La fijacin apropiada de los tejidos para el examen histolgico es extremadamente importante.

Sin
prestar atencin a este proceso, la gama de pruebas realizadas en un moderno laboratorio de
histopatologa se volver ineficaz y prcticamente intil.
El concepto de fijacin de los tejidos biolgicos para comprender la funcin y estructura biolgicas
ha llevado al desarrollo de muchos tipos de fijadores durante el ltimo siglo.

Los mecanismos y principios por los cuales los fijadores especficos actan para endurecer y
preservar tejidos y prevenir la prdida de molculas especficas caen en categoras amplias.
Estos incluyen la adicin covalente de grupos reactivos y de enlaces cruzados, deshidratacin y los
efectos de cidos, formacin de sal y calor, junto con combinaciones de estas acciones.

Los fijadores compuestos pueden funcionar a travs de varios de estos mecanismos.

Aunque cada fijador tiene ventajas, todos tienen muchas desventajas. Estos incluyen la prdida
molecular de los tejidos 'fijos', la hinchazn o retraccin de los tejidos durante el proceso, las
variaciones en la calidad de la tincin histoqumica e inmunohistoqumica, la capacidad de realizar
anlisis bioqumicos con precisin y capacidades variables para mantener las estructuras de
organelos celulares.

Uno de los principales problemas con la fijacin con formaldehdo ha sido la prdida de la
identificacin inmunolgica del antgeno debido a ese tipo de fijacin combinado con el
procesamiento del tejido a la cera de parafina (Eltoum et al., 2001a, 2001b).
Sin embargo, desde una perspectiva clnica, el advenimiento de mtodos de recuperacin de
eptopos inducidos por calor, instigados a principios de los 90, han superado muchas de estas
limitaciones (Shi et al., 1991).
Anlogamente, el anlisis de ARNm y ADN de tejido embebido en parafina fijado con formalina ha
sido problemtico (Grizzle et al., 2001, Jewell et al., 2002, Stek et al., 2006, Lykidis et al.

Todos los fijadores ampliamente utilizados se seleccionan mediante compromiso; Sus buenos
aspectos son equilibrados
Contra caractersticas menos deseables.

Este captulo discute los fundamentos de la fijacin, las ventajas y desventajas de los fijadores
especficos, y proporciona algunas de las frmulas para fijadores especficos actualmente
utilizados en patologa, histologa y anatoma.

El principal objetivo de la fijacin en patologa es mantener caractersticas morfolgicas claras y

consistentes (Eltoum et al., 2001a, 2001b, Grizzle et al., 2001).
El desarrollo de fijadores especficos usualmente ha sido emprico y gran parte de la comprensin
de los mecanismos de fijacin se ha basado en la informacin obtenida del curtido de cuero y la
produccin de vacunas.

Para visualizar la microanatoma de un tejido, sus secciones teidas deben mantener las relaciones
microscpicas originales entre las clulas, los componentes celulares (por ejemplo, el citoplasma y
los ncleos) y el material extracelular con poca interrupcin de la organizacin del tejido, y deben
mantener el tejido Composicin qumica local.
Muchos componentes tisulares son solubles en ambientes acuosos cidos u otros lquidos, y una
visin fiable de la microanatoma y microambiente de estos tejidos requiere que los componentes
solubles no se pierdan durante la fijacin y el procesamiento de tejidos.
Minimizar la prdida de componentes celulares, incluyendo protenas, pptidos, ARNm, ADN y
lpidos, previene la destruccin de estructuras macromoleculares tales como membranas
citoplasmticas, retculo endoplsmico liso, retculo endoplasmtico rugoso, membranas
nucleares, lisosomas y mitocondrias.

Cada fijador, combinado con el protocolo de procesamiento de tejidos, mantiene algunos aspectos
moleculares y macromoleculares del tejido mejor que otras combinaciones de fijacin /
procesamiento.
Por ejemplo, si se pierden componentes solubles a partir del citoplasma de las clulas, se reducir
o modificar el color del citoplasma sobre la tincin de hematoxilina y eosina (H & E) y aspectos de
la apariencia de la microanatoma del tejido, p. Mitocondrias, se perdern o daarn.
De forma similar, las evaluaciones inmunohistoqumicas de estructura y funcin pueden ser
reducidas o perdidas.

Casi cualquier mtodo de fijacin induce retraccin / hinchamiento, endurecimiento de tejidos y

variaciones de color en diversas manchas histoqumicas (Sheehan y Hrapchak 1980, Horobin 1982,
Fox et al., 1985, Carson 1990, Kiernan 1999, O'Leary & Mason 2004). Varios mtodos de fijacin
producen siempre algunos artefactos en la aparicin del tejido en la tincin; Sin embargo, para la
patologa diagnstica es importante que tales artefactos sean consistentes.

El fijador acta minimizando la prdida o destruccin enzimtica de molculas celulares y

extracelulares, manteniendo las estructuras macromoleculares y protegiendo los tejidos de la
destruccin por microorganismos. Esto da como resultado una vista de un tejido viable
dinmicamente cambiante (Grizzle et al., 2001). Un fijador tambin debe evitar la descomposicin
subsiguiente del tejido o caractersticas moleculares por actividad enzimtica y / o por
microorganismos durante el almacenamiento a largo plazo, porque los tejidos diagnsticos /
teraputicos retirados de los pacientes son recursos importantes que pueden ser re-analizados en
el futuro.

Un fijador no slo interacta inicialmente con el tejido en su entorno acuoso, sino tambin,
posteriormente, el fijador sin reaccionar y las modificaciones qumicas inducidas por el fijador
continan reaccionando. La fijacin interacta con todas las fases de procesamiento y tincin
desde la deshidratacin hasta la tincin de las secciones de tejido utilizando tinciones
histoqumicas, enzimticas o inmunohistoqumicas (Eltoum et al., 2001b, Rait et al., 2004). Una
seccin de tejido manchada producida despus de la fijacin especfica combinada con el
procesamiento de tejido produce un compromiso en la imagen que se forma de una o ms
caractersticas del tejido vivo original. Hasta la fecha, no se ha identificado un fijador universal o
ideal. Por lo tanto, los fijadores se seleccionan basndose en su capacidad para producir un
producto final necesario para demostrar una caracterstica especfica de un tejido especfico
(Grizzle et al., 2001). En patologa diagnstica, el fijador de eleccin para la mayora de los
patlogos ha sido 10% de formalina tamponada neutra (Grizzle et al., 2001).

La caracterstica ms importante de un fijador es apoyar la tincin de alta calidad y consistente

con H & E, tanto inicialmente como despus del almacenamiento de los bloques de parafina
durante al menos una dcada. El fijador debe tener la capacidad de prevenir la destruccin a corto
y largo plazo
De la microarquitectura del tejido interrumpiendo la actividad de las enzimas catablicas y, por
tanto, la autolisis, minimizando la difusin de molculas solubles desde sus localizaciones
originales. Otra caracterstica importante de un buen fijador, que ayuda a mantener la integridad
celular y tisular, es la inanimacin de agentes infecciosos, que ayuda a mantener
Tejido y integridad celular. Tambin es importante contar con buenos perfiles toxicolgicos y de
inflamabilidad que permitan el uso seguro del fijador (Grizzle &
Fredenburgh 2005). El advenimiento de nuevos mtodos biolgicos, la mayor comprensin del
genoma humano y la necesidad de evaluar rpidamente la biologa de los procesos de la
enfermedad, significa que los fijadores tambin deben permitir la recuperacin de
macromolculas incluyendo
Protenas, ARNm y ADN sin modificaciones bioqumicas extensivas a partir de tejidos fijos y
embebidos en parafina.

Otras caractersticas importantes de un fijador ideal incluyen ser tiles para una amplia variedad
de tejidos, incluyendo tejidos grasos, linfoides y neurales. Debe conservar ejemplares pequeos y
grandes y apoyar la produccin histoqumica, inmunohistoqumica,
Hibridacin in situ y otros procedimientos especializados. Debe penetrar y fijar los tejidos
rpidamente, tener una vida til de al menos un ao y ser compatible con los procesadores
automatizados de tejidos modernos. El fijador debe ser fcilmente desechable o reciclable y
apoyar el almacenamiento de tejidos a largo plazo dando excelente microtoma de bloques de
parafina, y debe ser rentable

Tipos de fijadores:

Fijadores coagulantes

Tanto las soluciones orgnicas como las no orgnicas pueden coagular las protenas, hacindolas
insolubles. La arquitectura celular se mantiene principalmente por las lipoprotenas y por las
protenas fibrosas tales como el colgeno; La coagulacin de tales protenas mantiene
histomorfologa de tejido a nivel microscpico de luz. Desgraciadamente, debido a que los
fijadores coagulantes dan como resultado una floculacin citoplsmica as como una pobre
preservacin de las mitocondrias y de los grnulos secretores, tales fijadores no son tiles en el
anlisis ultraestructural.

Fijadores coagulantes deshidratados

Los fijadores coagulantes ms comnmente usados son alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol) y
acetona. El metanol est ms cerca de la estructura del agua que el etanol. Por lo tanto, el etanol
compite ms fuertemente que el metanol en la interaccin con las molculas de las reas
hidrofbicas; Por lo tanto, la fijacin del coagulante comienza en una concentracin del 50-60%
para el etanol pero requiere una concentracin de 80% o ms para el metanol (Lillie y Fullmer
1976). La eliminacin y el reemplazo de agua libre de tejido por cualquiera de estos agentes tiene
varios efectos potenciales sobre las protenas dentro del tejido. Las molculas de agua rodean las
reas hidrofbicas de las protenas y, por repulsin, forzan a los grupos qumicos hidrfobos a un
contacto ms estrecho entre s y, por lo tanto, estabilizan la unin hidrofbica. Al eliminar el agua,
el principio opuesto debilita la unin hidrfoba. De manera similar, las molculas de agua
participan en el enlace de hidrgeno en reas hidroflicas de protenas; Por lo que la eliminacin
del agua desestabiliza esta unin de hidrgeno. Juntos, estos cambios actan para alterar la
estructura terciaria de las protenas. Adems, con el agua eliminada, la estructura de la protena
puede volverse parcialmente invertida, con grupos hidrfobos movindose hacia la superficie
exterior de la protena. Una vez que se ha modificado la estructura terciaria de una protena
soluble, la velocidad de inversin a un estado soluble ms ordenado es lenta y la mayora de las
protenas despus de la coagulacin permanecen insolubles incluso si se devuelven a un medio
acuoso.

La interrupcin de la estructura terciaria de las protenas, es decir, la desnaturalizacin, cambia sus

propiedades fsicas, causando potencialmente insolubilidad y prdida de funcin. Aunque la
mayora de las protenas se vuelven menos solubles en ambientes orgnicos, se puede perder
hasta un 13% de protena, por ejemplo con fijacin de acetona (Horobin 1982). Los factores que
influyen en la solubilidad de las macromolculas incluyen:

1. Temperatura, presin y pH.

2. Fuerza inica del soluto.
3. La constante de salazn, que expresa la contribucin de la electrosttica
Interacciones.
4. Las interacciones de salazn y salazn.
5. El (los) tipo (s) de reactivo (s) desnaturalizantes (Herskovits et al., 1970, Horobin, 1982,
Papanikolau & Kokkinidis 1997, Bhakuni 1998).

El alcohol desnaturaliza la protena de forma diferente, dependiendo de la eleccin y

concentracin de alcohol, la presencia de sustancias orgnicas y no orgnicas, y el pH y la
temperatura de fijacin. Por ejemplo, el etanol desnaturaliza protenas> fenoles> agua y alcoholes
polihdricos> cidos monocarboxlicos> cidos dicarboxlicos (Bhakuni 1998).

Otros tipos de fijador coagulante

Los coagulantes cidos tales como cido picrico y cido tricloroaceti cambian las cargas sobre las
cadenas laterales ionizables, p. gramo. (-NH2 NH3 +) y (COO- COOH), de las protenas y
rompen las conexiones electrostticas y de hidrgeno. Estos cidos tambin pueden insertar un
anin lipoflico en una regin hidrfila y por lo tanto interrumpir las estructuras terciarias de las
protenas (Horobin 1982). El cido actico coagula cidos nucleicos pero no fija o precipita
protenas; Por lo tanto se aade a otros fijadores para evitar la prdida de cidos nucleicos.

El cido tricloroactico (Cl3CCOOH) puede penetrar en dominios hidrfobos de protenas y el

anin producido (-C-COO-) reacciona con grupos amina cargada. Esta interaccin precipita
protenas y extrae cidos nucleicos. El cido pcrico o trinitrofenol se disuelve ligeramente en agua
para formar una solucin de cido dbil (pH 2,0). En las reacciones, forma sales con grupos bsicos
de protenas, haciendo que las protenas coagulen. Si la solucin se neutraliza, la protena
precipitada puede redisolverse. La fijacin de cido pcrico produce una tincin ms brillante, pero
las soluciones de bajo pH del cido pcrico pueden causar hidrlisis y prdida de cidos nucleicos.
Fijadores de reticulacin no coagulantes

Se seleccionaron varios productos qumicos como fijadores secundarios a sus acciones potenciales
de formacin de enlaces cruzados dentro y entre protenas y cidos nucleicos, as como entre
cidos nucleicos y protenas.
La reticulacin puede no ser un mecanismo importante en los tiempos cortos actuales de fijacin,
y por lo tanto "fijadores aditivos covalentes" puede ser un mejor nombre para este grupo. Los
ejemplos incluyen formaldehdo, glutaraldehdo y otros aldehdos, p. Hidrato de cloral y glioxal,
sales metlicas tales como mercurio y cloruro de zinc, y otros compuestos metlicos tales como
tetrxido de osmio. Los grupos aldehdo son reactivos qumicamente y biolgicamente y son
responsables de muchas reacciones histoqumicas, p. Los grupos aldehdo libres pueden ser
responsables de las reacciones de argentafina (Papanikolau & Kokkinidis 1997).

La fijacin del formaldehdo

El formaldehdo en su forma amortiguada neutra al 10% (NBF) es el fijador ms comn utilizado en

la patologa diagnstica. El formaldehdo puro es un vapor que, cuando est completamente
disuelto en agua, forma una solucin que contiene 37-40% de formaldehdo; Esta solucin acuosa
se conoce como "formalina". El habitual "10% formalina" utilizado en la fijacin de los tejidos es
una solucin al 10% de formalina; Es decir, contiene aproximadamente un 4% en peso a volumen
de formaldehdo. Las reacciones del formaldehdo con las macromolculas son numerosas y
complejas. Fraenkel-Conrat y sus colegas, utilizando la qumica simple, identificaron
meticulosamente la mayora de las reacciones del formaldehdo con aminocidos y protenas
(Fraenkel-Conrat & Olcott 1948a, Fraenkel-Conrat y Mecham 1949).

En una solucin acuosa, el formaldehdo forma hidrato de metileno, un metilenglicol como primer
paso en la fijacin (Singer 1962).

H2C = O+H2O HOCH2OH

El hidrato de metileno reacciona con varias cadenas laterales de protenas para formar grupos
laterales hidroximetilo reactivos (-CH2-OH). Si se utilizan tiempos de fijacin relativamente cortos
con formalina tamponada neutra al 10% (horas a das), la formacin de cadenas laterales de
hidroximetilo es probablemente la reaccin primaria y caracterstica. La formacin de enlaces
cruzados reales puede ser relativamente rara en los tiempos de fijacin relativamente cortos
utilizados actualmente.

El formaldehdo tambin reacciona con protenas nucleares y cidos nucleicos (Kok & Boon 2003;
Leong 2005). Penetra entre los cidos nucleicos y las protenas y estabiliza la capa cido nucleico-
protena, y tambin modifica los nucletidos reaccionando con grupos amino libres, como lo hace
con las protenas. En el ADN desnudo y libre, se cree que las reacciones de entrecruzamiento
comienzan en regiones ricas en adenina-timidina (AT) y aumenta la reticulacin con el aumento de
la temperatura (McGhee y von Hippel 1975a, 1975b, 1977a, 1977b). El formaldehdo reacciona
con los enlaces C = C y -SH en los lpidos no saturados, pero no interacta con los carbohidratos
(French & Edsall 1945, Hayat 1981).
Las cadenas laterales de los pptidos o protenas que son ms reactivos con el hidrato de metileno
y, por tanto, tienen la afinidad ms alta para el formaldehdo, incluyen lisina, cistena, histidina,
arginina, tirosina y grupos hidroxilo reactivos de serina y treonina (vase Tabla 4.1) & Feeney
1995).

Gustavson (1956) inform que uno de los enlaces cruzados ms importantes en la "sobre fijacin",
es decir, en curtido, es el que existe entre la lisina y el grupo amida del esqueleto proteico. Debido
a los tiempos de fijacin ms cortos de las aplicaciones patolgicas y biolgicas actuales de
diagnstico, es improbable que se produzcan reacciones de reticulacin con la cadena principal de
la protena

Reversibilidad de las reacciones formaldehidemacromoleculares

Los grupos reactivos pueden combinarse con grupos hidrgeno o entre s, formando puentes
metilnicos. Si el formalina se elimina, los grupos reactivos pueden volver rpidamente a sus
estados originales, pero cualquier puente que ya ha ocurrido puede permanecer.

El lavado durante 24 horas elimina aproximadamente la mitad de los grupos reactivos, y 4

semanas de lavado elimina hasta 90% (Helander 1994). Esto sugiere que la reticulacin real es un
proceso relativamente lento, por lo que, en la fijacin rpida utilizada en la patologa diagnstica,
la mayora de la "fijacin" con formaldehdo antes del procesamiento de tejidos se detiene con la
formacin de grupos hidroximetilo reactivos.

Para el almacenamiento a largo plazo en formalina, los grupos reactivos pueden oxidarse a los
grupos ms estables (por ejemplo, cidos -NH-COOH) que no se eliminan fcilmente lavando en
agua o alcohol. Por lo tanto, despus de la fijacin, el retorno de la muestra a agua o alcohol
reduce an ms la fijacin de la muestra, porque los grupos reactivos producidos por la reaccin
inicial con formalina pueden revertirse y ser eliminados. Aunque inicialmente se pens que la
reticulacin era ms importante en la fijacin de tejido para usos biolgicos (basado en el nmero
limitado de reticulaciones durante cortos periodos de fijacin), es probable que la formacin de
estos grupos hidroximetilo desnaturaliza y macula las macromolculas insoluble. Como estos
experimentos de lavado no han sido reproducidos, los mecanismos reales y su importancia para la
fijacin por formaldehdo son inciertos. Adems del simple lavado bajo agua corriente, la
sobrefixacin del tejido se puede corregir parcialmente remojando el tejido en amonaco
concentrado ms 20% de hidrato de cloral (Lhotka & Ferreira 1949). Fraenkel-Conrat y sus colegas
observaron frecuentemente que las reacciones de adicin y condensacin del formaldehdo con
aminocidos y protenas eran inestables y podan revertirse fcilmente por dilucin o dilisis
(Fraenkel-Conrat et al., 1945, 1947, Fraenkel-Conrat y Olcott 1948a, 1948b, Fraenkel-Conrat y
Mecham 1949).

Se cree que el tipo principal de reticulacin en la fijacin a corto plazo est entre el grupo
hidroximetilo en una cadena lateral de lisina y arginina (a travs de grupos amino secundarios),
asparagina, glutamina (a travs de grupos amida secundarios) o tirosina
(A travs del grupo hidroxilo) (Tome et al., 1990). Por ejemplo, un grupo lisina metil hidroxil amina
puede reaccionar con un grupo arginina para formar una reticulacin lisina-CH2-arginina; De
manera similar, un grupo tirosina metil hidroxil amina puede unirse con un grupo cistena para
formar un enlace cruzado tirosina-CH2-cistena. Cada una de estas reticulaciones entre
macromolculas tiene un grado de estabilidad diferente, que puede ser modificado por la
temperatura, el pH y el tipo de ambiente que rodea y permea el tejido (Eltoum et al., 2001b). El
tiempo de saturacin de tejidos humanos y animales con grupos activos por formalina es de
aproximadamente 24 horas, pero la reticulacin puede continuar durante muchas semanas
(Helander 1994).

Cuando el formaldehdo se disuelve en una solucin acuosa no tamponada, forma una solucin
cida (pH 5,0-5,5) porque 5-10% del formaldehdo comercialmente disponible es cido frmico. La
formalina cida puede reaccionar ms lentamente con protenas que la NBF, ya que la amina
(Por ejemplo, -N + H _ {3}). En solucin, esto requiere un pH mucho ms bajo que 5,5. Sin
embargo, el requisito de un pH ms bajo para producir grupos -N + H3 puede no ser equivalente al
requerido en pptidos. La formalina cida tambin preserva la inmunorecognicin
Mucho mejor que el NBF (Arnold et al., 1996) y, de hecho, el xito de Taylor en los primeros das
de inmunocitoqumica para demostrar inmunoglobulinas en secciones de tejidos procesados con
parafina, probablemente se bas en la fijacin de los tejidos en formalina cida , 1974). La
desventaja de usar formalina cida para la fijacin es la formacin de un pigmento negro-marrn
con hemoglobulina degradada. Este pigmento relacionado con heme, que
No suele ser un gran problema a menos que los pacientes tengan una anormalidad en la sangre
(por ejemplo, enfermedad de clulas falciformes, malaria).

El formaldehdo preserva principalmente los enlaces peptdicos protenicos y la estructura general

de los organelos celulares. Puede interactuar con cidos nucleicos pero tiene poco efecto sobre los
carbohidratos y conserva los lpidos si las soluciones contienen calcio (Bayliss High & Lake 1996).

Fijacin de glutaraldehdo

Se sabe menos sobre las reacciones y efectos biolgicos del glutaraldehdo en comparacin con el
formaldehdo, ya que no se ha utilizado tan ampliamente en aplicaciones biolgicas. El
glutaraldehdo es un aldehdo bifuncional que probablemente se combina con los mismos grupos
reactivos que el formaldehdo. En soluciones acuosas el glutaraldehdo se polimeriza, formando
compuestos cclicos y oligomricos (Hopwood 1985), y tambin se oxida a cido glutrico. Para
ayudar en la estabilidad, se requiere almacenamiento a 4 C ya un pH de alrededor de 5
(Hopwood 1969).

A diferencia del formaldehdo, el glutaraldehdo tiene un grupo aldehdo en ambos extremos de la

molcula.
Con cada reaccin del primer grupo, se puede introducir un grupo aldehdo que no ha reaccionado
en la protena y estos grupos aldehdo pueden actuar para reticular ms la
protena.
Alternativamente, los grupos aldehdo pueden reaccionar con una amplia gama de otros objetivos
histoqumicos, incluyendo anticuerpos, enzimas o protenas. La reaccin del glutaraldehdo con
una protena aislada, tal como la albmina de suero bovino, es ms rpida a pH 6-7, y es ms
rpida (Habeeb 1966), y resulta en ms reticulacin que el formaldehdo (Habeeb 1966, Hopwood
1969). La reticulacin es irreversible y soporta cidos, urea, semicarbazida y calor (Hayat 1981). Al
igual que el formaldehdo, las reacciones con la lisina son las ms importantes para formar enlaces
cruzados.
El reticulado extensivo por el glutaraldehdo da lugar a una mejor preservacin de la
ultraestructura, pero este mtodo de fijacin afecta negativamente a los mtodos
inmunohistoqumicos y retarda la penetracin por el fijador. Por lo tanto, cualquier tejido fijado en
glutaraldehdo debe ser pequeo (0,5 mm como mximo) y, a menos que los grupos aldehdos
estn bloqueados, se producir una tincin de fondo mayor si se utilizan varios mtodos
histoqumicos (Grizzle 1996a). El glutaraldehdo no reacciona con carbohidratos o lpidos a menos
que contengan grupos amino libres como se encuentran en algunos fosfolpidos (Hayat 1981). A
temperatura ambiente
El glutaraldehdo no reticula los cidos nucleicos en ausencia de nucleohistonas, pero puede
reaccionar con cidos nucleicos igual o superior a 45 C (Hayat 1981).

Fijacin de tetrxido de osmio

El tetrxido de osmio (OsO4), un slido txico, es soluble en agua as como disolventes no polares
y puede reaccionar con sitios hidrfilos e hidrfobos que incluyen las cadenas laterales de las
protenas, pudiendo causar reticulacin (Hopwood et al., 1990). Los sitios reactivos
Incluyen grupos sulfidrilo, disulfuro, fenlico, hidroxilo, carboxilo, amida y heterocclicos. Se sabe
que el tetrxido de osmio interacciona con cidos nucleicos, especficamente con el resto 2,3-
glicol en los grupos ribosa terminales y los 5,6 enlaces dobles de los residuos timina. Los ncleos
fijados en OsO4 y deshidratados con alcohol pueden mostrar un agrupamiento prominente de
ADN.
Este artefacto inaceptable puede evitarse prefijando el permanganato de potasio (KMnO4), post-
fijacin con acetato de uranilo o aadiendo iones de calcio y triptfano durante la fijacin (Hayat
1981). La reaccin de OsO4 con los carbohidratos es incierta (Hayat 1981). Grandes proporciones
de protenas y carbohidratos se pierden de los tejidos durante la fijacin de osmio; Algo de esto
puede deberse a la penetracin superficial limitada de OsO4 (es decir, <1 mm) en los tejidos oa sus
lentas tasas de reaccin. En electrones
Microscopa, esta prdida se minimiza mediante la fijacin inicial del tejido en el glutaraldehdo.

La reaccin mejor caracterizada del smio es su reaccin con enlaces insaturados dentro de lpidos
y fosfolpidos. En esta reaccin, el osmio en su estado de valencia +8 se convierte en un estado de
valencia +6, que es incoloro.
Si dos enlaces insaturados estn prximos entre s puede haber reticulacin por OsO4. Aunque el
complejo es incoloro en este punto, la tincin negra tpica de membranas que se espera de la
fijacin con osmio requiere la produccin de dixido de osmio (OsO2 2H2O). El dixido de osmio
es negro, denso en electrones e insoluble en solucin acuosa; Precipita cuando los compuestos
inestables anteriores se descomponen y se depositan sobre las membranas celulares. La
descomposicin de los complejos de valencia smio +6 a dixido de osmio (estado de valencia +4)
se facilita mediante una reaccin con disoluciones de etanol. Adems de su uso como un fijador
secundario para los exmenes de microscopio electrnico, OsO4 tambin se puede utilizar para
teir los lpidos en las secciones congeladas. La fijacin del tetrxido de osmio causa hinchamiento
del tejido que se invierte durante las etapas de deshidratacin. La hinchazn tambin se puede
minimizar aadiendo cloruro de calcio o sodio a fijadores que contienen osmio (Hayat 1981).
Fijadores de reticulacin para microscopa electrnica

Los organelos celulares tales como las membranas citoplasmticas y nucleares, las mitocondrias,
los grnulos secretores ligados a la membrana y el retculo endoplsmico liso y rugoso necesitan
conservarse cuidadosamente para la microscopa electrnica. Los lpidos en estas estructuras son
extrados por muchos fijadores con deshidratantes (por ejemplo, alcoholes). Por lo tanto, para el
examen ultraestructural es importante utilizar un fijador que no solubilice los lpidos. Los fijadores
preferidos son un fijador de reticulacin fuerte, tal como glutaraldehdo, una combinacin de
glutaraldehdo y formaldehdo, o Millonig modificado de Carson, seguido de fijacin posterior en
un agente que estabiliza adicionalmente, as como enfatiza las membranas tales como OsO4.

Cloruro de mercurio

Histricamente, el cloruro mercrico era muy favorecido por sus cualidades de mejorar las
propiedades de tincin de los tejidos, particularmente para las manchas tricrmicas. Sin embargo,
actualmente se utiliza poco en el laboratorio clnico debido a las cuestiones de salud y seguridad
relacionadas con el uso de un fijador que contiene mercurio, y tambin debido a la dependencia
reducida de las "manchas especiales". Otro inconveniente mayor de la fijacin del cloruro
mercrico es la inevitable formacin de depsitos de precipitados intensamente negros de
pigmento mercrico en los tejidos.
Esto posteriormente les da un valor inferior para estudios inmunohistoqumicos y moleculares.
En los tejidos recientemente fijados, estos precipitados se pueden eliminar fcilmente mediante
un paso de yodo de Lugol en el procedimiento de tincin, seguido por el blanqueo de la seccin en
solucin de hipoclorito de sodio (Hypo). Sin embargo, esto no es efectivo en tejidos fijados con
cloruro de mercurio que han sido almacenados durante varios aos como bloques de parafina.
En estos tejidos, el anlisis retrospectivo por inmunohistoqumica y tcnicas moleculares se vuelve
poco fiable debido a la formacin de agregados mucho ms grandes de pigmento mercrico que
no pueden ser eliminados posteriormente por el yodo de Lugol.

La qumica de la fijacin con cloruro mercrico no se conoce bien. Sin embargo, se sabe que el
cloruro mercrico reacciona con sales de amonio, aminas, amidas, aminocidos y grupos sulfidrilo,
y endurece los tejidos. Es especialmente reactivo con cistena,
Formando un dimercaptido (Hopwood 2002) y acidificando la solucin:

Si slo est presente una cistena, es probable un grupo reactivo de R-S-Hg-Cl.

Los fijadores basados en mercurio son txicos y deben manejarse con cuidado. No se debe
permitir que entren en contacto con el metal y se disuelvan en agua destilada para evitar la
precipitacin de sales de mercurio. Los productos qumicos que contienen mercurio son un
problema de eliminacin ambiental. Estos fijadores penetran lentamente, por lo que los
especmenes deben ser delgados, y el mercurio y los pigmentos de hematena de formaldehdo
cido pueden depositarse en el tejido despus de la fijacin. Los fijadores de mercurio (Hopwood
1973) ya no se utilizan rutinariamente excepto por algunos laboratorios para fijar tejidos
hematopoyticos (especialmente B5). Un sustituto potencial del cloruro mercrico es el sulfato de
zinc. Formulaciones especiales de sulfato de zinc en formaldehdo que reemplazan el cloruro
mercrico en B5 pueden dar un mejor detalle nuclear que el formaldehdo solo y mejorar la
penetracin del tejido (Carson 1990).

Fijadores especiales

Dichromato y fijacin de cido crmico

El trixido de cromo se disuelve en agua para producir una solucin cida de cido crmico, con un
pH de 0,85.
El cido crmico es un poderoso agente oxidante que produce aldehdo a partir de los residuos de
1, 2-diglicol de los polisacridos.
Estos aldehdos pueden reaccionar en manchas histoqumicas (PAS y argentafina / argtrofila) y
aumentar el fondo de tincin inmunohistoqumica (Grizzle 1996a).

Las sales crnicas reales (es decir, iones de cromo en estado de valencia +3) pueden destruir
tejidos animales (Kiernan 1999), pero los iones de cromo en sus protenas coaguladas de estado +6
y cidos nucleicos. Las reacciones de fijacin y endurecimiento no se entienden completamente,
pero probablemente implican la oxidacin de protenas, que vara en intensidad dependiendo del
pH del
Fijador, ms la interaccin de los iones de cromato reducidos directamente en las protenas de
entrecruzamiento (Pearse & Stoward 1980). Los iones de cromo interactan especficamente con
las cadenas laterales carboxilo e hidroxilo de las protenas. El cido crmico tambin interacta
con los puentes disulfuro y ataca a los residuos lipfilos como la tirosina y la metionina (Horobin
1982). Los fijadores que contienen cromato a un pH de 3,5-5,0 hacen que las protenas sean
insolubles sin coagulacin. Se ha informado que el cromato produce lpidos insaturados pero no
saturados insolubles tras una fijacin prolongada (> 48 horas) y, por lo tanto, las mitocondrias
estn bien conservadas por fijadores dicromatos.

Los fijadores que contienen dicromato se han utilizado principalmente para preparar tejidos
neuroendocrinos para la tincin, especialmente mdula suprarrenal normal y tumores
relacionados (por ejemplo, feocromocitomas). Sin embargo, la dependencia de la reaccin
cromafina utilizada para identificar los grnulos de cromafina despus de la fijacin de dicromato
ha disminuido considerablemente, siendo reemplazada por inmunohistoqumica a una gama de
marcadores neuroendocrinos, incluyendo enolasa especfica de neurona, cromagranina A y
sinaptofisina (Grizzle 1996a, 1996b).

Fijadores para anlisis de ADN, ARN y protenas

Lykidis et al. (2007) realizaron un anlisis exhaustivo de 25 compuestos fijadores, muchos de ellos
reputados para proporcionar preservacin mejorada de ADN y ARN y protenas en tejidos para el
anlisis inmunocitoqumico, mientras que al mismo tiempo asegurar una preservacin morfolgica
ptima. Los compuestos incluyeron los compuestos comercialmente disponibles
HOPE (fijador de HEPES-cido glutmico mediado por el Efecto de Proteccin de Solvente
Orgnico) y el reticulante reversible ditio- bis [succinimidil propionato] (DSP) para
inmunocitoqumica y perfiles de expresin, adems de fijadores a base de cinc.

Concluyeron que una nueva formacin de zinc (Z7) que contena trifluoroacetato de zinc, cloruro
de zinc y acetato de calcio era significativamente mejor que el fijador estndar basado en zinc (Z2)
y NBF para la perseveracin de ADN, ARN y antgeno. Se detectaron fragmentos de ADN y ARN de
hasta 2,4 kb y 361 pb de longitud, respectivamente, mediante PCR, PCR de transcriptasa inversa y
PCR en tiempo real en los tejidos fijados Z7, adems de permitir el anlisis de protenas mediante
electroforesis 2D. Se encontr que los cidos nucleicos y las protenas eran estables durante un
perodo de 6-14 meses. Adems, el fijador es menos txico que las formulaciones de
formaldehdo. Si bien este fijador parece ser muy prometedor, debe tenerse en cuenta que la
fijacin en NBF tambin permitir la extraccin de fragmentos de tamao similar de ADN y ARN
para su anlisis mediante tecnologas basadas en PCR, dentro de este marco de tiempo.

Iones metlicos como un suplemento de fijacin

Varios iones metlicos se han utilizado como ayudas en la fijacin, incluyendo Hg2 +, Pb2 +, Co2 +,
Cu2 +, Cd2 +, [UO2] 2+, [PtCl6] 2+ y Zn2 +. Mercurio, plomo y zinc se usan ms comnmente en
fijadores actuales, p. Se sugiere que el formaldehdo que contiene cinc es un mejor fijador para la
inmunohistoqumica que el formaldehdo solo. Sin embargo, esto depende del pH del
formaldehdo, as como del formaldehdo de cinc (Arnold et al., 1996, Eltoum et al., 2001a).

Fijadores compuestos

Los patlogos usan fijadores basados en formaldehdo para asegurar patrones histomorfomtricos
reproducibles. Se pueden aadir otros agentes al formaldehdo para producir efectos especficos
que no son posibles con el formaldehdo solo. El etanol deshidratado, por ejemplo, se puede
aadir al formaldehdo para producir formalina alcohlica. Esta combinacin conserva molculas
como el glicgeno y da como resultado menos contraccin y endurecimiento que los
deshidratados puros.

Los fijadores compuestos son tiles para tejidos especficos, p. Formalina alcohlica para la fijacin
de algunos tejidos grasos, como el pecho, en los que la preservacin del lpido no es importante.
Adems, la fijacin de especmenes brutos en formalina alcohlica puede ayudar a identificar los
ganglios linfticos incrustados en la grasa. Algunos fijadores combinados que incluyen formalina
alcohlica son buenos para preservar la deteccin de antgenos, pero se puede aumentar la
tincin no especfica o la tincin de fondo en procedimientos inmunohistoqumicos.
Los grupos aldehdo no reaccionados en la fijacin de glutaraldehidoformaldehdo por ejemplo
pueden aumentar la tincin de fondo, y la formalina alcohlica puede causar tincin no especfica
de los nervios mielinizados (Grizzle et al., 1996, 1996).