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UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD DE QUMICA Y BIOLOGA


PRINCIPIOS DE SISTEMAS CELULARES

TRANSFORMACI
TRANSFORMACIN BACTERIANA

INTEGRANTES: Francis Gonzlez

Javiera Tapia

PROFESOR: Eduardo Lpez


pez

AYUDANTE: Rafael Berrios


errios

FECHA DE ENTREGA: 9 de junio de 2017


1. INTRODUCCIN

La transformacin se puede definir como la variacin hereditaria de una clula bacteriana


susceptible, originada por la captacin de ADN desnudo libre en el medio. Durante la
transformacin los genes se transfieren de una bacteria a otra como DNA desnudo en solucin.
Este proceso se demostr por primera vez hace ms de 70 aos, sin embargo en ese momento no se
comprendi.

En la naturaleza algunas bacterias luego de la muerte y lisis celular liberan su DNA en el ambiente,
luego, otras bacterias pueden encontrar el DNA y, segn su especie particular y las condiciones de
crecimiento, captar fragmentos de DNA e incorporarlos a sus propios cromosomas por
recombinacin. La transformacin sucede de manera natural entre muy pocos gneros de bacterias,
como Bacillus,Haemophilus, Neisseria, Acinetobacter y ciertas cepas de los gneros Streptococcus
y Staphylococcus(Case C.L, 2007).

Cuando una clula receptora se halla en un estado fisiolgico en el cual puede captar el DNA
donante, se dice que es competente. La competencia es resultado de alteraciones de la pared celular
de la clula receptora, que la tornan permeable a las molculas grandes de DNA (el DNA es una
molcula hidroflica y la membrana plasmtica est formada por una bicapa lipdica hidrofbica). Si
las bacterias no son capaces de captar material gentico forneo naturalmente, stas debern tratarse
artificialmente, de forma tal de modificar su estructura externa y tornarlas competentes (Case C.L,
2007).

Durante la experiencia, se realizar la transformacin de bacterias competentes con un plsmido


forneo (unidades de ADN que contiene informacin gentica). Estos elementos genticos son
extracromosomales, se replican de manera independiente del cromosoma bacteriano y codifican
para una gran variedad de enzimas que confieren resistencia a antibiticos. Los plsmidos tienen
numerosas propiedades que favorecen su utilizacin como vector de clonacin, entre ellas se
encuentran: su pequeo tamao que hace que el ADN sea fcil de aislar y manipular; su naturaleza
circular que hace que el ADN sea ms estable durante la extraccin; su origen de replicacin
independientemente del control directo de la replicacin del cromosoma bacteriano; la presencia de
marcadores seleccionables, tales como genes de resistencia antibiticos; su mltiple nmero de
copias, de manera que se aumenta la eficiencia de la extraccin del ADN plasmdico. Por otra parte,
se definir la eficiencia de transformacin como el nmero de bacterias transformantes por g de
DNA presente en el medio de transformacin, es decir por g de ADN plasmdico (Puerta Bulla J.,
2009).

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Para el final de esta experiencia, se espera obtener una buena eficiencia de transformacin de
bacterias, mediante ADN plasmdico, que presenten resistencia a los antibiticos utilizados como
marcadores seleccionables.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo General:

Utilizar un protocolo de transformacin bacteriana y comprobar su eficiencia.

2.2 Objetivo especfico:

2.2.1Transformacin de clulas competentes MAX efficiency DH5 con plsmido pGEM-T

2.2.2 Realizar una siembra de las bacterias alteradas en placas de LB-antibitico

3. MATERIALES Y MTODOS

3.1 Se limpia la superficie en la que se trabaja con alcohol, se instala mechero y se enciende.

3.2 Para la preparacin de la placa LB- antibitica, se agregan 140 l de ampicilina en frasco
con 140 ml de agar LB lquido a temperatura soportable por las manos y se agita.

3.3 Se flamea tapa del frasco de agar y se abre en las cercanas de la llama para aadir un
volumen de aproximadamente 20 ml de mezcla a las placas petri.

3.4 Luego de agregada la mezcla lquida, se mueve la placa para que el agar se esparza
uniformemente en toda la superficie.

3.5 Se deja placa con agar a temperatura ambiente mientras se enfra, y luego es llevado a
refrigeracin.

3.6 Para la preparacin de la muestra, se agrega 1l de plsmido pGEM-T a un tubo


Eppendorf al que previamente se le agregaron 63 l de clulas competentes MAX
efficiency DH5 y se mezcla mediante pipeteo.

3.7 Se deja mezcla durante 20 minutos en hielo.

3.8 Pasados los 20 minuto, se pone el tubo en bao de calor a 43 C por 90 segundos.

3.9 Luego se vuelve a poner en hielo por solo 5 minutos.

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3.10 Se aade al tubo 940 l de medio de cultivo LB.

3.11 Se deja tubo en agitacin a 135 rpm y 37C durante 1 hora.

3.12 Finalizada la agitacin, se extraen 100 l de muestra y se siembran con aza de vidrio en
placa LB-antibitica.

3.13 El tubo con la mezcla que queda, se centrifuga por 10 segundos a 12000 rpm y luego se le
agregan 50 l ms de medio de cultivo LB.

3.14 Se extraen 100 l de muestra y se siembran con aza de vidrio en otra placa LB-antibitica.

3.15 Ambas placas se dejan incubando a temperatura ambiente.

4. RESULTADOS

4.1 Bacterias en placa LB-antibitica.

En la figura 4.1, tanto A como B, se aprecia la ausencia de crecimiento bacteriano.

Figura 4.1: Sembrado de bacterias quimio-competentes sometidas a transformacin bacteriana con


plsmidos en placa LB-antibitica (A) Despus de centrifugado (B) Antes de centrifugado.

5. DISCUSIONES

En los resultados obtenidos en las imgenes 4.1 y 4.2, se observa que no hubo crecimiento
bacteriano como era de esperarse, por lo tanto, no se pudo calcular la eficiencia de transformacin
de bacterias.

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Se esperaba que las bacterias de E.coli utilizadas, al ser sometidas al proceso de transformacin
mediante plsmidos con presencia de genes resistentes al antibitico ampicilina, presentaran el
crecimiento de un nmero determinado de colonias, ya que, el plsmido por sus diversas
propiedades debi haber transformado las bacterias de E.coli y debi amplificar el nmero de
bacterias con genes que presentaran resistencia antibitica como marcador seleccionable.

Debido a que las clulas empleadas eran clulas competentes, es decir, se encontraban en un estado
fisiolgico en el cual eran capaces de captar el DNA plasmdico, la transformacin debi haber sido
realizada con xito, sin embargo, los resultados obtenidos demuestran que el procedimiento
experimental no se desarroll de la manera correcta o que las condiciones ambientales como por
ejemplo la incubacin no cumpli con los requerimientos necesarios para la obtencin de los
resultados esperados. El no desarrollo de colonias bacterianas tambin se puede producir por un
tamao inadecuado de plsmido, de modo que este no haya podido ingresar a las clulas
competentes de manera eficaz y por lo tanto clulas sin resistencia fueron sembradas en placa con
antibitico que produjo su muerte.

6. CONCLUSIONES

Se logr realizar un protocolo de transformacin bacteriana durante la experiencia. Sin embargo, no


se obtuvieron los resultados esperados para la transformacin de clulas competentes MAX
efficiency DH5, ya que no se obtuvo crecimiento bacteriano de la siembra en una placa de
LB-antibitica, por lo tanto, el desarrollo experimental no se realiz de la manera correcta o el
plsmido utilizado no era del tamao ms adecuado para las clulas competentes.

7. REFERENCIAS

7.1 Case C.L, Funke B.R, Totora G.J. (2007). Introduccin a la microbiologa. 9 Ed. Mdica
Panamericana (Buenos aires) pp: 240-242.

7.2 Puerta Bulla J, Uruea C. (2009). Prcticas de biologa molecular. Vol.14. Ed. Pontificia
Universidad Javierana (Bogot) pp: 55.

7.3 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18258012