.
5. Lavar el exceso de colorante con agua.
6. Aadir el mordiente lugol, solucin de yodo-ioduro potsico, durante 1 minuto.
7. Lavar el exceso de mordiente con agua.
8. Lavar la preparacin con alcohol formando un ngulo con la preparacin, durante 30
segundos (el tiempo de decoloracin es clave para un resultado correcto).
9. Lavar inmediatamente con abundante agua.
10. Cubrir con el colorante de contraste, safranina durante 1 minuto.
11. Lavar el exceso de colorante con agua.
12. Dejar secar al aire.
13. Aadir una gota de aceite de inmersin.
14. Observar con objetivo de inmersin (100 x).

La diferente estructura y organizacin de la pared celular en estos dos tipos de organismos

hace que ambos grupos respondan de manera distinta, as mientras las bacterias gram
positivas mantienen y conservan el complejo cristal violeta-iodo, las bacterias gram negativas
se decoloran rpidamente con la aplicacin del alcohol, admitiendo el colorante de contraste
que proporciona un color entre rosa y rojo que contrasta con el intenso color violeta.
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Tincin de Gram de Bacillus cereus

(bacilos gram positivos) Microscopa de
cam
po
clar
o
(10
0x)

Tincin de Gram de Escherichia coli (bacilos gram

negativos)
Microscopa de campo claro (100x)

Se han propuesto diferentes explicaciones para justificar la respuesta de los microorganismos

a esta tincin, parece que la diferencia se debe tanto a la estructura fsica como a la
composicin de la pared celular, en bacterias gram positivas la gruesa capa de
pptidoglucano con abundantes entrecruzamientos parece contribuir a la retencin del
colorante fundamental, cristal violeta, mientras que en bacterias gram negativas la delgada
capa de peptidoglucano junto con la abundancia de lpidos en la membrana externa de la
pared celular incrementan la porosidad y por ello, contribuyen a la prdida del colorante
fundamental despus de la decoloracin con alcohol.
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Observacin microscpica del frotis:

CUESTIONARIO

1. Esquematice la estructura de una clula eucariote y procariote. Compare.

2. Qu es un colorante? Cmo est constituido?
3. Cules son las fuentes de error ms frecuentes en la tincin de Gram?
4. Si se aplica la tincin de Gram de Bacillus sp. con endosporas Cmo se
observaran la clula vegetativa y la endospora? Por qu?
5. Existen circunstancias en las que la flora habitual se convierte en patgena?
6. Mencione 5 nombres de microorganismos y su importancia:
Gram positivos
Gram negativos
Capsulados.
Esporulados
7. Cul es la importancia estratgica que tiene el examen directo al momento de
procesar una muestra clnica?
8. La tincin de Gram, Qu reaccin dar en la levaduras y parsitos? Por qu?
9. Investigue cuales son las estructuras celulares o moleculares responsables de la
tinciones. De ejemplos de otros colorantes que se pueden utilizar