Ao de la consolidacin del Mar de Grau

15-04-
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ALUMNAS:
Bustinza Damiano, Roco
Gonzales Rosales, Brisayda
Huiza Acosta, Karen Briguit
Lzaro Mendoza, Carmen Janeth
Rocha Yupanqui, Ruth Milagros

DOCENTE:
Alexandra Muoz

MATERIA:
Microbiologa Ambiental

CICLO:
IV

LIMA, 2016

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 I. OBJETIVOS

El objetivo principal del presente informe es aprender a evaluar la calidad de

agua de la laguna 2 de villa 2. Los objetivos especficos con los siguientes:

1. Identificar Vibrio, Salmonella, Coccus presentes en el agua de la laguna

2 de villa 2.

2. Aprender a realizar la tcnica de prueba presuntiva y confirmativa para

Escherichia coli.

3. Interpretar los resultados obtenidos a partir de la comparacin con la tabla

del ECA.

II. MATERIALES

Audio y video 2 agares EMB

Incubadora Pipetas de 1ml,

Microscopio 9 tubos con caldo de lauril

sulfato de sodio
Cristal violeta
4 tubos con caldo de EC
Lugol
4 tubos con verde bilis
Alcohol acetona

Safranina

Pizetas con agua

Varilla metlica

Mechero

Portaobjetos y cubreobjetos

1 agar de TCBC, SS, AMS

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 III. METODOLOGIA

1. OBSERVACIN EN EL
MICROSCOPIO

Frotis fresco Coloracin Gram

Primero retiramos, con la varilla Primero colocamos una asada de la muestra

metlica, una gota de la muestra de sobre el portaobjeto y fijamos al fuego.
agua de la laguna II de villa 1 de la
Universidad Cientfica del Sur.

Segundo, colocamos la gota en el Luego pusimos una gota de cristal violeta

portaobjeto y la cubrimos con el y esperamos un minuto
cubreobjeto.

Observamos en el microscopio, a Enjuagamos suavemente, luego colocamos

10 x y luego a 40x. una gota de lugol. Esperamos 1 minuto.

Enjuagamos nuevamente, despus pusimos 1

gota de alcohol acetona y esperamos 30
segundos

Otra vez enjuagamos y colocamos una

gota de safranina por un minuto y luego
enjuagamos con agua destilada

Otra vez enjuagamos y colocamos una

gota de safranina por un minuto,
posteriormente enjuagamos con agua
destilada y dejamos secar.

Finalmente observamos en el microscopio a 10x,

40x. 100x y 1000x.

3
 2. SIEMBRA POR ESTRAS

Esterilizamos el asa metlica con el mechero

bunsen, luego acercamos la placa Petri con el agar
respectivo especfico para cada bacteria, y
sembramos en forma de estras por los costados de
esta.

TCBC SS AMS

(Agar tiosulfato citrato bilis Salmonella Shigella Agar

sacarosa) es un medio BD Manitol Salt Agar se
(agar SS) es un medio de
selectivo de diferenciacin utiliza para el aislamiento
cultivo utilizado para el
para el aislamiento y cultivo selectivo de estafilococos y
aislamiento de Salmonella
de Vibrio cholerae y otras para la deteccin de
spp. Y de algunas especies
especies Vibrio. Staphylococcus aureus a
de Shigella spp. a partir de
partir de muestras clnicas.
heces, alimentos y otros
materiales en los cuales se
sospeche su presencia.

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 3. INOCULAR POR REPETICIN

De la muestra que fue recolectada en la laguna II de

villa 1, sacamos un mililitro con la pipeta y
posteriormente la introducimos en el T1 que
contena caldo lauril sulfato de sodio,
posteriormente se hizo lo mismo con los siguientes
tubos realizando disoluciones seriadas.

Incubamos a 37C
24-48 horas

4. INOCULAR EN Aquellos tubos que presente la

Escherichia Coli burbuja de Durham y se
observe turbidez, son los
positivos

Con el asa metlica

inocularemos una gota de los
tubos (+) en el caldo EC, medio
utilizado para la
determinacin de la presencia
de escherichia coli en agua,
alimentos y otros materiales.

Con el asa metlica

inocularemos una gota de los
tubos (+) en el caldo verde bilis
brillante para la determinacin
de nmero ms probable de
coliformes totales.

5
 5. SIEMBRA EN EMB

Sembramos con una asa metlica previamente

esterilizada una gota de la muestra de agua de la
laguna II de villa 1 sobre el EMB, el cual es un medio
utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram
negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias
nutricionales. Permite el desarrollo de todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae

6. MEDICIN DEL pH

Medimos el pH de la muestra de agua de la laguna 2 de

villa 1 con ayuda del papel tornasol.

6
 IV. RESULTADOS

Microscopia antes de realizar prueba presuntiva y confirmativa

Fig. 1: Probable Fig. 2: Tipo de algn

macroalga Chladophora
laetevirens
Esta fotografa nos muestra a una
posible macroalga por el tamao y
por el color medio marrn. Es una
probable macroalga Chladophora
laetevirens.
animlculo
En la fotografa pareciera un
ciliado, pero no lo es porque es
muy grande, tampoco es un
protozoo ni mucho menos una
alga, lo que nos surge la idea
que se algn animlculo.

Fig. 3: Probable
Euglenophyta Fig. 4: Semejante a
euglenophyceae esporas de hongos

La fotografa nos muestra a un

microorganismo de color oscuro y Esta imagen nos muestra
mvil porque presenta a un lado el pequeos crculos de color
flagelo lo que le da la capacidad morado por la tinturacin lo
motora. Es una posible que hace probable que sean
Euglenophyta euglenophyceae. esporas de hongos.

7
 Fig. 5: Probable
Chlorophyta
zygophyceae
En la fotografa podemos observar
la divisin de dos clulas de
manera simtrica. Lo que hace
probable que se pareciera una
Chlorophyta zygophyceae.
Fig. 6: Probable helminto
La imagen nos muestra varios
gusanos, pero uno es ms notorio,
que es largo y presenta una color
oscuro lo que hace probable que
sea un helminto, ya que estos hay
en abundancia.

Fig. 7: Semejante a
Fig. 8: Semejante a
Chlorophyta
Cyanobacteria
chlamydomonas
phormidium
La fotografa nos muestra algn tipo
de microorganismo ms parecido a La imagen nos muestra una
un alga con flagelo de color posible Cyanobacteria
transparente. Lo que hace muy phormidium, por la caracterstica
probable que se una alga alargada y que en ciertos casos
Chlorophyta chlamydomonas. toma tonalidad amarillenta.

8
Asimismo, la medicin del pH resulto 8, siendo este un valor mayor a 7 me indica
que la muestra de agua presenta alcalinidad como una de las caractersticas del
medio en que viven estos microorganismos.

A continuacin, se presenta un cuadro general de los resultados obtenidos por

la prueba presuntiva y confirmativa.

Cuadro 1: Prueba Presuntiva y Confirmativa

N TUBOS PRUEBA PRESUNTIVA PRUEBA CONFIRMATIVA

TUBOS (24 horas a 37.5 C) (48 horas a 44.5 C)
1 1 T1 Probable Positivo Positivo
2 1T2 Probable Positivo Positivo
3 1T3 Probable Positivo Negativo
4 2T1 Negativo Negativo
5 2T2 Negativo Negativo
6 2T3 Negativo Negativo
7 3T1 Negativo Negativo
8 3T2 Probable Positivo Negativo
9 3T3 Negativo Negativo

Fig1: Resultados de la Fig. 2: Resultados de la

prueba presuntiva. prueba confirmativa.

9
 1. Prueba presuntiva

Para calcular la densidad microbiana en la prueba presuntiva, nos basaremos en

la tcnica del nmero ms probable, lo que nos podr ayudar a estimar la
poblacin de bacterias coliformes totales en nuestra muestra de agua. Para ello
contaremos la cantidad de tubos positivos obtenidos en la tabla anterior.

TUBOS PUEBA PRESUNTIVA

(24 horas a 37.5 C)
1T1 Probable Positivo
1T2 Probable Positivo 3 tubos (+)= 3
1T3 Probable Positivo
2T1 Negativo
2T2 Negativo Se lee: 3-0-1 es la
0 tubos (+)= 0
combinacin de
2T3 Negativo tubos positivos.
3T1 Negativo
3T2 Probable Positivo 1 tubos (+)= 1
3T3 Negativo

Por lo tanto, los resultados de la combinacin de los tubos positivos en la prueba

presuntiva fueron: 3-0-1, lo que ahora pasaremos a verificar en la tabla de
nmero ms probable para combinaciones de 3 tubos (ver anexos: tabla 1)

En la ubicacin de 3-0-1 en la tabla obtenemos 39 NMP, lo que aplicaremos la

siguiente frmula para determinar la poblacin microbiana de NMP/ml.

10

Reemplazando:

3910
0.1
= 3900 NMP/ml

10
Segn la prueba presuntiva, en nuestra muestra de agua tomada de la laguna II
de la universidad Cientfica del Sur, encontramos 3900 NMP/ml. Por lo
consiguiente, compararemos con la tabla de ECA agua (ver anexo: tabla 2)
propuesta en el 2005 por el exministro del ambiente, Antonio Brack Egg, donde
nos indica segn la categora 4 para lagos y lagunas (con respecto a coliformes
termotolerantes debe tomar valores de menor o igual a 1000). A partir de ello,
deducimos que nuestro valor no se encuentra dentro del rango establecido.

2. Prueba confirmativa

Del mismo que la prueba presuntiva, tambin emplearemos la tcnica del NMP
para determinar la densidad microbiana de la prueba confirmativa y definitiva
estimando la poblacin de bacteria coliformes termotolerantes presentes.

TUBOS PRUEBA CONFIRMATIVA

(48 horas a 44.5 C)
1 T1 Positivo
1T2 Positivo 2 tubos (+)= 2
1T3 Negativo
2T1 Negativo
Se lee: 2-0-0 es la
2T2 Negativo 0 tubos (+)= 0 combinacin de
2T3 Negativo tubos positivos.

3T1 Negativo
3T2 Negativo 0 tubos (+)= 0
3T3 Negativo

Por lo tanto confirmamos que la combinacin de tubos es: 2-0-0

Se contina a la verificacin en la tabla de nmero ms probable por 3 tubos (ver

anexos: tabla 1), y obtenemos 9 NMP, lo que nos indica el dato real gracias a la
prueba confirmativa.

Para estimar la poblacin de coliformes termotolerantes de NMP/ml, aplicamos:

10

11
Reemplazando:

910
= 900 NMP/ml
0.1

Segn nuestra prueba confirmativa, en nuestra muestra de agua tomada de la

laguna II de la universidad Cientfica del Sur, encontramos 900 NMP/ml. Del
mismo modo que la prueba presuntiva procederemos a la comparacin de
valores, ya que debe estar dentro del rango establecido por el ECA agua para la
categora 4 de lagos y lagunas (con respecto a coliformes termotolerantes debe
tomar valores de menor o igual a 1000). Con ello, deducimos que nuestro valor
determinado se encuentra dentro de los valores establecidos por el ECA.

Agares:

Fig. 4: EMB (Eosina-azul de Fig. 2: AMS (agar manitol sulfato:

metileno: medio de cultivo para el medio de cultivo para el aislamiento
aislamiento de escherichia coli) de cocos)

El AMS es un medio selectivo de color

El EMB es un medio especfico de
rojizo que al realizar el sembrado del
color marrn, que al realizar el
Vibrio en el AMS y ser verificado luego de
sembrado de escherichia coli y ser
las 24 horas se observaron el crecimiento
revisadas luego de las 24 horas se
de colonias de color amarillo, lo que
observ la coloracin verde metlica
demostr la posible presencia de cocos lo
indicando positivo para la presencia
cual fue confirmado al siguiente da. Es
de este microorganismo en la
decir, tambin hay presencia de cocos en
muestra de agua.
la muestra de agua.

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 Fig. 1: TCBs (agar tiosulfato citrato
Fig. 3: SS (agar salmonella
bilis sacarosa: medio de cultivo para
shigella: medio de cultivo para el
el aislamiento de Vibrio cholerae)
aislamiento de la salmonella)
El TCBs es un medio selectivo de color
verde, el cual al realizar el sembrado del El SS es un medio selectivo de color
Vibrio y ser revisadas luego de las 24 rosado, el cual al realizar el sembrado
horas se obtuvieron colonias de color de la salmonella y ser verificado luego
amarillo demostrando resultados de las 24 horas se obtuvieron
positivos; es decir que en la muestra del resultados de colonias amarillas.
agua si hay presencia de este
microorganismo.

Microscopia despus de realizar prueba presuntiva y confirmativa

Fig.1: Vibrio Cholerae

En la imagen podemos observar

vibrios gram positivos la cual lo
identificamos por el color violeta
azulado, adems estos son muy
pequeos y redondos y algunos
un poco alargados.

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 Fig.2: Cocos

En la imagen podemos observar

cocos de color violeta o azul lo
que indica que son gram
positivos, y obviamente que estos
son redondos y son pequeos.

Fig.3: Salmonella

En la imagen se puede observar a

la salmonella de color azulado o
violeta, ello indica que son gram
positivos, tienen la forma redonda.

Fig.4: Escherichia coli

En la imagen podemos distinguir

la coloracin que rosada, ello nos
ayuda a identificar que
pertenecen al grupo de las gram
negativas, tienen la forma de
alargada de los bacilos.

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 V. DISCUSIN

Microscopia antes de realizar prueba presuntiva y confirmativa

Recordando que la muestra de agua fue de la laguna II de villa 1, como podemos

ver el resultado, pudimos observar en el microscopio diversos microorganismos
que se reconocieron y otros que posiblemente sean (Algas, animlculos,
hongos, cianobacterias, helmintos). La presencia de microrganismos se
debe a que, en esta laguna est en constante eutrofizacin; por el riego de
plantas en su contorno con aguas tratadas y que estos puedan llegar a la laguna
por infiltracin; el cual ayuda a incrementar los nutrientes para los
microrganismos hetertrofos (los helmintos, hongo, bacterias), por otro lado las
presencia de algas se debe a la llegada de los rayos solares a mencionada
laguna, puesto que ellas realizan fotosntesis.

El movimiento lento de las aguas, el pH (8) que encuentra no muy lejos del
ptimo para el crecimiento de microorganismo tambin sera otro factor de
crecimiento y la interaccin de estos microorganismos.

Prueba Presuntiva y Confirmativa

Segn la prueba presuntiva realizada en el laboratorio, despus de inocular en

9 tubos de caldo Lauril Sulfato de Sodio cada uno con 10 ml del mismo, luego de
24 horas de incubacin a 37C de los cuales resultaron posibles positivos los
tubos (1T1,1T2,1T3 Y 3T2),en los 3 primeros no hay mucho que decir porque
se podra decir que esto se esperaba ya que se realiz una siembra por
disoluciones seriadas ,y como sabemos la concentracin de microorganismos en
los primeros tubos ser mayor con respecto a los ltimos ,sin embargo se
evidenci un resultado muy raro entre todos estos, se trata del tubo 3T3 sali
positivo ,en el que suponamos que saldra negativo, este caso posiblemente
haya ocurrido por la contaminacin del aza de siembra ,o que se haya pipeteado
un menor volumen de caldo respecto a los otros tubos. De los organismos
crecidos, estaramos hablando de coliformes fecales, puesto que se sembraron
en un medio recomendado para la deteccin de estos.

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Tras comparar los resultados con la tabla de combinacin de tubos positivos del
ECA y realizar los clculos correspondientes se hall 3900 NMP/ml, este
resultado sobrepasa los parmetros establecidos por el ECA, para la categora
4 de lagunas y lagos) para el caso de microorganismos termotolerantes, todava
no podemos definir que se trate de una laguna contaminada o que sobrepase los
parmetros ya que an nos falta verificar los resultados de la prueba
confirmatoria.

Prueba confirmativa

De los 4 posibles positivos se inoculo de cada uno de ellos en un tubo que

contena Verde bilis Brillante y otro tubo con caldo escherichia coli que contena
se incubo por 48 horas a 44,5C. Coincidentemente salieron positivos para caldo
verde bilis y escherichia coli el inocul que parti a partir de los tubos 1T1 y 1T2
Como podemos observar la tabla 1 y Fig. 2 parte dela prueba confirmativa, esto
evidenciara la existencia de coliformes fecales y escherichia coli
respectivamente en la laguna II de Villa 1 de la universidad Cientfica Del Sur.
Una vez realizadas la verificacin en la tabla de positivos segn el ECA y el
clculo se hall 900 NMP/ml de microorganismo termo tolerantes, este resultado
se encuentra dentro del parmetro establecido por el ECA, ya que el mximo de
microrganismo segn el ECA es de 1000 NMP/ml para la categora 4 de lagos
y lagunas, entonces estamos la laguna II de Villa 1 no est contaminada .Si
realizramos otros anlisis y pruebas respecto a otros parmetros indicadores
biticos o abiticos recin se tendra un resultado similar o talvez lo contrario
respecto en que condicin se encuentra actualmente este cuerpo de agua.

Microscopia de la prueba confirmativa

Luego de realizar el sembro, lo llevamos a incubar a 37C por 24 horas, con

agares especficos, nos resultaron todos positivos evidenciando as el
crecimiento de Vibrio Cholerae (TCBs), salmonella (SS), bacteria cocos (AMS)
Y Escherichia coli (EMB).

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VI. RECOMENDACIONES

1. Se recomienda usar una muestra de agua contaminada, ya que si usamos

una muestra de agua sin contaminar no nos servir para realizar el ECA.
2. Se debe pipetear la muestra con diferentes pipetas para cada tubo para
poder contabilizar los microorganismos de manera eficiente en las
siguientes pruebas.
3. Para la observacin de los resultados en la prueba presuntiva se debe
tener en cuenta los siguientes criterios: el gas formado en la campana de
durham y el nivel de turbidez en los tubos.
4. En el caso del sembro de la muestra en agar, se recomienda sembrar
cerca al mechero bunsen para no contaminar la muestra con otros
microorganismos del ambiente.
5. Despus de usar la varilla metlica para la siembra en el agar, esta debe
ser esterilizada en el mechero bunsen hasta que alcance un color rojo
vivo.
6. Para la observacin de los resultados de la prueba confirmativa del medio
para Escherichia coli se recomienda hacer un sembro en agar para
comprobar si hay o no presencia de E. coli.
7. Rotular los tubos de manera ordenada para no tener inconvenientes al
momento de buscar los resultados del nmero ms probable en la tabla.

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 VII. ANEXOS

Tabla 1: Combinacin de tubos positivos

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Tabla 2: Categora 4 del ECA.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

(2014). Determinacin de coliformes totales por la tcnica de tubos mltiples.

Recuperado de: http://www.bvsde.paho.org/bvsacd/scan/013761/013761-
02.pdf
(2015). Mtodo para la determinacin de bacterias coliformes, coliformes fecales
y Escherichia coli por la tcnica de diluciones en tubo mltiple. Recuperado
de:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Analisis_Agua_NMP_22309.p
df
Burgos R. Mara (2013). Atlas de microorganismos planctnicos en el humedal
de Andaluca. Recuperado de:
http://www.juntadeandalucia.es/medioambiente/portal_web/rediam/conteni
dos_ordenacion/PDF/Atlas_Org_Planctonicos_1.pdf
Ministerio del Ambiente. (2016). Decreto Supremo-N-015-2015-MINAM.
Estndares de Calidad Ambiental para Agua. Recuperado de:
http://www.minam.gob.pe/wp-content/uploads/2015/12/Decreto-Supremo-
N%C2%B0-015-2015-MINAM.pdf
OMS (2003a). Informe sobre la salud en el Mundo 2013: Forjemos el futuro.
Ginebra, Organizacin Mundial de la Salud. Recuperado de:
http://www.who.int/topics/escherichia_coli_infections/es/

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