Carta

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Obtencin de imgenes de superxido generacin en el rea dopaminrgicas del cerebro en el

Parkinson ' s Disease, Usar Mito-TEMPO
Zhivko Zhelev, , , Rumiana Bakalova, *, , Ichio Aoki, Dessislava Lazarova, y Saga Tsuneo
Molecular Imaging Center, Instituto Nacional de Ciencias Radiolgicas, 4-9-1 Anagawa, Inage-ku, Chiba 263-8555, Japn

Facultad de Medicina, Universidad de Trakia, 11 Armeiska Str., 6000 Stara Zagora, Bulgaria

Instituto de Biofsica e Ingeniera Biomdica, Academia Blgara de Ciencias, 23 Avad. G. Bonchev Str., As fi 1000, Bulgaria
Facultad de Medicina, tanto fi una universidad, 1 Koziak Str., As fi un 1407, Bulgaria

ABSTRACTO: Se presenta una nueva metodologa para la visualizacin directa de la

produccin de superxido en la zona dopaminrgico del cerebro en el Parkinson ' enfermedad
s, basado en el ciclo redox de mito-TEMPO, un barrier- hematoenceflica, por clulas,
y el derivado de nitrxido mitocondrias-penetrante con propiedades de depuracin de
superxidos y T 1 formacin de imgenes por resonancia magntica (MRI) de contraste.
Los experimentos se realizaron en saludable y 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina
(MPTP) - ratones tratados. En ratones sanos, la seal de resonancia magntica
nitrxido mejorada era dbil y de corta duracin (vida media ~ 40 s; duracin ~ 80

s). El PRO fi Le de los histogramas indica una alta actividad de reduccin de los
tejidos normales del cerebro contra mito-TEMPO. En
los ratones tratados con MPTP, la seal de MRI nitrxido mejorada era fuerte y de larga vida (vida media> 20 min; duracin> 20 min), especialmente en el rea dopaminrgico del
cerebro. Los histogramas indican una alta actividad oxidativa en los tejidos dopaminrgicos de los ratones tratados con MPTP. Los resultados muestran directamente, en
mamferos intactos, que superxido es un inductor principal y / o mediador de dao neurodegenerativa en Parkinson ' s enfermedad. El alto estado oxidativo del tejido cerebral en el
Parkinson ' s enfermedad tambin se con fi rma en muestras de tejido aisladas, usando el ensayo de capacidad de reduccin total y ensayo de ROS / RNS.

PALABRAS CLAVE: Mito-TEMPO, metoxi-TEMPO, TEMPOL, superxido, la resonancia magntica nitrxido mejorada, Parkinson ' enfermedad de s

PAG
perspectivas sobre la patognesis de PD. Las alteraciones en el metabolismo de
trastorno de causa
Arkinson desconocida.
' s enfermedad sntomas
(PD) de la EP seneurodegenerativa
es una enfermedad atribuyen a la comn energa (por ejemplo, la disfuncin mitocondrial), la generacin de especies reactivas
degeneracin de las neuronas que contienen dopamina en la de oxgeno (ROS), y perturbacin en la homeostasis del calcio se producen dentro de
la sustancia negra pars compacta ( SNpc) y una de fi cit en dopamina en el cerebro. 1 - 3 En horas de la administracin de MPTP, antes de cualquier signi fi se ha producido la
la mayora de los casos de PD, sin embargo, se sabe que ni la causa ni los mecanismos muerte neuronal no puede. 5 - 7 Estos eventos iniciales podran ser seales intracelulares
que subyacen a la prdida (muerte) de las neuronas dopaminrgicas nigroestriatales. que pueden establecer en cascadas de movimiento deletreos molecular (por
Por lo tanto, las cuestiones pendientes son por qu y cmo estas especi fi neuronas c ejemplo, activacin de apoptosis), que son responsables de la muerte de las neuronas
mueren en la EP. Aunque las investigaciones de los tejidos post-mortem PD tienen su de dopamina. Vale la pena sealar que muestras de cerebro post mortem de
lugar en la bsqueda para responder a estas preguntas, que suelen proporcionar una fi imagen
pacientes con PD muestran un defecto selectivo en el complejo de la cadena de
fija de la etapa final de PD. 1 Este enfoque no es adecuado para de fi ne primeros eventos
transporte de electrones mitocondrial que es una ff ected por MPTP. 1,2,8,9 El mecanismo
neurodegenerativas y su evolucin temporal.
molecular se muestra en la Figura 1. Es bien descrito por Vila y Przedborski. 2 Despus
de su administracin sistmica, MPTP, que es un pro-toxina generalmente no txico,
cruza rpidamente la barrera hematoenceflica (BBB) y se metaboliza a
En la medicina experimental, uno de los modelos ampliamente utilizados de la
1-metil-4-fenil-2,3-dihydropyrolidine (MPDP +) por la monoamina oxidasa B (MAO-B)
EP es el modelo de ratn MPTP . 1,2 MPTP (1-metil-4fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina)
en clulas nondopamine y, a continuacin, probablemente por la oxidacin
es un subproducto de la sntesis qumica de un anlogo de meperidina con
espontnea, a 1-metil-4-phanylpyrolidine (MPP +). MPP + es el compuesto txico
herona-como e ff ECTS que pueden inducir un sndrome parkinsoniano en los seres
activo con alta una FFI nidad a los transportadores de dopamina. Por lo tanto, MPP +
humanos casi indistinguible de la EP. 4 MPTP es la neurotoxina dopaminrgica
se puede entregar en la dopamina
nico conocido capaz de causar una lesin fiable y reproducible de la va
dopaminrgica nigroestriatal y un cuadro clnico de parkinsonismo en varias
especies de mamferos (por ejemplo, humano, primates no humanos, ratones). 2 Durante
los ltimos 20 aos, con MPTP modelo de ratn de la EP ha generado importantes

Publicado: 11 de septiembre de 2013

2013 American Chemical Society 1439 dx.doi.org/10.1021/cn400159h | ACS Chem. Neurosci. 2013, 4, 1439 - 1445
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Figura 1. mecanismo molecular de Parkinson inducida por MPTP ' s enfermedad [segn la
Vila y Przedborski 2] y la deteccin de la generacin de superxido usando
BBB-penetrante y nitrxido mitocondrias de penetracin como un sensor molecular. DT,
transportador de dopamina; MPP +, 1-metil-4-fenilpiridinio; MPTP,
1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina; O 2 , radical superxido; MARIDO 2 O 2, perxido de
hidrgeno.
neuronas. MPP + se concentra dentro de las mitocondrias, donde inhibe complejo I de
la cadena de transporte de electrones y deteriora la respiracin mitocondrial. La
inhibicin de complejo-I impide la Florida ow de electrones a lo largo de la cadena de
transporte de electrones mitocondrial, lo que resulta en un aumento de la produccin
de ROS por las mitocondrias (probablemente, los radicales superxido y / o perxido
de hidrgeno), la posterior activacin de NADPH oxidasas dependientes (NOX), lo
que provoca el estrs oxidativo y la activacin de la apoptosis y necrosis de neurona.
Actualmente, no existe una metodologa universal para la visualizacin directa de los
eventos iniciales oxidativos en rea dopaminrgico del cerebro in vivo (en los mamferos
intactos), causada por la administracin de MPTP.
En publicaciones anteriores, en base a modelos de cncer, se demostr que
algunos derivados de nitrxido de penetracin celular (TEMPOL, nitrosourea TEMPO
marcado, metoxi-PROXYL) son sensores apropiados moleculares para formacin de
imgenes de ROS (en particular generacin, superxido) en los tejidos vivos ( in vivo),
el uso de imgenes por resonancia magntica (MRI) o resonancia magntica de
electrones-para- (EPRI). 10 - 14 Estos derivados de nitrxido penetran BBB y son tambin
sensores moleculares apropiados para formacin de imgenes de la generacin de
superxido en el cerebro. 15 - 18
El mtodo se basa en el ciclo de nitrxido redox se muestra en la figura
2. En los estudios in vitro demuestran que el radical nitrxido (que se caracteriza
por T 1 contraste) se puede convertir rpidamente a hidroxilamina y / o de
oxoamonio sin contraste por di ff compuestos celulares Erent (iones libres de
metales de transicin, radicales peroxilo hidro, ubiquinoles, NAD (P) H, glutatin,
ascorbato, etc.). 13,14,19 - 23 Hidroxilamina y son oxoamonium de xido de super-
superxido-mimticos y podra recuperar el radical nitrxido. 19,21,24,25 Se encontr
que la interaccin de oxoamonio con superxido se produce muy rpidamente
(constante de velocidad
~ 10 9 METRO - 1 s - 1) 0,25 En condiciones fisiolgicas, la oxoamonnium podra
reducirse correo ff caz a hidroxilamina por el NAD (P) H. 21 Hidroxilamina tambin
interacta correo ff caz con radicales hidroperoxilo a pH fisiolgico ~ 7.4 con la
recuperacin de la forma de contraste. 25 Por lo tanto, in vivo varios reductores y
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oxidantes podran estar involucrados (directa o indirectamente) en la
formacin de oxoamonio y / o hidroxilamina, pero slo la interaccin de ambos
compuestos con superxido / radical hidroperoxilo parece ser un proceso
dominante in vivo que puede restaurar el radical nitrxido y MRI / contraste
EPR . En estudios in vivo (en los mamferos intactos) demostrar que la seal
de MRI / EPR nitrxido mejorado sigue la reduccin / oxidacin del derivado
de nitrxido en los tejidos y el cuerpo
Florida fluidos. 10 - 19 Por lo tanto, este parmetro podra servir como un marcador de la
generacin de superxido y el estrs oxidativo in vivo. Una seal de duracin corta
nitroxideenhanced MRI / EPR indica una alta capacidad de reduccin del tejido
respectivo, mientras que una seal de larga vida nitroxideenhanced MRI / EPR indica una
alta capacidad oxidativa. Esto se puede ver muy bien en modelos experimentales de
cncer (Figura 2B). 10 - 12 El uso de BBB- y TEMPOL de penetracin celular y nitrosourea
marcado con TEMPO, hemos encontrado que la seal de resonancia magntica
nitroxideenhanced en el cerebro de mamferos sanos tena una muy corta vida media ( 1/2),
menos de 2 min, y haba un di ff rencia entre las curvas cinticas de degradacin de la
seal de resonancia magntica en di ff partes Erent del cerebro. 17,18 Por el contrario, en el
cerebro de portadores de cncer, que se caracteriza por niveles elevados de ROS, la
seal de MRI nitrxido mejorada era de larga vida ( 1/2> 15 min) (Figura 2B). 10 - 12
En el presente estudio, se aplic la metodologa descrita para la visualizacin de la
produccin de superxido en la zona dopaminrgico del cerebro de los ratones tratados
con MPTP, utilizando mito-TEMPO. Mito-TEMPO es BBB- y derivado nitrxido con la
acumulacin mitocondrial frecuente de penetracin celular, 26 propiedades de depuracin
de superxidos 26,27 y comparativamente alta T 1 contraste de resonancia magntica. Esto
hace que sea un sensor molecular til para la deteccin de la produccin de superxido
en la zona dompaniergic del cerebro, mediante resonancia magntica (Figura 1).
La Figura 3 muestra imgenes tpicas de la seal extrada nitroxideenhanced MRI
(normalizado a la lnea de base) en saludable (B) y los ratones tratados con MPTP
(C). Se seleccionaron dos regiones de inters: (i) todo el rea del cerebro (ROI1) y (ii)
el rea dopaminrgica (ROI2) (Figura 3A).
En los ratones de control, en ambos ROIs, la seal aument ligeramente despus
de la inyeccin de mito-TEMPO seguido por una rpida disminucin de la lnea de
base (Figura 3B y D1, D2, lneas negras). La mejora de la seal de MRI en el
principio es debido a la penetracin y acumulacin de mito-TEMPO en los tejidos del
cerebro, mientras que la disminucin se debe a su reduccin a hidroxilamina sin
contraste, que se produce predominantemente en el interior de las clulas
cerebrales. La vida media de la seal de MRI nitrxido mejorada fue de
aproximadamente 45 s y la duracin de la seal era
~ 1 min 20 s. El PRO fi Le de los histogramas indica una alta actividad de reduccin
de los tejidos normales del cerebro contra radical nitrxido mito-TEMPO.
En los ratones tratados con MPTP, se detect una seal de MRI
nitroxideenhanced fuerte y de larga duracin en la zona dopaminrgico del cerebro
despus de la inyeccin de mito-TEMPO (Figura 3C). Las curvas cinticas de la
seal de MRI nitrxido potenciada en el cerebro (Figura 3D1, D2, lneas rojas) eran
completamente di ff Erent de la pro referencia fi les, registrada para el grupo control
(Figura 3D1, D2, lneas negras). En ambos ROIs de los ratones tratados con
MPTP, la seal aument despus de la inyeccin, despus de lo cual la intensidad
disminuy ~ 50% y alcanz una meseta sin ms disminucin a la lnea de base
dentro de 15 min. Uso del anlisis a largo plazo, se estableci que la duracin de la
seal de MRI nitroxideenhanced era ms de 20 min ( p < 0,001 vs control). Las
imgenes en la Figura 3C muestran que el aumento de la seal de MRI en la
corteza de ratones tratado con MPTP fue insignificante.
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Figura 2. ciclo redox nitrxido como una plataforma de deteccin para formacin de imgenes de la generacin de superxido en el cerebro: principio del mtodo. (A) Los estudios in vitro demuestran que
radical nitrxido, que se caracteriza por resonancia magntica mejora de contraste / EPR, se puede convertir a la hidroxilamina sin contraste para mejorar y / o oxoamonio por di ff compuestos Erent en las
clulas, el cuerpo Florida fluidos y tejidos (por ejemplo, iones libres de metales de transicin, radicales hidroperoxilo, ubiquinoles, NAD (P) H, ascorbato, glutatin, etc.). La forma radical de mejora del contraste
puede ser recuperado por la interaccin de hidroxilamina con el superxido / radical a pH fisiolgico (7,4) hidroperoxilo. Parece que el nitrxido in vivo existir principalmente en dos formas: como un radical y
como hidroxilamina. Varios reductores y oxidantes participan (directa o indirectamente) en la formacin de hidroxilamina, pero slo la interaccin de hidroxilamina para dominan in vivo como el proceso que
restaura el radical nitrxido y su / contraste EPR MRI. Por lo tanto, la seal de MRI / EPR nitrxido mejorado sigue la reduccin / oxidacin del derivado de nitrxido y podra servir como un marcador de la
generacin de superxido. (B) En los estudios in vivo demuestran que la vida media ( 1/2) de la seal de MRI nitrxido potenciada en el cerebro sano es de menos de 2 min, lo que indica una alta actividad de
reduccin de los tejidos cerebrales. En el cerebro portadores de cncer, y especialmente en el tejido de cncer, la vida media de la seal de MRI nitrxido mejorado es ms de 15 min. Se obtuvieron y se
procesaron despus de la inyeccin intravenosa de nitrosourea TEMPO marcado en ratn sano o el ratn glioma-cojinete Las imgenes de resonancia magntica (detalles se describen en las referencias 10 y
17).

Por lo tanto, la di observado ff erences entre las curvas cinticas de ratones sanos
y ratones tratados con MPTP son debido a la di ff actividad redox tejido Erent
contra mito-TEMPO en la zona dopaminrgico del cerebro. Los histogramas
indican una alta actividad oxidativa en la zona dopaminrgica mitocondrias rica
de ratones MPTPtreated debido a la produccin anormal de superxido
mitocondrial.
Los datos sugieren que mito-TEMPO, que es un conocido scavenger
superxido mitocondrias-dirigida, 26 - 28 penetra en el cerebro y participa en
transformaciones redox. El ciclo redox de mito-TEMPO se compone de
dos antagonista
los procesos con respecto a sus propiedades de contraste de MRI. La
reduccin de mito-TEMPO a la forma de hidroxilamina se acompaa con la
prdida de la seal de MRI nitrxido mejorada. Por el contrario, la
interaccin de la forma hydrohylamine con superxido recupera la forma
radical de mito-TEMPO y el contraste MRI nitrxido mejorada. similar di ff erences
en la cintica de MRI nitrxido reforzada entre ratones sanos y tratado con
MPTP se obtuvieron utilizando otros derivados de nitrxido, metoxi-TEMPO
y hydroxyTEMPO (TEMPOL) (Figura 4). Ambos nitrxidos se
BBBpenetrating y clula-penetrante. La intensidad de nitroxide-

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Figura 3. Nitrxido mejorada MRI en ratones sanos y tratados con MPTP, utilizando mito-TEMPO como un agente de contraste. imgenes (A) MR indicando regin-ofinterest (ROI; lneas de puntos). (B) Las
imgenes de RM de cerebro de ratn sano: (a) imagen de RM de cerebro de ratn; (B) mejora de la seal MRI extrada, obtenida antes de la inyeccin de mito-TEMPO; (do - e) extrado mejora de la seal
MRI, obtenido 1, 5, y 15 min despus de la inyeccin de mito-TEMPO, respectivamente. imgenes (C) de RM de cerebro de ratn tratado con MPTP: (a) imagen de RM de cerebro de ratn; (B) mejora de la
seal MRI extrada, obtenida antes de la inyeccin de mito-TEMPO; (do - e) extrado mejora de la seal MRI, obtenido 1, 5, y 15 min despus de la inyeccin de mito-TEMPO, respectivamente. La intensidad
de la seal de resonancia magntica en la zona dopaminrgico es notablemente superior en comparacin con el control. En (A), (B) y (C), las imgenes se obtuvieron por T 1-

secuencia de eco de gradiente ponderada. (D) curvas cinticas de seal de MRI nitrxido potenciada en el cerebro (ROI1) de ratones sanos (lnea de color negro) y los ratones MPTPtreated (lnea roja). (E)
curvas cinticas de seal de MRI nitrxido reforzada en el mbito dopaminrgico del cerebro (ROI2) de ratones sanos (lnea de color negro) y los ratones tratados con MPTP (lnea roja). En (D) y (E), los datos
son la media SD de 6 o 10 animales para el grupo de control o el grupo tratado con MPTP, respectivamente.

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seal de MRI mejorada es ms alta en el cerebro tratado con MPTP que en el cerebro
sano (Figura 4A). Sin embargo, 10 min despus de la inyeccin de la sonda nitrxido,
la mejora se distribuye uniformemente en todos los tejidos cerebrales (incluyendo
corteza) y no fuertemente no localizada en la zona de dopaminrgico del cerebro
(Figura 4B). El tratamiento con MPTP una ff eja las condiciones fisiolgicas generales
de ratones: se llev a la hipotensin y la ligera disminucin de la temperatura del
cuerpo (datos no se muestran). Sin embargo, no hizo una ff ect la distribucin de
nitrxido en el cerebro. La cantidad promedio de mito-TEMPO en el tejido cerebral
sano (estimado por espectroscopia EPR en muestras de tejido aisladas 10 min
despus de la inyeccin) fue 8,4 2,1 pmol / g de tejido. En el cerebro tratado con
MPTP, la cantidad era casi la misma 8,1 1,7 pmol / g de tejido. Los datos sugieren
que mito-TEMPO es sensor redox apropiado para imgenes de RM de la generacin
de superxido en la zona dopaminrgico del cerebro en Parkinson ' s enfermedad.
Obviamente, en el cerebro tratado con MPTP, la oxidacin de mitoTEMPO domina
sobre la reduccin como resultado de la produccin anormal de superxido
mitocondrial en tejidos dopaminrgicos. Los resultados muestran directamente, en
mamferos intactos, que dismutasa mitocondrial es un inductor principal y / o
mediador de dao neurodegenerativa en Parkinson ' s enfermedad. El alto estado
oxidativo del tejido cerebral en el Parkinson ' s enfermedad tambin se con fi rma en
muestras de tejido aisladas, usando antioxidante total (reduccin) de ensayo de la
capacidad y ensayo de ROS / RNS (Figura 5). La metodologa descrita podra ser
aplicado tambin para el anlisis no invasivo de estrs oxidativo del cerebro y el
desequilibrio redox en otras condiciones neurodegenerativas, tales como Alzheimer ' enfermedad
s, esquizofrenia, epilepsia, y as sucesivamente.

Figura 4. MRI nitrxido mejorada en ratones sanos y tratados con MPTP, utilizando
metoxi-TEMPO o hidroxi-TEMPO (TEMPOL) como un agente de contraste. (A) curvas
cinticas de seal de MRI nitrxido potenciada en el cerebro (ROI1) de ratones sanos (lneas
negras) y de los ratones tratados con MPTP (lneas rojas). En el caso de metoxi-TEMPO, los
MTODOS
Productos qumicos. MPTP y uretano (99%) fueron adquiridos de
datos son la media SD de 4 y 7 animales para el grupo control y el grupo tratado con MPTP,
Sigma-Aldrich. Mito-TEMPO se adquiri de SantaCruz Biotechnology, Inc
respectivamente. En el caso de TEMPOL, los datos son la media
4-metoxi-TEMPO y 4-hidroxi-TEMPO se adquirieron de Sigma-Aldrich.
SD de 4 y 5 animales para el grupo control y el grupo tratado con MPTP, respectivamente. (B)
MPTP modelo de ratn de Parkinson ' Enfermedad s. Todos los experimentos se
aumento de la seal Extradas MRI en el cerebro de ratones sanos o ratones tratados con
llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Sociedad Fisiolgica de Japn y
MPTP, obtenidos 5 y 10 min despus de la inyeccin de la sonda nitrxido posterior.
fueron aprobados por el Comit de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de
Ciencias Radiolgicas, Chiba, Japn.

Figura 5. ( A) La capacidad total antioxidante (TAC) del tejido cerebral de ratones sanos y tratados con MPTP. Los datos son la media SD de 4 animales para cada grupo. En el grupo
control, TAC se consider 100%, que corresponda a 17 equivalentes de cido rico M por miligramo de protena ( ~ 37
M cobre equivalentes reductores por miligramo de protena). (B) ROS / RNS nivel en el tejido cerebral de ratones sanos y tratados con MPTP, estimado por DFC Florida fluorescencia intensidad a 530 nm.
Un mayor DCF Florida fluorescencia intensidad es un marcador de un nivel ms alto ROS / RNS en muestras de tejido. Los datos son la media SD de 4 animales para cada grupo. ** p < 0,01, frente al grupo
control.

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El modelo de ratn MPTP agudo de Parkinson ' enfermedad s se desarroll siguiendo
estrictamente el protocolo (A) ( la inyeccin de MPTP ),
descrito por Jackson-Lewis y Przedborski en Protocolos de la naturaleza. 1
Los ratones (C57BL / 6, macho) se separaron en dos grupos: grupo control (ratones sanos)
y el grupo tratado con MPTP (ratones con Parkinson ' enfermedad s). En ambos grupos, los
ratones eran de la misma edad (10 - 12 semanas de edad), casi el mismo peso (28 2 g), y se
mantiene bajo las mismas condiciones.
MPTP se disolvi en solucin salina estril. Se inyecta por va intraperitoneal (ip). Un rgimen
comn implica una inyeccin de MPTP cada 2 h durante un total de cuatro dosis durante un
perodo de 8 h en 1 da. Cada dosis consisti en 20 mg / kg de peso corporal (BW), y el volumen
inyectado fue de 150 L por una dosis. Se ha informado de que en virtud de este dopamina
estriatal rgimen puede empobrecido por al menos 40 - 50% en adultos jvenes ratones C57BL / 6,
la neurodegeneracin dopaminrgica se produce morfolgicamente por una forma no apopttica
de la muerte, y la prdida de cuerpos celulares dopaminrgica en el Substancia nigra es estable
por 7 das despus de la administracin de MPTP. 1,29 Los ratones de control fueron inyectados con
solucin salina al mismo rgimen. Los ratones se sometieron a mediciones de resonancia
magntica en la octava hora despus de la fi inyeccin de primera.
Las mediciones in vivo de resonancia magntica. mediciones de resonancia magntica se
realizaron en 7,0 imn horizontal T (Kobelco y Jastec, Kobe, Japn) interconectado a una
consola de Bruker Avance-I (Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemania) y controlado con Paravision
4.0.1 (Bruker BioSpin). Los ratones fueron anestesiados por uretano (1,5 - 2,0 g / kg de peso
corporal; inyeccin ip) y se colocaron en un soporte de cabeza (Rapid Biomedical, Limper,
Alemania). Un sensor de la respiracin (SA Instruments, Stony Brook, NY) fue colocado en el
pecho de los ratones. Una sonda de temperatura (FOT-M y FTI-10, FISO Technologies, Quebec,
Canad) se us para monitorizar la temperatura rectal. La vena de la cola se canul a travs de
tubo de polietileno (PE-10, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) para la inyeccin de nitrxido.
El ratn se coloc en el 1 H-volumen de frecuencia de radio (RF) resonador (Bruker BioSpin) con
un receptor de RF de superficie (1,5 cm, en cuadratura bobina de cerebro de ratn, Rapid
Biomedical), que fue precalentado utilizando un controlador de la temperatura del cuerpo (Rapid
Biomedical). Las unidades de resonador, incluyendo el ratn, se colocaron en la cavidad del
imn. La temperatura corporal se mantuvo a 36,5 0.5 C durante las mediciones de resonancia
magntica. Inicialmente, para la seleccin de regin de inters (ROI;
Substancia nigra), una resonancia magntica de alta resolucin giro - se utiliz secuencia de eco.
Despus de la colocacin apropiada de las rodajas en el rea de Substancia nigra
(acerca de - 3,30 mm desde el bregma), tres imgenes de control del cerebro de ratn se obtuvieron
antes de la inyeccin de nitrxido, con los siguientes parmetros: T 1- secuencia de eco de gradiente
incoherente ponderada (disparo rpido de bajo ngulo; FLASH), tiempo de repeticin = 75 ms;
tiempo de eco = 5.135 ms;
Florida ngulo ip = 45 ; fi campo de vista = 1,92 1,92 cm 2; nmero de promedios = 4; tiempo de
exploracin = 19,2 s; matriz = 64 64; grosor de corte = 0,5 mm; Cantidad de rebanadas = 2. Una
solucin de mito-TEMPO (disuelto en 10 mM de fosfato-bu ff solucin salina Ered, pH 7,4) (mM
solucin madre 100) se inyect a travs de la vena de la cola (100 L por 25 g de ratn; 0.4 mol / g
de peso corporal) despus de 1 min desde el inicio de la exploracin. T 1- las imgenes ponderadas
fueron adquiridas continuamente dentro de ~ 20 min, utilizando los parmetros mencionados
anteriormente. Los ratones inyectados con PBS solo sirvieron como controles negativos. Ninguno de
los ratones muri como resultado de la inyeccin iv de TEMPO mito-.
Los datos de resonancia magntica fueron analizados utilizando el software ImageJ (National
Institute of Health, Bethesda, MD). El valor promediado de la fi primeras tres secuencias de control
(registrados antes de la inyeccin) se calcul, y cada secuencia de la curva cintica se normaliz
a este promedio de valor por la divisin, usando el mismo algoritmo que en Zhelev et al. 17
En Ensayo de Capacidad Vitro antioxidante total. Los ratones se sacrificaron, y
se aisl el cerebro y se mantuvieron a - 80 C (sin
fi fijacin). lisados de tejido se obtuvieron por homogeneizacin en PBS fro (01:20, w: v; ~ 50
mg / ml), sonicacin posterior (2 min a 20 kHz, en hielo), y centrifugacin a 2000 gramo/ 10
min (4 DO).
La capacidad antioxidante total (TAC) de muestras de tejido aisladas (lisados de
tejido cerebral) se analiz utilizando el kit de ensayo Capacidad OxiSelect
antioxidante total (Cell Biolabs, Inc.), segn el fabricante ' instrucciones s. El mtodo
se basa en la reduccin de Cu 2+ a Cu + por los antioxidantes endgenos y por los
otros equivalentes de reduccin en la muestra. Cu + interacta con cromforo,
1444
Carta
que se convierte en producto de color con absorbancia mxima a 490 nm. El valor de la
absorbancia es proporcional a la antioxidante total (reduciendo respectivamente)
capacidad de muestra de tejido. Las muestras se analizaron espectrofotomtricamente a
490 nm usando el lector de microplacas En Tecan fi noche F200 PRO ( Tecan Austria
GmbH).
El TAC se determin por la curva de calibracin basada en las normas de cido rico. Los
datos se calcularon de M equivalentes de cido rico (EAU) o M cobre equivalentes
reductores (CRE). Una concentracin de cido rico 1 mM corresponde a 2189 M CRE.
En Vitro ROS / RNS Ensayo. Tejido cerebral homogeneizado / lisados se
prepararon como se describi en el prrafo anterior. Se analiz la cantidad de
ROS / RNS usando OxiSelect In vitro ROS / RNS Assay Kit, Fluorescencia verde
(Cell Biolabs, Inc.), segn el fabricante ' instrucciones s. El mtodo se basa en el
uso de
Florida sonda uorogenic 2 ', 7 '- dichlorodihydro Florida uorescin DiOxyQ (DCFH- DiOxyQ), que
es especfica fi c para ROS / RNS. En el citosol, la sonda es desacetilado a la no Florida 2
fluorescente ', 7 '- dichlorodihydro Florida uorescin (DCFH). DCFH reacciona rpidamente con
ROS y RNS (H 2 O 2, ROO, NO, ONOO- -) con la formacin de la Florida producto fluorescente 2 ', 7
'-
dichlorodihydro Florida uorescena (DCF). La intensidad de DCF Florida fluorescencia ( ex = 480
nm, em = 530 nm) es proporcional a la cantidad de ROS / RNS en el espcimen biolgico.
La cantidad de ROS / RNS se calcul por la curva de calibracin, a partir de
soluciones estndar de DCF en PBS. Las mediciones se realizaron en el lector de
microplacas En Tecan fi noche F200 PRO
(Tecan Austria GmbH).
Mediciones in vitro EPR. Los ratones fueron sacrificados 10 min despus de la inyeccin iv
de derivado de nitrxido. El cerebro se aisl y se mantuvo a - 80 C (sin fi fijacin). El tejido
cerebral se homogeneiz en un volumen de 4 veces de PBS. La concentracin de protena se
midi utilizando el mtodo de Bradford, y cada homogeneizado se diluy a 10 mg de protena /
ml. Un volumen de 100 se aadi L de ferricianuro de potasio (solucin 10 mM STOCK-) a
400 L de homogeneizado de tejido y se incubaron dentro de 15 min, ya que fue descrito por
Hyodo et al. 13 El ferricianuro convierte cuantitativamente la hidroxilamina (producido como
resultado de la reduccin in vivo de radical nitrxido) de nuevo a la forma oxidada. La muestra
(100 L) se coloc en un capilar de vidrio, y de banda X EPR espectros se registraron en un
instrumento de banda X EPR (Bruker) con una cavidad TE-mode. Las mediciones se
realizaron en las siguientes condiciones: frecuencia de microondas = 9,4 GHz; magntico fi intensidad
de campo = 336 mT; potencia de microondas = 2,0 mW; fi frecuencia de modulacin de campo
= 100 kHz; fi modulacin de campo amplitud = 0.063 mT; tiempo constantes =
0,01 s; anchura de barrido = 10 mT; tiempo de exploracin (tiempo de barrido) = 1 min. 17 Los
espectros EPR se registraron antes y despus de la adicin de ferricianuro. La concentracin de
derivado de nitrxido y su estado redox en el tejido se determinaron por la curva de calibracin.
Anlisis estadstico. Los datos se analizaron estadsticamente por ANOVA usando
Student ' s t prueba.
INFORMACIN DEL AUTOR
Autor correspondiente
* Tel .: + 81-43-206-3274. Fax: + 81-43-206-9470. E-mail:
bakalova@nirs.go.jp.
Contribuciones de autor
ZZ y RB formularse el paradigma experimental y diseados todos los
experimentos. RB realiz todos los experimentos. DL realiza una parte de los
experimentos in vitro. ZZ y IA realiz el anlisis de los datos. Todos los autores
tuvieron la oportunidad de discutir los resultados, han participado en la escritura,
e hicieron comentarios sobre el manuscrito.
Fondos
El estudio fue parcialmente apoyado por una subvencin-en-Ayudas (Kakenhi) del
Ministerio de Educacin, Ciencia y Tecnologa de Japn.
notas
Los autores declaran no competir fi inters financiero.
dx.doi.org/10.1021/cn400159h | ACS Chem. Neurosci. 2013, 4, 1439 - 1445
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