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INTRODUCCIN A LA HISTOQUMICA
Gamaliel Ordenes
03 de Septiembre de 2002
La Histoqumica estudia la composicin qumica y la actividad metablica en clulas y tejidos

en los que ha sido preservada su organizacin estructural, mediante reacciones qumicamente
demostrables y justificables.
Para que la reaccin qumica tenga validez se requiere:
Que la sustancia investigada conserve su localizacin: esto se puede lograr con una adecuada
fijacin.
La reaccin qumica debe ser especfica: debe haber mecanismos comprobables, reconocidos
por los cuales se demuestre que es eso y no otra cosa lo que se est identificando.
Debe ser suficientemente sensible para la deteccin: muchas veces el tejido est incluido en
parafina, lo que junto a la fijacin, deshidratacin y aclaramiento produce la extraccin en parte de las
sustancias a identificar, e incluso en estos casos la reaccin debe ser capaz de detectar las sustancias,
debe tener tal sensibilidad y no obtener falsos negativos.
Se debe conservar de la mejor forma la estructura. Para algunas tcnicas se puede conservar
la estructura bastante parecida a lo que estamos acostumbrados, pero para otras tcnicas es necesario
realizar cortes por congelacin, en los que la estructura est medianamente conservada; en otras
ocasiones la reaccin qumica es agresiva y suele destruir ciertas estructuras, pero de igual manera se
debe tratar de conservar las estructuras tisulares morfolgicamente lo mejor posible, si no, no estamos
haciendo histoqumica.
Establecidos estos preceptos obligatorios para el cumplimiento de los objetivos de la
Histoqumica, podemos sealar que esta rea cuenta con diferentes especialidades, las cuales son:
Enzimohistoqumica: trata de determinar la presencia y funcionalidad de enzimas dentro del

tejido. Para esto se necesita conservar la morfologa del tejido y la funcionalidad de la enzima. Algunas
enzimas, al pasar por el procesamiento histolgico, conservan su funcionalidad, su sitio activo, en
cambio hay otras enzimas que no pueden ser fijadas.
Neurohistoqumica: est dentro de la enzimohistoqumica. Comprende el estudio de enzimas

en el sistema nervioso y tambin incluye el estudio de marcadores neuroqumicos.
Histoqumica cuantitativa: no todas las reacciones histoqumicas son cuantificables, por

ejemplo, una reaccin enzimtica va a depender de cuanto tiempo se deje la enzima con el sustrato para
que se de un producto coloreado, si se deja ms tiempo va a haber ms color, lo que complica comparar
dos tejidos cuantitativamente, pero hay reacciones que son cuantificables, porque reaccionan con el
tejido en forma estequiomtrica, es decir, se produce tanto color como sustancia hay y eso es
cuantificable a travs de instrumentos.
Ultrahistoqumica: se refiere a la histoqumica aplicada a la M.E.
Inmunohistoqumica: es el estudio de componentes cito-histolgicos mediante reacciones

antgeno-anticuerpo especficas.
Biologa molecular in situ: se refiere a los estudios moleculares del DNA aplicados in situ.
Enzimohistoqumica
La histoqumica enzimtica se basa en la deteccin de la reactividad de enzimas en tejidos con

morfologa conservada. Lo bsico para detectar una enzima, est en el hecho que:
E + S [ ES ] E + P
donde E: Enzima; S: Sustrato; [ ES ]: Complejo Enzima-Sustrato; P: Producto. En enzimohistoqumica

interesa que cuando:
[ ES ] E + P
P + C Producto coloreado
Es decir, que el producto sea reactivo con algo que ponemos en el medio para que haya color,
que sea reactivo con un cromgeno, sustancia que permite que se observe color.
Se va a trabajar con un corte de tejido en el que est presente la enzima. El corte se pone en una
mezcla incubadora que contiene el sustrato, cromgeno, buffer adecuado, concentracin salina
adecuada y los cofactores que necesita la enzima. Esta mezcla se pone a una temperatura adecuada.
Histoqumica Cuantitativa
En Hq. cuantitativa se trabaja fundamentalmente con DNA. Es posible determinar las

cantidades relativas de DNA en clulas y en poblaciones celulares, comparar entre poblaciones
celulares la cantidad de DNA, determinar si en una poblacin hay clulas con su cantidad de DNA
equivalente a Go, equivalente a G2 o a la fase S. Para esto se utilizan reacciones especficas para DNA
que sean estequiomtricas, es decir, reacciones que dan tanta cantidad de color como DNA presente en
el tejido. Luego las placas se leen en un equipo computarizado para realizar la cuantificacin:
microdensitmetro, citofluormetro o citodensitmetro. Se puede cuantificar reacciones fluorescentes y
no fluorescentes, obteniendo finalmente grficas que indican la cantidad de clulas en cada etapa del
ciclo.
DNA + Colorante estequiomtrico DNA coloreado proporcionalmente
Biologa molecular in situ
Dentro de la biologa molecular est la hibridacin in situ, que permite detectar genes,
segmentos gnicos o secuencias de genes dentro del ncleo en clulas o tejidos. Cmo determinar si
dentro de un tipo de clulas est presente la secuencia gnica de un virus como el HPV, para esto se
usan kits que permiten determinar incluso la cepa de virus que est infectando las clulas. Esto se logra
a travs de la complementariedad de bases que permite unir una sonda marcada a la secuencia de DNA
complementaria (DNA viral), identificando positivamente el segmento gnico que se estaba buscando.
CTGACTAGCTGAA

CTGACTAGCTGAA
AGTCAAGGCTGACTGATCGACTTTCCAG
Existen tcnicas de biologa molecular que permiten identificar apoptosis. Una de las etapas de
la apoptosis es la fragmentacin del DNA en segmentos (180-50 Dalton), lo que se puede identificar
con reacciones de biologa molecular, para ello se utiliza una enzima la TDT (terminal deoxi
nucleotidil transferasa), que donde encuentra un extremo 3' comienza a polimerizar. Se pone el tejido
en una mezcla incubadora que contiene todo los elementos, los nuclotidos trifosfatados y los
nuclotidos marcados. La enzima produce un alargamiento en el extremo 3' , sintetiza DNA dejndolo
marcado y despus se detecta esa marca con anticuerpos, la mayora de las veces, y con eso se
determina si hay o no fragmentacin de DNA.
Inmunohistoqumica
La inmunohistoqumica bsicamente se fundamenta en que hay Ag, sustancias que se pueden

tratar como Ag, para las cuales se pueden construir Ac. Por ejemplo, una citoqueratina del
citoesqueleto, se puede tomar esa citoqueratina e inyectarla en una animal apropiado de
experimentacin y hacer que ese animal produzca Ac, tomamos los Ac y los ponemos en contacto con
el tejido en la mezcla de incubacin en las condiciones adecuadas y despus se utiliza un sistema de
deteccin de la unin Ag - Ac. Se pueden producir los Ac, pero hoy existen industrias que los fabrican
de buena calidad.
Aplicaciones de la histoqumica:
E Investigacin biolgica:
- Procesos celulares.
- Composicin estructural.
- Anlisis de DNA: ha permitido la comprensin de la cintica de las poblaciones celulares en
tejidos normales y patolgicos.
E Clnica:
- Diagnstico histopatolgico de tumores.
- Diagnstico histopatolgico de enfermedades no tumorales.
Hay una serie de enfermedades metablicas que son diagnosticadas con histoqumica
enzimtica, detectando la presencia o ausencia de una enzima determinada.
IDENTIFICACIN DE CIDOS NUCLICOS
Introduccin
El estudio de los cidos nucleicos en el diagnstico patolgico, conlleva una serie de

dificultades debido al histoprocesamiento de rutina que se realiza en los laboratorios de histopatolga,
dado principalmente por la heterogeneidad inherente de las distintas clulas que componen los
diferentes tejidos, lo que afecta significativamente los resultados de una tcnica determinada, sin
embargo hoy en da gracias a numerosos estudios realizados sobre este tema, se ha logrado estandarizar
e identificar las condiciones mas apropiadas de cmo realizar cada una de las tcnicas que se
describirn mas adelante, para el estudio de AN en el diagnstico de un sin nmero de patologas,
principalmente tumoral.
Hoy en da las tcnicas de DNA microarrays, microarrays en tejido y muchas otras, han tenido un gran
xito en proveer informacin sobre los genes y protenas involucradas en un sin nmero de patologas.
Son varios los genes y sus productos los que han sido identificados en variados tipos de cncer
humano, por screening en material archivado mediante el uso de estas tcnicas de estudio del DNA.
Actualmente el diagnstico molecular es cada vez mas cotizado, hoy se requiere que el diagnstico
molecular sea cada vez mas concluyente, pero para que se logre esto es necesario estandarizar y poder
evaluar la calidad del material y la forma en que se procesan estas muestras para darles validez a todos
los mtodos que comentaremos en esta unidad.
(FIG2) Los AN son macromolculas de alto grado de polimerizacin, formadas
estructuralmente por una unidad repetida que corresponde al nucletido. Pero a su vez el nucletido es
una molcula compuesta por tres unidades. (FIG3) Una pentosa, ya sea ribosa o desoxiribosa, un
fosfato, y una base nitrogenada, ya sea prica o pirimdica que corresponden a los componentes
aromticos heterocclicos. Segn los conocimientos actuales, el DNA est presente nicamente dentro
del ncleo, donde se localizan los cromosomas, en cambio el RNA puede ser demostrado en el
citoplasma, nucleolo, y cromosomas. En el citoplasma el RNA est asociado principalmente con el RE,
y por lo tanto con los ribosomas
(Fig4)Estos cidos Nucleicos estn formados, por largas cadenas de nucletidos enlazados
entre si por el grupo fosfato. Y Cada nucletido entre s est unido por enlace fosfodiester. (FIG5) La
molcula de DNA esta formada por dos cadenas de nucletidos adoptando una configuracin helicoidal
como fue descubierta por Watson y Crick en 1953. Estas cadenas de nucletidos estn unidas por
enlaces dbiles como puentes de hidrgeno e interacciones hidrofbicas entre las bases
complementarias. El esqueleto de la hlice de DNA consiste en subunidades alternadas de fosfato y
desoxiribosas, la cul queda hacia fuera del espiral. Las bases, que son hidrofbicas quedan hacia el
interior de la hlice
El RNA es un filamento de una sola cadena, no forma doble hlice. Se encuentra ubicado
principalmente en los ribosomas y en el o los nuclolos. La presencia de un oxgeno en la posicin 2'
de la ribosa impide que se forme la doble cadena de la manera en que se forma en el ADN. El filamento
de ARN se puede enrollar sobre s mismo mediante la formacin de pares de bases en algunas
secciones de la molcula. (HOME)
Obtencin de una muestra de tejido para estudio molecular de cidos nuclicos:

Es importante tener en cuenta que desde el momento es que se obtiene una muestra, comienzan a
ocurrir cambios en sus constituyentes celulares, e incluso durante el procesamiento de rutina mismo de
la muestra. Por tal motivo dependiendo de la naturaleza de la muestra, son cuatro los posibles tipos de
muestras que se podran obtener para estudios moleculares.
1.- Tejido removido desde el paciente por ciruga o biopsia.
2.- Muestras citolgicas obtenidas por puncin o aspiracin.
3.- Sangre, plasma o productos del suero.
4.- Autopsia. (gran degradacin del mRNA)
Durante el procesamiento de la muestra existen tres alternativas que pueden realizarse para preservar de
la mejor forma el tejido.
1.- Congelar el tejido.
2.- Mantenerlo fresco.
3.- o estabilizarlo en un fijador.
Hoy en da los estudios moleculares que se pueden llevar a cabo en tejidos, requieren de una
preservacin ptima de las protena y cidos nucleicos. Son varios los factores prefijacin, intrafijacin
y postfijacin los que influenciaran el estado de estas molculas. En general en el tejido comienzan a
ocurrir alteraciones luego de 10 minutos de extrado en tejido es decir luego de 10 minutos en estado de
anoxia. Por lo tanto este itempo debe ser mnimo.
Fijadores.
Los mecanismos por los cuales los fijadores pueden actuar, han permitido clasificarlos en:
1.-Deshidratantes
2.- Efecto a travs del calor
3.- Crosslinkers
4.- efecto cido
5.- Combinacin de estos.
Como debemos recordar, aquellos fijadores que actan combinndose con las protenas son llamados
aditivos y los que precipitan las protenas son coagulantes.
La formalina: Fijado universal mas ampliamente utilizado, sin embargo numerosos estudios indican
que la extraccin de DNA o mas bien la calidad de DNA extrado desde muestras fijadas en formalina
tamponada para estudios moleculares, dan resultados no del todo exitosos y mas bien variables. No
obstante en la fijacin del tejido con formalina reduce notoriamente la solubilidad del DNA y produce
algn grado de degradacin del DNA. Los estudios existentes acerca de la reaccin entre el
formaldehdo y el DNA, han demostrado que las reacciones bsicas que ocurren son similares a las que
ocurren entre la formalina y las protenas.
Interacciones del formaldehdo con el DNA:
Estudios sobre las interacciones qumicas que ocurren entre el formaldehdo y el DNA han
demostrado, que las reacciones bsicas que ocurren son similares a las que se observan entre el formol
y las protenas. El formaldehdo inicia la denaturacin del DNA en regiones ricas de AT, a travs del
rompimiento de los puentes de hidrogeno que unen las dos cadenas del DNA y despegando las bases.
Son cuatro las reacciones bsicas que ocurren en la interaccin DNA formol:
1.- Lo primero que ocurre es una reaccin de adicin, el formaldehdo es adicionado a una base del
DNA para forma el grupo hidroximetil (CH2OH)(metilol).
2.- Posteriormente ocurre una ataque electroflico lento del N -metilol sobre una amino base para
formar un puente metilnico entre dos grupos aminos.
3.- El tratamiento con formaldehdo puede generar sitios AP (apurnicos o apirimdicos), por hidrlisis
de los enlace n-glicosdicos, dejando residuos libres de purinas o pirimidinas. Estos sitios apurnicos
tienen un ion carboxlico altamente inestable, que se hidroliza rpidamente para producir 2 deoxiribosa.
4.- el formaldehdo puede tambin causar una hidrlisis lenta del enlace fosfodiester, produciendo
cadenas cortas de polideoxiribosas con las pirimidinas intactas.
Cuando se compara el DNA extrado desde tejidos frescos y tejidos fijados en formalina, se
puede observar una gran frecuencia de alteraciones en la secuencia que no son reproducibles. El error
mas frecuentemente encontrado en las molculas de DNA ocurre en que el formol prodcue un
crosslinking con el residuo citosina y posteriormente la Taq pol falla en reconocer la citosina e
incorpora adenina en lugar de guanina, generando una mutacin artificial.
Efecto del formol sobre el RNA:
En general la eficiencia de extraccin del RNa desde tejidos fijados en formalina es muy pobre, debido
principalmente a la falta de lisis del tejido debido al crosslinking que origina el fijador con la molcula
de RNA y tambin debido a la presencia de RNA asa. Se han creado diferentes protocolos para
aumentar esta eficiencia , pero en peral se logra con xito en fragmentos cortos de RNA. Se piensa que
gran parte del RNA es degradado durante la fijacin del tejido.
Al igual que con el DNA , el formaldehdo reacciona con el RNA formando un grupo n metilol y
posteriormente sufre el ataque electroflico para formar los puentes metilnicos. En el caso del RNA el
ataque se produce principalmente sobre el residuo adenina.
Son varios los factores que influyen en la degradacin del DNA por el formol, entre ellos , la
concentracin del fijador, pH, temperatura y.
A medida que se aumenta la concentracin del formol , va aumentar la tasa de denaturacin del DNA.
LA temperatura ambiente tambin favorece la degradacin de la molcula de DNA , por tal motivo es
recomendable realizar la fijacin a 4C. Cerca del 30 % del DNA se pierde durante la fijacin, y
mientras mayor es la T, se obtiene fragmentos mas cortos de DNA.
Otro factor importante es el pH, en condiciones de hipoxia del tejido, se reduce el pH, provocando una
degradacin masiva del DNA en el tejido. Por tal motivo la fijacin a pH cido o en presencia de cido
frmico por ejemplo produce una gran degradacin del DNA. Adems a pH cido se producen mayor
cantidad de mutaciones . Diversos estudios han concluido que lo mas recomendable es realizar la
fijacin en formalina tamponada, incluso a un pH mas bien alcalino cercano 9 10 de pH, ya que a ese
pH se mejora notoriamente por ejemplo la seal en los estudios de ISH.
Efecto de las nucleasas en el tejido:
la DNAasa en el tejido ha sido considerada como uno de los principales factores que favorece la
degradacin del DNA durante la fijacin. Hoy en dia se utilizan en la solucin de fijacin , un
neutralizante de la DNA asa, llamado cidoetilendiaminotetractico.
Otro factor importante de tener en cuenta en la fijacin con formol es su tasa de penetracin, en general
el formol, comparado con otros fijadores tiene una tase de penetracin relativamente rpida, sin
embargo lo recomendable es fijar muestras de 5 mm a 1 cm. Y el volumen del fijador debe exceder por
lo menos unas 20 veces al volumen de la muestra. En general para este tamao de muestras , lo mnimo
es fijar durante una hora, pero lo mas comn es que las muestras se fijen de 24 a 48 horas normalmente.
Aunque el rango es relativamente amplio, y para propsitos generales de morfologa no se observan
mayores variaciones, para el estudio de AN , mientras mayor tiempo este el tejido en contacto con el
fijador , mayor tasa de degradacin del DNA se encontrar. EL protocolo mas recomendado para el
estudio molecular es irradiar la muestra durante 1 a 2 minutos en horno microondas a 60C, ya que
reduce la degradacin enzimtica y potencia la fijacin.
En conclusin los criterios recomendados para el uso del formaldehdo son .
mnimo (menor a 2 horas)
Formalina tamponada Tiempo de prefijacin al 10% a 4 C
Baja concentracin de sales
La duracin de la fijacin de 3 a 6 horas.
cido etilendiaminotetractico
Evitar pH cido, favorecer alacalino.
Fijadores alternativos:
Glutaraldehdo: Funciona del mismo modo que el formol a travs de la formacin de cross linking con
los AN. El gluta reacciona primeramente con el grupo e-amino de los amino cidos de los cidos
nucleicos. Se utiliza en solucin acuosa. Sin embargo su uso limitado debido a la baja coeficiente de
difusin en el tejido, penetra muy lento en el tejido , favoreciendo la denaturacin del DNA. Sin
embargo se ha utilizado el gruta al 1% a pH 7, con excelente resultados, incluso mejores que el formol
al 10 %
Genipina. Un agente formador de cross linking natural, reacciona espontneamente con los amino
cidos dando origen a un pigmento azul oscuro, sin embargo su efecto sobre los An no se conoce y solo
se utiliza porque provoca una resistencia a la colagenasa en el tejido despus de su fijacin.
Solventes orgnicos y fijadores alcohlicos.

Mltiples estudios han indicado que los fijadores que no producen cross linking en el tejido
producen mejores resultados en el estudio de los AN que los fijadores aditivos como el formol. El
etanol y el metanol, preservan mejor los cidos nucleicos porque producen cambios qumicos mnimos
sobre estas molculas. El DNA en etanol al 65% est totalmente colapsado. El etanol y metanol al 100
% son excelentes fijadores del DNA y RNA, producido principalmente por la rpida penetracin en el
tejido de estos fijadores.
Mezcla de Fijadores:
Ya que no existe un nico fijador ideal para los An, se han utilizado mezclas de fijadores, como
por ejemplo el carnoy.
Carnoy: etanol 60%, cloroformo al 30% y cido actico al 10%. Esta mezcla fijador da excelentes
resultados en la fijacin de los cidos nucleicos comparado con la formalina. Solo provoca una leve
degradacin del DNA y da excelentes resultados sobre el RNA, especialmente en el tratamiento
postfijacin con vapores del formaldehdo.
Methacarn: Metanol 60%, cloroformo 30%, cido actico 10%. Excelente fijador del RNA, sus
resultados son comparable con los obtenidos desde muestras frescas. Adems causa precipitacin de
protenas ribosomales, inactivando a RNAsa endgena y a su vez enmascarando al mRNA de la accin
de RNA asa. Mantiene mejor la inmunoreactividad de los fijadores a base de zinc.
Acetona: AMEX, acetona metilbenzoato xilol. Se usa un protocolo de fijacin en acetona a -20C
durante toda la noche y despus aclarar en metilbenzoato y posteriormente es xilol.
HOPE : Hepes glutamic acid buffer-mediated organic solvent protection effect). Consiste en la
incubacin del tejido en una solucin protectora formada por una mezcla de amoniacidos a pH 5.8 a
6.4. posteriormente se incuba en acetona a 0 a 4 C para deshidratacin.
Otros fijadores:
Fijacin de los cidos nucleicos (fig7)
Reaccin de los fijadores sobre los AN: La fijacin de los tejidos conlleva un cambio en el
estado qumico y fsico de los AN. La fijacin de estos ocurre en parte en la fijacin convencional que
se realiza en los tejidos como parte del histoprocesamiento de rutina. O puede ser realizado en forma
ms selectiva o especfica, como por ejemplo para el estudio cuantitativo de medicin citofotomtrica o
para el estudio de RNA en muestras de tejido de diferente naturaleza. Con la fijacin convencional, los
AN son fijados paracialmente e indirectamente, ya que la formalina causa la insolubilidad de las
protenas nucleares que rodean el DNA genmico.
Durante varios aos muchos han sido los fijadores utilizados con el propsito de fijar de forma
mas selectica los AA, pero relativamente pocos son los que se conocen que reaccionan con ellos
qumicamente. EL DNA al estar asociado a protenas se fija razonablemente bien con casi todos los
fijadores, sin embargo se prefieren aquellas mezclas fijadores que contienen cido actico, como por
ejemplo el ALFAC (formol, cido actico, alcohol)
En su estado nativo los AN no reaccionan en ningn grado con el formaldehdo. Sin embargo si
la mezcla de reaccin es calentada a cerca de 45C en el caso del DNA y a 65C en el RNA, comienza
a haber algn grado de reaccin. Los tiempos utilizados para fijar AN en general son cortos desde 6
horas hasta 1 da como mximo en muestras pequeas.
Un fenmeno similar es observado en la interaccin de los AN con glutaraldehdo. La importancia de
estos hallazgos, es que las temperaturas normalmente utilizadas para la fijacin, entre 20-22C, no
ocurre un desenrrollamiento o descompactacin de los AN. Solo a T elevadas, durante la
impregnacin con parafina puede tomar lugar la interaccin entre los AN y restos del fijador. Esta falta
de reaccin permite utilizar el material archivado para anlisis de DNA, sin embargo se pierde cerca
del 30 % de los AN en la fijacin. Y en parte tambin son retenidas por la matriz proteincea que no
deja escapar estas molculas de tamao muy grande.
El etanol y el metanol, generalmente son usados en mezclas fijadoras para la HQ de los AN, por
ejemplo el Carnoy. Las medidas fsico-qumicas, han demostrado que el DNA est totalmente
colapsado en el metanol y el etanol.
En trminos generales los AN son mejor preservados en fijadores alcohlicos o acdicos,

un buen ejemplo es el Carnoys, el cul contiene alcohol y cido actico glacial. Este ltimo no fija
protenas pero coagula o mas bien dicho colapsa los cidos nucleicos, el mecanismo por el cual se
producen estos cambios son aun oscuros, pero al parecer los factores de una penetracin rpida y
produccin de hinchazn estaran involucrados. La formalina tiene slo una reaccin limitada con el
DNA y el RNA, pero para el trabajo de rutina da resultados aceptables. En este caso la fijacin se
realiza a 4C en formalina tamponada, porque previene la degradacin del DNA por nucleasas.
A pesar de que la formalina tamponada produce excelentes resultado en cuanto a la
preservacin de la histologa y una morfologa celular detallada, la principal desventaja, es que produce
un efecto perjudicial sobre la calidad de los AN, lo que dificulta el anlisis de genes y transcriptos en
los tejidos.
En estudios recientes se encontr una leve mejora en la calidad morfolgica de los tejidos
estudiados y fijados con fijadores a base de zinc, adems hubo una produccin significativamente mas
alta de DNA. Y tanto la produccin como la calidad del DNA en tejidos fijados con ZBF fueron
comparables con cortes por congelacin sin fijar, y fue mejor preservada la inmunoreactividad.
En general deben evitarse en el estudio de AN, fijadores que contengan metales pesados o pH muy
bajo.
SO3- pK1, PO4= pK2, COO-= pK2-2,5,
Identificacin de AN:
LA deteccin de cidos nuclicos tradicionalmente y antiguamente se ha realizado mediante
colorantes catinicos, y el DNA ha sido demostrado ms selectivamente mediante la reaccin de
Feulgen. La especificidad de los mtodos histoqumicas para DNA o RNA pueden ser confirmados por
remocin especfica de estas sustancias mediante hidrlisis enzimtica o extraccin qumica.
LA demostracin de AN depende de la reaccin de los colorantes con el grupo fosfato o de la
produccin de aldehdos desde el azcar desoxiribosa. No existen mtodos HQ para demostrar las BN.
Demostracin del DNA:

Es realizada comnmente por la Reaccin de Feulgen, la cual identifica el azcar desoxiribosa,
y por la tcnica de verde metil-pironina, cuando el fosfato se combina con el colorante bsico verde
metilo a un pH cido. El DNA tambin puede ser demostrado por mtodos fluorescentes usando
acridine-orange, aunque la confiabilidad de este mtodo es menor que los previos. EL DNA y el RNA
pueden ser demostrados por el mtodo de cromo alumbre- galocianina. Este mtodo no es capaz de
diferenciar entre uno y otro AN, por lo tanto requiere de una extraccin enzimtica segn el AN que se
requiera identificar. Sin embargo la tcnica ms sensible para identificar DNA es la ISH.
EN la histoqumica tradicional los colorantes ms utilizados para la demostracin de AN han

sido los colorantes bsicos derivados de las tiazina, los ms usados son la tiamina y el azul de metileno,
que son molculas pequeas, bsicas a pH cidos. Ests reacciones no son especficas, porque por
ejemplo el azul de metileno a pH cido tambin se une a los glicosaminoglicanes. A pH 4 por ejemplo
se unir al COO- de protenas
Reaccin de feulgen
Esta reaccin fue propuesta por Feulgen y Rossenbeck hace 75 aos atrs (1924), es una de las
reacciones citohistoqumicas mas ampliamente utilizadas en la biologa y medicina. Permite teir el
DNA in situ, especficamente, basada en la reaccin del reactivo Schiff con los grupos aldehdos
generados en las molculas desoxiribosas por hidrlisis cida (HCl). LA intensidad de la tincin es
proporcional a la concentracin de DNA. Esta reaccin es utilizada principalmente para la
cuantificacin de DNA en el ncleo de las clulas por citometra de flujo para la evaluacin de
diploidia en patologa tumoral. Sin embargo desde el punto de vista morfolgico, la demostracin
especfica del DNA en estructuras celulares a nivel de la microscopa de luz, es muy poco lo que se
utiliza hoy en da.
Los autores de esta tcnica aconsejan una hidrlisis cida para producir un grupo aldehdo libre
en el DNA, que puede ser detectado por una reaccin coloreada para aldehdos. El reactivo de Schiff
fue desarrollado en 1866.
El objetivo fundamental de esta tcnica en las ciencias biolgicas ha sido la ubicacin y

distribucin cuantitativa del DNA en una variedad de clulas normales y anormales. La reaccin de
Feulgen ha ayudado a establecer una seria de principios:
1.- Existe una relacin 1:1 entre el contenido de DNA de un ncleo y su nmero de cromosomas.
2.- El contenido de DNA es el mismo o nmeros enteros mltiples de dos en todos los ncleos
celulares de un organismo dado.
3.- Antes de la mitosos las clulas duplican su contenido de DNA.
La reaccin de Feulgen tambin permiti medir la cantidad de DNA presente en un solo
cromosoma y comparar el contenido de DNA nuclear entre diferentes especies. En el rea biomdica
esta reaccin ha permitido medir la ploida en clulas tumorales, lo que ha permitido utilizarlas como
metodologa diagnstica y prognstica en varias lesiones neoplsicas. La medicin de ploida del DNA
tambin se ha aplicado ha varias patologas no neoplsicas. La aplicacin de esta tcnica en la
microscopa electrnica, provee una herramienta nica para investigar in situ la organizacin
ultraestructural de estructuras que contienen DNA.
Mecanismo de accin:
El primer paso en la reaccin de Feulgen, es la hidrlisis cida:
EN un medio cido las bases puricas son separadas del azcar desoxiribosa, exponiendo un grupo
aldehdo libre y dejando intacto el esqueleto del DNA. Por lo tanto la molcula de DNA se transforma
en un DNA apurnico. Las condiciones hidrolticas ptimas para el procedimiento de la reaccin han
sido extensamente estudiadas, y se ha observado ue esots pasos estn influenciados por los fijadores y
la accesibilidad al DNA. As, la produccin de los grupos aldehdo se puede contrapesar por una
prdida de fragmentos del DNA desde el ncleo, lo que altera la estequiometra de la reaccin.
En el procedimiento original descrito por Feulgen, sugieren un tratamiento de 4 min. con HCl 1
N a 60C. Sin embargo posteriormente establecieron que para la mayora de las aplicaciones las
condiciones hidrolticas ms favorables son producidas con HCl 5N entre 20-25C por 45-60 min. ya
sea en clulas fijadas o no. Esta variante retrasa y minimiza la produccin de pequeos fragmentos de
DNA que podran escapar del ncleo. No obstante tanto la cantidad de grupos aldehdos producidos
como la solubilizacin del DNA estn influenciado por la fijacin y el grado de compactacin de la
cromatina.
En las condiciones originales la mayora del DNA se rompe o es hidrolizado, haciendose

soluble y escapando del tejido. Sin embargo el DNA slo es parcialmente hidrolizad. LA hidrlisis de
Feulgen no rompe el enlace esterentre el cido fosfrico y el azcar en el DNA. No obstante la razn
de porque ocurre esto en el DNA y no en el RNA, no est bien entendido. Una de las teoras explica
que el residuo ribosil de cualquier RNA que no es removido durante la hidrlisis no reacciona con los
CHO. Esto probablemente debido a la presencia de un grupo OH en la posicin 2 de la ribosa. El
porque no se tien otras estructuras que poseen CHO, es porque la hidrlisis cida los destruye, por lo
tanto no se dan falsos positivos. (FIG16) (Qumica de la hidrlisis cida)
EN el Gunter tambin se seala otra hiptesis alternativa de porque no se tien los RNA. Si la
hidrlisi se realiza a tiempos cortos, se provoca en el RNA una perdida de reactividad a los colorantes,
porque se altera la posicin del cido fosfrico. Si embargo a tiempos de hidrlisis ms prolongados
se vuelve a posicionar pero se protona.
Reaccin con el reactivo de Schiff:

Despus del paso hidroltico las clulas son expuestas al reactivo de Schiff. Los sitios celulares
con grupos aldehdos libres en las molculas de DNA apurnica se unen a la pararosanilina incolora
disuelta en el reactivo, adquiriendo un color magenta.
LA pararosanilina (FIG17), es la forma desmetilada de una serie de colorantes triaminotrifenilmetano
agrupadas bajo el nombre de fucsina bsica. (carcingeno). Formacin del Reactivo de Schiff.
Este reactivo es preparado por burbujeo o hervor de SO2, a travs de una solucin al 0,5% de
pararosanilina, hasta saturacin. Posteriormente se agrega metabisulfito de potasio o sodio, agregado
en una cantidad de 5 10 mg/ml, a una solucin de 0,5% de pararosanilina acidficada con HCl, la
cual es comnmente hoy en da usada como fuente de So2. Todas las soluciones son filtradas
finalmente a travs de 2-10 mg/ml de carbn activado por 1 a 2 min. Para decolorar el reactivo, por
remocin de impurezas. La solucin final tendra un pH 1,5 aprox. La pararonalinina es blanqueada o
incolora porque el So2 se une al doble enlace central del cromforo, destruyendo la estructura
quinoide de la molcula y formando un compuesto cido sulfnico, el cul es conocido como
leucofucsina o cido leucosulfnico.
Qumica de la Reaccin:
Los dobles enlaces conjugados, los cuales confieren el color rojo prpura, son rpidamente
restaurado por la reaccin de CHOs con exceso de SO2 en el reactivo, para dar un cido
alquilsulfnico, que reacciona con el grupo amino de la leucofucsina. El SO2 es desplazado y el doble
enlace central es restaurado junto con el color. Una hiptesis alternativa, sugiere que el SO2 tambin
reacciona con el grupo amino del anillo benceno para producir un cido n-leucosulfnico. Este ltimo
reactivo, formara un puente n-sulfnico con los CHO, causando un rearreglo del cido leucosulfnico
dentro del compuesto quinoide coloreado.
.
(FIG20) Especificidad de la Reaccin:
HA sido investigado minuciosamente por una variedad de investigadores, llegando a un amplio
concenso entre los citoqumicos , que bajo las condiciones controladas apropiadamente, la reaccin
de Feulgen es especfica para el DNA y no para grupos CHO extraos formados en el ncleo.
Las evidencias que permiten establecer esto son las siguientes:
Los cromosomas no actan como simples absorbentes de para el reactivo de Schiff.
La reaccin de Feulgen puede ser eficazmente obstaculizada bloqueando los grupo
aldehdos del DNA hidrolizado por diferentes reactivos que se ac0oplan o reconocen CHO.
Despus de una digestin del tejido con deoxiribonucleasa la reaccin de Feulgen no tie el
ncleo o los cromosomas.
Una hidrlisis de 5 min. Con HCl de ncleo aislados sin fijar, no produce solubilizacin del
DNA.
LA digestin prolongada con tripsina de los cromosomas no modifica la positividad de la
reaccin de Feulgen.
(FIG21) Para que la reaccin de Feulgen sea especfica, la fijacin del tejido debe ser
apropiada, por lo tanto es obvio que se deben evitar los fijadores a base de alcohol el
gluraladehdo, el cual despus de la fijacin mantiene su grupo CHO libre, el cual reacciona
con el Schiff. LA forma de fijacin que se ha establecido como la mas apropiada es la
formalina tamponada al 10% para frotis y tejidos, y unamezcla de metanol o etanol, formalina,
y cido actico. Fijadores como el Bouin no son recomendados.
Reactivos que han reemplazado al Schiff:

Se han realizado numerosos estudios para explorar nuevos reactivos que pudieran reemplzar la
pararosanilina en la reaccin de Schiff. El propsito de estos estudios fue esencialmente la necesidad de
encontrar un producto final de reaccin que sea ms fluorescente que la pararosanilina o que despliegue
un color diferente para realizar estudios histolgicos con diferentes, y tambin para estudiar la cintica
de la reaccin.
Todos los que han estudiado contienen al menos un grupo amino reactivo libre con SO2- y
tesyeado positivo para la reaccin de Felugen.
Acriflavina fluorescente
Thiazinas
Tionina
Azul de toluidina
A Pesar DE que estos reactivos son especficos para el DNA apurnico, su mecanismo de
accin y la estructura de los productos de la reaccin no estn bien establecidos
Preparacin del espcimen:

El estudio de ploida del DNA mediante la reaccin de Feulgen, puede ser medido nuclearmente
o en suspensiones celulares sobre porta objetos , en placas de cultivo de fluidos biolgicos, o cortes
histolgicos. La clula nica e intacta, es el blanco menos comn donde se reaiza este tipo de
estudios. Las clulas pueden ser disociadas desde se cultivo celular o desde el tejido fresco con
mtodos que alteran el contacto clula-clula y su adherencia estromal. Por tal motivo pueden
obtenerse preparaciones apropiadas para citometria de imagen desde sangre, u otros fluidos
corporales, tales como orina, liqudos de efusin, o esputo, labado de cavidades, biopsias o piezas
quirrgicas. Por impronta o raspado de la superficie celular, que corresponderan a mtodos
adicionales para disociar celulas nicas desde el tejido. Una vez en suspensin, las clulas pueden
ser llevadas a una monocapa sobre un portaobjetos, mediante citocentrigfugacin o filtros de
polycarbonato. Posteriormente son fijadas.
Las clulas pueden ser disociadas desde tejidos previamente fijados o tejidos fijados e incluidos
en parafina, aunque para tal efecto se requiere de fuerzas ms fuertes e incluso actividad
enzimtica. La sensibilidad de la reaccin es comparable con cualquiera de los mtodos descritos.
Sin embargo es necesario tener en cuenta que el DNA extraido desde tejidos fijados en
formalina e incluiudos en parafina, ha sido encontrado extensamente y degradado en diferentes
grados pequeos fragmentos de DNA. LA cantidad de degradacin puede variar de un organo a
otro. Y a pesar de que la hidrlisis cida ocurre en DNA intacto, denaturado y degradado, estas
observaciones indicaran que el ncleo de diferentes clulas y diferentes preparaciones contienen
DNA de estados diferentes, lo que podria darnos una fragmentacin hidroltica impredecible. Por
tal motivo se a aplicado al estudio de polidia en cortes de tejido, algoritmos matemticos que
corrieran estas variables. Es necesario adems estandarizar otras varalbes que se pueden manejar
con respecto al procedimiento y procesamiento de las muestras en estudio, entre ellas el grosor de
los cortes, la fijacin (tiempo, temperatura y fijador). Por este motivo el principal uso de la
reaccin de Feulgen in cortes de tejido intactos , es usando la thiazina como tincin de contraste.
Aplicaciones hoy en da para la Reaccin de Feulgen:
Hoy en da es muy poco lo que se usa para la demostracin histoqumica del DNA a nivel de
estructuras celulares en la microscopa de luz. Solo se utiliza aplicado para comprobar si
estructuras basofilicas contienen DNA. No obstante la principal aplicacin de esta tcnica ha
sido en la cuantificacin del DNA en ncleos celulares por citometria de imagen para la
evaluacin de ploida, y esto debido a que la reaccin del color es proporcional a la
concentracin de DNA. La intensidad del color final de la reaccin es proporcional al nmero
de grupos aldehdos liberados en la molcula de DNA
El contenido de DNA de ncleos teidos con la reaccin de Felugen , fueron primero cuantificados
por citofotometra. LA cuantificacin in situ del DNA, fue originalmente realizada por por
citofotometria UV sobre ncleos celulares no teidos
Verde de metilo pironina
Este mtodo histoqumico tiene su origen en los mtodos empricos de tincin ms antiguos.
Fue introducida por Pappenheim a fines del siglo ante pasado. Est tcnica bajo condiciones muy
controladas, permite demostrar los DNA y RNA en el mismo corte. Con esta tcnica dos colorantes
catinicos son aplicados simultneamente bajo condiciones cuidadosamente controladas de
concentracin y pH
En trminos generales el DNA se tie con el Verde de metilo, y RNA con la pironina. Tanto el verde
de metilo como la pironina son colorantes bsicos y su combinacin con los AN no puede ser explicada
con un fundamento puramente qumico. Tanto la forma como el tamao de las molculas de colorantes
determinan la selectividad de estos. La prctica ensea que el verde de metilo se une especficamente a
los DNA altamente polimerizados, y que la pironina tiene una especial afinidad a los polmeros ms
bajos de RNA. La tincin selectiva puede por lo tanto ser atribuida a los diferentes grados de
polimerizacin del DNA y RNA. Se ha observado por ejemplo, que si el DNA es depolimerizado en
algn grado por calor, o agentes denaturantes, pierde su capacidad de unirse al verde de metilo, y de
esta forma podra ser teido con pironina. En un medio controlado (pH, fuerza inica, temperatura,
etc.), la unin del colorante es estequiomtrica, y con tcnicas microespectrofotomtricas es posible la
medicin del contenido en DNA de los ncleos. Por lo tanto parece que la disposicin molecular del
DNA (quizs dado por la periodicidad de los grupos electronegativos para la unin del verde metilo) es
de vital importancia para la reaccin tintorial. La reactividad especfica del verde metilo por el DNA es
atribuida al alineamiento espacial de los grupos NH2 del colorante a los radicales fosfatos sobre la
doble hlice del DNA
En el caso del RNA, los mecanismos de captacin de la pironina por los polmeros mas bajos de
RNA no han sido tan estudiados. L apironina tiene una estructura mas planar, por lo tanto podra
intercalarse entre los pares de bases de los AN, pero al DNA no puede entrar porque sus iones son
excluidos por la molcula de verde metilo, pero como la molcula del RNA es mas abierta , admite ms
fcilmente los cationes de la pironina.Por tal motivo se considera que la especificidad de la pironina
por el RNA es menor, y su tincin est influenciada por otros factores como el pH, por lo tanto la
especificidad de la pironina debe ser controlada mediante el uso de la digestin con ribonucleasa en
cortes control.
Est tcnica se ha usado especialmente para la tincin histolgica de sistema nervioso y tejido
linfoide, y se ha utilizado para contrateir con fluorocromos o incluso con procedimientos IHQ.
En el trabajo histoqumico sin embargo siempre es necesario la extraccin enzimtica o cortes
control tratados con enzimas para chequear la especificidad de la tincin de DNA o RNA
Mtodo de Galocianina-alumbre de cromo para DNA y RNA
Este mtodo fue introducido para la demostracin de los granulos de Nissl. Con este mtodo
exclusivamente no pueden diferenciarse los DNA de los RNA, ya que ambos se tien.
Mecanismo: La galocianina (oxacina), es ligeramente cida en solucin acuosa. A altas
temperaturas puede formar tres complejos con el alumbre de cromo: una laca catin, galocianina-Cr-
(H2O), una laca hidrxido, galocianina-Cr-(H2O)OH, y una laca sulfato, galocianina-Cr (H2O)2SO4.
La laca catin es la responsable de la tincin de los cidos nuclicos. Se una a los grupos fosfatados de
los cidos nuclicos, probablemente a travs de enlaces salinos, para formar un complejo azul oscuro.
Estas uniones tienen lugar en un medio cido con un pH entre 0.8 y 4.3. A pH bajo (0.8-1,75), la laca
catin se une solamente a los cidos nuclicos y solo en una mnima cantidad a las protenas. Al
aumentar el pH de la solucin de tincin, aumenta su reaccin con las protenas . Esta tcnica tambin
se ha utilizado para la determinacin citofotomtrica de los cidos nuclicos. Una de las principales
ventajas de esta tcnica es que es progresiva, lo que significa que cuando se ha llegado al punto final de
la reaccin, no ocurrir ningn cambio en la intensidad de tincin. Esta laca formada entre los cidos
nuclicos y la laca catin es estable y resistente al alcohol, xilol, cidos diludos, etc..Sin embargo est
tcnica ha sido bien controversial porque hay algunos autores que sealan que esta tcnica no se puede
considerar como un mtodo HQ.
Extraccin enzimtica de los cidos nuclicos
Digestin con ribonucleasas: Brachet en el ao 40 introdujo este procedimiento en la HQ, como

procedimiento control. Las tinciones debidas a la presencia de RNA se eliminan si los cortes son
tratados con ribonucleasa antes de someterlos a la accin del colorante.
La ribonucleasa es una enzima termoestable que degrada los ribonucletidos en dos etapas. En
la primera realiza una actividad de fosfodiesterasa fraccionando los grupos terminales pirimidn-
nuclesido2:3-fosfato, los cuales en una segunda etapa, ms lenta son hidrolizados al correspondiente
nuclesido 3-fosfato. Estos productos de la hidrlisis son fcilmente difusibles.
En la extraccin enzimtica , se han utilizados enzimas pancreticas como ribonucleasas

(RNasa) y desoxiribonucleasa (DNasa), con el fin de remover selectivamente los dos AN. Tambin se
han utilizado enzimas para remover otro tipo de sustancias como colgeno, mucosustancias, glicgeno,
etc..Sin embargo es necesario tomas una serie de recomendaciones para validar el mtodo.
El sustrato debe estar presente en el tejido en su estado apropiado par ser atacado por la
enzima. Por lo tatno deben evitarse fijadores con cido pcrico, mercurio o cromo,
porque tienen un efecto inhibitorio sobre las enzimas.
La enzima usada debe estar libre de la contaminacin con otras enzimas, por ejemplo las
DNasa debe estar libre de RNasa o las enzimas proteolticas tambin deben estar libre de
RNasa. Sin embargo hoy en da es posible encontrar enzimas de lata pureza
Las condiciones de incubacin deben ser las adecuadas para la completa accin de la
enzima
Puede existir extraccin no especfica, por lo tanto es necesario el uso de cortes
controles tratados solo con el buffer de la ezima.
Se deben incorporar los cofactores imprescindibles para la funcin de la enzima
(neuroaminidasa).
Es posible extraer los AN no enzimticamente, es decir mediante extraccin qumica. Por

ejemplo el TCA 4% en solucin acuosa (cido tricloroactico), remueve el DNA y el RNA- el cido
perclrico al 10% remueve el DNA pero no el DNA si se realiza a 4C durante toda la noche. Un
tratamiento ms drstico con cido perclrico al 10% pero a 60C durante 30, extrae ambos cidos
nuclicos. Sin embargo este tratamiento tambin extrae algunas protenas desde los cortes.
Estos procedimientos qumicos estn basados sobre la catlisis por cidos de la hidrlisis de los
puente entre los azucares y las bases y entre los azucares y el cido fosfrico. El enlace ester fosfato
del RNA es ms lbil que la hidrlisis del DNA.
El RNA tambin es posible removerlo con HCl 1 M, como por ejemplo en la hidrlisis de Feulgen.
Los reactivos utilizados para la extraccin enzimtica son mas baratos que las enzimas, sin
embargo son menos especficos, y su accin, es mas difcil de controlar, adems que son mas difcil
de manipular.
Deteccin de cidos Nuclicos Con Fluorocromos
Existen tres tinciones de cidos nuclicos:

Colorantes intercalantes, tales como el bromuro de etidio y el ioduro de propidio
Los que se unen a la curvatura menor del DNA, tales como el DAPI y el Hoechst
Y colorantes miscelneos, incluyendo el acridine orange, 7-AAD, LDS 751 and
hydroxystilbamidine, y cyaninas con propiedades especiales.
Dentro de los colorantes intercalantes clsicos se encuentran las acridinas, y las fenantridinas (BE,
IP), son adems impermeantes, es decir no pueden atravesar la membrana en clulas vivas. Estos
colorantes se unen tambin a RNA , por lo que se requiere extraccin enzimtica para hacer
especfica su tincin. Este tipo de colorantes tiene una estructura de anillo aromtico plano, con
dimensiones apropiadas, y que tenga al menos un grupo polar, es capaz de ajustarse como relleno
de un sndwich, entre las bases de un DNA. Entre ellos, las fenantridinas, propidios y etidios,
cumplen con este requisito. El mecanismo de intercalacin dentro de la doble hlice de DNA
requiere de la apertura transiente de la hlice para admitir la molcula coloreada o fluorescente.
Ocurre una apertura como en bisagra de la hlice. Un ejemplo de estos fluorocromos intercalares es
la quinacrina, la cual se une esbtre las bases A-T, pero no G-C. (aplicacin en citogentica)
Entre los colorantes que se unen a la curvatura menor del DNA se encuentran los Indoles y los
imidazoles, entre ellos el mas famoso es el hoechst y tambin el DAPI, este ltimo se une con
mayor fuerza en presencia de los clusters de A-T, pero deben haber por lo menos dos consecutivos.
Estos fluorocromos catinicos son atrados a los grupos fosfatos del DNA por fuerzas inicas, y son
adheridos por fuera de la doble hlice en regiones ricas en A-T, pero sin intercalarse
Y otros mas, pero con aplicaciones ms especficas.
Propiedades de los colorantes Cyaninas:

Las principales ventajas de estos colorantes, son que poseen una fluorescencia intrnseca mnima,
cuando no est unido a un cido nuclico.tienen una gran afinidad a los AN, y muy baja unin a
otros biopolmeros. Otra caracterstica representativa de esta familia de colorantes es que tienen un
rango de fluorescencia de excitacin y emisin en el espectro visible, y con un peak adicional en el
espectro UV, lo que hace compatible con diferentes tipos de instrumentos. La principal diferencia
entre ellos, es que tiene diferentes grados de permeabilidad celular y de especificidad por los
cidos nuclicos.(picogreen, oilgreen, etc..)
Otra familia de colorantes cyanine, son los TOTO, que corresponden a dmeros simtricos de
cyanine, con una sensibilidad especial por los AN. Esta sensibilidad es debido a su alta afinidad por
los AN, en combinacin con una gran fluorescencia.
Este tipo de colorantes o fluorocromos se unen de dos formas., intercalandose cada monomero de
colorantes entre un par de bases. Con el sistema de sandwich, el anillo nezazolim, la pirimidina, y el
anillo quinilina entree l anillo purina, causando el desenrrollamiento de la hlice. Una segunda forma
de unin de estas molculas, aunque menos estudiada, es a nivel externo.
Su sensibilidad es suficiente para detectar una molcula de cido nuclico marcada, por ejemplo
mediante citometra de flujo. Estos colorantes estn considerados dentro de la clasificacin de
impermeables, es decir no penetran las clulas, por lo tanto se requiere fijarlas, o permeabilizar
clulas vivas por ejemplo con DMSO al 5%.
Entre los colorantes permenates se encuentra el ioduro de hexidium, que pertenece a la familia de
fenantridium, pero es lipofilico
EL acrdine orange, es un colorante miscelneo, que se une al DNA por intercalacin, y tambin por
interacciones electrostticas, sin embargo, tiene las desventaja de se menos sensible cuando la
cromatina se encuentra condensada, porque su compactacin le impide intercalarse entre las bases.
Identificacin de cidos Nucleicos- Cecilia Alliende1
Demostracin de cidos Nucleicos

Prof. Cecilia Alliende G.
Martes 03 de Septiembre de 2002
Aunque generalmente la identificacin de cidos nucleicos (AN) se realiza en tejidos fijados, ciertos
fluorocromos se pueden emplear en tejidos sin fijar. Siempre es recomendable utilizar fijadores que contengan
cido actico en la fijacin de los AN pues es el nico fijador que los precipita. Debido a que los AN estn
unidos a protenas su fijacin no presenta grandes problemas, obtenindose una buena preservacin de stos
con la gran mayora de los fijadores. Sin embargo, deben conocerse ciertas reglas generales para la
caracterizacin ptima del DNA y RNA.
Fijacin del DNA y del RNA:
Es recomendable utilizar fijadores que tengan cido actico. Se obtienen buenos resultados con
fijadores alcohlicos que contienen cido actico (Carnoy, etanol-cido actico 3:1, etc) o fijadores que adems
del alcohol y cido actico que contengan formaldehdo (Alfac). Se deben evitar los fijadores muy cidos
como el Bouin acuoso pues producen hidrlisis del DNA durante la fijacin.
El RNA por su parte se hidroliza fcilmente con medios cidos o bsicos, hecho que debe considerarse
al utilizar agentes decalcificantes cidos. Hay que cuidar adems que la temperatura no sea demasiado elevada
(no mayor de 60 C pues provoca desnaturacin del DNA).
Mtodos Histoqumicos para la identificacin de cidos Nucleicos:
Los Mtodos Histoqumicos que permiten identificar los AN se pueden clasificar en 2 grandes
categoras:
a) Reacciones de las pentosas desoxirribosa o ribosa
b) Reacciones de los grupos fosfato
Identificacin del DNA mediante la Reaccin de Feulgen:
Este mtodo introducido por Feulgen y Rossenbeck en 1924 es una reaccin especfica y cuantitativa
para el DNA que ha desempeado un importante papel en el estudio de la fisiologa celular, pues ha permitido
realizar importantes estudios referidos al contenido de DNA nuclear, p. ej. estudios del ciclo celular, contenido
de DNA anormal en tumores cancerosos, determinacin del contenido de DNA nuclear caracterstico de la
especie, etc.
Mecanismo de reaccin:
1. Separacin selectiva de las bases pricas (Adenina y Guanina) del DNA mediante una hidrlisis moderada.
Esta hidrlisis conduce a la formacin de cido apurnico. La ruptura de la unin glucosdica de las bases
pricas (C1-C9) con la deoxiribosa, permite que el grupo aldehdo potencial del azcar se haga reactivo al
quedar libre el C1 del azcar.
En la aparicin del grupo aldehdo hay que admitir la existencia de un estado de equilibrio entre la forma
furansica del azcar (tautomrica) y la forma aldehdica. La forma tautomrica de la deoxiribosa
corresponde a una estructura cclica que se ha originado por la unin hemiacetal entre el grupo aldehdo del
azcar y el grupo OH del C4. Las formas tautomricas se encuentran siempre en equilibrio y predominan
una sobre la otra segn las condiciones del medio en que se encuentra.
Tautomera es la emigracin de un tomo o de un grupo de tomos desde un punto de la molcula a otro con
lo que se forman enlaces diferentes pero fcilmente retornables a la posicin primitiva.
Para obtener el mayor nmero de grupos aldehdos reactivos debemos realizar una hidrlisis que libere la
mayor cantidad de bases pricas sin producir depolimerizacin de DNA ni romper las uniones steres con
los grupos fosfato en los C3-C5.
Para conseguir una hidrlisis ptima deben considerarse los siguientes factores:
Tiempo de hidrlisis: un tiempo demasiado largo produce depolimerizacin de DNA, en tanto que un
tiempo corto no permite exponer todos los grupos aldehdos.
[cido]pH
Temperatura
Fijador utilizado
Compactacin del DNA en el tejido utilizado
La duracin de la hidrlisis es fundamental para alcanzar la liberacin de un mayor nmero de grupos
aldehdos reactivos. Si la hidrlisis es muy corta la ruptura de las uniones glicosdicas del azcar con la
base prica es incompleta y no todos los grupos aldehdos son desenmascarados. Si la hidrlisis es
demasiado prolongada se produce la depolimerizacin del DNA, por lo tanto el azcar portador del grupo
aldehdo se solubiliza.
Es importante observar un tiempo de hidrlisis muy estricto, el que vara de acuerdo con:
El fijador empleado
La naturaleza del tejido
Concentracin del cido
Temperatura del cido utilizada
El tiempo de hidrlisis debe ser determinado en cada caso estudiado; los valores indicados en las tablas
pueden servir de referencia.
Todos los fijadores histolgicos sirven para realizar la reaccin de Feulgen. El nico que debe evitarse es el
Bouin acuoso que por ser muy cido da una reaccin menos intensa, pues en presencia del HCl la hidrlisis
es excesiva y producira depolimerizacin del DNA.
La influencia del fijador sobre el tiempo ptimo de hidrlisis se debera a la accin del fijador sobre la
fraccin proteica (histonas y protenas no histnicas).
En 1966 Decosse y colaboradores realizaron un estudio histofotomtrico en linfocitos humanos realizando
una hidrlisis con HCl 5N a 26 C y HCl 1 N a 60 C. (ojo)
El contenido de DNA ptimo fue igual en ambos tipos de hidrlisis; con HCl 5 N se obtiene un plateau con
la cantidad mxima de DNA.
La proximidad de las curvas ascendentes en los dos mtodos de hidrlisis indicara que la depurinacin es
dependiente primariamente de la concentracin de H y es slo modestamente acelerado por la temperatura.
La amplia diferencia entre el final de la depurinacin (tiempo ptimo) y el comienzo de la depolimerizacin
con HCl 5 N (35 minutos tiempo ptimo y a los 120 minutos empieza la depolimerizacin. En cambio, con
HCl 1 N a 60 C el tiempo ptimo se alcanza a los 16 y a los 20 se inicia la depolimerizacin. La
depolimerizacin estara ms influenciada por la temperatura.
Reactivo de Schiff:
La fucsina bsica tratada con un exceso de cido sulfuroso se decolora, conocindose esto como reactivo de
Schiff, el que en presencia de un aldehdo participa de la formacin de un compuesto nuevo de color fucsia
que tiene un espectro distinto a la pararosanilina.
cido sulfuroso:
H2O +SO2 H2SO3 H+ HSO3- 2H+ + SO32-
La fucsina bsica estara formada principalmente por:
Pararosanilina (magenta O)
Rosanilina (magenta 2)
Magenta 3
Nueva fucsina (magenta 4)
El principal constituyente es pararosanilina; entre los distintos lotes comerciales de fucsina bsica existen
diferencias habiendo siempre impurezas que deben ser eliminadas con carbn activado.
La pararosanilina es un derivado del trifenilmetano que presenta un espectro de absorcin caracterstico con
3 puntos de absorcin mxima (538, 280 y 232 nm).
La absorcin a 538 nm es tpica de los colores derivados del trifenilmetano y debe ser asociada con la
molcula de transicin que por el fenmeno de resonancia puede asumir la pararosanilina, cualquiera de los
3 anillos puede transitoriamente asumir la configuracin quinoide.
Si a la pararosanilina se le agrega metabisulfito de sodio desaparece el peak de absorcin de 538 nm que es
el responsable del color que presenta la pararosanilina.
El reactivo de Schiff ms aldehdo presenta un espectro similar al de la pararosanilina, con la diferencia de
presentar peak de absorcin a 560-290-240 nm.
Se forma un producto nuevo muy estable y distinto de la pararosanilina.
La naturaleza de este compuesto no est del todo clara, al respecto existen varias teoras, siendo la ms
aceptada en la actualidad aquella que propone la formacin de un cido aminoalquilsulfnico.
Varios colorantes y fluorocromos distintos a la fucsina bsica, si se tratan con SO2 tambin se decoloran y
forman reactivos llamados Pseudo Schiff, los que en presencia de grupos aldehdo tambin forman
compuestos coloreados. Son colorantes bsicos que contienen al menos un amino primario y no poseen
grupos cidos. Estos compuestos pseudo Schiff son altamente sensibles y son cuantitativos, por ejemplo la
acridina, acriflavina, auramina O. estos colorantes bsicos fluorescentes saturados con SO2 emiten una
fluorescencia especial en presencia de los grupos aldehdos y en los estudios cuantitativos no estn
sometidos al error distribucional.
Preparacin, conservacin y uso del reactivo de Schiff:

la calidad del reactivo de Schiff depende mucho de la calidad de la fucsina en parte del modo de
preparacin. Existe una gran variedad de procedimientos para la preparacin del reactivo de Schiff. En
cualquier caso deben tomarse ciertas consideraciones:
1. La concentracin de la fucsina vara extremadamente de 0.017% a 1%.
En un trabajo de 1969 realizado por Dutt, se utilizaron diferentes concentraciones de fucsina bsica para
preparar el reactivo de Schiff. Se emplearon clulas hepticas y mediante un citofotmetro se midi el
DNA, encontrndose que la mxima intensidad de tincin se alcanza con una concentracin de 0.5%,
aunque con 0.25% la diferencia es mnima.
Concentracin colorante DNA

(%) (unidades)
0.5 33.90
0.25 28.88
0.125 24.05
0.0625 21.50
0.03125 15.19
Hay una progresiva reduccin de la intensidad de tincin del DNA cuando la tcnica se realiza con un
reactivo de Schiff que contiene una concentracin de fucsina bsica bajo 0.5%. la sensibilidad del
reactivo de Schiff se relaciona con su contenido de SO2. Atkinson en 1952 prepar reactivo de Schiff
con una concentracin de 0.42% de fucsina bsica y fue variando la cantidad de NaHSO3. En un rango
que variaba entre una relacin molar 5/1 a 100/1 bisulfito-colorante 5/1, 10/1, 100/1. Se alcanz una
mayor coloracin con formalina como fuente de aldehdos con la relacin molar 10:1 del bisulfito y el
colorante.
La cantidad excesiva de cido sulfuroso baja mucho el pH del reactivo. Por estudios histofotomtricos
se ha visto que el rango de pH a los cuales se alcanza una mayor intensidad de reaccin se situara entre
1.8 y 2.0; a pH ms bajos dara reacciones especficas pero de menor intensidad, en tanto que a pH 3.0
dara reacciones inespecficas, por lo que es importante realizar los lavados con agua sulfurosa despus
del reactivo de Schiff pues si se transfiere directamente la preparacin al agua corriente que tiene un pH
cercano a 6 el exceso de reactivo presente en la placa se recolora transformndose en fucsina bsica. Es
decir, el reactivo se recolora en presencia de bases regenerndose la fucsina bsica.
Respecto de la conservacin, debe hacerse en fro en frascos oscuros llenos y hermticos para evitar la
evaporacin del xido sulfuroso; con el tiempo se produce la oxidacin de sulfido a sulfato lo que baja
el pH de la solucin. El reactivo de Schiff debe ser incoloro o de un color naranja debido a las
impurezas de la fucsina. Para eliminar las impurezas se utiliza carbn activado, que acta adsorbiendo
las impurezas.
Uso de fluorocromos en la identificacin de DNA:

Fluorocromo es un colorante capaz de absorber la luz ultravioleta y emitir luz de longitud de onda ms
larga que la luz absorbida.
Una molcula para ser fluorescente debe contener un sistema de dobles enlaces conjugados, que pueden
incluir los dobles enlaces del anillo aromtico. Los dobles enlaces provenientes de compuestos cclicos emiten
una fluorescencia ms fuerte que la proveniente de compuestos lineales.
Los compuestos fluorescentes de inters en microscopa son molculas coplanares rgidas:
Poco fluorescente Mayor fluorescencia
Ms fluorescente Menos fluorescente
Los compuestos coplanares son ms fluorescentes cuando los anillos estn puestos uno al lado del otro.
Por ello el antraceno fluoresce ms que el fenantreno en respuesta al mismo nivel de excitacin. La
fluorescencia tambin es afectada por lo sustituyentes.
Cuando existe un solo sustituyente la fluorescencia es aumentada por OH, -OCH3, -F, -CN, -NH y
NHCH3; en tanto que es reducida por C=O, -COOH, -Cl, -Br, -I, -NO2, o SO3H.
Las genealizaciones anteriores no se cumplen cuando hay ms de un sustituyente.
Los fluorocromos que identifican cidos nucleicos se pueden clasificar en 2 grupos:
a) Los que forman complejos bastante estables con el DNA (Intercalares)
b) Especficos para DNA, se unen externamente y no se intercalan:
Nitramicina NMC (GC)
Hoechst 33342 (A=T)
4,6- diamino-2-fenilindol (DAPI) (A=T)
actinomicina O (GC)
Derivados de las cianinas: TOTO-1 y YOYO-1, que se pueden unir al DNA externamente y por
intercalacin, son extremadamente sensibles, tienen una fluorescencia ms duradera pero su costo es
considerablemente alto.
Acridina Orange:
Colorante bsico de la serie de las acridinas, fue uno de los primeros colorantes intercalares que se
emplearon para la tincin diferencial de DNA y RNA. Sobre clulas sin fijar o postfijadas con Carnoy este
fluorocromo produce una fluorescencia verde en presencia de DNA y roja en el caso del RNA, lo que se debe a
que la acridina Orange exhibe grandes cambios en sus propiedades de emisin si interacta con DNA de doble
cadena y RNA generalmente de una cadena rojo.
Cuando se une al DNA de doble cadena se une como un monmero, en forma intercalar entre 2 pares de
bases. El mecanismo de intercalacin en el DNA requiere una apertura transciente de la doble hlice para
admitir el colorante fluorescente. Esta abertura no implica desenrollar la hlice ya que la apertura slo puede
ocurrir en sitios determinados. En cambio en el RNA de una sola hebra se une como polmero a las cargas
negativas del RNA. Si el DNA es denaturado se observa fluorescencia roja.
Aplicaciones:
Aos atrs se utiliz ampliamente para la caracterizacin de clulas malignas en frotis, donde la
cantidad de RNA ribosomal muestra un aumento en la sntesis de protenas.
En las tinciones con fluorocromos es muy importante la concentracin. Se utilizan bajas
concentraciones. Altas concentraciones producen el fenmeno de Quenching (disminucin de la fluorescencia).
A+hv A* (monmero)
A*+ A (A A*) (polmero)
(A A*) hv2+ 2
En algunos casos si se aumenta la concentracin del soluto se observa la desaparicin de la fluorescencia

inicial.
DAPI: es una molcula muy sensible que ha permitido la deteccin de DNA en micoplasmas, mitocondrias,
cloroplastos y otros. Se emplea en mtodos cuantitativos, es de 2 a 3 veces ms sensible que el Feulgen, se
utiliza a pH 4.4. es un colorante catinico que se une a los grupos fosfato del DNA por fuerzas inicas y tb a
regiones externas a la doble hlice ricas en A=T por fuerzas no inicas, y no se intercala.
Deteccin del radical fosfato:

La basofilia de los cidos nucleicos se relaciona con los radicales fosfato de su molcula. El radical
fosfato de los AN a pH 2.0 est disociado; sus cargas negativas fijan a los colorantes bsicos cargados
positivamente.
En la clula viva los grupos fosfato cargados negativamente estn unidos a las protenas (en el caso del
DNA estn unidos a histonas) por ello los AN no se detectan por colorantes bsicos en clulas sin fijar. La
fijacin libera en parte a estos grupos electronegativos.
Sin embargo, la coloracin de los cidos nucleicos por colorantes bsicos implica siempre una
competencia entre los cationes del colorante y los grupos amino de la fraccin proteica de las nucleoprotenas.
Siempre hay que recordar la influencia primordial del pH sobre esta fijacin de colorantes bsicos; a pH >3.0 se
empieza a encontrar disociados los grupos cidos de las protenas.
Se considera en general que la unin de los colorantes bsicos a los AN es por uniones salinas. Todos
los colorantes bsicos son susceptibles de fijarse sobre los AN, pero la mayor parte se fija igualmente sobre
grupos cidos no pertenecientes a los AN, especialmente en los proteoglicanos.
Para confirmar la especificidad de la unin de un colorante bsico a los cidos nucleicos se debe realizar
por extraccin enzimtica o qumica.
Para el estudio de ambos AN las reacciones ms utilizadas son las de verde metilo-pironina y
galocianina que empleadas en ciertas condiciones tienen especificidad por los AN.
Mtodo de Verde metilo- Pironina:
En 1899 Pappenheim propuso el uso de dos colorantes bsicos, el verde de metilo y la pironina para la
caracterizacin diferencial de los cidos nucleicos.
Verde de metilo: es un colorante bsico derivado del trifenilmetano preparado a partir del cristal
violeta, por introduccin de un sptimo grupo metilo; este metilo suplementario est dbilmente unido por ello
hay siempre una cantidad de cristal violeta en los stock comerciales de colorante, lo que requiere someterlo a
purificacin con cloroformo, en el cual el cristal violeta es soluble, en tanto que el verde de metilo no. La
pironina Y o G (sinnimos) es un colorante bsico derivado de los xantenos, son derivados metilados y
deaminados. La pironina Y no debe confundirse con la pironina B en la cual los grupos metilos estn
reemplazados por grupos etilos.
Mecanismo:
Los colorantes bsicos cargados positivamente se combinan con los constituyentes tisulares cargados
negativamente en una medida que depende del colorante dado y del pH de la solucin colorante. As ciertos
constituyentes tisulares reaccionan con un colorante bsico a cierto pH y con otro colorante bsico a otro pH
ms bajo o ms elevado.
Si se somete a estos constituyentes celulares a una mezcla de colorantes bsicos como el caso del verde
de metilo-pironina, la coloracin obtenida depender de la afinidad de estos constituyentes tisulares por los 2
colorantes bsicos en funcin del pH de la mezcla colorante.
Si la solucin est a pH 1.5 todas las estructuras cidas se tien con el verde de metilo, en cambio a pH
9.3 y superiores todas las estructuras cidas se tien con la pironina.
A pH entre 4-5 el ADN se colorea en forma selectiva con el verde de metilo y el RNA con la pironina.
Las causas de esta coloracin diferencial no estn an muy claros pero se han propuesto diferentes
hiptesis:
Kunnick y Pollesty estimaron que la coloracin diferencial se debe al grado de polimerizacin diferente
de ambos AN.
El DNA ms altamente polimerizado tendra afinidad por el verde de metilo mientras el RNA menos
polimerizado se unira a la pironina. Esta teora se basa sobre experiencias realizadas in vitro. Despus de
tratar el DNA con desoxiribonucleasa que depolimeriza el DNA se tie con pironina.
Vercantier en 1950 sostuvo que influyen factores de estereoespecificidad; en efecto, verde de metilo con
sus 2 grupos aminos terciarios puede unirse a los grupos fosfato del DNA que est a una determinada distancia
que le permiten unirse con el colorante. Si se realiza una hidrlisis corta con HCl 1N se rompen los enlaces de
H pero no las uniones fosfato C5-C3, no se depolimeriza el ADN pero de igual forma se pierde la afinidad por el
colorante al romperse las uniones de H entre las bases complementarias se separan las cadenas de la molcula
de ADN alterando la distancia entre los grupos fosfato.
Scott suguri que la configuracin helicoidal del DNA convierte a los grupos fosfato en una estructura
no planar del verde metilo pironina. Mientras el RNA tiene una conformacin ms abierta fcilmente
penetrable por la molcula ms pequea y planar de la pironina Y. Existe un mecanismo de tincin competitiva
por el .
Mtodos de extraccin de cidos Nucleicos:

Extracciones enzimticas:
Ribonucleasa:
Est ampliamente repartida en los tejidos animales y vegetales. Se ha aislado ribonucleasa de hgado,
bazo, timo, pncreas.
La ribonucleasa pancretica porcina o bovina es la que ha sido ms estudiada gracias a su fcil
obtencin.
RNAsa aislada de pncreas es una diesterasa que acta sobre el grupo fosfato unido a la posicin 3 de
aquella ribosa que est unida en su C1 a una base pirimdica TC. El ster fosfato de la posicin del C5 del
siguiente residuo es transferido a la posicin 2 de la 1 ribosa. El RNA se rompe en oligonucletidos solubles.
La ribonucleasa pancretica es una protena soluble a pH ptimo 7.7 y es estable a una temperatura entre
40-70 C.
Actualmente se dispone de RNAasa muy puras que dan resultados confiables. No deben usarse
extractos animales de RNAasa que son ms baratos pero estn ms contaminados con proteasas. Son inhibidas
por Ca, Mg, Mn, cido peridico, formaldehdo.
Por especificidad es una reaccin til para observar en forma simultnea DNA y RNA; es ms utilizado
para caracterizar RNA no hay una buena reaccin.
El verde de metilo a pH 4-5 tambin se une a mucinas, fundamentales para el cartlago y a las
granulaciones de los mastocitos. Para identificar DNA se recomienda la reaccin de Feulgen.
La pironina tampoco es totalmente especfica por eso para determinar si la tincin corresponde a RNA
se debe hacer una extraccin con ribonucleasa o extraccin cida.
Ribonucleasa y fijacin:
Cuando se realiza la digestin con ribonucleasa no pueden utilizarse fijadores que contengan sales de
Cr, formaldehdo o glutaraldehdo. Se recomienda fijar en alcohol actico, hacer controles enzimticos en
placas en cmara hmeda. La desoxiribosa se usa raramente ya que existe el Feulgen especfico para DNA.
Hidrlisis cida:
Presenta la ventaja de ser ms econmica y el inconveniente de tener una accin hidroltica ms variable
sobre los cidos nucleicos. Algunas hidrolizan el RNA y otros RNA y DNA, algunas veces de manera
incompleta.
Los reactivos qumicos ms utilizados son:
cido tricloroactico (TCA) al 4% 90 C por 15 minutos elimina DNA y RNA
cido perclrico 10% a 4 C toda la noche RNA
cido perclrico 5% 30 a 60C RNA y DNA
Se produce la hidrlisis entre el azcar y la base y entre el azcar y el fosfato. Los steres fosfato del
RNA son ms hbiles a la hidrlisis que el DNA.
HCl 1N a 60 C remueve RNA en el tiempo ptimo de hidrlisis.
La extraccin del RNA con cido perclrico tambin extrae las bases pricas y pirimdicas del DNA el
que puede ser detectado por el reactivo de Schiff.
TCNICAS PARA LA DEMOSTRACIN DE APOPTSIS
IN SITU
Gamaliel E. Ordenes
Apoptosis:
Es una forma de muerte celular cuyo objetivo es eliminar las clulas del husped que ya no son necesarias a
travs de la activacin de una serie coordinada y programada de acontecimientos internos, que se inicia por un
grupo de productos gnicos cuya funcin especfica es precisamente sta. Es responsable de numerosas
respuestas fisiolgicas, adaptativas y patolgicas. Se puede observa en los siguientes contextos generales:
1) durante el desarrollo.
2) como mecanismo homeosttico para el mantenimiento de las poblaciones celulares en los tejidos.
3) como mecanismo de defensa en las reacciones inmunitarias.
4) cuando las clulas son afectadas por enfermedad o por agentes lesivos.
5) en el envejecimiento.
La connotacin biolgica que tiene este proceso es fundamental, sobre todo en las primeras etapas de la
vida, como en la formacin de los dedos de la mano referido a la desaparicin de las membranas
interdigitales. Durante el desarrollo embrionario, toda la morfognesis tiene que ver con procesos de
proliferacin, diferenciacin y apoptosis, esto es lo que nos modela.
Durante la apoptosis ocurren eventos tempranos, que si miramos la clulas, morfolgicamente no
presentan cambio alguno, pero los eventos tardos s reflejan cambios morfolgicos que se pueden ver incluso
con H-E: cuerpos apoptticos, eliminados por clulas vecinas no macrofgicas.
El esquema que a continuacin se presenta (fig. 1), trata de explicar los mecanismos que controlan el
proceso. Desde una seal externa a una interna como es la unin de un ligando al receptor de Fas, que desata
una cascada de eventos hasta llegar a un fenmeno irreversible y definitivo que es la fragmentacin del DNA.
En el intertanto ocurren muchas otras cosas, algunas son reversibles y otros irreversibles. Existen ciertos
puntos crticos de los cuales ya no hay vuelta. El proceso es extremadamente complejo y el esquema que se
muestra es una simplificacin.
La unin de una molcula a un receptor externo produce la transduccin de la seal que activa
molculas como el Fas, que a su vez, al ser activado permite la activacin de ciertos dominios que llevan a
apoptosis. Esta molcula activada, a su vez va a ser capas de activar, de clivar a las enzimas caspasas,
produciendo una cascada de caspasas clivadas y activadas. Estas a su vez van a desactivar una serie de otras
protenas, como por ejemplo el desmontaje de las protenas nucleares lmina, estas protenas son las que
permiten la mantencin de la estructura de la envoltura nuclear. Uno de los procesos que ocurre cuando se
desensambla el ncleo es el desmontaje de las protenas lmina, que produce el desensamblaje de la doble
envoltura nuclear. Estas protenas tambin son blanco del final de la cascada de las caspasas, al igual que
otras protenas, como la activacin de las nucleasas especficas de la apoptosis que van a fragmentar el DNA.
fig. 1
Existen distintos tipos de seales, generalmente seales externas que permiten la activacin del proceso de
apoptosis. Tal como el proceso de proliferacin celular, el proceso de apoptosis es exquisitamente regulado,
significa que existen muchos elementos reguladores, la clula no prolifera en cualquier momento y por
cualquier cosa, sino que en condiciones muy precisas se le permite proliferar porque es peligroso para el
organismo, peligroso para la poblacin celular. Esto depende de las condiciones del medio, de la economa
del sistema. Si la proliferacin se desata se pueden perpetuar mutaciones y esas mutaciones pueden llevar a
neoplasias que finalmente van a terminar con la vida del individuo. En el caso de la apoptosis, como se trata
de eliminar clulas, tambin se puede tener el fenmeno contrario, si la apoptosis se desatara tendramos una
muerte sin control de elementos importantes con perdida de funciones. Pero eso no ocurre porque son
procesos finamente regulados. Hasta ahora no se conoce alguna patologa donde ocurra una hiper apoptosis,
pero si puede ocurrir la eliminacin de poblaciones celulares completas como en el caso de elementos
linfoides que fueron tiles en un proceso determinado que ya finaliz.
Cualquiera de estas seales externa, generalmente provenientes de otras clulas van a producir un
estmulo con la consiguiente transduccin de seal. Desde estimulantes especficos, como el TNF, ligandos
de Fas, protenas de apoptosis, hasta inespecficos como la luz UV, que es capas de producir necrosis por una
parte y tambin apoptosis. El estmulo acta sobre un elemento sensor como un receptor que produce la
transduccin de la seal. Los sensores participan en el mtodo de deteccin de apoptosis. Existen diversos
sensores, se considera como sensor a la molcula receptora y a los participantes del proceso del transduccin
de seal. Los adaptadores de la seal, a veces hay seales que son parecidas a otras, seales de estmulo de
crecimiento, seales de estmulo de diferenciacin, pero quienes adaptan la seal al proceso apopttico son
los adaptadores, por ejemplo la activacin del dominio de apoptosis. Una vez que la seal ha sido adaptada el
proceso de inicia, se inicia con los eventos propios de la va de la apoptosis, uno de ellos es el clivaje de las
caspasas o de los sustratos, uno de los primeros iniciadores en ese aspecto es la caspasa 8 que inicia una serie
de eventos moleculares, generalmente fosforilaciones, desfosforilaciones, clivajes en protenas, para llevar a
elementos efectores, como por ejemplo la caspasa 3, que participara en la activacin de las nucleasas de
DNA, finalmente tendremos un resultado, que es la fragmentacin del DNA, un ncleo desensamblado.
FAMILIA Bax
NOMBRE FUNCIN
Bad Promotor
Bik Promotor
Bid Promotor
Blk Promotor
Hrk Promotor
BNIP 3 Promotor
BimL Promotor
Bok Promotor
Bak Promotor
Bax Promotor
EGL- 1 Promotor
Se presenta los componentes de la familia Bax, todos ellos son promotores de la

apoptosis y pueden ser identificados con IHQ.
Las conclusiones que se pueden obtener de esto son relativas al entorno y a una
serie de cosas, porque no es suficiente decir que una clulas est en apoptosis porque hay
Bax presentes, depende de otros factores tambin.
Si se tiene por ejemplo, un cultivo celular que normalmente no presenta Bax, pero si
se pone en el cultivo un estimulante conocido de apoptosis y aparecen Bax en las clulas, se
tiene un elemento para medir con IHQ que las clulas estn en apoptosis.
Anexina V
Permite detectar clulas en procesos tempranos o medios de apoptosis, en comparacin con
el proceso de fragmentacin del DNA detectable con TUNEL, pero tiene la desventaja que
slo se puede usar con clulas viva porque requiere integridad de la membrana citoplasma y
al fijarla se pierde. Cuando la clula inicia la apoptosis se da un fenmeno en la membrana
celular que es caracterstico. En la membrana celular normal, que es una bicapa lipdica, se
presentan en rojo las fosfatidilserina, que estn siempre en la cara citoplasmtica, en
cambio, cuando la clula entra en apoptosis inmediatamente se produce la traslocacin de
las fosfatidilserinas a la cara extracelular.
La anexina V, es una molcula similar a las molculas adhesivas como la avidina,

biotina, etc. Por alguna razn se une especficamente, en forma muy potente a la molcula
de fosfatidilserina, por la cara extracelular hidrfila. Entonces basta con que la clula
presente fosfatidilserina en la cara externa para que la anexina V se una a ella y como es
una protena se puede identificar con un Ac anti- anexina V y un sistema detector (IHQ).
Es la imagen tpica de la tcnica de la anexina que usa fluorescencia, pero tambin
puede usar un cromgeno. Se ve que la clula (A) tiene una marcacin verde en la
membrana, por todo el contorno debido a que es una clula entera. En la segunda imagen
(B) se ve la marcacin verde de la anexina V por el contorno, pero adems se ve una marca
roja que corresponde a yoduro de propidio, que detecta DNA, por lo tanto indica que est
pasando algo distinto de la apoptosis por la permeabilidad de la membrana, lo que
posiblemente sea necrosis. Puede ocurrir en una misma clula necrosis y apoptosis
simultaneamente. En C, se puede ver precisamente ambos procesos simultneamente. En el
caso de D, se observa todo marcado con yoduro de propidio, lo que indica que est
sufriendo necrosis.
A B C D
La otra ventaja que tiene es que permite la cuantificacin de poblaciones en

citmetro de flujo, como en el caso que a continuacin se describe:
Donde se observa lo que no se ti, lo que se ti con anexina V y con yoduro de

propidio. Se puede cuantificar y decir la cantidad de clulas en apoptosis, necrosis y en
ninguno de los dos procesos.
fig. 1
FAMILIA Bax
NOMBRE FUNCIN
Bad Promotor
Bik Promotor
Bid Promotor
Blk Promotor
Hrk Promotor
BNIP 3 Promotor
BimL Promotor
Bok Promotor
Bak Promotor
Bax Promotor
EGL- 1 Promotor

Anexina V

sufriendo necrosis.
A B C D

Cuantificacin de DNA
Esteban rdenes 1
Tcnicas de Cuantificacin de DNA
Citometra, Citofluorormetra, Citometra de Flujo
Prof. Gamaliel E. rdenes

Viernes 06 de Septiembre de 2002
La mayor parte de las tcnicas de HQ son cualitativas, algunas semicuantitativas y nos permiten hacer estudios
semicuantitativos, y otras, excepcionales, nos permiten realizar reacciones cuantificables. La determinacin cuantitativa
tambin tiene sus limitaciones pues las cuantificaciones son relativas, aunque prestan una gran utilidad.
Es interesante cuantificar el DNA pues precisamente durante el estudio de procesos celulares funcionales tan
importantes como el ciclo celular se producen variaciones en la cantidad de DNA, que pueden analizarse gracias a
tcnicas como la reaccin de Feulgen, que permiten comparar clulas con distintas cantidades de DNA.
Nos referimos a la cuantificacin del DNA en el sentido de determinar cuntos picogramos de DNA hay, lo que
podra establecerse, pero el inters fundamental de estas tcnicas es el establecimiento de cuantificaciones relativas a
una cantidad conocida. Un ejemplo de ello es cuando conocemos la cantidad de DNA presente en clulas de una especie
determinada en G1 y la comparamos con clulas que estn en la misma etapa del ciclo, en cuyo caso se determinan las
cantidades en relacin con G1.
Figura 1: Microdensitmetro
Las tcnicas se relacionan con la citometra de imgenes o esttica (no de flujo) que emplea colorantes
cromgenos como el Feulgen no fluorescente, la citofluorometra que utiliza fluorforos, y la citometra de flujo, que
tambin utiliza siempre fluorforos.
Los sistemas de citometra de imgenes se iniciaron con el empleo de microscopios a los que se asociaba un
sistema detector de luz, como una celda fotoelctrica, sistema que tiene una membrana o un elemento fotosensible y
que al incidir fotones (luz) sobre este se generan cambios a nivel de electrones producindose una corriente elctrica que
genera una diferencia de potencial que resulta en un voltaje determinado medible y dependiente de la cantidad de luz,
mientras ms luz incida sobre la placa mayor ser la diferencia de potencial. La celda fotoelctrica o un fotmetro es
capaz de captar la luz que pas por el sistema ptico y llevarla a un voltmetro. Se puede medir la luz emitida, en el caso
de un elemento fluorescente, o la luz transmitida o retenida, en el caso de un elemento opaco; debe entonces decidirse
el tipo de medicin a realizar.
El sistema consta de un microscopio, la celda fotoelctrica y un computador que tiene un programa capaz de
captar la seal elctrica proveniente de la celda y procesarla, analizarla, e incluso amplificarla si es necesario, obteniendo
un grfico final (figura 1).
Se deben medir un mnimo de 200 clulas para realizar un anlisis estadstico a partir del cual realizar un
histograma: densidad ptica v/s nmero de clulas, operaciones que en la actualidad se realizan mediante programas
estadsticos. Al seleccionar el operador las clulas a cuantificar existen ventajas y desventajas, pues deliberadamente se
podra medir una clula que no corresponde, alterando los datos, o tambin ocurrira esto al seleccionar las clulas a
medir y no medir en forma aleatoria la poblacin celular. Cuando se eligen las clulas a medir, tambin se podran
descartar todas las clulas muertas presentes, pero que no debiesen estar; cuando el anlisis es hecho mediante
mquinas, sin intervencin de operadores humanos, se hace la lectura de todos los tipos celulares presentes alterando
los resultados.
Otro ejemplo corresponde a la medicin de clulas tumorales, separndolas de clulas normales, caso en que se
puede realizar la separacin de ambas poblaciones antes de la medicin en el citmetro de flujo, utilizando un aparato de
cell sorting, que permite separar fsicamente las poblaciones, o bien realizar una seleccin a travs de un software.
Esteban rdenes 2
Citmetro de Flujo:
La citometra de flujo se ha desarrollado principalmente en hematologa. Permite utilizar el material histolgico
mediante un procesamiento adecuado relativamente simple (figura 2):
Se toman cortes de parafina gruesos (50 m) y se ponen dentro de un tubo de ensayo con xilol para desparafinar,
posteriormente se hidrata en una batera de etanol a concentraciones decrecientes hasta llegar a buffer. Luego se
desmenuza mecnicamente en trocitos pequeos y se trata con una enzima proteoltica como papana, tripsina u otra
para lograr obtener una suspensin celular. Que se trata incluso con RNAasas para eliminar el RNA evitando su tincin, y
luego se tien las clulas con yoduro de propidio, se obtiene una suspensin celular de un tejido incluido en parafina lista
para pasar por el citmetro. Este procedimiento se ha utilizado con fines pronsticos en algunos cnceres como el
prosttico.
Fundamentos:
La citometra se relaciona con un cuerpo opaco.
Esteban rdenes 1
Tcnicas de Cuantificacin de DNA
Citometra, Citofluorormetra, Citometra de Flujo
Prof. Gamaliel E. rdenes

Viernes 06 de Septiembre de 2002
La mayor parte de las tcnicas de HQ son cualitativas, algunas semicuantitativas y nos permiten hacer estudios
semicuantitativos, y otras, excepcionales, nos permiten realizar reacciones cuantificables. La determinacin cuantitativa
tambin tiene sus limitaciones pues las cuantificaciones son relativas, aunque prestan una gran utilidad.
Es interesante cuantificar el DNA pues precisamente durante el estudio de procesos celulares funcionales tan
importantes como el ciclo celular se producen variaciones en la cantidad de DNA, que pueden analizarse gracias a
tcnicas como la reaccin de Feulgen, que permiten comparar clulas con distintas cantidades de DNA.
Nos referimos a la cuantificacin del DNA en el sentido de determinar cuntos picogramos de DNA hay, lo que
podra establecerse, pero el inters fundamental de estas tcnicas es el establecimiento de cuantificaciones relativas a
una cantidad conocida. Un ejemplo de ello es cuando conocemos la cantidad de DNA presente en clulas de una especie
determinada en G1 y la comparamos con clulas que estn en la misma etapa del ciclo, en cuyo caso se determinan las
cantidades en relacin con G1.
Figura 1: Microdensitmetro
Las tcnicas se relacionan con la citometra de imgenes o esttica (no de flujo) que emplea colorantes
cromgenos como el Feulgen no fluorescente, la citofluorometra que utiliza fluorforos, y la citometra de flujo, que
tambin utiliza siempre fluorforos.
Los sistemas de citometra de imgenes se iniciaron con el empleo de microscopios a los que se asociaba un
sistema detector de luz, como una celda fotoelctrica, sistema que tiene una membrana o un elemento fotosensible y
que al incidir fotones (luz) sobre este se generan cambios a nivel de electrones producindose una corriente elctrica que
genera una diferencia de potencial que resulta en un voltaje determinado medible y dependiente de la cantidad de luz,
mientras ms luz incida sobre la placa mayor ser la diferencia de potencial. La celda fotoelctrica o un fotmetro es
capaz de captar la luz que pas por el sistema ptico y llevarla a un voltmetro. Se puede medir la luz emitida, en el caso
de un elemento fluorescente, o la luz transmitida o retenida, en el caso de un elemento opaco; debe entonces decidirse
el tipo de medicin a realizar.
El sistema consta de un microscopio, la celda fotoelctrica y un computador que tiene un programa capaz de
captar la seal elctrica proveniente de la celda y procesarla, analizarla, e incluso amplificarla si es necesario, obteniendo
un grfico final (figura 1).
Se deben medir un mnimo de 200 clulas para realizar un anlisis estadstico a partir del cual realizar un
histograma: densidad ptica v/s nmero de clulas, operaciones que en la actualidad se realizan mediante programas
estadsticos. Al seleccionar el operador las clulas a cuantificar existen ventajas y desventajas, pues deliberadamente se
podra medir una clula que no corresponde, alterando los datos, o tambin ocurrira esto al seleccionar las clulas a
medir y no medir en forma aleatoria la poblacin celular. Cuando se eligen las clulas a medir, tambin se podran
descartar todas las clulas muertas presentes, pero que no debiesen estar; cuando el anlisis es hecho mediante
mquinas, sin intervencin de operadores humanos, se hace la lectura de todos los tipos celulares presentes alterando
los resultados.
Otro ejemplo corresponde a la medicin de clulas tumorales, separndolas de clulas normales, caso en que se
puede realizar la separacin de ambas poblaciones antes de la medicin en el citmetro de flujo, utilizando un aparato de
cell sorting, que permite separar fsicamente las poblaciones, o bien realizar una seleccin a travs de un software.
Esteban rdenes 2
Citmetro de Flujo:
La citometra de flujo se ha desarrollado principalmente en hematologa. Permite utilizar el material histolgico
mediante un procesamiento adecuado relativamente simple (figura 2):
Se toman cortes de parafina gruesos (50 m) y se ponen dentro de un tubo de ensayo con xilol para desparafinar,
posteriormente se hidrata en una batera de etanol a concentraciones decrecientes hasta llegar a buffer. Luego se
desmenuza mecnicamente en trocitos pequeos y se trata con una enzima proteoltica como papana, tripsina u otra
para lograr obtener una suspensin celular. Que se trata incluso con RNAasas para eliminar el RNA evitando su tincin, y
luego se tien las clulas con yoduro de propidio, se obtiene una suspensin celular de un tejido incluido en parafina lista
para pasar por el citmetro. Este procedimiento se ha utilizado con fines pronsticos en algunos cnceres como el
prosttico.
Fundamentos:
La citometra se relaciona con un cuerpo opaco.
TCNICAS PARA LA DEMOSTRACIN DE APOPTSIS IN SITU
Gamaliel E. Ordenes
Apoptosis:
Es una forma de muerte celular cuyo objetivo es eliminar las clulas del husped que ya no son necesarias a
travs de la activacin de una serie coordinada y programada de acontecimientos internos, que se inicia por un
grupo de productos gnicos cuya funcin especfica es precisamente sta. Es responsable de numerosas
respuestas fisiolgicas, adaptativas y patolgicas. Se puede observa en los siguientes contextos generales:
1) durante el desarrollo.
2) como mecanismo homeosttico para el mantenimiento de las poblaciones celulares en los tejidos.
3) como mecanismo de defensa en las reacciones inmunitarias.
4) cuando las clulas son afectadas por enfermedad o por agentes lesivos.
5) en el envejecimiento.
La connotacin biolgica que tiene este proceso es fundamental, sobre todo en las primeras etapas de la
vida, como en la formacin de los dedos de la mano referido a la desaparicin de las membranas
interdigitales. Durante el desarrollo embrionario, toda la morfognesis tiene que ver con procesos de
proliferacin, diferenciacin y apoptosis, esto es lo que nos modela.
Durante la apoptosis ocurren eventos tempranos, que si miramos la clulas, morfolgicamente no
presentan cambio alguno, pero los eventos tardos s reflejan cambios morfolgicos que se pueden ver incluso
con H-E: cuerpos apoptticos, eliminados por clulas vecinas no macrofgicas.
El esquema que a continuacin se presenta (fig. 1), trata de explicar los mecanismos que controlan el
proceso. Desde una seal externa a una interna como es la unin de un ligando al receptor de Fas, que desata
una cascada de eventos hasta llegar a un fenmeno irreversible y definitivo que es la fragmentacin del DNA.
En el intertanto ocurren muchas otras cosas, algunas son reversibles y otros irreversibles. Existen ciertos
puntos crticos de los cuales ya no hay vuelta. El proceso es extremadamente complejo y el esquema que se
muestra es una simplificacin.
La unin de una molcula a un receptor externo produce la transduccin de la seal que activa
molculas como el Fas, que a su vez, al ser activado permite la activacin de ciertos dominios que llevan a
apoptosis. Esta molcula activada, a su vez va a ser capas de activar, de clivar a las enzimas caspasas,
produciendo una cascada de caspasas clivadas y activadas. Estas a su vez van a desactivar una serie de otras
protenas, como por ejemplo el desmontaje de las protenas nucleares lmina, estas protenas son las que
permiten la mantencin de la estructura de la envoltura nuclear. Uno de los procesos que ocurre cuando se
desensambla el ncleo es el desmontaje de las protenas lmina, que produce el desensamblaje de la doble
envoltura nuclear. Estas protenas tambin son blanco del final de la cascada de las caspasas, al igual que
otras protenas, como la activacin de las nucleasas especficas de la apoptosis que van a fragmentar el DNA.
fig. 1
FAMILIA Bax
NOMBRE FUNCIN
Bad Promotor
Bik Promotor
Bid Promotor
Blk Promotor
Hrk Promotor
BNIP 3 Promotor
BimL Promotor
Bok Promotor
Bak Promotor
Bax Promotor
EGL- 1 Promotor

Anexina V

sufriendo necrosis.
A B C D


UTILIZACIN DE PRECURSORES DE DNA PARA
DETERMINACIN DE FRACCIONES PROLIFERATIVAS EN
POBLACIONES CELULARES
Gamaliel E. Ordenes
Para realizar identificacin de protenas, se utilizan precursores de estas molculas. Lo que se

utiliza generalmente es S marcado porque tienen enlaces disulfuro y permite hacer seguimiento, en
cambio no sirve usar un amino cido determinado porque casi todas las protenas poseen. Para el DNA
se utiliza la timidina o su homlogo.
El objetivo de la utilizacin de precursores es establecer la fraccin de clulas que estn en la
fase de sntesis del DNA durante el tiempo de administracin del precursor.
El problema es que tenemos tejidos, clulas o poblaciones celulares que estn transcurriendo en
forma asincrnica y se quiere saber cuntas estn ciclando, algunas clulas pueden estar en reposo
proliferativo o ciclando. Una manera certera de saber si estn dentro del ciclo es saber si estn
sintetizando DNA. El objetivo de esta tcnica es establecer la fraccin de clulas en fase de sntesis de
DNA, no se trata de establecer la fraccin proliferativa, qu es ms complejo. La fraccin proliferativa
comprende todas las clulas que estn en fase G1, S, G2 i M. Aqu slo vamos a establecer aquellas
clulas que estn en S.
Tipos de precursores del DNA utilizados como marcadores:
E Radiactivos:
- timidina tritiada.
- Mtodo de deteccin: autorradiografa.
E No radiactivos:
- bromodeoxiuridina (BrdU).
- Mtodo de deteccin: inmunohistoqumica.
El mtodo de deteccin para los precursores radiactivos es la autorradiografa. Es un mtodo muy
engorroso en que todo el material debe estar muy bien lavado y utilizarse exclusivamente en esta
tcnica, adems tienen el inconveniente de ser radiactivo y para trabajar con material radiactivo el
laboratorio debe contar con una licencia y contar con un lugar para eliminar los desechos (timidina: t
1/2 de 12 aos; lo que quiere decir que en 12 aos baja al 50%, aunque tiene una energa relativamente
baja). Este mtodo es largo y tedioso, demora 15 das o ms para obtener resultados. Por la forma de la
autorradiografa lo que se forman son granos sobre una emulsin fotogrfica (baja resolucin de la
marca)
Los mtodos no radiactivos, que fueron inventados hace menos tiempo, tienen grandes ventajas. En el
caso del mtodo de la bromodeoxiuridina demora unas horas, es una marcacin permanente, la
resolucin es buena ya que se forma una marca sobre la misma molcula.
Formas de incorporacin de precursores de DNA:

E In vitro: Se puede trabajar con cultivos de clulas o tejidos o material de biopsias, en el caso de
material de biopsia se puede incubar el tejido recin obtenido en una solucin con bromodeoxiuridina,
en medio de cultivo a 37 C, hay otra tcnica en que se incuba el tejido a alta PpO2 poniendo agua
oxigenada. En el caso de los cultivos celulares se incorpora la bromodeoxiuridina en el medio de
cultivo. La dosis es del orden de 1 mg. por 1 ml de BrdU, incluso existen algunas tcnicas en que se
microinyecta la BrdU al interior de las clulas.
E In vivo: En los animales se administra intravascular, intraperitoneal o en el agua de beber. Se
incorpora en mayor dosis por las barreras que tiene que traspasar.
En ocasiones de ha utilizado la BrdU junto a la fluodeoxiuridina, que acta como competidor ms
activo con la timina en el pool intracelular. La clula fabrica su DNA con la BrdU que se le da porque
est en exceso obligndola a usarla, y si adems se le administra un competidor va a capturar mejor la
que se le da que la del pool intracelular normal.
E Pulsos: se llama pulso a la aplicacin de un reactivo durante un tiempo determinado. El precursor se
incorpora durante un perodo de tiempo predeterminado, dependiendo del tipo de estudio. Puede ser por
30 min., 60 min., 2 hrs., 24 hrs. El pulso estar en relacin con la duracin de la fase S, que se estima
de 7 - 10 hrs. y con la cintica estimada de la poblacin que se est estudiando. En general las clulas
tienen un ciclo entre 25 - 30 hrs. Si se pretende estudiar sntesis de DNA en S.N., donde sabemos que
prcticamente no hay clulas ciclando, estn en reposo proliferativo, vamos a tener que poner das o
meses para encontrar alguna; en cambio en la mdula sea o en el intestino va a bastar con una hora y
ya va a haber marcacin. Tambin va a depender del objetivo del estudio, si se quiere saber cuntas
clulas pasaron por S durante un ciclo celular completo, el pulso tendr que tener por lo menos 24
horas. Pero si slo se quiere ver cul es la fraccin proliferativa en un momento dado, llamado una
ventana, se puede aplicar un pulso de 1 hora. Es cuantitativo en el sentido que se puede determinar
porcentualmente las clulas, no en el sentido de la intensidad de la reaccin, aunque si se pueden
evaluar ciertas cosas.
La idea es que el precursor se incorpore durante un tiempo determinado y esa va a ser nuestra ventana
de observacin.
En la autorradiografa se ha incorporado brevemente un precursor al ncleo (azul) y este radioncleo
est emitiendo radiacin particulada, estas partculas tienen una determinada energa cintica y son
capaces de impactar sobre otras molculas y desestabilizarlas. En la autorradiografa se cubre el
material biolgico con una emulsin (blanco) sensible a la radiacin, en general esta condicin la
cumplen las emulsiones fotogrficas. Entonces, se pone muy pegada a la clula una emulsin
fotogrfica que se seca y queda como una capa. Esta emulsin es sensible a la luz y a la radiacin, no
se ennegrece con la radiacin, sino que se sensibiliza, cuando esto pasa, se debe revelar con un
revelador fotogrfico que lo que hace es reducir los granos de plata de la emulsin a plata metlica,
adems el revelado tiene un proceso de fijacin con hiposulfito que saca toda la plata que no fue
reducida a plata metlica, que no fue sensibilizada. De manera que se tiene en la zona impactada por la
radiactividad grnulos negros y se vern sobre la clula, no exactamente dentro del ncleo, sino que
encima.
Entonces los pasos que tiene la autorradiografa son:

E incorporacin del marcados.
E inmersin en emulsin fotogrfica.
E exposicin: que dura dependiendo de la emulsin, del marcador ,de la resolucin de la tcnica y de
la temperatura entre 1 semana y algunos meses. Es ms rpido el tiempo de exposicin a 4 C que a
temperatura ambiente. Para autorradiografa a nivel de M.E. demora entre 3 semanas y 1 1/2 mes de
exposicin a 4 C.
E revelado.
Se puede realizar tambin una contra tincin.
La tcnica de la autorrqadiografa, que no es muy recomendable por la radiacin, ha aportado los
grandes conocimientos respecto al ciclo celular y cintica del ciclo celular.
La demostracin de la BrdU incorporada comprende aplicar un Ac especfico contra la BrdU y un
sistema marcador. Aqu no hay emulsin y se ven las clulas directamente marcadas.
Si tenemos una poblacin de clulas en activa proliferacin, supongamos un cultivo en su fase de

crecimiento exponencial. Esto significa que si se siembran clulas a una baja densidad, con suero fetal,
factores de crecimiento y todos los estimulantes, estas clulas por el hecho de haber sido sembradas a
baja densidad, haber sido tritiadas previamente en otro cultivo, es un estimulo para proliferar. Entonces
la curva de crecimiento va a ser as:
Supongamos que son clulas normales, no transformadas. Y luego, cuando se produce la confluencia,
cuando se tocan unas con otras sufren una inhibicin por contacto y la poblacin celular tiende a
estabilizarse en un plateau. En la fase de crecimiento exponencial hay mayor cantidad de proliferacin.
Si analizamos esas poblaciones en fase de crecimiento exponencial, las poblaciones son asincrnicas,
es decir, no importa que todas hayan sido estimuladas en el mismo momento, no van todas en el misma
etapa del ciclo, algunas van en S otras en G1, otras van partiendo, otras se quedaron en reposo, eso pasa
especialmente en las poblaciones transformadas en cultivo y en condiciones in vivo, esto pasa con
mayor frecuencia, son totalmente asincrnicas. En cultivo, con estrategias especiales se puede
sincronizar poblaciones, pararlas en un determinado momento, juntarlas todas en una determinada
etapa del ciclo con un factor de inhibicin y luego levantar el bloqueo y partir, logrando poblaciones
sincronizadas. Se entiende entonces que las poblaciones en crecimiento son asincrnicas.
Entonces vamos a tener clulas que en un momento dado van a estar saliendo de S, estn en G2
entrando a M, unas que estn completamente en S, otras que estn en G1 y a esa poblacin que aun no
ha entrado a S se le dar la BrdU, que ser incorporada slo en las clulas que estn pasando por S. Si S
dura 7 horas, el pulso debe ser proporcionalmente de 3 - 3 30 horas, slo algunas clulas van a
incorporar la BrdU, si una clula est saliendo de S ya no va a incorporar. Esto se debe tomar muy en
cuenta al hacer el anlisis de resultados. Una clula que estaba en este punto cuando se dio el pulso
alcanz a incorporar poco lo mismo que una que vena de all que alcanz a estar poco rato mientras se
daba el pulso y otra en cambio, como estas dos, alcanzaron a incorporar un poco ms, pero estas dos
incorporaron todo lo que era posible incorporar durante las 330 horas. La ventana de observacin
corresponde al perodo de tiempo en que se agrega la BrdU.
Las aplicaciones que tiene esto son numerosas, se pueden hacer estudios tanto de la fraccin
proliferativa, es decir determinar el porcentaje de clulas de la poblacin en fase S:
Fraccin S = porcentaje de clulas en fase S
Podemos determinar utilizando estrategias especiales la duracin del ciclo celular. Esto se puede hacer,
slo incorporando BrdU o timidina, estudiando el nmero de mitosis marcadas. Si se da en el punto O
un pulso, comienza el recuento de la siguiente manera: se tiene varias cpsulas de cultivo, se da el

pulso y se saca una cpsula o un cubre objetos, se fijan y se procesan. Se hace lo mismo a los distintos
tiempos seleccionados. Luego se observan y se cuenta el nmero de mitosis en cada una. La curva que
se obtendr ser similar a la que se muestra arriba, donde pasa un tiempo (1 hora) en que no va a haber
nada, luego empiezan a haber clulas positivas hasta llegar a un mximo, luego se estabilizan y
finalmente empieza a bajar el nmero de clulas con mitosis marcadas. Pasa el tiempo, sigo sacando
cpsulas y no se encuentra nada hasta que en un momento comienzan a aparecer nuevamente mitosis
marcadas, se estabilizan y comienzan a bajar. Se debe tomar en cuenta que se trabaja con una poblacin
asincrnica. En el momento que se dio el pulso, las clulas que estaban entrando a S incorporaron la
timidina tritiada y sus mitosis marcadas aparecieron despus de un tiempo, son las primeras mitosis
marcadas que se observan y las ltimas mitosis marcadas que se observan corresponden a las mitosis de
aquellas clulas que cuando se dio el pulso estaban saliendo de S. Entonces, el tiempo en que no hay
mitosis marcadas corresponde a G2 y el plateau corresponde a S. Sabiendo que la mitosis dura
habitualmente 1 hora, teniendo G2 y S, se puede calcular la duracin de G1, que adems es el tiempo
ms variable. Con slo la autorradiografa y contando el nmero de mitosis marcadas se pudo
determinar la duracin del ciclo celular y de cada etapa.
Anlisis del ciclo celular- BrdU:

Se puede hacer una serie de anlisis del ciclo, incluso la BrdU se puede leer en un citmetro de flujo.
La reaccin de la BrdU no necesariamente tiene que ser con un cromgeno, si no que puede ser con
fluorescencia, el marcador final puede ser fluorescena.
Los citmetros son capaces de leer la emisin de luz y leer muchas clulas, lo que es ventajoso pues al
leer un mayor nmero de clulas, estos estudios estadsticos presentan menor error estndar.
Al hacer un estudio con microscopia de imgenes de campo claro o de fluorescencia, se cuenta un
nmero de clulas limitado, aproximadamente 100-200 clulas, y eso produce un error estadstico
importante. Es posible en aparatos automticos como los citmetros de flujo hacer recuentos de cientos
de miles de clulas en mucho menos tiempo lo que baja el error estadstico, la diferencia est en que en
los citmetros de flujo se tienen que usar clulas en suspensin, pero difcilmente es capaz de
diferenciar clulas tumorales de las que no lo son.
Hay estudios compuestos, como el que se presenta, donde se utiliz BrdU con FITC v/s la marcacin
con yoduro de propidio. Usando los dos marcadores se puede obtener grficos como este.
Finalmente la citometra de flujo se reduce al anlisis de grficos.
En este grfico se representa la intensidad de marcacin con BrdU y con yoduro de propidio. Se ve que
una clula en fase G1 tiene una cantidad de DNA marcado con yoduro de propidio con respecto a una
clula en la fase G2 igual a la mitad, con una cantidad de DNA igual a 2c. Y el intervalo entre ambas
ser S. Se encuentra adems que la incorporacin de BrdU ser en S y lo que es yoduro de propidio
est fundamentalmente en G2. Podemos decir tambin que en G1 hay mayor cantidad de clulas que en
G2. Si desde este grfico aislamos los datos de yoduro de propidio, encontraramos una curva as:
Partiendo de la base que se trabaja con una poblacin celular normal, la mayor parte de las clula est
en G1, una menor proporcin est en G2/M y una cantidad menor aun est en S. Esta es la distribucin
habitual de las poblaciones cuando se mide intensidad de fluorescencia de acuerdo a la marcacin del
DNA.
La incorporacin de los marcadores por la clula es generalmente por pinocitosis, pues los marcadores
estn disueltos en lquidos. La incorporacin del marcador se hace previo a la fijacin.
En los cortes el tejido est permeabilizado porque fue fijado y deshidratado, permitiendo que los
anticuerpos penetren. En el caso de las clulas en cultivo (clulas enteras), si se fijan con un fijador no
coagulante no hay penetracin del Ac, entonces hay que permeabilizarlas, para lo que existen varias
formas como con detergente o con etanol. Dependiendo de la forma de fijacin, a veces, como en el
caso de la tripsina requiere como forma de permeabilizacin cortar molculas para permitir que el Ac
pase o denaturar el DNA para permitir el paso hasta el DNA marcado.
HIDRATOS DE CARBONO, GENERALIDADES
Los hidratos de carbono son compuestos orgnicos de origen biolgico formados
por carbono, hidrgeno y oxgeno. La importancia biolgica de estos compuestos se
encuentra en la formacin del glucocalix, proteoglicanos en las membranas, hormonas y
constitucin de la lmina basal.
Qumicamente, los carbohidratos corresponden a polihidroxialdehidos o
polihidroxiacetonas. Su origen se encuentra en las plantas como resultado de la fotosntesis.
Existen muchos tipos de hidratos de carbono, los que se clasifican principalmente segn 1:
el nmero de unidades elementales que los constituyen: monosacridos glucosa,
manosa, fructosa, etc. ; oligosacridos ( 2 o ms monosacridos) lactosa, sacarosa,
maltosa, etc. ; polisacridos (muchos monosacridos) almidn, celulosa, glicgeno,
etc.
por el grupo funcional: aldosas glucosa, galactosa, arabinosa, etc.
cetosas fructosa, etc.
por el nmero de tomos de carbono que constituyen el monosacrido: triosas, hexosas,
pentosas, heptosas, etc.
Estas clasificaciones, que representan caractersticas estructurales de su molcula,
sern de mucha utilidad para el posterior reconocimiento de los carbohidratos.
Los carbohidratos se pueden encontrar en forma cclica, ramificada o formando
estructuras de mayor complejidad, unindose covalentemente a lpidos o a protenas 1. Un
ejemplo de estas molculas son los mucopolisacridos, los cuales estn formados por dos
unidades de monosacridos modificados, asociados con protenas. De esta manera, se
encuentran las glicoprotenas (larga cadena proteica unida a numerosas oligosacridos) y a
los proteoglicanos (largas cadenas de polisacridos unidos a un pequeo core proteico)
cuyas unidades son los GAGs (cido hilalurnico, condroitn sulfato y keratn sulfato). Los
GAGs, estn formados por cidos urnicos y por acetilglucosamina, lo que le confiere
propiedades qumicas que influyen en las tcnicas de su identificacin, por ejemplo, ser
PAS (-).
Cualquier alteracin en los carbohidratos, ya sea en su produccin o en su
estructura, se reflejar en una patologa. De esta manera, se tienen cuadros como
alteraciones enzimticas, glomerulopatas, amiloidosis e incluso neoplasias, en donde es
fundamental su deteccin para de esta manera clasificar a la neoplasia, ver su grado de
malignidad e incluso, en el caso de metstasis, averiguar su procedencia. De este modo, se
han desarrollado diversas tcnicas que permiten la deteccin y reconocimiento de
carbohidratos y de sus tipos. Es as que la tcnica ms general y ms usada es el PAS para
la deteccin de glicgeno, para la identificacin de proteoglicanos se puede desarrollar el
mtodo de Alcian Blue (distintos pH para la identificacin de distintos grupos qumicos),
metenamina de plata para la identificacin de glicoprotenas de la lmina basal, mtodo del
rojo congo alcalino para la identificacin del amiloide, etc.
El presente informe tiene como objetivo el desarrollo de los mtodos antes
sealados, con el anlisis respectivo de sus mecanismos de accin y la interpretacin de sus
resultados.
Mtodo para la identificacin de glicgeno: reaccin del cido
perydico de Schiff (PAS)
Materiales y mtodos
Para la identificacin de glicgeno mediante el mtodo de PAS, se utilizaron trozos de
hgado directamente sacados de un ratn. La fijacin del hgado se realiz en fijador de
Rossman durante 16-20 horas a 4 C. Posteriormente, se deshidrataron los tejidos en
etanoles de escala ascendente, se colocaron en xilol como lquido intermediario (2 baos), y
se incluyeron en paraplast. Se realizaron cortes de 4 en un micrtomo rotatorio. Se realiz
la tcnica de PAS indicada en gua Mtodos de Histoqumica 2 pg. 39 con y sin tincin
nuclear (tincin nuclear empleada fue hematoxilina de Mayer), PAS con digestin
enzimtica de amilasa salival (gua Mtodos de Histoqumica 2 pg.40.) y H-E.
Mecanismo de accin
Fijador de Rossman: los fijadores a base de alcohol, cido pcrico y formalina son los ms
recomendados para la fijacin del glicgeno y carbohidratos en general. Este es el caso del
fijador de Rossman, ya que es a base de estos tres elementos. El alcohol precipita al
glicgeno, dejndolo insoluble al agua. El cido pcrico y la formalina fijan a las protenas
tanto las que estn unidas al glicgeno como las que estn en el resto de la clula.
Importante es que al utilizar el fijador de Rossman, la perdida de glicgeno por
solubilizacin en agua es mnima, por lo tanto, hay una mayor cantidad de glicgeno que se
conserva en comparacin con la utilizacin de otros fijadores (ej. Bouin, formaldehdo). El
fijador de Rossman es uno de los pocos fijadores que precipita al glicgeno en un medio
soluble como el agua. Tambin, el fijador de Rossman no dispersa el glicgeno, es decir,
favorece su forma macromolecular y/o su unin a protenas.
Reaccin de PAS: el cido perydico oxida selectivamente a los grupos OH unidos a
tomos de carbono adyacentes. De esta manera, mediante fisin de enlaces carbono-
carbono intermedios con produccin de dos grupos aldehdos. Vale la pena mencionar, pese
a que no es el momento, que ste es el paso que falla en los proteoglicanos, porque falla la
oxidacin de las formaciones glicol en C2-C3 en los cidos urnicos. Estos aldehdos
reaccionan con el reactivo de Schiff formando un compuesto coloreado: el grupo aldehdo
reacciona con el metabisulfito, formando un compuesto bisulfito, el cual va reaccionar con
el reactivo de Schiff. Entonces, el compuesto bisulfito va a perder un grupo hidroxilo y va a
formar un nuevo compuesto estable llamado cido amino alquil sulfnico derivado de la
pararrosanilina.
Digestin con amilasa: la amilasa es una enzima que degrada el glicgeno.
Resultados
Descripcin hgado de ratn H-E.
Se observan dos cortes de hgado de ratn, donde se aprecia la arquitectura normal del
hgado: lobulillos hepticos adjuntos a una vena central y al espacio porta. Los hepatocitos
se ven de citoplasma muy granular, eosinfilo, disgregado, los ncleos son redondos,
basfilos, cromatina granular y nuclolo prominente, algunos son binucleados. La
morfologa est medianamente conservada.
Descripcin hgado de ratn PAS con tincin nuclear, sin tincin nuclear y con digestin
enzimtica amilasa.
Leyenda:
+ : reaccin de intensidad leve. --- : reaccin negativa
++: reaccin de intensidad moderada.
+++: reaccin de intensidad fuerte.
Nota: las sustancias PAS positivas presentan un color rojo prpura, por lo que es ste color
con el que se compara la reaccin.
PAS sin tincin PAS con tincin PAS con digestin

nuclear nuclear enzimtica amilasa
Localizacin Citoplasma de los Citoplasma de los Citoplasma de los
sustancia a hepatocitos hepatocitos hepatocitos
identificar
Comparacin Fucsia morado Morado fucsia Blanco. Existe una
con control tonalidad muy suave
de rosado
Intensidad +++ +++ ---
reaccin
Especificidad S S no
reaccin
Fracaso --- --- No hay reaccin debido
reaccin y a que el glicgeno, que
posibles causas es la sustancia a
identificar, fue
degradado por la
amilasa
Interpretacin de los resultados
En el hgado de ratn, al realizar la reaccin de PAS result positivo. Sin embargo, para
comprobar que la sustancia positiva era glicgeno, se realiz un control negativo utilizando
digestin enzimtica con amilasa, la cual va a degradar al glicgeno. Posteriormente se
realiz otro PAS, el cual result negativo. En conclusin, la sustancia positiva era
glicgeno, ya que, al ser degradado por la amilasa, el siguiente PAS realizado no tuvo con
qu reaccionar y dio negativo.
Discusin
La utilizacin del fijador de Rossman dio excelentes resultados en
comparacin con otros fijadores utilizados (Bouin). Efectivamente, otorgo una buena
distribucin del glicgeno en la clula conservando tambin su morfologa. La cantidad de
glicgeno en los hepatocitos que se ve con el fijador de Rossman es mayor que la cantidad
de glicgeno que se ve con el fijador de Bouin (en donde se ve al glicgeno desplazado
hacia un polo de la clula). El hecho de tener alcohol entre sus componentes hace necesario
evitar las corrientes de difusin, para lo cual se guarda a 4C. ahora, todo esto es importante
debido a los distintos tipos de glicgeno que existen ( glicgeno fcil de fijar, asociado
fuertemente a protenas, cuya estructura es ms grande, se encuentra en mayor cantidad en
el hgado; y el glicgeno difcil de fijar, poco asociado a protenas, de estructura ms
pequea y soluble).
La presencia de glicgeno en la clula se determin realizando el mtodo de PAS y

se comprob realizando digestin enzimtica con amilasa. Esto es de gran importancia, ya
que se ha descrito en la literatura que la reaccin de PAS no es especfica, est sujeta a dar
positiva con no solo los grupos aldehdos del glicgeno, sino que con otros grupos
aldehdos formados en la clula. Por lo tanto, la realizacin de un control es fundamental
para asegurar que lo positivo es glicgeno.
Mtodo para la identificacin de glicoprotenas de la lmina basal:
metenamina de plata.
Materiales y mtodos
Para la realizacin de esta tcnica, se emplearon trozos de cuello uterino humano,
los que haban sido fijados en formalina. Estos tejidos se deshidrataron en una escala
ascendente de etanoles, se colocaron en xilol como lquido intermediario (2 baos), y se
incluyeron en paraplast. Se realizaron cortes de 4 en un micrtomo rotatorio. La tcnica
realizada a continuacin es la sealada en gua Mtodos de Histoqumica 2 pg.53-54 con y
sin tincin nuclear (tincin nuclear empleada fue hematoxilina de Mayer). Tambin se
realiz PAS con tincin nuclear y sin tincin nuclear y H-E.
Se realiz un control de la tcnica de metenamina de plata utilizando rin de ratn fijado
en Bouin.
Mecanismo de accin
El cido perydico oxida selectivamente a los grupos OH unidos a tomos de
carbono adyacentes. De esta manera, mediante fisin de enlaces carbono-carbono
intermedios con produccin de dos grupos aldehdos. As, al haber aldehdos libres, la plata
interactua con estos grupos reduciendose a plata metlica.
El mecanismo de accin del mtodo de PAS puede leerse en mtodo de
identificacin del glicgeno.
Resultados
Descripcin cuello uterino humano H-E.
Corte histolgico de tero, donde se advierte la unin escamo columnar, quistes de

Naboth, arriba de ellos hay un gran infiltrado inflamatorio. El epitelio del exocervix tiene
una marcada acantosis y paraqueratosis.
El endocervix tiene largas zonas de epitelio cubico simple, pero en zonas se ven
nidos celulares cuyas clulas son globosas, citoplasma claro, ncleo redondo basfilo claro,
nuclolo prominente, hay ncleos alargados muy basfilos cuya cromatina est condensada.
Otros ncleos son pequeos, basfilos, cromatina descondensada. Todos estos
ltimos se encuentran en la misma zona de las clulas globosas.
Descripcin cuello uterino humano metenamina de plata con tincin nuclear y sin
tincin nuclear (descripcin PAS ver mtodo de identificacin de glicoprotenas).
Leyenda: ver mtodo de identificacin del glicgeno; reaccin de PAS.

Metenamina de plata Metenamina de plata
sin tincin nuclear con tincin nuclear
Localizacin Lamina basal de Lamina basal de
sustancia a epitelios de epitelios de
identificar revestimiento y revestimiento y
glandulares (endo y glandulares (endo y
exocervix). exocervix).
Comparacin Gris oscuro Gris oscuro
con control
Intensidad + +
reaccin
Especificidad s, aunque hay otras s, aunque hay otras
reaccin estructuras estructuras
impregnadas en el impregnadas en el
tejido. tejido.
Fracaso
reaccin y ---- ----
posibles causas

El cuello uterino humano presenta una suave lamina basal, la que se observa
levemente en el corte. Para descartar que la baja intensidad de la reaccin se debi a
fallas tcnicas con la solucin de metenamina, se realiz conjuntamente con la
impregnacin del cervix, una impregnacin de rin de ratn, el cual s present una gran
impregnacin de su lamina basal. Por lo tanto, la suavidad de la lamina basal que se
observ en el cervix, se debe a que ste tejido presenta menos cantidad de glicoprotenas en
su lamina basal en comparacin con el rin. Esto es debido a las diferentes funciones que
realizan ambos tejidos, por lo que van a necesitar distintas magnitudes de lamina basal.
Discusin
El significado que tiene en patologa la identificacin de la membrana basal en los
tejidos es muy grande, sobre todo en patologas como la glomerulonefritis. La realizacin
de tcnicas como la metenamina de plata es muy til para la identificacin de laminas
basales mediante la identificacin de glicoprotenas asociadas a esta estructura. La lamina
basal y, por lo tanto sus constituyentes (entre ellos las glicoprotenas), varan segn el tejido
de que se trate, ya sea por mayor aumento en su rol estructural, soporte, organizaciones, etc.
Es importante que para la realizacin de esta tcnica, el tejido conserve su reactividad para
que de esta manera, reaccione otorgando grupos aldehdos al medio. De esta manera, hay
que tener precaucin en el tratamiento del tejido.
Fundamental es la utilizacin de controles positivos en esta tcnica, para asegurar el
correcto resultado de la reaccin. Cualquier alteracin en la solucin de metenamina puede
provocar falsos positivos que perfectamente pueden ser detectados y evitados mediante el
uso de controles.
Mtodo de identificacin de glicoprotenas: PAS
Materiales y mtodos
En esta tcnica se empleo cuello uterino humano fijado en formalina e
incluido en paraplast. Los cortes que se realizaron fueron de 4. Los mtodos realizados
fueron PAS con tincin nuclear, sin tincin nuclear ( segn lo indicado en en gua Mtodos
de Histoqumica 2 pg.39) y H-E.
Mecanismo de accin
Las glicoprotenas tienen asociado azucares neutras como manosa y glucosa. Unidas
a las protenas hay monosacridos que pueden ser glucosamina (PAS -) y galactosa (PAS
+). stas estn unidas a cido silico, el que tiene grupos hidroxilos vecinos capaces de
formar aldehdos y, por lo tanto, dar PAS +. En resumen, las glicoprotenas son PAS +
porque la galactosa y el cido silico tienen grupos OH, los que sern oxidados por el cido
perydico. De esta manera, se generaran grupos aldehdos por fisin de enlaces carbono-
carbono intermedios. Estos aldehdos reaccionan con el reactivo de Schiff formando un
compuesto coloreado. Para ms detalles ver mtodo de identificacin del glicgeno;
reaccin de PAS.
Resultados

ver Mtodo para la identificacin de glicoprotenas de la lmina basal: metenamina
de plata.
Descripcin tero humano PAS con tincin nuclear, sin tincin nuclear y con digestin
enzimtica amilasa.

PAS sin tincin PAS con tincin
nuclear nuclear
Localizacin Citoplasma clulas Citoplasma clulas
sustancia a cbicas del endo y cbicas del endo y
identificar exocervix. exocervix.
Cornificacin del Cornificacin del
epitelio del exocervix epitelio del exocervix
Comparacin No se realiz control. No se realiz control.
con control An as, la reaccin dio An as, la reaccin dio
color fucsia morado. color morado fucsia.
Intensidad +++ +++
reaccin
Especificidad S s
reaccin
Fracaso
reaccin y ---- ----
posibles causas

Las glicoprotenas se distribuyen en el citoplasma de las clulas, en la superficie de
las membranas plasmticas y en la lamina basal. Son estas zonas las que, pese a que no se
ven en detalle, se ven rosadas fuertes, por lo tanto, resultaron ser PAS (+).
Discusin
Una crtica del protocolo realizado en este mtodo es la no utilizacin de un control
negativo que me asegurara que la sustancia que dio PAS (+) fueron las glicoprotenas y no
otras estructuras celulares.
Esta tcnica del PAS no es especfica para glicoprotenas, por lo que se debe realizar un
control.
Ya que se esta identificando glicoprotenas, es fundamental la correcta eleccin del fijador:
alcohol + cido pcrico + formaldehdo, para que las glicoprotenas se conserven bien y
para que se oligosacrido unido no solubilice en el agua y que, por lo tanto, se precipite.
Tambin, la conservacin del tejido es muy importante para el xito de la reaccin (buena
conservacin de su reactividad).
Mtodo para la identificacin de proteoglicanos: mtodo del alcian
blue pH 2.5 y 1.0 .
Materiales y mtodos
Para la realizacin de esta tcnica se utiliz cuello uterino humano, fijado en formalina e
incluido en paraplast. Los cortes que se obtuvieron fueron de 4.
Las tcnicas realizadas son las indicadas en gua Mtodos de Histoqumica 2, pg. 40-41
para alcian blue pH 2.5 (con y sin tincin nuclear) (tincin nuclear fue hematoxilina de
Mayer), y pgina 41 para alcian blue pH 1.0 (con y sin tincin nuclear).
Se realiz una metilacin a 37 y 60C seguida de la realizacin de alcian blue pH 2.5,
como se indica en gua Mtodos de Histoqumica 2 pg.46 .
Tambin se realiz H-E.
Mecanismo de accin
El alcian blue se une a grupos carboxilicos y sulfnicos del cido silico de los
proteoglicanos. Debido a los distintos pK de estos grupos:
pK carboxilo = 2.6
pK Sulfnico = 1.5
se puede realizar una identificacin selectiva de estos grupos a distintos pH:
pH 1 = se detecta grupo sulfnico
pH 2.5 = se detecta grupo carboxilo y sulfnico.
No se une a los cidos nucleicos debido a su tamao (muy grande para entrar en los
surcos).
Metilacin: a 60C por esterificacin de los grupos carboxilo y por hidrolizacin de los
grupos sulfnicos, a esta temperatura quedan no reactivos los grupos carboxilo y
desulfatados los sulfatos (no reactivos).
A 37C se produce una esterificacin de los grupos carboxilo dejando reactivos solamente
los grupos sulfnicos.
Resultados

ver Mtodo para la identificacin de glicoprotenas de la lmina basal: metenamina
de plata.
Descripcin tero humano PAS con tincin nuclear, sin tincin nuclear y con digestin
enzimtica amilasa.

Alcian blue pH Alcian blue pH Alcian blue pH Alcian blue pH
2.5 1.0 2.5 metilacin 37 2.5 metilacin 60
C C
Localizacin Citoplasma de Citoplasma de Citoplasma de
sustancia a clulas epiteliales. clulas epiteliales. clulas epiteliales. ----
identificar Secreciones Secreciones Secreciones
glandulares glandulares glandulares
Comparacin Calipso calipso calipso ----
con control
Intensidad +++ ++ + ----
reaccin
Especificidad S s s ----
reaccin
Fracaso Debido a la alta
reaccin y ---- ---- ---- temperatura, los
posibles causas grupos carboxilo y
sulfnico
quedaron no
reactivos, por lo
que no hay
reaccin.

Alcian blue a pH 2.5, ya sea con o sin tincin nuclear, muestra una gran zona
calipso en el citoplasma de las clulas epiteliales y en las secreciones glandulares, que
corresponde a proteoglicanos, especficamente a reaccin de sus grupos carboxilo y
sulfnico, ya que a ste pH, se detectan ambos grupos por su pK.
Alcian blue a pH 1.0, ya sea con o sin tincin nuclear, muestra una menor zona
calipso (en comparacin con AB pH 2.5) en el citoplasma de las clulas epiteliales y en las
secreciones glandulares. Esto sucede as porque a ste pH, se favorece la reactividad de los
grupos sulfnicos de los proteoglicanos, debido a que su pK se asemeja ms al pH (pK es
de 1.5). los grupos carboxilo quedaran no reactivos a este pH, por lo que la reaccin se
produce slo con los grupos sulfnicos, por esto es menor la intensidad.
Con la metilacin a 37C sucede esto mismo, ya que a esta temperatura se favorece
slo la reactividad de los grupos sulfnicos, debido a que los grupos carboxilo se han
esterificado. Con la metilacin a 60C no se ve nada ya que se ha perdido la reactividad de
ambos grupos, por lo que no hay lugar a una reaccin.
Discusin
La identificacin de proteoglicanos es muy importante en el estudio de componentes
de la lamina basal y el la identificacin e interpretacin de patologas como los
adenocarcinomas. De esta manera, el diagnostico aumenta su eficiencia si se logra precisar
en que grupos es ms rico la patologa.
Mtodo para la identificacin de amiloide: rojo congo alcalino y

Rojo congo alcalino pretratado con permanganato de potasio
Materiales y mtodo
Para esta tcnica se utiliz un molde de corazn humano fijado en formalina. A este
molde se realizaron cortes de 4. Las tcnicas empleadas son las indicadas en gua Mtodos
de Histoqumica 2 pg. 49 para el rojo congo alcalino (con y sin tincin nuclear
(hematoxilina de Mayer)), y pgina 50 para el mtodo de rojo congo con pretratamiento de
permanganato de potasio. Tambin se realizo H-E.
Se utiliz un control consistente en un trozo de bazo en el cual se saba la presencia de
amiloide.
Mecanismo de accin
El mtodo del rojo congo es una reaccin selectiva porque:
El rojo congo es un colorante de estructura lineal que por medio de puentes de hidrgeno se
une a la fibrilla de amiloide. Esto se realiza gracias a la presencia de grupos OH en
distancias determinadas y peridicas en la molcula del amiloide.
La coloracin que se obtiene es de color rojo ladrillo y, a microscopa de polarizacin es
birrefringente. La estructura plegada de la fibrilla de amiloide, en su mayor o menor
expresin, determina la intensidad de la birrefringencia ( directamente proporcionales).
El permanganato de potasio elimina la unin inespecfica favoreciendo slo las uniones
puentes de hidrgeno.
Resultados
Descripcin de corazn humano H-E.
En el corte de corazn se observa: epicardio, miocardio y pericardio.

El epicardio se ve basfilo muy claro, ncleos basfilos ovalados. El epicardio est
compuesto por varias capas de clulas (5 aproximadas), un poco separadas entre s.
El miocardio presenta dos zonas: una normal eosinfila, ncleos alargados
basfilos, fibras separadas por artefacto de tcnica (dificultad del corte).
El otro sector est basfilo muy claro, fibras separadas (no por artefactos), sin
ncleos. Hay un infiltrado celular entre las fibras. Esta zona corresponde a un infarto al
miocardio y est cercana y seguida del endocardio.
El pericardio se observa eosinfilo claro, normal, sin alteracin.
Descripcin de corazn humano rojo congo alcalino, rojo congo alcalino pretratado con
permanganato de potasio.
Rojo congo alcalino Rojo congo alcalino

pretratado con
permanganato de
potasio
Localizacin
sustancia a ---- ----
identificar
Comparacin Rojo ladrillo suave Rojo ladrillo suave
con control
Intensidad ---- ----
reaccin
Especificidad ---- ----
reaccin
Fracaso No hubo reaccin No hubo reaccin
reaccin y porque no hay amiloide porque no hay amiloide
posibles causas en el tejido. en el tejido.

En el corte de corazn humano no existen evidencias de amiloide, ya que al mirarse
con polarizacin, ninguna sustancia dio birrefringencia. La posibilidad de que la reaccin
haya dado negativa por culpa de errores tcnicos fue descartada parcialmente gracias al
control positivo que se empleo (bazo), el cual fue procesado conjuntamente con el corazn.
Parcialmente porque esta en duda su contenido de amiloide.
Discusin
La amiloidosis es una alteracin compuesta principalmente por protenas. Se ve
como una sustancia hialina extracelular, agrupada principalmente en los vasos sanguneos.
Hay distintos orgenes del amiloide y, por lo tanto distintas protenas amiloidognicas,
dentro de las cuales se destacan las AA y AL. Es aqu donde el permanganato de potasio
juega un rol trascendental, ya que permite separar los tipos de amiloide del amiloide AA, ya
que ste no se tie y, por lo tanto, no da la birrefringencia. Importante para el desarrollo de
la tcnica es la utilizacin de cortes de aproximadamente 8., ya que permite una mayor
intensidad de la birrefringencia. ste ltimo elemento es fundamental en la identificacin
de amiloide, ya que la presencia de birrefringencia es el diagnstico de amiloide. Para
terminar la identificacin de amiliode, se debiera realizar microscopa electrnica y tcnicas
de inmunohistoqumicas para lograr la identificacin del componente amiloideo..
Es bueno tener presente que para obtener resultados ptimos, el amiloide se demuestra
mejor por cortes por congelacin, los moldes antiguos disminuyen la reactividad y que
grandes depsitos de amiloide dan tinciones ms suaves. El tiempo de fijacin no altera los
resultados.
Como todo en histoqumica, es imprescindible la utilizacin de controles positivos que
descarten los errores tcnicos en los casos negativos, como lo que sucedi en este caso, en
que el corazn no tena amiloide y la posibilidad de errores tcnicos fueron descartados
gracias a la utilizacin de un tejido control (bazo) en el cual se analizara su contenido de
amiloide el da de entrega de ste informe.
Glndula salival de ratn
Materiales y mtodo
Se utiliz glndulas salivales de ratn, fijadas inmediatamente despus de ser

extradas en fijador de Bouin. Se incluyeron en paraplast y se realizaron cortes de 4.
Las tcnicas que se realizaron fueron H-E, PAS (ver mtodo de identificacin del
glicgeno) y alcian blue pH 2.5 (ver mtodo de identificacin de proteoglicanos).
Mecanismo de accin
(ver mtodo de identificacin del glicgeno)
Resultados
Descripcin de glndulas salivales de ratn H-E.
Corte histolgico de glndulas salivales de ratn donde se aprecian, las glndulas

submaxilar, sublingual y partida.
La submaxilar se encuentra en la parte superior izquierda del corte; sta es una
glndula mixta, de secrecin mucosa y serosa. Las glndulas mucosas son levemente
basfilas. El ncleo est desplazado a la parte basal, cromatina granular, nuclolo
prominente. Las clulas cerosas son eosinfilas, citoplasma levemente granular, nuclolo
redondo, basfilos, cromatina granular, nuclolo prominente. El ncleo est ubicado
relativamente en el tercio inferior de la clula.
Los conductos que se ven son contorneados y con grnulos, al igual que con los
acinos, ambos tienen las clulas cubicas, eosinfilas, ncleo redondo basfilo central,
cromatina granular.
La glndula sublingual esta compuesta por grupos de clulas, cuyo citoplasma es
claro, granular, levemente basfilo, ncleo desplazado a la base de la clula. Los acinos son
redondos, lumen escaso, ncleo redondo central basfilo. Estas clulas estn organizadas en
grupos ovalados. Los conductos son ms amplios que los de la submaxilar, pero de las
mismas caractersticas celulares.
La partida, ms pequea, est al lado derecho de la glndula sublingual y bajo un
ganglio. Las clulas presentan las mismas caractersticas que las clulas de la submaxilar
(ambas son cerosas). Los acinos son alveolares y junto con los conductos, tienen las
mismas caractersticas citolgicas antes descritas.
En el corte tambin se puede ver un ganglio.
Descripcin de glndulas salivales de ratn con mtodo de PAS y alcian blue pH 2.5.
PAS sin tincin PAS con tincin Alcian blue pH Alcian blue pH
nuclear nuclear 2.5 sin tincin 2.5 con tincin
nuclear nuclear
Localizacin Citoplasma de Citoplasma de Citoplasma de Citoplasma de
sustancia a clulas de clulas de clulas de clulas de
identificar adenmeros adenmeros adenmeros adenmeros
mucosos mucosos mucosos mucosos
(sublingual y (sublingual y (sublingual y (sublingual y
submaxilar) submaxilar) submaxilar) submaxilar)
Comparacin No se No se No se No se
con control realizaron realizaron realizaron realizaron
controles controles controles controles
Intensidad ++ sublingual ++ sublingual ++ sublingual ++ sublingual
reaccin +++ submaxilar +++ submaxilar +++ submaxilar +++ submaxilar
Especificidad S S S S
reaccin
Fracaso ---- ---- ---- ----
reaccin y
posibles causas

Las clulas de las glndulas salivales de ratn muestran un gran contenido de
glicgeno en su citoplasma, el cual se ve PAS (+).
Discusin
Para mayor certeza de que la sustancia identificada fue glicgeno, se debi realizar
un control negativo con digestin enzimtica.
La calidad de conservacin y de precipitacin del glicgeno con el fijador de Bouin
es muy inferior a la calidad obtenida con el fijador de Rossman. En estos cortes, el
glicgeno est ms disperso y ms desplazado hacia periferias celulares.
Bibliografa
-. 1 Varios Autores, Gua de seminarios de Qumica Orgnica, Departamento de

Bioqumica, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, 1997, pg. 184-205.
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Facultad de Medicina, Escuela de Tecnologa Mdica, 2000, pginas 15-19; 24-26.
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E. Ordenes, 18/10/00
Asignatura de Histoqumica,Carrera de Tecnologa Mdica.
-. Cook H., Theory and practice of histological techniques, captulo 11, pg. 180-216.
Identificacin de glucoprotenas y proteoglicanos
Las glicoprotenas tienen una parte proteica (14 60% de su peso) a la que se
encuentran unidas cadenas de oligosacridos relativamente cortas, no ms de 15 residuos de
azucares de composicin variable que generalmente termina en un cido silico seguido de
una galactosa.
La parte proteica de las glicoprotenas es sintetizado en el RER, donde se le transfiere
en bloque un oligosacrido proferido compuesto de 2 acetil-glucosamina, 9 manosa u 3
glucosas. Dado que este oligosacrido siempre es transferido al grupo NH2 de la cadena
lateral de un residuo de asparragina se le denomina N-oligosacrido. En el RER se aade
un mismo tipo de N-oligosacrido a muchas protenas diferentes, este oligosacrido es
posteriormente procesado en el Golgi donde pierden manosa y se les agrega galactosa o
fucosa y cido silico en distinta proporcin. Los N-oligosacridos son los oligosacridos
ms comunes que se encuentran en las glicoprotenas. Menos frecuentes son los
oligosacridos unidos al grupo de la cadena lateral de un residuo de serina treonina o de
hidroxilisina. Estos O-oligosacridos se forman en el complejo de Golgi.
Ejemplos de glicoprotenas:
Protenas de secrecin tanto endocrinas como exocrinas reguladas o constitutivas las
que pueden contener glicoprotenas o proteoglicanos.
Protenas del glicocaliz celular. Glicoprotenas que forman parte de la membrana
plasmtica. Glicoprotenas integrales de la membrana plasmtica que presentan la parte
glucdica hacia el exterior de la membrana plasmtica para extraerlos hay que lavarlos con
detergentes no inicos, tambin existen en el glicocliz, tambin existen proteoglicanos
integrales de membrana y glicolpidos. Habitualmente el glicocaliz contiene a dems
glicoprotenas y proteoglicanos que han sido secretados al espacio extracelular y que luego
son absorbidos en la superficie celular.
Glicoprotenas de matriz extracelular. Laminina que forma parte de la lmina basal,
fibronectina de matriz.
Protenas del suero
Antgenos A y B de glbulos rojos
Enzimas
Protenas de transporte
Receptores
Hormonas
Protenas estructurales
proteoglicanos
Tienen un centro proteico al igual que las glicoprotenas sintetizado en el RER al cual
se unen covalentemente largas cadenas no ramificadas de disacridos llamadas
glicosaminoglicanos (GAGs) se les denomina GAGs porque uno de los residuos del
disacrido siempre es un azcar aminada (N-acetilglucoamina y N-acetilgalactosamina).
En la mayora de los casos este amino azcar se encuentra sulfatado siendo el segundo
residuo un cido urnico (glucurnico, idurnico). Debido a la presencia de grupos
sulfatos o carboxilo en la mayora de los residuos glicoides presentan una gran carga
negativa.
En funcin de dichos residuos glucdicos, el tipo de enlace entre ellos y el ncleo y
localizacin de los grupos sulfatos se pueden distinguir 4 grupos principales de GAGs:
1. cido hialurnico
2. Condroitin sulfato y dermatn sulfato
3. Heparn sulfato y heparina
4. Queratan sulfato
cido hialurnico
Enlace (1-3). Existe en varios en varios estados de polimerizacin. Cordn

umbilical, humor vitreo, lquido sinovial.
Condroitn sulfato 4 y 6
Cartlago, cornea, pared vasos sanguineos, condrosarcomas.
Dermatn sulfato
Mucosa gstrica, tejido conectivo, piel, vasos sanguineos
Heparina
Mastocitos, hgado, pulmn
Keratn sulfato
Cartlago, cornea, disco intervertebral
El componente central del proteoglican del cartlago y matriz extracelular es una larga
molcula de cido hialurnico, unido a el cada 40nm de intervalo estn las molculas de
agregacan, el que tiene un centro proteico que por su dominio amino teminal se une a un
disacrido del cido hialurnico central con alta afinidad, la unin es facilitada por una
protena de unin la cual se une al cido hialurnico y al centro proteico del agregacan. Al
centro proteico de cada agregacan se unen 30 cadenas cortas de keratn sulfato y 17
cadenas ms largas de condroitin sulfato.
Fijacin
En la fijacin de los carbohidratos debemos considerar su estructura molecular y grado
de polimerizacin, unin a protenas y tratamiento que sufrir el tejido en la coloracin a
utilizar.
Se han obtenido buenos resultados con mezclas fijadoras que contienen alcohol, formol
y cido pcrico Ej. Bouin alcohlico, Gendre, Rossman. Tambin da buenos resultados
formol alcohol a 4C.
Formol acetato de sodio al 2% conserva bien glicoprotenas y proteoglicanos pero la
conservacin de la morfologa no es tan buena.
Para la fijacin de frotis se utiliza metanol.
Cuando se trata de identificar glcidos dbilmente unidos a protenas los fijadores
antes mencionados no dan buenos resultados. Para estabilizarlos se utiliza fijadores que
contienen sales de amonio cuaternario que vuelven insolubles a los proteoglicanos
formando complejos insolubles en agua. Se utiliza formaldehdo y cloruro de
cetilpiridinium para preservar GAGs unidos dbilmente a protenas y los proteoglicanos de
una enfermedad frecuentemente llamada mucopolisacaridosis o enfermedad de Hurler. La
fijacin se realiza a temperatura ambiente.
Se fija 24 a 48hrs con bromuro de cetiltrimetilamonio con deoxano y despus fenil +
bromuro de cetiltrimetil amonio.
Congelacin, desecacin o coagulacin sustitucin de buenos resultados para mucinas
particularmente solubles.
Para identificar carbohidratos tres tipos de tcnicas:
1. Utilizacin de colorantes catinicos y reactivos catinicos para identificar residuos

de azucares cidos
2. Mtodo de PAS, azucares neutros presentes en glicgenos y glicoprotenas
3. Utilizacin de lectinas
Todos estos mtodos se utilizan con controles negativos en los que se utilizan
bloqueadores de los grupos a identificar o extracciones con enzimas especficas.
Todas estas tcnicas no identifican a los proteoglicanos, glicoprotenas o glicgeno
como tal, sino que grupos caractersticos de estos carbohidratos como OH vecinos, COO-,
SO4-, etc. Actualmente se caracteriza la parte proteica de proteoglicanos o glicoprotenas
por inmunohistoqumica.
Utilizacin de colorantes catinicos

Alcian blue
Fierro coloidal
Metacromasia
Azul de alcian 8gx es un colorante bsico introducido por Steedman (1950) como
colorante especfico para las mucinas. La composicin qumica no se conoce exactamente,
se sabe que pertenece a la familia de las talocianinas cpricas, las que son pigmentos
altamente coloreados insolubles en agua (color azul). Tienen una alta estabilidad fsica y
qumica. Los tomos C y N forman un sistema de enlaces conjugados estabilizados por
resonancia. La unin del tomo de Cu probablemente se debe a enlaces covalentes.
Las talocianinas estn formadas por la condensacin de cuatro molculas:
1amino-3iminoisodolenina en presencia de cloruro cprico.
Para hacerlo soluble en agua se han introducido diferentes grupos catinicos que
caracterizan los diferentes colorantes derivados de las talocianinas.
Scott (1972) analiz el Alcian blue 8gx y determin que contiene 4 grupos
tetrametilisotiournicos los que le confieren la carga + al colorante.
Tiene un tipo de resonancia donde la carga + es compartida entre el N y C (electrn

que se deslocaliza entre dos centros electromagnticos).
Entre los proteoglicanos y cido silico 3 grupos con carga:
COO- cidos urnicos pK 4,2
COO- cido silico pK 2,6
SO4 pK 1,5
Si estos grupos estn ionizados o no depende del pH.
Mecanismos
Los grupos isotiournicos cargados positivamente se unen a los grupos cidos
reactivos mediante uniones salinas.
La afinidad del Ab por los grupos cidos de las sustancias glucosdicas depende
principalmente del pH de la solucin:
-pH 2,5 se une a los grupos COO- y SO=
-pH 1 solamente a los grupos SO4-, a ese pH los grupos COOH no estn ionizados.
Es posible identificar mucosutancias que son ricas en COO-, cido hialurnico y cido
silico y sustancias ricas en SO4=.
Para identificar las mucosustancias cidas que tienen grupos COO- y grupos HSO4- se
utilizan bloqueos especficos por metilacin.
La metilacin se efecta tratando con los cortes con una mezcla de alcohol metlico
absoluto y HCl. El HCl acta como catalizador. La metilacion tiene doble efecto, por un
lado esterifica los grupos COO- y por otro lado elimina los grupos sulfatados.
Los grupos COO- esterificados por la metilacin se hacen nuevamente reactivos por
saponificacin con K CL H. Los grupos SO3 no se recuperan por saponificacin.
Si se metila a 37C se bloque los grupos COOH y se conserva la reactividad de los

grupos SO3.
Otro efecto de la metilacin es que causa la hidrlisis cida de la mayora de los
enlaces glicosdicos con residuos con cido silico, por eso la perdida de basofilia de las
glicoprotenas que contienen cido silico no puede ser restaurada por saponificacin, al
menos la mayor parte de la basofilia debido a cido silico, por eso la metilacin-
saponificacin es ms til para el estudio de cidos urnicos que de glicoprotenas.
El AB es un colorante catinico muy adecuado para identificar en forma especfica a

proteoglicanos y glicoprotenas sin teir ncleo. La molcula de AB es demasiado grande
para unirse a los grupos fosfatos de la doblehlice de DNA.
Otra ventaja de AB es que forma compuestos muy estables con los carbohidratos, no es
extrado de los cortes por agua, alcohol y cidos dbiles.
El procedimiento PAS es frecuentemente aplicado en tejidos ya teidos con AB.

Fierro coloidal
ste mtodo fue introducido por Haly en 1946, posteriormente a sufrido muchas
modificaciones que le dan ms especificidad al mtodo.
El reactivo se prepara agregando cloruro de fierro a agua hirviendo se forma hidrxido
frrico que no precipita y forma una solucin coloidal.
Las partculas en la solucin coloidal estn positivamente cargadas, as ellas tienen

propiedades similares a las de los colorantes catinicos. Para eliminar el fierro que no ha
formado coloide y los iones H+ y Cl- que pueden interferir en la reaccin se debe dializar la
solucin de fierro coloidal durante 24 hrs en agua destilada. Se utiliza a pH 1,8, las
partculas coloidales se unen a los grupos COO- de los cidos urnicos y cido silico y a
los grupos sulfatados de los proteoglicanos.
Para detectar el fierro que se ha unido al tejido se trata con ferrocianuro de K, se forma
ferrocianuro frrico Azul de Prusia.
La especificidad de la reaccin depende del pH que se utilice, es ms especfico

cuando se utiliza a pH cercano a 2. Para dar mayor especificidad es conveniente dializar.
Es conveniente controlar la especificidad metilando. Si no se dializa suele dar tincin
nuclear y algunas veces se tien protenas dependiendo del pH utilizado.
CARBOHIDRATOS: ESTRUCTURA Y CARACTERSTICAS
IDENTIFICACIN DE GLICGENO
Marioly Mller
1 de Octubre de 2002
Los Hc son la principal fuente de energa en la naturaleza. Se definen qumicamente como

derivados aldehdicos o cetnicos de alcoholes polivalentes y se clasifican segn el tipo y nmero de
productos que se forman al hidrolizar en medio cido.
Principalmente se cuentan los Hc por unidades monosacridas que son la unidad ms pequea.
Al unirse los monosacridos por enlaces glucosdicos se forman los disacridos y oligosacridos que
van entre 2-12 monosacridos aproximadamente y los polisacridos que son cadenas mucho ms
grandes de monosacridos.
Los monosacridos pueden a su vez subdividirse en grupos segn el nmero de tomos de C
que poseen: triosas (CH2O)3, tetrosas (CH2O)4, pentosas (CH2O)5, hexosas (CH2O)6, heptosas (CH2O)7,
etc.
Ahora los Hc tambin se subdividen adems en aldosas y cetosas segn tengan un grupo
aldehdo o ceto. Aqu hay un ejemplo de una glucosa en su estructura lineal en que sera una aldosa
porque tiene un grupo aldehdo y ac, esta otra tiene un grupo ceto y sera una cetosa como en este caso
la fructosa.
D-glucosa D-fructosa
En general, esta ------------ representan estructuras llamadas N-acetales, son cclicos, reacciona el grupo
carbonilo con un OH ya sea del mismo grupo o de otro polisacrido, entonces forman N-acetales.
En general, este sera el C1 del azucar, luego el C2 hasta el C6 y es importante porque el grupo
funcional principal de los Hc son estos grupos OH que van a formar los grupos 1 y 2 glicoles que
vamos a ver son importantes para la identificacin de glicgeno y otros grupos que tambin son
importantes para la identificacin de otros carbohidratos.
Es importante saber que la unin de dos monosacridos ocurre por un enlace glicosdico entre el C1 y
el C6 de otro monosacrido, no siempre es con el C6, puede ser con el C3 o el C4 u otro, pero
generalmente se representa con el C6. No slo va a ser tambin puede ser , lo que depende de la
posicin del OH, si est arriba en el plano va a ser y si est abajo en el plano va a ser , entonces se
va a llamar -D-glucosa o -D-glucosa, dependiendo de la posicin en el plano del OH.
Composicin y clasificacin de las mucosustancias:

Aunque el termino Hc se ha aplicado a todos los azucares y sus derivados, en el tejido las principales
sustancias que estn disponibles son azucares ya sea unidos a lpidos o a protenas o mucosustancias.
Las mucosustancias incluyen:
E polisacridos, que estn compuestos completamente por Hc
E proteoglicanes que son cadenas de polisacridos unidos a un centro proteco covalentemente
E glicoprotenas que son protenas unidas a cadenas de oligosacridos que son mucho ms pequeos
que los polisacridos, tienen hasta 12 monosacridos.
Clasificacin:
La clasificacin es muy diversa. Hoy en da se habla de los Hc y mucosustancias como
glicoconjugados. Los glicoconjugados se subdividen en proteoglicanes y glicoprotenas.
Los polisacridos consisten en muchas unidades de monosacridos unidos por enlaces glicosdicos.
Pueden ser homo polisacridos cuando estn formados por el mismo monosacrido, como por ejemplo
el glicgeno, quitina, celulosa, etc. Un ejemplo es el glicgeno formado por residuos de -
glucopiranosa unidos por enlaces glicosdicos 1-6. Especficamente en este polisacrido el grupo
funcional ms importante es el OH, que forma los grupos 1 y 2 glicoles importantes para su
identificacin.
En el caso de los proteoglicanes, estn compuestos por heteropoliscaridos, a diferencia de los

polisacridos. Cada cadena est compuesta por unidades repetidas formadas cada una de ellas por dos o
ms unidades de monosacridos diferentes. Dentro de la clasificacin de los proteoglicanes estn los
glicosaminoglicanes (GAGs), que son cadenas mas cortas de estos heteropoliscaridos, por ejemplo el
c, hialurnico, condroitin sulfato, dermatn sulfato, heparn sulfato, heparina, etc.
c. hialurnico Heparina
Son disacridos que tienen otros grupos incorporados como grupos sulfatos o c. glucornico, en
general los grupos que tienen incorporados son grupos cidos que le dan una fuerte afinidad a los
colorantes catinicos. Son unidades repetidas. Las dos caractersticas de los GAGs: nitrogenados y que
tienen grupos cidos.
Las glicoprotenas que son las mucosustancias ms numerosas y ms variadas. Son cadenas de 2-12
unidades y las ms comunes son la galactosa y la manosa y el azucar terminal est unido a un centro
polipeptdico. Como ejemplo de glicoprotena estn las Ig, productos secretores, constituyentes del
glicoclix, del colgeno, del amiloide, etc. La demostracin de las glicoprotenas por histoqumica
tradicional est basada en la presencia de grupos carboxilos, hidroxilos o esteres sulfato. En general son
preservados por la mayora de los fijadores.
(Profe Alliende)Las glicoprotenas tienen generalmente azucares que no son cidos. Por eso se pueden
detectar con el PAS, porque tienen azucares neutras y los esteres sulfato de los GAGs.
Fijacin de los carbohidratos:

En general los proteoglicanes son preservados qumicamente intactos por fijadores no oxidantes. Dan
mejores resultados las mezclas fijadoras como la formalina-c. actico o el Bouin, pero la solucin de
formalina sola no da resultados ptimos. Otro de los fijadores utilizados para la fijacin de
proteoglicanos es el cloruro de cetilpiridina, que es uno de los principales fijadores para la
identificacin de proteoglicanes, aunque disminuye la tincin con colorantes catinicos.
En el caso de las glicoprotenas son preservadas por la mayora de los fijadores, pero las mezclas que
tienen agentes oxidantes no deben ser usados porque en general precipita las protenas y altera su
identificacin posterior.
El modo de accin de los fijadores alcohlicos sobre las mucinas del tejido, es que actan parcialmente
por formacin de una red de protenas denaturadas y tambin parcialmente por precipitacin de
carbohidratos (acetato de calcio al 10% en formol al 10%).
Fijacin y preparacin de los cortes para la identificacin de glicgeno:

Existen tres teoras que tratan de explicar el posible mecanismo de accin de los fijadores sobre el
glicogeno. Los tres principales aspectos que explican la fijacin del glicgeno, tambin se aplican a
otras mucosustancias:
E un atrapamiento fsico del glicgeno por la matriz proteinacea circundante. Osea que el fijador
estara actuando ms que nada sobre las protenas del tejido ms que una fijacin directa del glicgeno.
E es fijado por protenas asociadas a l, siempre el glicgeno est asociado a protenas, lo que
insolubiliza al glicgeno y lo deja atrapado.
E sera por deshidratacin, disminuira la solubilidad en agua del glicgeno y lo deja atrapado en esta
red.
En general, se toma como mecanismo principal el atrapamiento del glicgeno en la matriz proteinacea
circundante.
Especficamente, para la identificacin del glicgeno, los fijadores a base de alcohol y c. pcrico,
generalmente favorecen la demostracin del glicgeno, como el Bouin o el Rossman (mezcla de
alcohol, c. pcrico y formol), que es uno de los principales.
En general los fijadores acuosos dan una preservacin adecuada pero no ideal, como el caso del formol.
Entre las condiciones recomendadas que se utilizan para la fijacin del glicgeno, est realizar la
fijacin a 4C y el principal resultado es que minimiza parcialmente el efecto de "streaming", que se
refiere a un efecto de difusin del glicgeno intra citoplasmtico, observndose el glicgeno en forma
no homognea, desplazado en el citoplasma. Se ve una gran diferencia entre una fijacin a temperatura
ambiente y una realizada a 4C.
El tipo de fijador tambin afecta la presentacin del glicgeno en el corte una vez teido. Esto se
refiere a que si se utiliza formalina el glicgeno se ve como partculas ms finas dentro del citoplasma,
en cambio con alcohol se ve mucho ms grueso.
En general como el glicgeno es citoplasmtico se observa en una tincin corriente como la H-E, en el
caso del hgado, en las clulas que tienen menor cantidad de glicgeno citoplasmtico se tien ms
intensamente que aquellas que tienen mayor cantidad de glicgeno. Entonces dependiendo del fijador
utilizado tambin va a afectar como lo vamos a observar en el M.O.
Identificacin del glicgeno:

El glicgeno corresponde a un polisacrido simple, corresponde a D- glucosa y que en condiciones
normales se encuentra en el citoplasma de la clulas. Se encuentra en mayor cantidad en el hgado y en
el msculo cardiaco y esqueltico.
Las tcnicas ms conocidas de identificacin de Hc son:
E PAS E alcian blue
E aldehdo fucsina E diamina de fierro y otras.
En general la mayora de estas tcnicas eran empricas, pero hoy en da se reconoce una reaccin
qumica especifica implicada en la tincin, por lo que han cado en la histoqumica.
Demostracin de glicgeno:
Uno de los mtodos ms utilizados es el uso de enzimas. Se sabe que el glicgeno es totalmente
digerido con amilasa y para eso se utiliza saliva sobre los cortes para la digestin del glicgeno, hoy en
da se utilizan adems enzimas comerciales como la diastasa.
En algunos tipos de glicogenosis, que son enfermedades donde hay un aumento de la cantidad de
glicgeno, un poco distinto se utiliza la peptinasa, que realiza una digestin ms fuerte y especfica
sobre el glicgeno.
Entre los mtodos ms comunes para identificar el glicgeno est el PAS (reaccin de c. perydico de
Schiff), que es uno de los indicadores tiles de presencia de Hc en el tejido y especialmente es til para
la identificacin de glicgeno cuando se incorpora previamente el paso de la digestin con diastasa.
El principio de la reaccin consiste en que el azucar (glicgeno) tiene grupos 1 y 2 glicoles, entonces
mediante la accin de un agente oxidante (c. perydico que se usa al 1%) va a oxidar selectivamente
grupos OH vecinos transformndolos en grupos aldehdos que posteriormente reaccionan con el c.
sulfuroso de la fucsina, la cual se combina con la pararrosanilina para formar el compuesto coloreado
magenta.
Esta tcnica de PAS identifica especficamente azucares neutros, que no contengan grupos esteres
sulfatos, cidos carboxlicos o nitrgenos, y/o c. silico como manosa, galactosa o glucosa. En general
en esta reaccin y otras en que se ocupa un agente oxidante con el mismo fin, el cido perydico es el
oxidante de eleccin porque no sobreoxida progresivamente los grupos aldehdos a c. carboxlicos lo
que disminuira la intensidad de la reaccin de PAS porque habran menos grupos aldehdos expuestos.
Otras tcnicas de identificacin del glicgeno son el carmn de Best (Bests carmine) que en un
principio era emprica y que hoy en da se conoce un poco ms su qumica. Se fundamenta en una
interaccin por puentes de hidrgeno entre los grupos OH del glicgeno y los tomos de hidrogeno del
c. carmnico, producindose tambin a nivel del grupo funcional del glicgeno la reaccin.
Otra de las tcnicas comunes, que se utiliza tambin para M.E. es la de tcnica de hexamina de plata.
Tiene un principio similar al del PAS, hay una oxidacin con c. crmico, lo que tambin produce
grupos aldehdos que reducen la plata-hexamina dejando un fino precipitado negro.
Se han utilizado otros oxidantes como el permanganato de potasio, c. crmico, pero el ms utilizado
es el c. perydico. En general, la tcnica de PAS es la que se ha desarrollado ms ampliamente.
Cuando se forman los grupos aldehdos se rompe la unin entre el C1 y el C2 del compuesto, no queda
unido, y en ese sitio se mete el grupo sulfato de la fucsina, sino no podra reaccionar.
El c. perydico no slo oxida los grupos OH, tambin oxida grupos ceto y oxhidrilos o grupo amino
oxhidrilo. Para hacer la tcnica ms especifica para Hc, hay tcnicas en que se bloquean estos otros
grupos.
El glicgeno no siempre aparece asociado igual en las clulas de distintos tejidos, a veces aparece ms
unido a protenas o menos, en mayor relacin glicgeno- protenas. Segn la fijacin se puede
encontrar como pequeas partculas o en granos ms grandes en el caso de las rosetas (tipo de agregado
de partculas de glicgeno) que son visibles al M.E. Todas esas asociaciones distintas que va a tener el
glicgeno con las protenas dentro de la clula va a intervenir en su facilidad o dificultad para retenerlo
en el tejido al fijarlo. Esto es importante tener en cuenta para saber como es la mejor condicin de
fijacin. Por ltimo, hay siempre una parte del glicgeno que es soluble, bajo cualquier circunstancia,
entonces hay que tener en cuenta que es imposible ver el 100% del glicgeno presente en el tejido.
En cuanto a las uniones del glicgeno son de dos tipos, no son slo 1-6, tambin son 1-4. Las uniones
ramificadas son 1-6 y las uniones lineales son 1-4. El almidn tiene la misma estructura del glicgeno,
pero es ms ramificado.
El glicgeno no es igual en todos los tejidos, es distinto, en el caso del glicgeno del hgado si se fija
con formaldehdo o con otro fijador se ve igual. En cambio en el caso del endometrio, la ubicacin
intracelular del glicgeno antes y despus de la ovulacin varia, despus de la ovulacin, en la primera
etapa, el endometrio secretor presenta el glicgeno en vacuola supranucleares, entonces si se fija con
formaldehdo este glicgeno se pierde, entonces es necesario fijar con Rossman, esto sirve para realizar
estudios de fertilidad.
Hay ciertas patologas en que la enzima es incapaz de cortar el enlace 1- 6, s el 1-4, lo que produce
que el glicgeno quede retenido produciendo problemas metablicos.
La amilasa al digerir el glicgeno no produce glucosa, produce unidades de dos monosacridos, acta a
nivel de los enlaces 1-4, estos disacridos son solubles en agua.
LMINA BASAL: ESTRUCTURA MOLECULAR,
IMPORTANCIA E IDENTIFICACIN DE COMPONENTES
Julieta Gonzlez
En esta clase se va a tratar la parte no celular del tejido conectivo: la matriz extracelular.
En un esquema de piel se ve todos los estratos celulares, desde los ms superficiales hasta los ms
profundos y bajo ese estrato estara toda la zona que parte desde la lmina basal hacia el interior que
sera la dermis. Est mostrando que la mantencin de cualquier conjunto de clulas que presentan una
organizacin requiere de la presencia de adhesiones celulares: desmosomas en la membrana plasmtica
lateral o hemidesmosomas en la baso lateral. Pero no slo existen este tipo de interacciones, hay otras
que estn formadas por otro tipo de protenas que estn participando preferentemente en la superficie
lateral de las clulas.
Como ejemplo se presenta la piel, que presenta diferentes estratos:
-superior, que es cornificado donde ya no hay clulas, slo hay queratina, que es una protena del
citoesqueleto.
-basal, que son clulas en proliferacin constante. En este estrato hay clulas que permanecen y
proliferan y otras que se diferencian y migran hacia los estratos superiores. Para que las clulas se
diferencien se requiere de seales. Estas seales se originan en algn compartimiento de todo este
conjunto celular y no celular y tienen que llegar hasta es estrato basal para que las clulas adquieran un
fenotipo diferente al que tenan y posteriormente las del estrato ms superficial van a ser a adquirir otra
forma hasta llegar a morirse y contener slo queratina.
La lmina basal que es el lmite entre el epitelio y el resto de componentes:
- fibrilares,
- vasos sanguneos,
- vasos linfticos,
- componentes celulares, que son componentes estables de las matrices extracelulares, de los estromas,
como son los macrfagos, los mastocitos, los fibroblastos, clulas dendrticas, etc.
- material amorfo, compuesto por una gran cantidad de agua, rico en proteoglicanos.
La hidratacin de toda esta regin va a estar dada por la capacidad de los componentes de la matriz
extracelular a hidratarse y eso hace posible tambin que todas las clulas puedan migrar a travs de
este gel tridimensional que seran los componentes de la matriz extracelular. A nivel de los capilares
sanguneos y linfticos se va a producir el intercambio ya sea de las molculas que estn siendo
desechadas por el epitelio o de los nutrientes que llegan a este nivel, como glucosa, aa, factores de
crecimiento, citoquinas y todos los componentes solubles que estn en este sistema. Los componentes
solubles son los que mantienen la comunicacin o el dilogo bidireccional entre el epitelio y la matriz
extracelular, que lejos de ser dos compartimentos separados, son prcticamente una sola cosa, donde
hay una comunicacin constante inequvoca de elementos que salen del epitelio hacia la matriz y de la
matriz al epitelio.
Los mastocitos por s solos una fuente productora de una gran cantidad de factores solubles: factores
de crecimiento, citoquinas, hormonas, proteasas, etc. Cada una de estas clulas es un mundo que aporta
componentes al epitelio.
Entonces, dentro del micro ambiente de la matriz extracelular hay factores de crecimiento y citoquinas
que estaran dentro del rango de los factores solubles, libres o unidos a otros componentes; hormonas;
receptores de superficie que comunican a la clula con el resto de componentes de la matriz; molculas
de adhesin libres o formando parte de la membrana plasmtica de los epitelios y proteasas que
tambin pueden estar libres o unidas.
En todo este conjunto de elementos que se han mencionado puede haber una accin:
- local
- sistmica, en el sentido que molcula que son formadas y expresadas en otro epitelio o en otro rgano
lleguen por va linftica o sangunea, en este caso a la piel,
- paracrina (hay una distancia entre las clulas, el producto difunde en la matriz y es tomado por el
receptor de la clula),
- yuxtacrina (cuando hay dos clulas vecinas a cierta distancia y el producto secretado por una de las
clulas nunca queda libre en la matriz, sino que es tomado inmediatamente por el receptor de la clula
vecina),
- producida por la propia clula y tener una accin autocrina.
Hay muchos ejemplos de yuxtacrinos que son secretados y captados inmediatamente. O sea, si se trata
de medir la presin soluble de una hormona o de un factor de crecimiento no va a ser posible porque
no va a estar libre, va a estar siempre de alguna forma ligado al receptor.
Cada tejido tiene una matriz extracelular propia. Si se menciona cualquiera de los elementos, por
ejemplo, molculas de adhesin, sindecanes, proteoglicanos, etc., en algunos tejidos van a ser
privativos o en otros van a ser proporcionalmente distribuidos. Pueden estar ms representados en un
epitelio o en otro tejido que no sea epitelio como el cartlago, adipocitos, msculo, donde cada uno
tiene una matriz que le es propia. Por esto se entiende porque hay clulas que estn cumpliendo
funciones que son tan diferentes. Pongamos como ejemplo el pncreas, que tiene un componente
endocrino y uno exocrino, donde la forma de las clulas, donde la expresin gnica que tienen las
clulas del endocrino, donde la organizacin estructural tridimensional al compararla con el exocrino
es totalmente diferente. Entonces, necesariamente al analizar la matriz extracelular del componente
endocrino y compararla con la matriz extracelular del exocrino, vamos a encontrar que estn formados
por constituyentes diferentes, con niveles de expresin distintos aunque sean los mismos
constituyentes y eso lleva a tener un fenotipo diferenciado y funcional, que en un caso por ejemplo, en
el endocrino haya cierto tipo de clulas que secreten insulina y glucagn y en el exocrino secrecin de
tripsina, quimiotripsina, amilasa, etc.
Anlisis de algunos de los constituyentes de la matriz extracelular

Los constituyentes fibrilares de la MEC (matriz extracelular) son las fibras colgenas y entre los
constituyentes no fibrilares estn las glicoprotenas estructurales y los proteoglicanos.
E Fibras
Las que estn en mayor cantidad son los colgenos. Todos ellos son de tipo fibrilar con la diferencia
que algunos constituyen estructuras que son un tanto diferentes a fibras, un ejemplo de ellos es el
colgeno IV. Hasta ahora se han encontrado ms de 20 tipos distintos. De manera que si se buscan los
colgenos en las diferentes matrices extracelulares, se va a encontrar que hay colgenos no
equivalentes en cada una de ellas. Un colgeno que s est muy representado casi en todas las matrices
es el colgeno I y III. Lo interesante adems, es que ha medida que se han estudiado ms los
colgenos, se ha encontrado que existe una interaccin entre ellos.
Todos los colgenos estn formados por una triple hlice de cadena . La triple hlice es una unidad
que se repite e interactan entre ellas a travs de puentes de hidrgeno. Todas las fibras de colgeno
son ricas en glicina, prolina, lisina, hidroxiprolina e hidroxilisina, estos aa son los que participan en los
puentes que estabilizan la fibra. Tambin hay puentes disulfuro que participan en la estabilizacin de la
fibra.
Las fibras de colgeno pueden tener hasta milmetros de largo.
La cadena es sintetizada en el RER y como cualquier protena, su el mensajero debe tener
informacin para secuencia seal. Dentro del RER se produce adems el ensamblaje de la hlice y
posteriormente es procesada en el Golgi quedando dos extremos equivalentes para finalmente ser
exocitada en vesculas y en la matriz extracelular ser ensambla la fibra.
como ejemplo est la fibra tipo I y II que tienen las caractersticas que se han sealado y si se miran
simplemente por morfologa no se ven diferencian estructurales, pero los componentes de la hlice
son los que tienen distintos componentes aminoacdicos que hacen que las fibras tengan un sello
particular que les permite la interaccin con otros colgenos que no son como los que forman estas
fibras, sino que se forman como hlice, pero despus quedan como estructuras con regiones
flexibles, regiones amino terminales que son globulares, como por ejemplo colgeno IX. En este caso
el colgeno I tiene que tener sitios que permiten el reconocimiento del colgeno IX y entre ellos
ensamblan una trama fibrilar particular en un determinado tipo de matriz extracelular. Y el colgeno
tipo I tiene afinidad por un colgeno formado por ms unidades repetidas que tiene sitios de quiebre,
que es el colgeno VI. Estos dos ejemplos son para ilustrar que los colgenos interactan entre s.
La gran mayora de los colgenos estn codificados por genes diferentes, pero algunos de ellos pueden
deberse a splicing alternativos.
E Lminas basales
Son importantes en la organizacin y funcionalidad de los epitelios. Es una especializacin de la
matriz extracelular.
Tienen una organizacin bsica, pero que no es equivalente en todos los epitelios, en todos los tejidos
que tienen lminas basales.
Se muestra una lmina basal de un epitelio que est formado por una monocapa de clulas, tambin la
lmina basal de la piel puede tener caractersticas semejantes a esta lmina basal. Pero hay lminas
basales que forman parte de los glomrulos renales, en ese caso hay una particularidad de esas lminas
basales que entran en contacto con las clulas endoteliales que son bastante particulares en
comparacin con otras clulas endoteliales y permiten funciones propias que no son las mismas que
ocurren en otros epitelios. Lo mismo si analizamos las lminas basales de las clulas musculares o de
los adipocitos. Cada una de estas lminas basales tiene composiciones distintas, que aunque estn los
mismos elementos hay una enorme versatilidad de posibilidades de formar molculas, que si bien son
isoformas, ellas no estn en todos los epitelios representadas y a veces pueden estar en un epitelio
varias isoformas de un mismo tipo de molculas.
Dentro de lo que es la interaccin de la lmina basal, lo clsico que se conoca era una estructura de
soporte, un andamiaje para la organizacin de los tejidos, eso sigue siendo as. Por otro lado, mantiene
una integridad en las funciones celulares, por ejemplo diferenciacin, proliferacin durante toda la
embriognesis cumple funciones muy importantes, tambin en todo lo que son las respuestas
metablicas, la expresin gnica y un rol fundamental en lo que es la muerte programada y en los
epitelios en lo que es la muerte no programada sino que es producida por dao causado por un agente.
Es importante que los receptores presentes en la superficie de la clula mantengan este dilogo
bidireccional con la matriz extracelular. Como ejemplos estn las integrinas (molculas de adhesin) y
los sindecanes (proteoglicanos unidos a membranas), que participan activamente en el dilogo al
recibir seales y transducirlas.
Entre los componentes mayores estn:
- colgeno - proteoglicanos
- glicoprotenas estructurales -elastina, la presencia de este ltimo componente es
discutido.
La MEC est permanentemente dando un medio dinmico para que se integre la forma del epitelio con
su funcin. No es slo determinar la forma, sino que la forma y funcin como dos elementos que van
unidos muy estrechamente.
Se muestra una microfotografa en que se ha extrado parte de la membrana plasmtica y organelos,
mostrando el lmite de la membrana plasmtica con la lmina basal. Se ve la trama que constituye la
lmina basal, es una trama fibrilar con conexiones directas con los componentes de la membrana
plasmtica.
Dentro de las glicoprotenas que forman parte de esta estructura, hay una familia de protenas llamadas
lamininas, son protenas de alto peso molecular (900 KD) formadas por tres subunidades: , y
(antes llamadas A, B1 y B2). Cada subunidad tiene dentro de su organizacin zonas globulares y otras
que son fibrilares. Las cadenas polipeptdicas de las distintas zonas tienen diferentes secuencias, por lo
tanto tienen informacin para interactuar con molculas particulares. En el ejemplo se muestra que una
zona globular de une ciertos tipos de colgenos, lpidos sulfatados, integrinas y una molcula que
cuando se descubri se llam entactina y hoy se conoce como nidgeno (glicoprotena). Se ver la
importancia de esta molcula en la organizacin tridimensional de la estructura de la lmina basal.
En el dominio globular de la subunidad , hay una zona que interacta con un proteoglicano presente
en todas las MEC, que es el heparn sulfato. La zona globular de la subunidad tiene interaccin con
colgeno tipo IV, que es un componente estructural de las lminas basales.
Hoy en da se conoce 15 isoformas de laminina. Cada una de ellas con una combinacin de las
subunidades , y (1, 1, 1, 2, 2, 2, etc.), incluso estas subunidades pueden ser diferentes
tejido a tejido. Lo interesante es que hay tejidos que en su lmina basal pueden coexistir ms de un tipo
de isoformas de laminina, incluso en regiones. Por ejemplo, en la zona en que estn los
hemidesmosomas, existe un subtipo de laminina cuya distribucin no es equivalente en el resto de la
lmina basal. Si bien la lmina basal se dibuja en los esquemas como una lnea continua, realmente son
parches de diferentes tipos de molculas. Lo que hace ms interesante a esta protena para comprender
las funciones que tiene al activar procesos celulares, ya sea de diferenciacin, proliferacin, expresin
gnica, etc. Tenemos que pensar por un lado en la fisiologa, pero tambin en que ocurre cuando se
altera esta interaccin, todo lo que le puede ocurrir a una clula cuando hay una mutacin en la
subunidad , en la zona globular de interaccin con el nidgeno. Esta parte globular presenta 4
dominios y cada uno de ellos interacta con molculas particulares.
Cualquier modificacin que hay en la interaccin de la lmina basal con los receptores de adhesin, se
va a ver reflejado en el comportamiento celular.
Se muestra un esquema del sitio donde la laminina interacta con el nidgeno 1. Esta zona
polipeptdica es altamente compleja. Hasta ahora se han descrito dos molculas de nidgeno: 1 y 2. No
son slo molculas polipeptdicas con un amino terminal y con un carboxilo terminal, sino que son
estructuras que se van repitiendo y que en algunos casos, como en este caso en el extremo carboxilo
terminal, no son equivalentes y esto hace la diversidad de ellas. Pero cumplen funciones que se han
descrito que son homologas en cuanto a funcin. No todas las lminas basales tienen nidgeno 1 o 2,
hay algunas que tiene ambas. Todo esto va incrementando el nivel de complejidad y de diversidad que
hay entre las especies.
Se muestra un esquema de la malla que forman las molculas de laminina y de la interaccin entre las
lamininas y otros componentes. Estas interacciones necesitan de Ca+2. De manera que si se pone un
quelante de Ca+2 se desorganiza esta malla.
Otra de las molculas importantes que forma una trama polimrica igual que la laminina es el
colgeno IV. Tiene una estructura de triple hlice con la diferencia que tiene ciertos puntos de quiebre,
en el carboxilo terminal (dominio NC1) tiene una estructura globular y tiene una estructura fibrilar en
el extremo amino terminal (dominio 7S). Cuatro molculas de colgeno IV forman una estructura que
es el monmero de lo que va a ser la estructura polimrica que va a adoptar cuando forme parte de la
lmina basal. A M.E. se ve como una red polimrica de grandes espacios, entre los cuales difunden los
nutrientes, las molculas de sealizacin, las citoquinas, etc. de un compartimiento a otro, del celular a
la matriz y de la matriz al celular.
Se muestra un esquema de un epitelio glandular donde se ve la lmina basal como una lnea continua
bajo la membrana plasmtica de las clulas epiteliales y se representa la red polimrica de colgeno IV
y el polmero de laminina. La laminina interacta directamente con un dominio con el nidgeno y
tambin va a interactuar con colgeno IV. Entonces, lo que hace el nidgeno es permitir la interaccin
de estas dos redes polimricas, una de laminina y otra de colgeno IV, o sea la ausencia de esta
molcula va a llevar a una desorganizacin de la lmina basal.
Un proteoglicano representado ampliamente en las lminas basales, es un proteoglicano libre no unido
a membrana plasmtica llamado perlecan. Tiene dominios que interactan con el nidgeno y otros que
interactan con el polmero de laminina y de colgeno IV.
Otra molcula muy importante es la fibronectina. Puede interactuar a travs de las lminas con la
membrana plasmtica de las clulas. Est presente en el resto de la MEC y puede interactuar con todas
las clulas que forman parte de la MEC. Hay una gran cantidad de isoformas y variantes de splicing de
fibronectina. Normalmente est formada por un dmero y una de las subunidades a nivel del carboxilo
terminal forma dos puentes disulfuro que mantienen unidas las dos cadenas. Se conocen ya los sitios
de interaccin, puede unir fibrina, heparn sulfato, colgenos estromales, integrinas, etc. Es una
molcula importante cuyas isoformas son tejido especficas y pueden modificarse durante el
desarrollo.
Los proteoglicanos estn formados por un eje central proteco que interacciona con azucares
llamados glicosaminoglicanos (GAGs) por las estructuras que forman. Las GAGs estn formados por
dmeros que se repiten. Algunos de ellos son el
- cido hialurnico: formado por el cido glucornico -N- acetilglucosamina.
- heparina y heparn sulfato: formados por cido glucornico o cido yudornico - N-
acetilglucosamina o N- sulfo-D-glucosamina.
Todas estos dmeros se pueden repetir muchas veces. El nmero de repeticiones es variable en una
matriz y de matriz a matriz, tambin es variable en el tiempo.
Los GAGs contienen grupos hidroxilos, carboxilos, sulfnicos, etc. en gran cantidad. Todos estos
grupos tienen en comn ser polares, interactan con el agua, por lo tanto mantienen la hidratacin de
todas las MEC. Son los que acumulan el agua de los tejidos.
En el eje central proteco hay un a. a., que es la serina, que tiene un grupo hidroxilo en su cadena
lateral
y este grupo permite formar una unin de tipo O- glicosdica con el GAG, y lo que lleva en la primera
parte son los azucares xilosa-galactosa-galactosa y luego varan. Entonces la cadena polipeptdica en
ciertos tramos tiene que tener serina para poder unir el GAG.
El agrecn es el proteoglicano presente en todas las articulaciones y tendones. Esta compuesta por una
larga cadena de cido hialurnico (GAG no sulfatado) al que se le unen proteoglicanos. La unin es a
travs de uniones de tipo O- glicosdica entre una serina y el cido hialurnico. Los proteoglicanos que
forman el agrecn tienen dos zonas, una con el GAG presente que es el queratan sulfato y en la zona
que va ms hacia el extremo est el condroitin sulfato. El agrecn tiene una organizacin que otorga
una gran resistencia y por otro lado facilita la migracin celular, adems adopta una gran hidratacin.
Hay proteoglicanos que estn presentes en la superficie como componentes de membrana plasmtica y
tienen como caracterstica ser concentradores de factores de crecimiento que pueden estar largo tiempo
en las MECs y son presentados a sus receptores en el momento que la clula sufre alguna modificacin
o es activa.
Cuando se produce una desorganizacin en la lmina basal, en un primer momento va a haber una gran
liberacin de factores de crecimiento, pero a la larga va a haber una perdida de ellos y la clula que se
mantiene normalmente con ellos diferenciada o proliferando, va a disminuir su funcionalidad y la
expresin de esos genes, incluso llegando a adoptar la va de la muerte celular.
El sindecan es el proteoglicano que est siendo ms estudiado porque se ha visto que tienen una
interaccin y participacin con algunos isotipos de integrinas, sobre todo el sindecan 4.
En esta organizacin para mantener una estructura y funcin son crticos los contactos que mantienen
la sobre vida, el crecimiento, la proliferacin, etc. Por otro lado las molculas de adhesin celular
(MAC) van a mediar el contacto, la recepcin y la transduccin de seales. Cuando ocurre una
transformacin maligna, la clula se transforma independiente de su MEC porque pierde las
interacciones, dndole una conducta de proliferacin y de adquirir un fenotipo diferente como por
ejemplo desarrollarse en un medio en que en estado no transformado no se podra haber desarrollado,
pudieran ser menos susceptibles a apoptosis o estn detenidas en alguna etapa del ciclo o ciclando
permanentemente.
Hay modificaciones en el patrn de proliferacin , en el de migracin, en la capacidad de invadir la
lmina basal, tienen menor capacidad apoptticas, no estn detenidas en alguna etapa del ciclo y son
capaces de desarrollarse en nuevos medios.
Hay familias de MAC:
- integrinas: formadas por dos subunidades: y . Hay una gran diversidad de estas subunidades por
lo tanto grandes posibilidades de conformar diferentes dmeros y esto lleva a que tengan diferentes
funciones dependiendo de las distintas interacciones con las clulas. Por lo general las integrinas
tienen en la subunidad dominios de unin a tres a. a. que estn dentro de la nomenclatura RGD
estableciendo una interaccin fsica, pero a travs de otras propiedades que tienen estas molculas son
capaces de interactuar con molculas que estn hacia el lado citoplasmtico. El dominio citoplasmtico
es muy pequeo y a este nivel puede interactuar con una gran cantidad de molculas que tambin se
pueden asociar al citoesqueleto.
Normalmente estn distribuidas en la superficie basolateral, ms bien basal de las clulas porque
tienen que interactuar con componentes de MEC, en este caso con fibronectina, pero puede interactuar
tambin con laminina.
Tienen uniones heteroflicas.
- caderinas: tienen uniones de tipo homoflicas porque interactan con molculas idnticas presentes
en clulas vecinas. Las caractersticas de estas interacciones es que a este nivel hay gran afinidad por
Ca+2 y se establecen puentes de Ca+2 entre ambas molculas y eso es lo que hace que permanezcan
estas interacciones estables. De manera que si se pone un epitelio en contacto con algo que atrape el
Ca+2 , estas interacciones fcilmente van a salir. O puede ser que en el medio extracelular se
modifiquen las interacciones o que haya molculas que sean atrapadoras de Ca y se van a
desensamblar esas interacciones. Otra cosa interesante es que estas molculas por el lado
citoplasmtico, al igual que las integrinas, interactan con protenas, entre las protenas con las que
interacta est la familia de las cateninas, estas protenas tienen funciones en transduccin de seales e
incluso pueden llegar como tales al ncleo y activar promotores y encender genes apagados. Hay una
serie de seales mecnicas que pueden modificar o activar el sistema de transduccin de seales.
Inicialmente lo que se conoci en recepcin y transduccin de seales era referido a molculas
agonistas o ligandos qumicos que llegaban a la clula, interactuaban y producan todo un proceso de
transduccin de seales y formacin de segundos mensajeros. Actualmente, adems de eso se adiciona
este tipo de interacciones fsicas capaces por accin mecnica de activar transduccin de seales. En
este caso se llaman E-caderinas porque pertenecen al epitelio.
- superfamilia de las Ig: son las primeras que fueron descubiertas. Tienen una estructura y un
componente muy similar al de las Ig. Lo caracterstico de esta familia es que tienen uniones de tipo
homoflico, interactan dominios semejantes y establecen uniones entre ellas.
- selectinas: son protenas caracterizadas por tener un dominio con la capacidad de reconocer azucares.
Todas las protenas o glicoprotenas que reconocen azucares o que interactan como azucares se las
denomino lectinas. Por eso las selectinas tienen dominios de lectina, o sea hay un sitio que tiene
afinidad para azucares en particular. Hay una diversidad de lectinas, algunas de ellas tienen mayor
afinidad por manosa, por azucares carboxilados, azucares sulfatados, etc. Se usan experimentalmente
para identificar sitios donde haya residuos de azucares o si se quiere conocer la distribucin de
azucares sobre una superficie.
Las interacciones de la MEC se dan a travs de estas MAC y estas MAC que interactan entre s en los
espacios intercelulares, las integrinas, son las que interactan directamente con componentes de la
MEC. Todo esto va a definir el comportamiento del epitelio y del tejido.
Ac tenemos como ejemplo un proteoglicano, sindecan 4, de membrana que es sintetizado en el RER,
glicosilado en el Golgi y tiene toda esta parte que corresponde a los GAGs y especialmente es rico en
heparn sulfato. Se ha visto que tiene por el dominio citoplasmtico interacciones con el citoesqueleto
y se ha asociado con el proceso de transduccin de seales activando protena quinasa C que est
relacionada con activacin de fosfoinositol.
Se muestra una tabla con algunas de las subunidades de las integrinas, como 1, 2 y una larga lista de
subunidades . Se combinan las subunidades y puede formarse la 3 con la 1, la 6 con la 4. La
6 con la 4 forman parte de los hemidesmosomas, lo mismo que la 3 con la 1 y otras protenas.
Entonces en una superficie se puede tener ms de un tipo de integrinas, lo que da interacciones, porque
no todas las integrinas interactan con todos los sustratos, por ejemplo la 3 con la 1 van a
interactuar con colgeno y laminina, pero no con fibronectina, entonces hay especificidad en el
reconocimiento y tambin en lo que va a desencadenar posteriormente.
Este tipo de adhesin es modulada por cambios de actividad y en el nmero de integrinas y los factores
que rompen la adhesin promueven la migracin y la remodelacin de la superficie celular. Si bien en
tejido adulto se relaciona la migracin de clulas como un fenmeno que ocurre en procesos
patolgicos, normalmente en la MEC las clulas se estn moviendo. En el caso de las interacciones en
un epitelio, por ms que tengan adhesiones a la MEC, hay un recambio de componentes que en algn
momento puede gatillar un programa gentico en particular.
En estas interacciones hay inversiones de las integrinas de dos tipos para formar lo que se llama la
adhesin focal. Esto es ms propio de clulas que estn libres, no formando epitelio y los
hemidesmosomas, que si son interacciones con clulas epiteliales. En el caso de la adhesin focal, por
el lado citoslico, interactan con protenas de andamio que establecen interacciones indirectas de las
integrinas con las fibras de actina. En el caso de los hemidesmosomas, no son las fibras de actina, sino
que es la queratina, los filamentos intermedios los que estaran participando en esta interaccin y
tampoco lo estaran haciendo en forma directa sino que a travs de otras protenas que estaran
formando una placa a ese nivel.
Un ejemplo de interaccin es una clula libre con puntos de adhesin focal, estos pueden ser
reconocidos porque hay una enzima que es una quinasa de adhesin focal que puede identificarse con
Acs, esta quinasa est presente slo cuando est formando puntos de adhesin focal.
Algunas molculas de andamio son la talina, vinculina y tensina. Todas actan como intermediarios en
la interaccin con los filamentos de actina.
Si a nivel de la unin integrina- clula de la MEC hay una modificacin o una activacin, se activa la
quinasa de adhesin focal que fosforila sustratos que pueden estar derivando a una serie de otras
seales mucho ms complejas, que van a llevar a encender diferentes programas.
En el caso especfico de los hemidesmosomas que interactan por el lado citoplasmtico con
citoesqueleto de queratina, la interaccin a nivel de la membrana plasmtica no slo es a nivel de las
integrinas sino que tambin con otras protenas. En este momento hay un nmero importante de
protenas en la interaccin para formar los hemidesmosomas, a partir de estas interacciones se generan
tambin procesos de transduccin de seales.
Hay lamininas que estn presentes slo en las regiones donde hay hemidesmosomas y en las zonas
donde no hay hemidesmosomas no estn presentes.
Es necesario considerar las interacciones entre las integrinas con el citoesqueleto que son importantes
en la conducta de las clulas. Para entender esto se han mutado sitios particulares de unin, ya sea en
las integrinas, molculas de matriz o en las molculas de andamio, para ver el comportamiento que
tiene ahora en la interaccin con el citoesqueleto, para ver si son capaces o no de formar adhesiones
focales o midiendo algunas de las molculas que participan en transduccin de seales, si se activa
una u otra va.
Lo otro interesante es el nmero de molculas que hay en la superficie, cuando hay una sobre
expresin o si ocurre una disminucin en la expresin de las molculas de la superficie va a cambiar la
conducta de la clula.
Los sistemas de adhesin focal son muy complejos. Un ejemplo es una integrina inactiva que al
activarse tiene una gran variedad de vas posibles de transduccin de seal que se activan. Muchas de
estas vas son conocidas, pero otras aun no se conocen bien. El sistema de transduccin de seal est
dado por componentes extracelulares, factores solubles, interaccin clula- clula, molculas de
adhesin, etc. Los niveles van a llevar a que una clula pueda progresar en el ciclo, que pueda
diferenciarse o mantener un fenotipo, etc. Hay cascadas unidireccionales, pero hay un sin nmero de
cascadas que estn cruzadas, es lo que se llama conversacin cruzada (cross talk).
Se puede pensar en lo complejo que son estos sistemas imaginndose la cantidad de receptores para
factores de crecimiento que hay en una clula, en la cantidad de diferentes isoformas de integrinas que
se pueden tener, de calidades de lminas basales por diferentes tipos de integrinas.
Para que las integrinas tengan un efecto en las clulas debe ocurrir su agregacin. Cuando se produce
la interaccin lo que desencadena es la agregacin y como agregado ellos van a desencadenar la
respuesta celular, no como dmero.
Es importante que las molculas de adhesin estn expresadas en los niveles adecuados porque cuando
estn sobre expresadas o hay una baja, de alguna forma la conducta celular y la interaccin se
modifica. Este un ejemplo de ello, hay dos lneas de clulas de glndulas mamarias, una lnea de
clulas S1 que expresan en forma normal la integrina 4 y una lnea tumoral que sobre expresa la
integrina 1 y receptores para factores de crecimiento epidermal. Se muestra que si se bloquea la sobre
expresin se puede bloquear el fenotipo anormal.
Identificacin de lmina basal

Para su identificacin se debe buscar sus componentes. Si se hace una reaccin de PAS y la reactividad
es baja o es mucha, indica que hay una alteracin. Entonces, se debera buscar expresin de molculas
especfica de la lmina como es la expresin de laminina, de nidgeno, de colgeno IV. Si se quiere
llegar a niveles cuantitativos necesariamente se tiene que usar RT PCR.
La M.E. ayuda mucho.
Hay muchas enfermedades renales que estn dadas porque las lminas basales del rin estn
formadas por distintas lamininas, entonces en algunos casos hay lamininas que no se expresan en
alguna etapa.
La metenamina de plata sirve para identificar las glicoprotenas de la lmina basal.
La identificacin de colgeno IV se realiza con IHQ.
La remodelacin de la MEC se realiza con proteasas que son bastante selectivas y especificas. Cuando
una clula est sometida a una noxa, se activa la induccin de estas enzimas que son metaloproteinasas
que comienzan a degradar localmente componentes de la lmina basal. Esto se puede producir por el
desbalance de cualquier molcula.
METACROMASIA
Una reaccin se considera metacromtica cuando un colorante tie selectivamente una
estructura tisular con diferente color al que tiene la solucin colorante diluida. Ej: intestino
grueso teido con Azul de toluidina diluido las clulas caliciformes se tien rojas mientras
que el resto del tejido queda azul. En la mayora de los casos el color metacromtico es de
una longitud de onda mayor que el colorante ortocromtico.
Cuando un colorante catinico imparte su propio color a un objeto la tincin es
ortocromtica.
La sustancia que se tie metacromticamente se llama cromtropa.
Para que una sustancia sea cromtropa debe presentar las siguientes caractersticas:
a) tener un carcter cido dado por los siguientes grupos

sulfnicos HSO3 proteoglicanos
carboxilos COO ac hialurnico, ac silico, proteoglicanos
fosfatos HPO3 como RNA y DNA
Otros radicales cidos no confieren carcter cromtropo
b) la metacromasia depende del numero y estado de disociacin inico de los radicales

cidos de la sustancia cromotrpica
c) grado de separacin de los grupos cidos. Se necesita una distancia de alrededor de 5 A
entre los grupos aninicos para que se produzca metacromasia. Si la distancia es menor
que 5 A hay aumento de la metacromasia, si es mayor que 5 A no hay metacromasia.
Caractersticas de los colorantes metacromticos
Generalmente son bsicos. Se conocen mas de 36 colorantes bsicos capaces de inducir

metacromacia los mas utilizados pertenecen al grupo de las tiazinas, oxazinas, azinas,
xantenos como el azul de toluidina, azur A, tionina, azul de cresilo etc. Generalmente se
trata de molculas planares.
El colorante debe ser muy puro por que existen algunos colorantes comerciales que
contienen dos o ms colorantes de modo que la coloracin policroma resulta de la
absorcin selectiva de los componentes de la mezcla y no de verdadera metacromasia.
Verde de metilo colorea el DNA verde y otras estructuras violeta no es metacromtico sino
que normalmente el verde metilo esta mezclado con el cristal violeta.
Existen tambin colorantes cidos capaz de producir metacromasia Ej Orange G, carmn
ndigo, rojo congo, Biebritch Scarlett, etc el mecanismo de accin de la metacromasia
debido a los colorantes cidos se conoce muy poco y es diferente al mecanismo de los
colorantes bsicos.
Para ser metacromtico un colorante debe por lo menos tener un grupo NH2 no sustituido.
No todos los colorantes que tienen grupos NH2 sin sustituir son metacromticos.
El efecto meta cromtico es Hipsocromo, es decir, los colorantes son capaces de aumentar
su longitud de onda, o sea la absorcin de la luz se desplaza hacia las longitudes de onda
mas corta y la transmisin hacia las ms largas.
Factores antagnicos a la metacromasia
a) dilucin del colorante. Las soluciones concentradas de colorantes metacromticos

presentan colores muy diferentes en la soluciones diluidas. Ej: solucin diluida azul de
toluidina azul, solucin concentrada violeta. Por estudios espectrofotomtricos, las
soluciones ms concentradas presentan su mxima absorcin en las zonas de longitud
de onda cortas, soluciones diluidas bandas . En la prctica histoqumica se usa
soluciones diluidas 0,1- 0,01 % el colorante debe estar en una banda .
b) Temperatura. El aumento de temperatura se opone a la metacromasia. Azul de toluidina

al 0,6% a temperatura ambiente violceo, si se hace hervir azul.
c) Presencia de sales neutras como cloruro de K, cloruro de sodio, cloruro de Bario, se

oponen a la metacromasia. Cantidades mnimas de soluciones salinas bastan para
inhibir una reaccin metacromatica. Esta inhibicin esta unida al fenmeno de
competicin entre la sal y los cationes del colorante por la sustancia cromtropa.
d) Agentes deshidratantes como el alcohol son antagnicos. El alcohol una constante

dielctrica ms baja que el agua disminuye la ionizacin y por consiguiente hace
dedesaparecer la metacromasia.
e) Aumento de la acidez tambin dificulta la metacromasia
Para explicar la metacromasia existen muchas teoras. Una de ellas es de Michaelis 1944 y
Sylver 1957.
Segn esta teora los cromtropos son sustancias capaces de favorecer la polimerizacin del
colorante pues como son sustancias con numerosas cargas negativas colocadas en la
superficie y a corta distancia unas de otras favorece la polimerizacin del colorante.
Se sostiene que el agua mantiene unidas las molculas colorantes al deshidratarse se

perdera la metacromasia. El agua interpuesta entre el colorante se cree que es necesario
para modificar la distribucin de los electrones en el colorante de tal manera de reducir la
longitud de onda a la cual la luz es mximamente absorbida.
Prctica histoqumica
Fijador: el fijador es capaz de modificar de manera significativa el grado de metacromasia

Los fijadores ms recomendados:
a) fijacin con subacetato de Pb y formalina
b) alcohol formol
c) bouin alcohlico
d) congelacin-desecacin
colorantes:
los mas utilizados son los derivados de las tiazinas . azul de toluidina, azur A
concentracin 0,1- 0,01
solvente agua o alcohol
ph 0,5 - 7
tiempo soluciones dbiles horas a das
Resumen
La metacromasia depende esencialmente de la unin del colorante a grupos aninicos del

tejido que no tengan una separacin mayor de 5 A.
La reaccin metacromtica se realiza solo para hacer una caracterizacin siempre debe ir
acompaada de otras coloraciones mas especificas para la sustancia en estudio.
La falla en obtener metacromasia se puede deber a baja densidad electrnica y unin a
otros ... .
Uso de lectinas
Los mtodos estudiados permiten diferenciar carbohidratos que contienen determinados

grupos COO-, HSO3 C-OH-C-OH, sin embargo no nos permiten caracterizar un
determinado carbohidrato. Mucho avance en la caracterizacin de carbohidratos se ha
obtenido con el uso de lectinas que son protenas de plantas o animales cuya importancia en
histoqumica yace en su afinidad por azucares terminales especificas conjugadas con un
marcador visible al microscopio de luz o ME (electrnico) las lectinas sirven como un
reactivo histoqumico para visualizar en forma selectiva determinados residuos de azucares
a los cuales la lectina se une
Esquema
La unin de una molcula de lectina a un azcar no compromete una unin covalente, es
similar a la unin antgeno anticuerpo, las molculas de algunas lectinas incorporan Ca o
Manganeso la presencia de estos esencial para la unin del carbohidrato.
Las lectinas son protenas con peso molecular de 20000 a 300000 es posible unir los
marcadores en algunos de sus grupos de amino libre sin interferir con la unin al
carbohidrato.
Los mtodos histoqumicos que usan las lectinas tienen mucho en comn con los mtodos
inmunohistoqumicos.
En el procedimiento ms simple una lectina unida covalentemente con un fluorocromo en
una concentracin 1mg/ ml en buffer ph 7 7,6 es aplicada al tejido por 15 a 60 min.
Tambien se puede utilizar como marcador, enzimas.
Siempre se debe controlar la especificidad de la unin de la lectina, esto se hace utilizando

un control al cual se le coloca en una alta concentracin del azcar a la cual se une la
lectina antes de tratar el tejido en estudio con la lectina, esta no se puede unir al tejido pues
tiene su sitio de unin al azcar ocupado.
Otro control son digestiones enzimticas especificas. Ej en el caso de las lectinas que
identifican ac. silico se utiliza neuroaminidasa
Los estudios con lectinas pueden realizarse en cortes por congelacin o cortes de tejidos
incluidos en parafina. La tincin con lectinas marcadas con fluorocromos generalmente se
utilizan cortes por congelacin, no conviene utilizar cortes fijados en formaldehdo pues da
auto fluorescencia. Hay que fijar en alcohol y acetona.
Las tcnicas que utilizan enzimas como marcadores es aplicable a cortes por congelacin o
tejidos incluidos en parafina fijados en formaldehdo o soluciones alcohlicas, las fijaciones
con formaldehdo debe ser corta.
Con las lectinas se reconoce un monosacrido individual.
Controles enzimticos
Hialuronidasa de origen bacteriano (Streptococus): rompe las uniones glicosdicas del cido
hialuronico causando su depolimerizacin especifica para cido hialuronico.
En cambio la hialuronidasa de origen testicular remueve cido hialuronico y condroitin
sulfato A y C.
Condroitinasa A B C remueve c. hialurnico y condroitn sulfato ...
Heparitinasa remueve heparn sulfato.
Neuroaminidasa
Generalmente se utiliza la enzima proveniente de vibrio colerae. La neuraminidasa remueve

los residuos terminales de cido silico, por eso es posible determinar si la tincin es debida
a cido silico. Sin embargo no todos los cidos silicos son sensibles a la enzima.
Sialoconjugados acetilados en el C4 resisten la hidrlisis con sialidasa. Saponificacion de
los cortes con KOH remueve el acetilo del C4 y permite su remocin por neuraminidasa.
Partes de las sialomucinas resistentes a neuraminidasa contienen c. silico en la forma N
acetil o O- diacil por saponificacin con KOH se rompe los grupos acetilos y el tejido es
fcilmente digerible por neuraminidasa.
Enzimas
Es importante conocer la actividad de la enzima para conocer la fisiologa de la clula,

porque si bien a veces por un lado importa la localizacin por otro lado nos interesa la
actividad. Actualmente, la presencia de enzimas puede seguirse por dos vas: la
inmunohistoqumica, (tiene cada vez ms auge) en que se detecta la enzima como tal, como
protena antignica construyendo un anticuerpo contra la enzima, el problema que tiene es
que muchas veces detecta la protena como tal pero no se sabe si est o no activa, a veces se
puede detectar enzimas en procesos diagnsticos como las metaloproteinasas, que son
enzimas que degradan las protenas de la lmina basal, donde lo que importa es la
ubicacin, si estn en las clulas epiteliales (hay una enfermedad donde hay destruccin de
las clulas de los conductos y los acinos) o si estn en los linfocitos. Pero para detectar si
estn activas hay que realizar una tcnica bioqumica. Otro ejemplo son las caspasas, pero
en este caso, utilizando HIQ si se puede detectar si estn activadas o no, dependiendo de si
ha sufrido protelisis.
Antes lo que se haca era bioqumica pero era muy complicado, ahora las tcnicas son
ms simples y se puede purificar protenas muy chicas mediante electroforesis pequeas
fcilmente por lo que ha habido un auge de la HIQ. De todos modos aun se hacen tcnicas
histoqumicas para realizar diagnsticos, pero cada vez menos.
Cuando uno inicia un estudio enzimtico, primero se caracteriza bioqumicamente la
protena (Km, pH, etc.) y despus se realiza el estudio histoqumica.
En la histoqumica nosotros detectamos la actividad de la enzima. A la enzima se le
agrega un sustrato, y ese sustrato por accin de la enzima puede ser hidrolizado, oxidado,
reducido, y tiene que obtenerse un producto.
1_ Sustrato enzima producto reactivo producto

especfico reaccin + agente final de
primario capturante reaccin
PRP AC PFR(coloreado)
2_ Sustrato enzima PRP +AC PI + Reactivo II PFR
PI: Producto intermediario insoluble sin color
3_ Sustrato enzima PFR

soluble no
coloreado
Es muy importante que el PFR se forme rpidamente para que no haya desplazamiento
desde donde est producindose la actividad de la enzima, porque entonces tendramos una
mala localizacin de la actividad de la enzima. Para esto es importante la concentracin del
agente capturante, si hay poco va a quedar parte del producto de reaccin primario sin
reaccionar, el que puede unirse a otras estructuras del tejido y dar reaccin inespecfica. Si
tenemos mucho agente capturante ste puede en algunos casos inhibir la enzima se puede
unir en forma inespecfica a grupos aninicos.
La reaccin 3 es la que da reaccin ms especfica ya que tiene menos pasos pero no
siempre se puede realizar. Para microscopa electrnica se utiliza est reaccin porque es
muy importante la localizacin.
La reaccin 1 es la ms eficiente.
PRF es insoluble y no tiene color. Debe ser muy insoluble, algunas veces este es
insoluble en agua pero si soluble en solventes orgnicos, entonces aqu hay que montar en
medios acuosos, otros son solubles en agua y en medios orgnicos...
En la reaccin 2 la localizacin es ms mala porque hay un paso ms por lo que puede
haber difusin.
En la reaccin 3 participan enzimas de xido-reduccin. El sustrato cuando est
oxidado es soluble y no tiene color y por accin de la enzima es reducido y se forma un
precipitado que si tiene color. Reaccin simple que da localizacin buena.
Antes de realizar una reaccin enzimtica hay que preparar el tejido y luego hacer la
reaccin y procesos que son posteriores a la reaccin, y en todo ese proceso, preparacin de
tejido, incubacin del tejido y procesos posteriores, nunca hay que olvidar dos cosas:
1. Preservar la actividad enzimtica

2. Mantener la localizacin
Para preservarla tengo que tener todos los cuidados de darle el pH y la temperatura que
sea adecuada, de evitar agentes que la denaturen como la fijacin, pero siempre vamos a
tener que considerar el objetivo de nuestro estudio, podemos perder parte de la actividad en
base a una mejor localizacin.
Para mantener la localizacin podemos considerar dos aspectos, por un lado que
muchas enzimas son solubles entonces con la fijacin se insolubilizan, y por otro lado hay
que mantener tambin la morfologa, porque si no se mantiene no va la actividad de la
enzima no va a ser la adecuada, as que muchas veces sacrificamos la actividad y fijamos
periodos cortos para mantener la localizacin. Siempre est en juego estos dos factores, la
actividad y la localizacin. Si en un estudio nos interesa ver si es ms activa o menos
activa la enzima generalmente no se fija y se usan las condiciones ptimas de la enzima, si
nos interesa la preservacin y la localizacin muchas veces una enzima que tiene actividad
ptima a 37 se estudia a 4C o a temperatura ambiente para que no se produzca una gran
cantidad de producto de la enzima y no haya agente capturante como para capturarlo y se
produzca desplazamiento.
Fijacin.
Entonces, para identificar la actividad de una enzima hay que considerar la

preparacin del tejido. En esta preparacin es importante la fijacin, no todas las enzimas
resisten fijacin, pues, como sabemos, es un proceso denaturante que altera las estructuras
terciaria y cuaternaria y muchas veces se puede modificar el sitio activo de la enzima. Hay
enzimas que si resisten fijacin muy bien, pero otras, como las enzimas oxidativas, en
general no pueden ser fijadas o resisten fijaciones muy cortas (10 min., por ejemplo) y
siempre en fro. Todas las fijaciones de enzimas, largas o cortas, deben ser en fro, si se fija,
por ejemplo 18 horas, a temperatura ambiente no se conserva la actividad. Siempre es
mejor fijar, si se puede, pero eso va a depender del objetivo del estudio, si se quiere
conservar la actividad hay que mantener condiciones muy estables de fijacin y
procesamiento, va a ser muy importante la inclusin que es donde ms se puede perder la
actividad de una enzima por la temperatura, como veremos ms adelante. Entonces, la
fijacin puede tener 3 objetivos:
conservar la morfologa
insolubilizar la enzima
aumentar la permeabilidad de la clula, permitiendo la entrada del sustrato, del
agente capturante y otros agentes que participen en la reaccin, sobre todo si se trabaja con
clulas que estn enteras.
Enzimas oxidativas. Si no se fija se puede tener una serie de problemas, uno de ellos
es que habr desplazamiento de la enzima, la morfologa no va a ser buena y tambin se
observan daos propios de la falta de suministro de oxgeno en mitocondria, donde se
encuentran las enzimas oxidativas, todas las deshidrogenasas, que por esta falta de oxgeno,
rpidamente se inactivarn y no podrn ser identificadas. En este caso, despus de la
extraccin del tejido se debe congelar rpidamente. Los cortes tambin deben ser
mantenidos en fro. En muestras de autopsia muchas veces es difcil hacer estudios de
enzimas, algunas deshidrogenasas pueden mantenerse hasta 6 horas, pero en cadveres de
24 horas los estudios enzimticos ya no tienen ningn valor. Al congelar, es importante que
no haya deshielo pues se pueden perder cofactores (iones metlicos, activadores) que son
bastante solubles y difunden. Entonces, hay que congelar y luego mantener en ambiente
fro, generalmente se guardan a 20 o, an mejor, a 80 C; a 20 C dura unos 7 das y a
80 C pueden durar meses.
Luego de obtener cortes en cristato, stos deben ser mantenidos en fro (dentro del
mismo cristato), hasta realizar la tcnica.
Por factores osmticos se puede producir aumento de permeabilidad mitocondrial y
difundir cofactores o coenzimas como NAD, NADP, FAD, para evitar esta prdida de
factores solubles se agrega agentes protectores como polvinilpironidona o la sucrosa 0,88M
(medio hiperosmtico).
Entonces, lo ms importante es congelar rpidamente y lo ms adecuado es usar
isopentano.
Tejidos sin fijar:
TIPO DE CAUSA EFECTO REMEDIO
INJURIA
Anoxia Privacin suministro de Dao mitocondrial Extraccin y
sangre congelacin
inmediata del tejido
Trmica a) Prdida de a) mantener
cofactores bloque a 20,
a) congelacin y b) Reduccin mejor a 70.
deshielo actividad b) Mantener
b) almacenamiento a enzimtica cortes a 4.
t ambiente c) Prdida c) Guardar cortes
c) calentamiento de actividad mientras se
cortes en secado enzimtica secan en
ambiente
hmedo a 4
Osmticos Tumefaccin Prdida de enzimas Proteccin con
mitocondrial, aumento de solubles soluciones
permeabilidad. hiperosmticas
Fijadores usados.
Se puede usar alcohol y acetona, en algunos casos glutaraldehdo, pero ste es ms

para microscopa electrnica. Tambin hay otros fijadores aldehdicos que preservan bien
las enzimas pero mal la morfologa. Los ms usados son:
alcohol
acetona
formaldehdo.
Se pueden usar de dos formas:
Fijar el tejido a 4 C por tiempos no muy largos que van de 2 a 6 horas
Cortar el tejido en fresco y despus posfijar 10 minutos en acetona fra (ms
usada) o 15 minutos en formaldehdo.
De todas formas siempre que se fija se pierde algo de actividad enzimtica, no se
conserva totalmente, lo que tambin va a depender de la enzima. Se han hecho estudios
cuantitativos en que por bioqumica se ve la actividad enzimtica total sin fijar y se
compara con actividad en homogenizado de tejido fijado para ver lo que se ha perdido.
- Fosfatasas alcalinas:
En tejido fijado con alcohol sin incluir: se pierde 25%. En acetona se pierde lo mismo.
Despus de la inclusin se pierde cantidad considerable, sobre todo con acetona. Entonces,
para fosfatasas alcalinas se recomienda fijar en alcohol. Si no se incluye, tambin se puede
fijar en acetona.
La actividad de la enzima tambin se conserva muy bien con la congelacin-
desecacin, pero sta no permite inclusin.
Con formaldehdo se conserva 80%, pero cuando se incluye hay una prdida muy
importante. En general, los tejidos fijados en formaldehdo no se incluyen.
- Fosfatasas cidas:
Si se fija en alcohol se produce gran prdida de actividad de la enzima, se conserva
slo de un 2-18%. En cambio, con acetona se conserva muy bien la actividad, aunque
cuando se incluye tambin se pierde bastante, 42%.
No slo no se debe fijar en alcohol, sino que tampoco se debe usar en ningn proceso
previo a la incubacin porque se inhibe de una manera muy importante.
Por congelacin-desecacin se conserva mucho sin incluir, pero nada despus de la
inclusin.
Con fijaciones en formol, la morfologa se conserva mucho mejor que con alcohol o
acetona, pero en general no permiten inclusin en parafina porque se produce una gran
prdida de actividad de la enzima. En estudios de tejidos congelados se puede fijar 2-4
horas en formaldehdo de buena calidad, ojal a partir de paraformaldehdo que est libre
de metanol porque algunas enzimas son inhibidas por metanol, sino se tiene
paraformaldehdo se debe usar formol neutro, para que est en la mejor forma para fijar,
forma monomrica, y para que no contenga cido frmico que tambin puede actuar como
inhibidor. Despus de la fijacin hay que lavar muy bien y si no se puede hacer la reaccin
al tiro, se guarda en medios generalmente hiperosmticos que contienen sucrosa y/o goma
arbiga a 4 C, son crioprotectores, se conserva bien la morfologa y actividad enzimtica,
se puede guardar meses. Tambin se puede hacer cortes del tejido fresco y posfijar en los
portaobjetos con formol fro. Si son enzimas hidrolticas se deja secar el corte una media
hora y luego se fija.
Inclusin
Para incluir en parafina se usa alcohol o acetona de 100, a 4 C por 18 horas. La
impregnacin debe ser lo ms corta que se pueda, de una hora y usando parafina de bajo
punto de fusin para que la temperatura de la estufa no sea tan alta (50-52 C). Se puede
usar vaco para disminuir el tiempo. Los bloques deben ser muy pequeos para que se
impregnen bien en tiempos tan cortos. Son pocas las enzimas que resisten inclusin y
siempre hay prdida.
Los cortes se secan por poco tiempo y despus se guardan a temperatura ambiente o
en fro.
ENZIMA FIJADOR ACTIVIDAD ACTIVIDAD

DESPUS DE FIJAR DESPUS DE INCLUIR
F. alcalina Alcohol 4 75%-74% 40% (1hr.), 20% (2
Acetona 4 75%-71% hrs.)
Congelacin- 85%-87% 28% (1 hr.), 20%
desecacin (2hrs.)
29% (1 hr.)
F. cida Alcohol 4 2-18% 7% (2 hrs.)
Acetona 4 78% 42% (1 hr.)
Congelacin- 91% 10% (2hrs.)
desecacin
Mezclas incubadoras.
El sustrato debe estar en concentraciones saturantes, para que se mantenga la

velocidad mxima de la enzima. Se debe usar el pH adecuado (al menos intentarlo), con
enzimas alcalinas usar pH de 8,5-9, hay otras que requieren pH de 7,2, otras son cidas (pH
5), para esto se usan tampones.
El tipo de tampn depender de la reaccin, por ejemplo, cuando se usa enzimas
fosfatasas en que se tienen aniones fosfatos, no es bueno usar bfferes fosfato, porque sos
fosfatos pueden precipitar tambin con el metal que se va a agregar. En este caso se puede
usar buffer acetato o brax.
Cuando se trabaja con una enzima oxidativa, las coenzimas (NAD, NADP, FAD)
propias del tejido son muy escasas. Todas las reacciones de dehidrogenasa se basan en que
sta le quita hidrgeno al sustrato y lo recibe la coenzima y luego el aceptor artificial. Para
esto debe haber una cantidad suficiente de coenzima, cuando sta est unida
covalentemente a la enzima (coenzima FAD de la succinato deshidrogenasa) no es
necesario agregarla a la mezcla de incubacin, pero otras dehidrogenasas no unidas
covalentemente a la coenzima (NAD, NADP) es necesario agregarla al medio.
Tambin se requiere agregar activadores como Mg o Mn que son los ms usados, el
activador que se agregue depende de la enzima.
Adems, las mezclas incubadoras deben contener el agente capturante, que puede ser
un metal o un compuesto reducible como una sal de tetrazolium u oxidable como la
diamino bencidina (DAB). Es muy importante la concentracin, para que no inhiba a la
enzima y, a la vez, tenga una visualizacin adecuada.
Controles.
Controles negativos:
Supresin de sustrato. Si no hay sustrato la enzima no va a actuar y lo que se
vea no va a ser producto de la actividad de la enzima.
Uso inhibidores especficos. A veces, una misma familia de enzimas, por
ejemplo las fosfatasas alcalinas, no todas se inhiben con el mismo inhibidor,
algunas se inhiben con levamisol, otras con cistena, no son tan especficos.
Para fosfatasas cidas muchos usan fluoruro se sodio.
Calor. Si se calienta unos 10 minutos en agua hirviendo todas las enzimas se
inhiben.
El uso de controles negativos es muy importante porque muchas veces pueden verse
precipitados que tienen el mismo color que el producto que se forma en la reaccin y no es
debido a la actividad de la enzima.
Control positivo:
Se usa un tejido que se sabe que tiene abundante actividad de la enzima en estudio.
Por ejemplo, las dehidrogenasas son muy abundantes en rin, hgado, corazn; las
fosfatasa cidas y alcalinas son abundantes en rin e intestino.
Clasificacin de enzimas.
CLASE TIPO DE REACCIN

Oxidorreductasas Transferencia de electrones
Transferasa Transfieren grupos qumicos
Hidrolasas Hidrolizan uniones
Liasas Adicionan grupos a dobles enlaces
Isomerasas Transfieren grupos dentro de la molcula
Ligasas Formacin de C-C, C-S, C-O y C-N en
racciones de condensacin unidas a degradacin
de ATP.
Enzimas hidrolticas.
Hay distintos tipos:
Fosfatasas:
Catalizan la hidrlisis de steres y amidas de cido fosfrico.
Fosfatasas alcalinas: hay especficas e inespecficas, nosotros estudiaremos las

inespecficas que hidrolizan monosteres y requieren estar a pH entre 8 y 9-9,5. Hay
fosfatasas alcalinas especficas como la ATPasa, que acta a pH 7,2 y su sustrato especfico
es ATP.
Fosfatasas cidas: las inespecficas actan a pH 5 y especficas. Catalizan la

hidrlisis de uniones ster entre cidos carboxlicos y una variedad de alcoholes y fenoles.
As, tenemos familias de esterasas, colinesterasas, lipasas, etc.
Estos van a ser nuestros productos de reaccin primarios: un alcohol y un fosfato y

vamos a ver dos tipos de identificacin de la fosfatasa alcalina en que ocupamos ambos
productos, el alcohol y el fosfato.
O
enzima
R O P OH R OH + H2PO4
H2O
OH
pH ptimo 8,8 - 9,4

Activadores: Mg+, Mn++, Zn++
Inhibidores: EDTA, L-cisteina, levamisol (uno de los ms utilizados), tetramisol. No se
inhiben todas las fosfatasas alcalinas sino la mayora de ellas.
Ubicacin (controles positivos): tbulos proximales del rin, endotelio de las arterias,
chapa estriada del intestino, etc.
Pretratamiento del tejido
*Fijacin en alcohol de 100 a 4C por 18 horas

Inclusin en parafina 1 hora
*Fijacin formol neutro 2 a 4 horas a 4C (cortes por congelacin)
*Fijacin formol Ca Baker 2-4 horas a 4C (formol neutro ms calcio 1%)
Muy importante realizar un lavado cuidadoso de al menos una hora y luego realizar
cortes por congelacin.
Tejido sin fijar se corta en cristato o en micrtomo de congelacin, pero cuando se
trabaja con enzimas oxidativas hay que cortar con cristato porque el CO2 la inhibe.
Tejido sin fijar se monta en portaobjetos, se deja secar por 15 minutos y se fija en
acetona por 10 minutos.
La actividad ms alta de las fosfatasas alcalinas se obtiene cuando se realiza
congelacin desecacin o congelacin sustitucin (ms difcil).
Tambin se puede usar formaldehdo por 15 min.
Mtodos que se utilizan para ver la actividad de la enzima:
Mtodos que utilizan sales metlicas (Gomori 1946-1952)
Es muy usado pero no es el mejor, es ms barato.

Puede usarse muchos fosfatos, el ms usado es el glicerofosfato de sodio, tambin
fenilfosfato y naftilfosfato. Hay enzimas con las que es mejor utilizar naftilfosfato que el
glicerofosfato (glicerol unido a fosfato por unin ster).
HO-CH2 O
H C O P O- + H2O fosfatasa alcalina

glicerofosfato
HO-CH2 OH pH 9-9,4
HO-CH2
H C OH + HPO=4
HO-CH2
Glicerol
HPO=4 + CaCl2 CaHPO4 + 2H+ + 2Cl

Incoloro
CaHPO4 + Co (NO3) CoHPO4 + (NH4)S2 CoS
Incoloro
Bajo pH 9 se obtiene un producto ms soluble, se puede usar un pH hasta 8,5 pero es

mejor usarlo a pH 9, porque a ese pH es ms insoluble el producto que se forma por el
producto de reaccin de la enzima con el agente capturante.
Anin fosfato se une a una sal de calcio (no necesariamente CaCl, puede ser otra pero
se ha estudiado la concentracin con esta sal porque no se puede agregar mucho calcio ya
que inhibe la enzima). Se forma fosfato cido de calcio que es insoluble pero incoloro (PI),
es insoluble a pH 9-9,2 pero a pH 8 se empieza a solubilizar (la enzima es capaz de actuar a
pH8), entonces es importante mantener un pH cercano a 9, incluso puede ser 8,8.
Fosfato cido de calcio se le agrega una sal de cobalto (fosfato de cobalto, pero puede
ser otra porque aqu no es tan importante la concentracin), se va a formar fosfato cido de
cobalto, ocurre precipitacin fraccionada (el fosfato de cobalto es ms insoluble que el
fosfato de calcio, entonces si tenemos fosfato de calcio en presencia de una sal de cobalto el
calcio va a tener tendencia a ser reemplazado y formarse el fosfato que es ms insoluble).
Fosfato de cobalto tambin es insoluble e incoloro.
Para detectar este precipitado agregamos sulfuro de amonio el que va a producir un
precipitado de color negro de slfuro de cobalto, que es insoluble en agua y tambin en
solventes orgnicos. De todos modos no debe permanecer mucho tiempo en los alcoholes
ni xiloles durante la deshidratacin porque igual algo se solubiliza, hay que realizar
deshidrataciones cortas (no dejarlo de un da para otro).
Problemas del mtodo
a) Difusin de la actividad de enzima, hay que ser cuidadoso con el tiempo, algunas
enzimas necesitan 10 min, otras 20, etc, pero si las dejamos por tres horas entonces va a
haber gran difusin de la actividad.
b) Difusin fosfato por lenta unin al Ca, se ha realizado muchos estudios (sobretodo en
ME)en cuanto a la concentracin que debe tener de calcio para que la unin a este sea
rpida, no haya difusin y no se inhiba la enzima. Si hay poco calcio va a haber
difusin del fosfato, unin lenta al calcio y unin del fosfato a grupos positivos del
tejido dando reaccin inespecfica.
c) Disolucin fosfato de Ca por usar pH bajo 8.5, bajo este pH el fosfato de calcio es
soluble.
Es una tcnica que siempre resulta mientras se controlen los factores importantes,
como por ejemplo mantener a 37C.
Por qu formol calcio no inhibe a la enzima? Hay trabajos en que se compara formol
con formol calcio y se ve que este ltimo es mejor pero no dan una explicacin. Parece que
el calcio tiene relacin con preservar la reactividad de las enzimas, y probablemente la
actividad del calcio sea distinta durante la fijacin y durante la incubacin.
Mtodos que usan sales de diazonio
naftilfosfato en presencia de fosfatasa alcalina a pH8 (ms adecuado para que se

produzca la copulacin del naftol a la sal de diazonio, no a pH9), entonces vamos a obtener
por accin de la enzima un naftol y un anin fosfato. Ahora se utiliza el naftol (no el
fosfato) en presencia de la sal de diazonio (catin, tiene cargas positivas), por sustitucin
electroflica se une a la sal de diazonio (en posicin para al naftol) para formar un colorante
azoico.
Esta tcnica es la ms adecuada para estudiar las fosfatasas alcalinas, porque tiene un
solo paso, es muy sensible y es especfica. Es una tcnica ms cara.
Existe otro mtodo, el que utiliza sales de tertazolium, que no es muy utilizado
cuando se investiga pero en IHQ y en HIS se usa mucho, tiene algunos inconvenientes,
cuesta interpretarlo.
Mtodos de sales de tetrazolium.
El compuesto que se forma (formazn) no es soluble en compuestos orgnicos por lo

que las preparaciones se pueden deshidratar y aclarar, al contrario de lo que ocurre con las
sales de diazonio. Pero, por otro lado, la reaccin no es tan especfica porque siempre hay
algo de reduccin inespecfica de la sal de tetrazolium.
El sustrato es un grupo indoxil con 4 bromos, 5 cloros, tres indoxil y fosfato. Es un
monoster fosfato. Por accin de las fosfatasas se obtiene indoxil + el grupo fosfato. Para
detectar la enzima usamos el grupo indoxil, que puede estar en forma enlica y por
tautomera puede formar la forma ceto. Dos formas ceto y exceso de indoxil en presencia
de un oxidante como las sales de tetrazolium, se forma un compuesto ndigo que tiene un
color azul dbil. Lo que importa, es que las sales de tetrazolium oxidan los indoxilos,
reducindose a formazn. Entonces, el color de la reaccin est dado por el formazn y el
ndigo, pero ms por el formazn. La sal que se usa es el NBT (nitro blue tetrazolium).
Fosfatasas cidas
Fosfatasas cidas al igual que las alcalinas tambin son inespecficas, actas sobre
monosteres fosfato siempre que estn a pH cercano a 5, pH es mucho ms estricto que
fosfatasas alcalinas, va entre 5-5,5 pero no ms.
Mtodos que utilizan sales metlicas (Gomori 1946-1952)
Es el mtodo ms utilizado porque con las sales de diazonio es muy difcil que se
produzca la copulacin por el pH tan cido.
Con este mtodo al igual que las alcalinas vamos a usar el anin fosfato pero ahora no
lo vamos a unir al calcio porque como vimos el fosfato de calcio es soluble a pH cido,
entonces vamos a usar plomo, cualquier sal de plomo. Anin fosfato ms sal de plomo va a
formar fosfato cido de plomo que es insoluble y sin color. Fosfato de plomo con sulfuro
de amonio va a formar sulfuro de plomo que es negro. Sulfuro de amonio debe prepararse
en el momento de usarlo.
Este precipitado es insoluble tambin en solventes orgnicos por lo que se puede
deshidratar usando alcoholes y aclarar usando xilol por perodos no muy largos.
Mtodos que usan sales de diazonio
Tambin se puede utilizar sales de diazonio pero da resultados inferiores por el

problema del pH.
Se usan naftoles que tiene grupos sustituyentes como el CH3 que hace que estos
sustratos sean ms insolubles que el naftol y sean ms reactivos. Hay distintos tipos de
naftol sustituidos como el Naftol AS-MX, Naftol AS-TR, etc.
Estos naftoles tienen dos ventajas, una es que son ms insolubles entonces para
solubilizarlos hay que agregar solventes orgnicos, de este modo la copulacin es ms lenta
no se va a solubilizar como el naftol y va a poder estar en el medio de incubacin no 10
min como la fosfatasa alcalina sino 2 o 3 horas sin que se desplace. La otra es que es ms
reactivo por los sustituyentes que tiene (sustituyentes positivos). Son ms sustantivos, es
decir tienen ms afinidad por protenas y se desplazan menos.
Naftol fosfato de Naftol + HPO4
Sodio (sustitudo) pH6
Naftol + Ar N = N+ Ar Colorante
Sal de diazonio azoico
Fast Garnet gbc
Pararrosanilina
Hexaziotizaida
No puede ser cualquier sal de diazonio, no todas funcionan. No se usa pH ptimo sino
que se usa pH 6 para facilitar la copulacin.
La reaccin es lenta, la intensidad no es muy buena porque tiene difusin. Los mejores
resultados se obtienen con la pararrosanilina que uno la prepara.
Naftoles sustituidos son ms estables a pH cidos, son ms fcilmente hidrolizables

porque tienen esos grupos sustituidos y soportan incubaciones ms largas porque son ms
insolubles.
Esta tcnica no se usa mucho, y en algunos libros ni siquiera aparece (ej.: Kiernan).
Enzimas Oxidativas (oxidorreductasas)
Participan en el proceso de oxido-reduccin, especialmente todo lo que sea de

respiracin de donde se obtiene la energa que necesitamos para todas nuestras actividades.
Se encuentran principalmente en las mitocondrias, y precisamente como participan en estos
proceso de respiracin en que se necesita oxgeno, son muy sensibles a la anoxia (falta de
oxgeno), resisten muy mal la fijacin, hay algunas excepciones que pueden ser fijadas por
diez minutos aprox pero no ms.
Estas enzimas se siguen estudiando en patologas, por ejemplo en msculo para
establecer el diagnstico en atrofias musculares, se usa ATPasa y deshidrogenasas.
enzima
SH2 + A S + AH2
Sustrato reducido que por accin de la enzima se oxida y se reduce el aceptor.
De acuerdo al aceptor se dividen en 3 grupos:
9 Oxidasas: aceptor es especfico, es oxgeno. Ej. Citocromooxidasa. Sustrato es ms

inespecfico. No permite fijacin.
oxidasa
SH2 + O2 S + H2O
9 Deshidrogenasas: hay toda una familia de deshidrogenasas que participan en el ciclo
de Krebs. Aceptor nunca es oxgeno. Aceptor el NAD, NADP, FAD (coenzimas).
Sustrato es especfico: D.lctica-cido lctico, D.succnica-succinato o cido succnico.
Sustrato se va a oxidar (succinato a fumarato en D.succnica). FAD se va a reducir, en
D.succnica coenzima unida covalentemente a enzima, entonces no hay que agregar
FAD al medio.
deshidrogenasa
SH2 + A AH2 + S
9 Peroxidasa: utiliza agua oxigenada como oxidante y agua como aceptor. Tampoco
son especficas para el sustrato (se utiliza colorantes como sustrato). La peroxidasa
para que oxide este sustrato rpidamente tiene que estar unida al agua oxigenada.
Peroxidasa + agua oxigenada van a oxidar a un compuesto que no es especfico
(compuesto oxidado). Agua oxigenada va a ser aceptor y se va a transformar en agua.
Agua oxigenada sera el aceptor especfico, y el dador sera inespecfico, generalmente
sera la DAB, la bencidina, etc. (compuestos que al estar reducidos son solubles y no
tienen color, y al estar oxidados se hacen insolubles y tienen color).
peroxidasa
SH2 + H2O2 S + 2H2O
9 Oxigenasas: introducen oxgenos en lugares de doble enlace en el sustrato. Ej:

triptofano oxigenasa.
Deshidrogenasas
deshidrogenasa
SH2 + A AH2 + S
Existe un sustrato reducido ms un aceptor oxidado, y por efecto de la enzima vamos a

tener un sustrato oxidado y un aceptor reducido.
Aceptores son NAD, NADP y FAD.
Preparacin del tejido
Puede haber distintos tipos de preparacin, ste es uno de los ms adecuados.
a) Pequeos bloques de tejido. Congelar rpidamente a 70C en propano o isopentano

enfriado con nitrgeno lquido. Corte en cristato. Sin fijar. Si la reaccin no se puede
hacer inmediatamente se guarda a 80C (donde puede durar meses). Tambin puede
ser a 20C pero es menos recomendable y dura slo una semana.
b) Pequeos bloques de tejido sin fijar. 5-10min formol neutro a 4C y de ah cortar en
cristato. No es el mejor mtodo porque se forman cristales y el tejido no da una
ubicacin muy buena. El msculo es bastante resistente a este efecto y no se destroza
mucho.
c) Pequeos bloques de tejido sin fijar (se pueden fijar 5-10min y luego lavar en agua
fra) se congelan en cristato rpidamente a 15C y cortan. El problema es que se
forman cristales grandes y la ubicacin no es muy buena. Los cortes se pueden fijar
brevemente en formol neutro o acetona.
Identificacin de la enzima
Ej.: succino deshidrogenasa
COOH COOH
CH2 CH
Enzima-FAD + Enzima-FADH2
CH2 CH
COOH COOH
cido succinico cido fumrico
Sustrato cido succnico. Participa en el ciclo de Krebs, y es la nica que est unida a
la membrana interna de la mitocondria (las otras estn en la matriz). Tiene como grupo
prosttico (es decir unido covalentemente) el aceptor FAD (no se agrega coenzima al
medio).
cido succnico se oxida a cido fumrico y el FAD se va a reducir.
Nosotros vamos a reemplazar el aceptor por un aceptor artificial que sern en este caso
las sales de tetrazolium (compuestos heterocclicos derivados del tetrazol), las que al estado
oxidado no tienen color y son solubles, y al estado reducido son coloreadas en insolubles y
se llaman formazanes. Estas sales de tetrazolium van a recibir los H del FAD, por lo tanto
tendrn que tener un potencial de oxido-reduccin mayor que el FAD para que el FAD le
pase los protones (potencial mayor que el aceptor biolgico).
Sales de tetrazolium: Son aceptores artificiales que reciben los hidrgenos desde el aceptor
biolgico.
En la identificacin de enzimas deshidrogenasas se utiliza como aceptor sales de
tetrazolium, que son compuestos heterocclicos derivados del tetrazolium. Una sal de
tetrazolium sin reducir es un catin, que en presencia de hidrgeno se va a reducir, se
rompe unin N-N y se reduce. Sales de tetrazolium oxidadas son solubles e incoloras y al
estar reducidas forman el formazan que es insoluble y coloreado.
Las caractersticas que debe tener una buena sal de tetrazolium son:
a) Que sean reductores eficientes, que tengan un potencial de oxido-reduccin alto, ms
alto que el del aceptor biolgico. Dependiendo de la sal va a poder aceptar ms del
NAD o del FAD o de la ubiquinona, etc. dependiendo del potencial de reduccin.
b) Que las partculas de formazn no sean solubles en lpidos (las primeras sales que se
usaban producan formazanes solubles en lpidos que daban ubicacin inespecfica).
c) Que las partculas de formazan sean pequeas para obtener una buena localizacin de
la actividad enzimtica, algunas forman cristales grandes entonces la localizacin de la
actividad de la enzima no es buena.
d) Que sean estables, no alteradadas por la luz.
Todas estas caractersticas son muy importantes de considerar.
En general hay dos tipos de sales, unas que tienen un grupo tetrazolium y otras que son
ditetrazolium, tienen dos grupos tetrazolium. Las que se ocupan generalmente son de
ditetrazolium, y en estas sales si se reduce un grupo dan un color y si se reducen los dos da
otro color, generalmente cuando se reduce un grupo da color rojo y cuando se reducen los
dos da un color azul. En general es mejor que se reduzcan los dos.
Este es el esqueleto bsico de las sales de tetrazolium, que tiene diferentes

sustituyentes y de ah van a ser las variaciones que tenga la sal.
Algunos ejemplos un poco antiguos, probablemente ahora hay algunas mejores, son los
siguientes. Estos eran muy recomendados antes.
Reduccin Solubilidad lpidos Cristales

Yodonitrotetrazolium (INT) Rpida +++ Gruesos
Neotetrazolium (NT) Rpida +++ Finos
Nitro Blue Tetrazolium (nitro-BT) (NBT) Rpida - Finos
Metiltiozolil tetrazolium (MTT) Rpida - Finos
Nitroneotetrazolium (NNT) Rpida +- finos
El ms usado es el nitro blue tetrazolium (NTB), que tiene potencial de xido-
reduccin de 0,05 y puede recibir electrones del FAD, ubiquinona y citocromo b. Este
potencial se da cuando la concentracin de los reactantes es igual a la del producto, si se
aumentan los electrones puede recibir electrones en un estado ms avanzado de la cadena
Mezcla incubadora:
pH 7-7,2 del medio, que no es el ptimo de la enzima (para todas las
deshidrogenasas se usa el mismo), porque pH ms alcalino haber reduccin
inespecfica del NAD (o NADP). Por ejemplo, en msculo hay muchos grupos
SH que actan como reductores a pH alcalino sobre 8,5, lo que provocar
reduccin de las sales de tetrazolium no por actividad de la enzima sino por
los grupos SH, sin embargo, a pH 7 los SH no tienen ppoder reductor.
Buffer Tris.
Sustrato: generalmente anin orgnico como sal sdica, por ejemplo succinato
de sodio o cido succnico pero hay que neutralizarlo con NaOH ara
transformarlo a succinato.
Coenzima: NAD o NADP, hay que agregarlas porque las del tejido son muy
pocas. FAD no porque est unido a la enzima.
Cofactores: generalmente Mg++
Se agrega sucrosa o polivinilpironidona que contribuyen a hiperosmolaridad,
para que no difundan las enzimas
Entonces, la manera de determinar deshidrogenasas es reemplazar aceptor artificial

por una sustancia ms reductora y que en estado oxidado sea soluble e incolora y en estado
reducido sea insoluble y coloreada.
Diaforasas.
Por su accin hay traspaso de electrones desde aceptores biolgicos NADH y

NADPH a las sales de tetrazolium. Si se estudia deshidrogenasa que tienen como coenzima
NAD o NADP, no es necesario agregar diaforasas porque estn presentes en el tejido. Si se
quiere identificar actividad diaforsica hay que agregar NADH o NADPH (reducidos) y la
sal de tetrazolium, si se realiza reduccin de la sal se determina que hay actividad
diaforsica en el tejido, en ausencia de las diaforasas la reaccin es muy lenta. La reaccin
debe ser realizada a pH 7. En el caso del FAD no participan las diaforasas, no se sabe bien
cul es el mecanismo.
diaforasa
NADH o NADPH + sal de tetrazolium NAD o NADP +formazn
Peroxidasas.
Enzimas presentes en peroxisomas que participan en la reduccin del agua oxigenada

formada en la degradacin de cidos grasos. Al reducir el agua oxigenada, oxidan
diferentes compuestos.
Las enzimas oxidativas degradan cidos grasos en presencia de oxgeno y, en este
proceso se produce agua oxigenada, que es txica para la clula.
RH2 + O2 Enz. oxidativa R + H2O2
El agua oxigenada es convertida en agua por accin de la peroxidasa, por lo tanto,

estas enzimas son detoxificantes.
peroxidasa
Alcoholes, fenoles + H2O2 R + H2O
Al reducirse el agua oxigenada, puede oxidar otros compuestos, como los alcoholes.
Para detectarlas se utiliza compuestos que al estado reducido son solubles y sin color y
cuando se oxidan adquieren color (al revs de las dehidrogenasas). Tiene que estar unida el
agua oxigenada a la peroxidasa para oxidar en forma eficiente estos componentes.
Si hay bajas concentraciones de compuestos oxidables actan las catalasas y

convierten agua oxigenada en agua.
catalasa
2 H2O2 2 H2O + O2
Pueden detectarse en tejidos sin fijar o fijados en alcohol de 70 o formaldehdo 4%,

siempre en fro. En general, se usa tejido fijado e formol sin incluir.
Son abundantes en tejido mamario, glndula tiroides, gndulas sudorparas, en

granulaciones de leucocitos, etc.
Identificacin:
Mtodo de bencidina:
Bencidina reducida no tiene color y es soluble, por accin de la peroxidasa en
presencia de agua oxigenada unida a la enzima, se produce la oxidacin de la bencidina
formndose un pigmento azul muy inestable que se llama quininhidrona (cromforo
quinoide), despus de poco tiempo (1/2 hora) adquiere un color parduzco que no es
especfico. Este compuesto puede estabilizarse por unos das con nitroprusiato de sodio.
Mtodo de diamino bencidina (DAB):

DAB al estado reducido no tiene color y es soluble. En presencia de agua oxigenada y
enzima peroxidasa se oxida, formndose quinonas iminas que son inestables. Luego, estas
quinonas iminas forman polmeros que contienen cromforos quinoides. Se observa un
color pardo que puede no ser muy intenso, por lo que se usan intensificadores como el
osmio, cobalto o nquel.
Controles negativos: inhibicin con agua oxigenada a concentracin alta (0,3%) en
metanol.
La DAB es ampliamente usada como marcador: para ICQ, para lectinas.
Hay quienes usan LAC? en lugar de DAB, que al oxidarse da color rojo, pero tiene el
incoveniente de ser soluble en solventes orgnicos y no ser tan duradera la reaccin.
En ausencia de peroxidasa, el agua oxigenada puede oxidar la DAB, pero la reaccin

es muy lenta.
AMILOIDOSIS
16 de Octubre del 2002
Gamaliel Ordenes
Enfermedad caracterizada por depsito de material amorfo, eosinfilo, predominantemente

extracelular.
Material amorfo = sustancias hialinas, ejemplo: fibrina, fibrinoide, colgenas (en ciertas
condiciones). En general son sustancias que aparecen como depsitos desprovistos de
estructuras a microscopa de luz y que se tien con eosina. No es fcil distinguir entre un
elemento y otro (amiloide vs fibrinoide), algunos se depositan en la pared de los vasos
sanguneos y la importancia de diferenciar entre uno y otro es muy distinta, p. ej. Fibrinoide
se ve en enfermedades como la vasculitis y enfermedades autoinmunes, en cambio, el
amiloide es parte de un proceso entre normal y patolgico predominantemente extracelular.
De acuerdo a la forma de presentacin de la amiloidosis se clasifican en:
z PRIMARIA.Idioptica. Afecta msculo, corazn, piel y lengua.

z SECUNDARIA. En artritis reumatoide, TBC, y otras. Afecta hgado, rin, bazo y
suprarrenales
z ASOCIADA A MIELOMA MLTIPLE. Afecta rganos como A. Primaria
z ASOCIADA A TUMORES. Especialmente APUD. Se localiza dentro del tumor
(ej.: ca. medular del tiroides) o en forma sistmica
z FAMILIAR
z ASOCIADA A VEJEZ
z ALZHEIMER
La primaria es idioptica, no se sabe la causa que la produce, lo interesante es la

distribucin atpica que tiene. La secundaria es la ms frecuente, es secundaria a
enfermedades de larga data; tiene distribucin tpica. El mieloma es una neoplasia con
proliferacin de clulas de tipo plasmocitoide, son verdaderas clulas plasmticas bien
diferenciadas que producen Ig. Asociado a esta enfermedad aparece el amiloide compuesto
en gran medida por cadenas lambda de Ig, afecta a rganos como la amiloidosis primaria.
Asociado a otros tumores, especialmente del sistema APUD, est el Ca medular de tiroides,
que crece formando cordones slidos y tpicamente produce amiloide. La gracia en el
diagnstico de ese tumor es demostrar la presencia de amiloide, aparte de otras cosas, como
demostrar que son clulas APUD.
En la amiloidosis familiar hay un componente gentico implicado. La amiloidosis asociada

a la vejez y asociada a enfermedad de Alzheimer (EA) en la que hay prdida de la memoria
reciente en personas relativamente jvenes (40 aos). Uno de los problemas es el depsito
de amiloide en SNC. Hay dos fenmenos tpicos en EA:
Alteraciones de neurofibrillas que forman los tangles (ovillos neurofibrilares)
Depsito de amiloide intercelular.
Composicin qumica del amiloide:
z Agua y solutos simples 75%

z Protena fibrilar amiloidea 18%
z Protenas plasmticas 2%
z Mucopolisacridos 1-2%
z Lpidos (variable) 2-3%
En general, su composicin es heterognea, dependiendo del tipo de amiloide, localizacin,

origen, antigedad, etc. Para determinar la antigedad se considera principalmente el
tamao.
Dentro de las protenas plasmticas se encuentran las Ig; los mucopolisacridos y los
lpidos se consideran contaminantes.
Hay una relacin entre el tipo de amiloide y la enfermedad asociada con determinada
disfuncin:
Correlacin clnico-patolgica en amiloide segn los tipos de protena
amiloidea
Protena Posible precursor Enfermedad Distribucin

amiloidea
AL Cadena liviana Ig Primaria Corazn,lengua,
Asoc. a mieloma rin (distr. atpica)
AA SAA (Suero) Secundaria Rin y vasos (distr.
tpica)
A(MCT) Pro calcitonina Ca.medular Tiroides
tiroides
A (SCA) Senil Corazn
A (FAP) Subunidad Polineuropata Nervios perifricos

prealbmina familiar corazn
rin
AL: amiloide light. El precursor es una cadena liviana lambda completa de Ig; es comn en
mieloma mltiple. Tpicamente las Ig monoclonales son IgM con cadenas lambda.
AA: derivado del precursor amiloideo srico, protena producida por el hgado (es una
prealbmina), es una protena nica y tpica que secreta el hgado. Casi siempre es
secundaria a algn proceso crnico y tiene distribucin tpica.
A(MCT): se ve en el Ca medular de tiroides. Esta est relacionado con derivados de

componentes (hormonas) del sistema APUD, p. ej. a partir de calcitonina se forma esta
protena, as que es muy especfica.
La A(SCA): no se sabe cul es el origen, asociada a amiloidosis de tipo senil, tpicamente

se ubica en el corazn.
La A(FAP) est relacionada con la EA.

Neuropata familiar: hay produccin de una protena especial llamada transtirretina, que es
una forma de transportador capaz de asociarse con otras protenas. Mutaciones en el gen
que codifica para dicha protena puede llevar a la expresin de una protena anormal que
puede precipitar o asociarse con otro tipo de protenas y formar amiloide.
Otros componentes del amiloide
Transthyretin
El amiloide reacciona con yodo de manera similar al almidn con lugol, dando un color
azul. Los rganos con amiloide se incuban con lugol y macroscpicamente se pueden ver
los depsitos de amiloide como puntitos azules (amiloide = almidonoide).
Cuando no est teido el rgano se puede ver translcido, firme.
Ya hemos visto que el amiloide es muy heterogneo, sin embargo, hay dos caractersticas
que comparten ultraestructuralmente.:
Componente fibrilar amiloideo (las colgenas?)

Componente puntiforme (componente P)
Ultraestructura del amiloide
Fibrillas amiloideas
Las dos microfibrillas presentan la misma estructura a microscopio electrnico, a pesar de

que tienen origen distinto.
Protena fibrilar amiloidea:
z Fibrillas AL (amyloid light chain). Proviene de plasmocitos. Generalmente,

contiene cadenas lambda de las inmunoglobulinas
z Fibrillas AA (amyloid-associated). Protena nica, sintetizada por el hgado.
PM:8,5kD, 76 aminocidos. Deriva de SAA (serum amyloid associated) de 12kD
circulante, asociado a lipoprotenas sricas clase HDL3
La protena fibrilar amiloidea
Son barras de 4 elementos rodeados por un componente proteico que forma una malla.
Componente P (puntiforme):
z Es estructuralmente distinto de las fibrillas, pero su composicin est relacionada.

z Aproximadamente 10% del amiloide est formado por P
z Similar a glicoprotena alfa-1 del suero
z Tiene homologa estructural con protena C reactiva
z PM: 180-220kD
Cmo demostramos el depsito de amiloide?
TINCIONES SELECTIVAS
z Reaccin del yodo

z Rojo congo y derivados (X-34)
z Azul de toluidina
z Metacromasia con cristal violeta
z Tioflavina T (fluorescente)
z Tricrmicos: Van Gieson, Masson, PTAH
z Reacin del cloruro de oro yodado
z Colorantes para fibras textiles
TINCIONES INMUNOHISTOQUIMICAS
z Cadenas kappa o lambda

z Calcitonina o insulina
z B2 microglobulina
z Protena B A4
z PrP (protena prion)
La reaccin del yodo se puede hacer tambin en cortes con cristato.
Lo ms importante es el RC por su especificidad. Hay una serie de molculas colorantes

derivadas del RC como el X-34.
Cuando descubrieron el RC, que tie textiles (almidn, celulosa, etc.), descubrieron que
otros colorantes, la mayora, dan reacciones positivas para el RC, aunque no siempre
especficas.
Los tricrmicos tambin son importantes: con Van Gieson, el amiloide se ve amarillo, con
Masson da rojo, con PTH se ve parecida a la colgena, de color rojizo.
Las reacciones inmunohistoqumica permiten determinar la composicin especfica del

amiloide y su origen. Protena B A4 tpica de la EA, protena prion que se encuentra en
encefalitis progresiva de tipo espongitica (vacas locas).
La protena amiloidea tiene conformacin beta plegada, lo que implica que deja ciertos
residuos expuestos al exterior, por ej. Grupos OH, en forma regular. El RC de estructura
lineal, puede unirse a la protena a travs de estos grupos OH. Si se altera la protena de
manera que estos grupos no se expongan regularmente, el RC no se une (mentira!!). La
unin sera por puntes de hidrgeno (uniones dbiles), pero cuando estos grupos son
abundantes se producira una unin apropiada del colorante. Esta forma de unin es
importante, porque el RC puede reaccionar formando enlaces electroqumicos con
componentes del tejido, especialmente citoplasma, pero esta forma de unin no da la
coloracin tpica de color rojo ladrillo ni tampoco da la birrefringencia.
El dicroismo tambin es un fenmeno tpico del amiloide, significa que puede dar dos
colores y funciona poniendo un solo polarizador en el microscopio.
Para hacer diagnstico de amiloide, se debe hacer la polarizacin.
Ojo: cules son las caractersticas tpicas de una sustancia amiloidea?, componentes
ultraestructurales, estructura proteica beta plegada y que se une al RC en forma no
electroqumica dando birrefringencia (RC no tie como colorante, porque no est usando
los auxocromos).
Para mejora la tincin (eliminar el fondo) se maneja el pH, alcalinizando la solucin.

Tambin se pude diferenciar entre el amiloide AL y el AA, haciendo un pretratamiento con
permanganato de potasio desaparece parte de lo que se tie y slo quedan focos teidos con
rojo Congo (RC). Segn esta tcnica, se puede determinar que la amiloidosis ser del tipo
AA, esto es una ayuda aunque no es especfica. La amiloidosis del bazo (nuestra muestra)
evidentemente es una amiloidosis secundaria, toda la parte clnica, el tamao del rgano as
lo indican, sin embargo, pareciera tener un componente AL que desaparece segn la tcnica
con permanganato. Entonces, todas estas cosas no son tan claras porque el amiloide es muy
heterogneo y la caracterstica que comparten es tener estas fibrillas con estructura beta
plegada a la que se une el RC.
Modelo de estructura del amiloide y

tincin con rojo congo
C. Alliende pregunta: entonces este es un colorante cido o bsico? y Ordenes responde:

es un colorantemmm..????.....bsico!. Entonces a la C. Alliende le da un preinfarto y
responde: si fuera bsico, qu pasara si Uds. Para hacerlo ms especfico estn usando
una solucin alcalina? Qu le pasa al colorante? cmo queda la tincin? Si el colorante
fuera bsico, los auxocromos seran los grupos amino; RC se une electoqumicamente a
algunos componentes de las colgenas, pero predomina el grupo sulfato, porque es un
grupo muy cido, el que se une a los grupos amino de las protenas. Si Uds. meten a un pH
alcalino, cmo estn los grupos amino? protonados!, por lo tanto se tiene que usar un pH
cido, si lo tiene a un pH alcalino van a estar desprotonados y no va a tener afinidad por los
grupos sulfnicos. (Uds, sacan sus conclusiones!!!).
Hay una serie de derivados del RC que son molculas parecidas, de estructura lineal. La
tioflavina T tiene un mecanismo de unin similar al RC, pero requiere de un microscopio
de fluorescencia, da fluorescencia bastante intensa.. Con azul de toluidina puede teirse
ortocromticamente, pero al hacer uso de polarizacin, da metacromasia de color rojo; no
se sabe por qu se produce esta polarizacin y tampoco es especfica, as que no tiene el
mismo valor que la reaccin con el RC. Con cristal violeta tambin hay metacromasia, se
postula que esta metacromasia se debe a la presencia de mucopolisacridos en el amiloide.
TINCIONES SELECTIVAS
z Reaccin del yodo
z Rojo congo y derivados (X-34)
z Azul de toluidina
z Metacromasia con cristal violeta
z Tioflavina T (fluorescente)
z Tricrmicos: Van Gieson, Masson, PTAH
z Reaacin del cloruro de oro yodado
z Colorantes para fibras textiles
GLUCOGENOSIS
Se llama glucogenosis a las enfermedades producidas por acumulacin de diversas formas

de glucgeno. Estas son enfermedades que resultan de un trastorno de tipo gentico como
alteracin de un gen que codifica para algunas enzimas, por lo tanto, la falla aqu es
enzimtica.
Clasificacin:
ENFERMEDADES POR ALMACENAMIENTO DE GLUCGENO
Nmero de la izquierda corresponde a la enzima defectuosa segn esquema de pgina

anterior.
. von Gierke (enf. de Cori tipo I)
. Pompe (tipo II)
. Forbe (tipo III)
. Anderson (tipo IV)
. McArdle (tipo V)
. Hers (tipo VI)
. Lewis-Spencer-Peet-Stewart (tipo VII)

La acumulacin de glucgeno se da habitualmente en el hgado, a veces en el msculo y
puede ser glucgeno comn o ciertas formas de glucgeno, dependiendo de la enzima
afectada (esquema).
Si se genera una falla en cualquier nivel, el proceso va a ser ms lento; la falla no puede ser
absoluta porque no sera viable. En todo caso, las enfermedades se dan en nios, porque es
complicada la vida con este tipo de fallas. Dependiendo de la enzima es el proceso que se
va a ver. Por ejemplo, si ocurre una falla en la fosforilasa heptica, la glucogenlisis se va a
detener y va a haber acumulacin heptica. Si falla la enzima desramificante, se va a
acumular glucgeno porque no puede ser cortado en las ramificaciones y se va a acumular
gran parte del glucgeno, la otra parte que s fue cortada se procesa para obtener glucosa.
Hoy se estudian todos estos procesos por mtodos enzimticos, nosotros slo podemos
demostrar la presencia de glucgeno, pero en el hgado y msculo siempre hay glucgeno!.
Los mtodos bioqumicos son ms fciles y permiten tener mediciones cuantitativas.
MUCOPOLISACARIDOSIS
Otras enfermedades que conviene mencionar son las mucopolisacaridosis: acumulacin de
diversos tipos de mucinas. Tambin corresponden a defectos enzimticos de origen
gentico. Todos estos pacientes, casi todos son oligofrnicos, con trastornos del SNC y
presentan compromiso de diversos rganos como el corazn, alteraciones intelectuales,
cambios esquelticos que van de moderados a severos, y hepatoesplenomegalia, porque es
all donde ms se acumulan los mucopolisacridos.
En este tipo de enfermedades, los GAGs no estn unidos a protenas, por lo tanto hay que
fijar con insolubilizantes de glcidos, como las sales de amonio cuaternarias.
Depende de la enfermedad el tipo de GAG que se acumula. Las tcnicas que se utilizan son
el PAS y el alcian blue a pH 1 para grupos sulfatados.
Mixoma: no es un tumor, tiene forma de edema. Hay mixoma peritibial (?), mixedema y
otros son verdaderos tumores mixoides. No todos los mixomas son tumores verdaderos.
El termino mixoide significa que est presente en el cordn umbilical, el tejido
intersticial de los vasos es tejido mixoide. Tpicamente es rico en mucopolisacridos cidos
que pueden ser teidos slo con azul de toluidina, no con PAS (y alcian blue????). Es un
tejido laxo, con pocas clulas y que se tie de un color azul-rosado (hay metacromasia).
Clulas en anillo de sello tienen vacuolas teidas con alcian blue, por lo tanto, contienen
mucopolisacridos cidos, es decir, es un adenoCa. El diagnstico de estas clulas es muy
importante; esto es un tumor con hematoxilina y PAS (Diapo): hay una gran vacuola, el
ncleo est desplazado y hay secrecin intersticial. En este caso tiene mucinas neutras. A
pesar de ser indiferenciado (porque el tumor no forma glndulas), la presencia de mucina
indica que es un adenoCa, aunque la morfologa no lo diga. No todas las clulas en anillo
de sello tienen mucina. Las clulas en anillo de sello tienen una vacuola y no un hoyito
como picarn. Algunas tienen vacuolas claras y otras no (esquema). La importancia de
estas clulas es que permite el diagnstico de adenoCa.
Aqu se ve un frotis de lquido asctico de una paciente con adenoCa ovrico: si se ven
clulas en anillo de sello, hay que buscar el tumor primario en sistema digestivo o en
ovario. Hay una tremenda aplicacin diaria de la determinacin de mucinas en Anatoma
Patolgica. Uds. Pueden diferenciar entre tumores productores de glucgeno, de los que
hay varios, p. ej. Los seminomas. Uds. Tienen que descartar la presencia de glucgeno o
demostrar la presencia de mucinas cidas o neutras tanto en vacuolas como en forma difusa
o extracelular, como en el caso de la piel que vimos anteriormente y en CA de colon. Hay
ciertos cnceres que se clasifican como adenoCa mucosos y que tienen un pronstico
distinto: habitualmente en colon es un tumor muy maligno, porque las clulas pierden la
polaridad y secretan para cualquier lado, abrindose camino. En cambio, el adenoCa
mucoso de mama es bastante ms benigno y se da en personas mayores.
Hay ciertos casos como la metaplasma intestinal en esfago en que la determinacin de

mucinas es muy til. En el esfago de Barret no basta con que haya metaplasma columnar,
sino que adems debe haber un cambio en el tipo de mucinas secretadas: de mucinas
gstricas (neutras) cambia a intestinal (cidas). El esfago de Barret se produce por un
reflujo gastroesofgico, debido a una falla en el esfnter gastroesofgico o a una hernia
hiatal, junto con un mal manejo de la acidez estomacal. Puede afectar a cualquier porcin
del esfago, incluso puede producir faringitis o laringitis crnicas.
Hay una enfermedad del duodeno en que se produce una atrofia total de las vellosidades
(enfermedad de mala absorcin), una de ellas se llama Enfermedad de Whipple, en que se
produce acumulacin de material PAS (+) en ciertas clulas de la mucosa. Las vellosidades
estn acortadas y engrosadas, con presencia de clulas de citoplasma granuloso, eosinfilo
y que cuando se tien con PAS, previo tratamiento con diastasa (para descartar glucgeno),
dan (+). No se sabe si son mucinas o pigmentos como la lipofucsina, pero son
caractersticas de esta enfermedad.
HISTOQUMICA ENZIMTICA EN PATOLOGA MUSCULAR
Gamaliel Ordenes
13 de Noviembre de 2002
El estudio enzimohistoqumico tuvo una fuerte aplicacin a la patologa hace muchos aos atrs, sobre todo a la
neuropatologa.
Procesamiento de tejidos para histoqumica enzimtica en patologa muscular

I Biopsia muscular: son de dos tipos: abierta o PAF (puncin con aguja fina; miden aprox. 0.5 mm de dimetro
y 1-2 mm de longitud).
I Cortes en cristato: ambas muestras deben ser cortadas en cristato.
I Orientacin de las muestras: para corte transversal ambos tipos de muestras.
I Congelacin inmediata: no es tan estricta, pero debe efectuarse dentro de los primeros 30 min. La congelacin
no debe realizarse en el cristato ni en el congelador porque se produce cristalizacin del agua intracelular lo que
provoca un aumento del volumen de la clula rompindola mecnicamente. Entonces, para evitar este artefacto se
realiza una congelacin rpida por ejemplo en estos compuesto: diclorodifluorometano (Arcton 12) o en
isopentano, que se mantienen en nitrgeno lquido a -150C. El isopentano al ser un alcohol no se congela,
entonces dentro de una cpsula con isopentano se pone la muestra y se introduce en nitrgeno lquido, ocurriendo
as la congelacin del agua a -150C lo que evita la formacin de cristales o los cristales que se forman son
extremadamente pequeos y no alteran la morfologa.
I Artefactos: en el msculo fcilmente se producen artefactos por cristalizacin del agua.
Tipificacin de fibras musculares

Una de las aplicaciones del estudio enzimtico del msculo es la caracterizacin de fibras musculares. Las fibras
musculares pueden dividirse en 1, 2A, 2B y 2C.
I Caractersticas de las fibras tipo 1

Contraccin lenta
Mayor resistencia a la fatiga
Mayor actividad de enzimas oxidativas
Menor actividad de ATPasa muscular y enzimas de la gliclisis
Este tipo de fibras tienen mayor actividad mitocondrial que glicoltica.
I Caractersticas de las fibras tipo 2 (A, B, C)

Contraccin rpida
Menos resistencia a la fatiga
Menos actividad de enzimas oxidativas
Mayor actividad de ATPasa muscular y enzimas de la gliclisis
Esta tipificacin, en cuanto a la velocidad de contraccin de las fibras musculares, es importante para la medicina
del deporte. Las biopsias musculares en los pases desarrollados son importantes para clasificar a los deportistas
que estn en desarrollo. Si el deportista tiene mayor cantidad de fibras tipo 2, lo pondrn en velocidad; en cambio,
si tiene mayor cantidad de fibras tipo 1 ser un fondista.
Tipificacin de fibras musculares a travs del estudio de enzimas

TIPOS DE FIBRAS MUSCULARES HUMANAS
Tipo Tipo Tipo Tipo
1 2A 2B 2C
ATPasa pH 9.5
luego de fijacin en metanol fro + + + + + + + (+)
luego de una pre-incubacin a pH 4.6 + + + + + + + +(+)
luego de una pre-incubacin a pH 4.3 + + + - - + (+)
SDH/NADH- TR +++ ++ + + + (+)
Miofosforilasa + + + + + + + (+)
El msculo de un adulto normal debera contener < 3% de fibras 2C
Entre las tcnicas enzimohistoqumicas que permiten realizar la tipificacin de las fibras musculares est la
ATPasa a pH 9.5, luego tipificacin en metanol fro. La misma ATPasa con una preincubacin a pH 4.6 y tambin
luego de una preincubacin a pH 4.3. Ambas son variantes de la ATPasa que estn presentes y que son resistentes
o sensibles a un pre tratamiento cido. La deshidrogenasa succnica o la NADH tetrasolium reductasa y la
miofosforilasa tambin permiten realizar tipificacin de fibras.
Entonces, las fibras tipo 1 tpicamente presentan intensa la reaccin con ATPasa a pH 4.6, a pH 4.3 y la SDH/
NADH-TR, pero dan muy poca reaccin o nada con ATPasa pH 9.5 luego del metanol fro y con miofosforilasa.
Al contrario, las fibras tipo 2 tienden a dar una reaccin positiva intensa con ATPasa pH 9.5 luego de metanol fro
y con miofosforilasa. Las fibras 2C son contradictorias en algunos aspectos, pero son escasas, representan menos
del 3%.
En la foto se ve un msculo normal tratado con ATPasa pH 9.5 despus de metanol fro. Las fibras tipo 1 dan muy
poca reaccin, en cambio las fibras tipo 2A y 2B dan reaccin intensa y las 2C dan reaccin con intensidad
intermedia.
ATPasa pH 9.5 despus de metanol fro ATPasa post incubacin pH 4.3
ATPasa post incubacin pH 4.6 NADH-TR

En el mismo tejido (cortes seriados) despus de incubacin a pH 4.3, las fibras tipo 1 dan reaccin intensa, las
fibras 2A y 2B no dan reaccin y las fibras 2C dan reaccin intermedia. Entonces con ATPasa a pH 4.6 y a pH 4.3,
las fibras tipo 2, excepto las 2B, presentan una reaccin al revs que con la tcnica de ATPasa a pH 9.5, lo mismo
pasa con las fibras tipo 1, pero al contrario. Por ltimo, con la NADH, las fibras tipo 1 dan positivo y las fibras tipo
2 tienden a dar negativo.
Con esta batera de reacciones se podra dar un informe. Si se hace estas reacciones en tejido muscular obtenido
adecuadamente y cortado en cristato, deberamos obtener los mismos patrones observados anteriormente e
informar el porcentaje de fibras musculares tipo 1 y tipo 2, lo que sera til para la medicina del deporte. Primera
aplicacin.
Otra aplicacin es en patologa. Permite ver como disminuye o aumenta el porcentaje de cada una de las fibras o
cmo cambian sus formas bajo diversas condiciones patolgicas.
De lo anterior, lo que hay que tener claro es que hay fibras que dan mayor cantidad de reaccin positiva para
enzimas mitocondriales (NADH) y otras ms para enzimas glicolticas (ATPasa).
Enzimas marcadoras de estructuras celulares
I Mitocondrias
SDH. Exclusiva de las mitocondrias.
NADH-TR (tetrazolium reductasa). Esta en el msculo no es exclusiva de las mitocondrias.
I Miofibrillas (ms bien en el citoplasma)

ATPasa miofibrilar: disminuye su actividad en desorganizacin de miofibrillas. Tiene que ver con la actividad
glicoltica.
I Lisosomas
Fosfatasa cida
Esterasas (alfa naftol). Son marcadores de actividad lisosmica (las alfa naftol esterasas).
Protocolo para diagnstico en biopsias musculares
Hematoxilina-Eosina para estudio morfolgico.

ATPasa miofibrilar con y sin pre-incubacin cida para tipificacin de fibras.
SDH o NADH-TR para actividad y deteccin de anormalidades mitocondriales.
PAS para deteccin de almacenamiento anormal de glucgeno u otros
polisacridos. En el msculo la distribucin del glicgeno es caracterstica y
permite ver alteraciones en ella.
Miofosforilasa para evaluacin de actividad glicoltica.
Negro Sudn B para evaluar acumulacin de lpidos neutros y/o fosfolpidos.
Fosfatasa cida y/o esterasa para evaluar alteraciones en lisosomas e identificar infiltracin por fagocitos o
histiocitos en el caso de necrosis.
Para realizar el diagnstico de patologas musculares, lo primero es hacer un estudio morfolgico para lo cual se
utiliza una H-E que sirve para ver el estado general de las fibras musculares: si estn grandes o chicas, pues hay
patologas en que las fibras musculares disminuyen considerablemente de volumen o son irregulares. Luego se
realiza la batera de tcnicas enzimohistoqumicas.
Alteraciones musculares por desnervacin
Se entiende por desnervacin cualquier fenmeno que dae las vas nerviosas alterando la conduccin del impulso
al msculo, ya sea a nivel medular o del nervio perifrico.
Ocurren por lesiones (traumatismos, infecciones, etc.) que afectan a:
I Clulas de las astas medulares anteriores (atrofias musculares espinales).
I Axones de los nervios perifricos o clulas de Schwann (neuropatas perifricas).
En el dibujo se esquematizan las atrofias musculares espinales y las neuropatas perifricas.
I Neuropatas perifricas: Son secundarias a lesiones de los nervios perifricos: traumatismos, inflamaciones y
enfermedades desmielinizantes.
Neuropata perifrica:
ATPasa ph 9.5 post fijacin MFF
En la foto de la derecha se muestra un corte de tejido normal con ATPasa a pH 9.5 para evaluar. En la foto de la
izquierda, la porcin izquierda est relativamente normal, pero hacia la derecha, se muestra un fascculo de fibras
totalmente alterado donde se observa un predominio de fibras tipo 1 o bien fibras que no son reactivas para la
ATPasa, podran ser fibras tipo 2 que han perdido su reactividad, que han perdido su actividad ATPasa. En este
caso se produjo el dao de un nervio en algn punto y se daa el msculo a continuacin.
I Atrofias musculares espinales: Son todas sndromes neuropticos no muy frecuentes y muchas de ellas
ligadas al cromosoma X, por tanto se nace con ellas y son ms frecuentes en nios, en hospitales infantiles:
Enfermedad de Werdnig-Hoffman
Atrofia muscular espinal intermedia
Atrofia muscular espinal de Kugelberg-Welander
En estos casos se produce dao de las neuronas de las astas espinales anteriores, siendo sta la clula degenerada.
Atrofia muscular espinal (forma intermedia)

NADH-TR ATPasa pH 9.5
Las microfotografas inferiores muestran cortes de tejido normal con tincin para lactividad de NADH-TR y
ATPasa Ph 9.5 a la izquierda y derecha respectivamente. La foto superior derecha muestra reactividad positiva de
ATPasa en todas las clulas, presencia slo de fibras tipo 2 y ausencia de fibras tipo 1, adems de alteraciones en la
distribucin de la reactividad, as como reas claras negativas centrales. Esto significa que la clula est alterada,
sus estructuras y componentes han sido reorganizados, de manera que presentan otra distribucin de reactividad.
Por otra parte, en la reaccin con NADH, las fibras tipo 1 deberan dar positivo, pero tambin se ve una alteracin
en la distribucin mitocondrial que deja adems espacios centrales negativos. Esto correspondera a una atrofia
muscular intermedia en cuanto a su nivel de gravedad patolgico.
Enfermedad de Werdnig-Hoffman:
ATPasa post incubacin pH 4.6
En la microfotografa derecha se muestra un corte de tejido normal tratado con ATPasa pH 4.6 y a la izquierda se
ve el tejido patolgico, donde se observan clulas muy grandes medianamente conservadas y gran cantidad de
clulas pequeas con algo de conservacin de la reactividad. Esta es una distrofia muscular grave.
I Distrofias musculares: En el caso del msculo son cambios de gravedad variable, casi todos ligados al
cromosoma X.
Distrofia muscular de Duchenne (distrofia severa ligada a X)
Distrofia muscular de Becker (distrofia benigna ligada a X)
Distrofia fascioescapulohumeral
Enfermedad de Duchenne:
ATPasa pH 9.5 ATPasa pH 4.3
Para explicar la enfermedad de Duchenne en estas microfotografas se muestra en las fotos inferiores los patrones
de tejido normal. A pH 9.5 se ve una total prdida de la actividad normal de las fibras 2B, incluso se ven algunas
clulas muy aumentadas de tamao. Las clulas estn atrficas y con forma redonda por aumento del espacio
extracelular, y ya no se tocan entre s. A pH 4.3 se ve una distribucin medianamente normal, pero con atrofia.
En la distrofia muscular de Becker, por su parte, hay cambios graves. Con P.A.S. se ve la distribucin del
glicgeno formando un patrn diferente al normal, lo que quiere decir que ha cambiado la estructura de la clula.
La ATPasa a pH 9.5 tambin muestra un cambio importante en la reactividad, aumenta mucho la reactividad de las
clulas tipo 1 y disminuye la actividad de la ATPasa, no hay prcticamente fibras con actividad intensa.
P.A.S. ATPasa pH 9.5
Distrofia facioescapular
NADH-TR
En la distrofia fascioescapulohumeral, las fibras se ven como apolilladas, como si tuvieran hoyitos. Hay un grave
cambio de la estructura de la clula, en la distribucin se ve que las mitocondrias estn en un lugar que no les
corresponde. En el msculo, las mitocondrias estn formando una especie de vaina alrededor de cada miofibrilla
muscular, entonces en este caso se ven zonas del tejido que no tienen actividad mitocondrial, puede ser que las
mitocondrias estn, pero no tienen actividad mitocondrial, dando un aspecto apolillado, hay muchas fibras, ms del
80% de las fibras que no estn funcionando como fibras con actividad mitocondrial, por lo tanto el paciente se debe
cansar muy rpido, no debe tener fuerzas.
I Miopatas congnitas
Enfermedad de central core o del ncleo central.
Enfermedad multicore.
Miopatas centronucleares.
Disproporcin congnita de los tipos de fibras musculares.
Miopata nemaline (material anormal en lnea Z). Se trata de una protena especfica que se deposita como
bastones en la zona de la lnea Z.
Enfermedad de centralcore:
NADH-TR
En esta enfermedad de forma un ncleo central. Lo que ocurre es que las clulas estn desprovistas en todo su
centro de actividad mitocondrial y todas las clulas dan este patrn de reactividad.
Miopata centronuclear
NADH-TR ATPasa post pH
Esta enfermedad, al realizar la tcnica de la NADH-TR se ve que las fibras presentan atrofia, la distribucin est
totalmente alterada y que presentan un aspecto apolillado. La ATPasa a pH 4.3 (actividad glicoltica) tiene una
distribucin ms o menos normal, hay un poco ms de fibras tipo 1 y las clulas se ven redondas y no con caras
planas por el contacto entre ellas.
Lo que es importante tener claro es que a travs de un conjunto de enzimas bien seleccionadas y bien aplicadas, en
una biopsia muscular es posible hacer diagnstico histopatolgico de diversas enfermedades por el patrn de
reactividad enzimtica que presentan las clulas. Aunando la enzimologa y la histoqumica enzimtica se puede
hacer diagnstico de patologas musculares o apoyar o corroborar cuadros clnicos. Lo segundo es que tambin se
puede tipificar las fibras, lo que es esencial para patologa tanto para ....
Distrofia facioescapular
NADH-TR
En la distrofia fascioescapulohumeral, las fibras se ven como apolilladas, como si tuvieran hoyitos. Hay
un grave cambio de la estructura de la clula, en la distribucin se ve que las mitocondrias estn en un
lugar que no les corresponde. En el msculo, las mitocondrias estn formando una especie de vaina
alrededor de cada miofibrilla muscular, entonces en este caso se ven zonas del tejido que no tienen
actividad mitocondrial, puede ser que las mitocondrias estn, pero no tienen actividad mitocondrial, dando
un aspecto apolillado, hay muchas fibras, ms del 80% de las fibras que no estn funcionando como fibras
con actividad mitocondrial, por lo tanto el paciente se debe cansar muy rpido, no debe tener fuerzas.
I Miopatas congnitas
Enfermedad de central core o del ncleo central.
Enfermedad multicore.
Miopatas centronucleares.
Disproporcin congnita de los tipos de fibras musculares.
Miopata nemaline (material anormal en lnea Z). Se trata de una protena especfica que se deposita
como bastones en la zona de la lnea Z.
Enfermedad de centralcore:
NADH-TR
En esta enfermedad de forma un ncleo central. Lo que ocurre es que las clulas estn desprovistas en
todo su centro de actividad mitocondrial y todas las clulas dan este patrn de reactividad.
Miopata centronuclear
NADH-TR ATPasa post pH
Esta enfermedad, al realizar la tcnica de la NADH-TR se ve que las fibras presentan atrofia, la
distribucin est totalmente alterada y que presentan un aspecto apolillado. La ATPasa a pH 4.3 (actividad
glicoltica) tiene una distribucin ms o menos normal, hay un poco ms de fibras tipo 1 y las clulas se
ven redondas y no con caras planas por el contacto entre ellas.
Lo que es importante tener claro es que a travs de un conjunto de enzimas bien seleccionadas y bien
aplicadas, en una biopsia muscular es posible hacer diagnstico histopatolgico de diversas enfermedades
por el patrn de reactividad enzimtica que presentan las clulas. Aunando la enzimologa y la
histoqumica enzimtica se puede hacer diagnstico de patologas musculares o apoyar o corroborar
cuadros clnicos. Lo segundo es que tambin se puede tipificar las fibras, lo que es esencial para patologa
tanto para ....
ESTRUCTURA QUMICA Y CARACTERSTICAS DE LOS
LPIDOS
IDENTIFICACIN DE LPIDOS CON LISOCROMOS
C. Alliende
Lpidos:
Son compuestos orgnicos, producidos por plantas y animales. Entre sus caractersticas est el ser
insolubles en agua o dbilmente solubles en agua y ser solubles en solventes orgnicos como acetona,
cloroformo y metanol, en los que en general son ms solubles. No todos son apolares.
Uno de los componentes principales de los lpidos son los cidos grasos, presentes en todos los lpidos
menos en el colesterol. Son largas cadenas de carbohidratos, entre 12-20 carbonos, que tienen en un
extremo un grupo carboxilo. El cido palmtico, es un cido graso saturado, en cambio otros como el
cido oleico, que tiene 18 carbono, tiene un doble enlaces, es insaturado. La importancia de la
saturacin o instauracin radica en que los cidos grasos insaturados estn en estado lquido a
temperatura ambiente, mientras que los saturados se encuentran como slidos a temperatura ambiente
pues tienen un alto punto de fusin, 60C.
Los lpidos en nuestro organismo tienen tanto cidos grasos saturados como insaturados y en general
estn en estado lquido, estado en que pueden ser identificados pues en estado slido no son
identificables con lisocromos. Hay muchas reacciones que van a ser influidas por la presencia de cidos
grasos insaturados. Las cidos grasos saturados ms frecuentes, tanto en clulas animales como
vegetales, son:
E cido palmtico que tiene 16 carbonos.
E cido esterico con carbonos.
E cido linoactico con 24 carbonos.
Entre los cidos insaturados ms comunes estn:
E cido oleico que tiene 18 carbonos y una instauracin.
E cido linoleco que tiene 18 carbonos y dos instauraciones.
E cido araquidnico con 20 carbonos y una instauracin.
Hay cidos grasos que son ms insaturados que otros y van a ser ms solubles que los que tienen menos
insaturaciones.
Los cidos grasos libres, en el organismo normalmente no existen, estn esterificados, en cambio son
abundantes en algunas enfermedades como la cirrosis.
Las grasas neutras se encuentran almacenadas en los adipositos y tienen como funcin ser fuentes de
energa a largo plazo, pues se oxidan con dificultad en las mitocondrias y en los peroxisomas. Si el
producto de esta oxidacin sigue al ciclo de Krebs pasa a la cadena respiratoria generando ATP. Es
decir, las grasas neutras son la mayor fuente de energa junto a los azucares. Se encuentran en los
adipositos como depsitos de grasa y en patologas, en el caso del hgado se encuentran no en
adipositos, estn solas. Las grasas neutras estn formadas por un glicerol (alcohol), que es una cadena
de tres carbonos con grupos hidroxilos que se unen a travs una unin ster con los grupos carboxilos
de los cidos grasos, se esterifican, formando los triglicridos. El C1 est esterificado con un cido
graso, el C2 con otro cido graso y el C3 con otro, pueden ser todos iguales, pero esto en la naturaleza
ocurre muy poco, generalmente son mezclas de cidos grasos saturados e insaturados para que puedan
ser lquidos.
Lo que vamos a detectar son casi todas grasas neutras. En ciertas patologas es frecuente la
acumulacin de grasas neutras, como en el caso de patologas hepticas o de vescula.
Los cidos grasos que vimos, tienen el grupo carboxilo esterificado, ya no cido, y una cola larga de
carbonos, entonces las grasas neutras en cuanto a su polaridad son apolares, hidrfobos. Las grasas
neutras tambin se llaman triglicridos porque vienen de un alcohol glicerol unido a tres cidos grasos.
No son solubles en agua y son muy estables. Si queremos identificar grasas neutras, no es necesario
fijarlas, se mantienen, no se alteran, lo nico que puede pasarles es que se oxiden y se pongan rancias,
como la mantequilla, pero en general son muy estables y no necesitan ser fijadas, cuando trabajamos
con tejidos grasos lo nico que estamos fijando es el entorno, la protena, todo lo que est rodeando las
grasas neutras, pero las grasas neutras no se ven afectadas por la fijacin porque no son solubles en
agua en el caso del formol.
Otro grupo de importancia, que interesa detectar en investigacin o en algunas patologas, son los
fosfolpidos.
Hay dos tipos de fosfolpidos:
E fosfoglicridos
E fosfoesfingol
En el caso de los fosfoglicridos el alcohol corresponde al glicerol. El glicerol tiene en los C1 y C2
cidos grasos unidos por uniones ster, esta parte de la molcula es apolar y en el C3, en lugar de estar
esterificado con un cido graso, est esterificado con un fosfato que le da carga negativa y unido
tambin a travs de una unin ster al fosfato est un grupo amino-alcohol, en este caso es un etanol-
amina. En el caso de los fosfolpidos, los cidos grasos forman la regin hidrofbica y el grupo fosfato
esterificado con una amina-alcohol que tiene carga al igual que el grupo fosfato, as este fosfolpido,
que se llama fosfatidiletanolamina tiene carga negativa y carga positiva dada por el grupo etanol-
amina. Hay distintos fosfolpidos segn el grupo amino-alcohol al cual se una el grupo fosfato:
fosfatidilcolina tiene carga positiva
fosfatidilserina, tiene carga negativa y positiva.
fosfatidilinositol, tiene carga negativa.
fosfatidilhidroxiprolina.
Todas estas molculas se llaman fosfatidil y se les agrega el nombre del amino-alcohol. Son
fosfolpidos que tienen como alcohol un glicerol con un grupo fosfato esterificado con un grupo amino-
alcohol.
En la identificacin de los fosfolpidos es importante la colina, porque la colina une cromo, forma sales
de cromato, cromatos de colina. Cuando se tratan los lpidos con cromo por estudios de cromatografa
se ha visto que el cromo se une a la colina y no a los otros lpidos.
Otros fosfolpidos que tienen como alcohol un glicerol son los plasmalgenos, la diferencia de este
fosfolpido con los otros, es que en el C1 en lugar de tener un cido graso tienen un grupo aldehdo con
una larga cadena de carbonos (18C-20C) con cola apolar unido a travs de una unin ter-vinlica con
el glicerol y unido al fosfato est un grupo etanol-amina o colina, pero con mayor frecuencia se
encuentra el etanol-amina. Para detectar los plasmalgenos es importante el grupo aldehdo del C1 que
es fcilmente hidrolizado y queda libre, pudiendo teirse con el reactivo de Schiff, entonces al trabajar
con tejidos no incluidos siempre hay que tener una placa adicional sin tratamiento porque en medios
cidos no tan fuertes se hidroliza el aldehdo y se hace reactivo. Entonces hay que tener en cuenta que
la presencia de plasmalgenos puede interferir al realizar estudios de lpidos o carbohidratos en tejidos
cortados por congelacin.
El segundo tipo de fosfolpidos son los que en lugar de tener un alcohol glicerol, tienen el esfingol que
es un amino-alcohol que tiene un grupo oxhidrilo. El esfingol tiene alrededor de 18C, tiene
instauraciones y un grupo amino que forma una unin amida con un cido graso y el alcohol est
esterificado con un grupo fosfato que a su vez est esterificado con una colina, esto es lo que se llama
esfingomielina, que es muy importante en la mielina y tambin es un fosfolpido que tiene colina,
entonces igual que la fosfatidilcolina, la esfingomielina es detectada con las tcnicas que usan
cromacin como el mtodo de Backer. Los dos fosfolpidos que tienen colina y que pueden ser
detectados, porque el plasmalgeno se hidroliza muy rpido, es la fosfatidilcolina y la esfingomielina
(alcohol esfingol con grupo oxhidrilo y amino unido por unin amida a un c. graso y donde est el
alcohol hay una unin ster con un fosfato que se une a una colina). A veces interesa detectar slo
colina y la unin amida al cido graso es resistente a la saponificacin (hidrlisis alcalina). Si se
saponifica un fosfolpido, fcilmente son hidrolizadas las uniones esteres con los c. grasos, en cambio
estas uniones amida con los c. grasos son resistentes. As, para detectar esfingomielina podemos
saponificar y luego realizar la reaccin de Backer detectando slo esfingomielina porque la
fosfatidilcolina ha sido hidrolizada.
Pregunta de prueba: por qu se puede detectar en forma independiente la esfingomielina? porque es
resistente a la saponificacin como se efecta habitualmente, si se realiza una hidrlisis alcalina muy
enrgica por supuesto que tambin se va a hidrolizar, en cambio los c. grasos de los otros fosfolpidos
fcilmente se hidrolizan, se saponifican.
Otro grupo que tambin interesa conocer son los glicolpidos. Hay enfermedades en que se acumulan
glicolpidos. Tambin estn formados por un alcohol esfingol y est presente una unin amida entre el
grupo amina y el c. graso, pero en el grupo oxhidrilo en lugar de haber un grupo fosfato hay un
azucar, un oligosacrido, si este es el caso se denominan ganglisidos y hay enfermedades en que estn
aumentados e interesa detectarlos, para ello existe un panel de reacciones. Los oligosacaridos, siempre
tienen azucares que estn acetilados, como la acetilgalactosamina o acetilglucosamina y tambin
siempre terminan en cido silico. Se pueden detectar en forma diferencial a otros lpidos como las
grasa neutras realizando PAS, son PAS positivo porque tienen c. silico, los azucares acetilados no
dan mucha reaccin PAS positiva.
Otros glicolpidos que estn aumentados en ciertas enfermedades, como algunas de nios no muy
frecuentes, son los cerebrsidos. Estn formados por un alcohol esfingol, una unin amida entre el
grupo amida y el c. graso, pero unido al grupo oxhidrilo del alcohol hay un solo azucar, que puede ser
una galactosa o una glucosa. Por ltimo estn los llamados glicolpidos sulfatados, que son igual que
los cerebrsidos, pero uno de los oxhidrilos del azucar est sulfatado.
Otro lpido que es muy importante, pero que no hay una buena reaccin para detectarlo es el colesterol,
derivado del ciclopentanoperhidrofenantreno. El colesterol libre se caracteriza por tener en el C3 un
grupo oxhidrilo no esterificado, pero muchas veces el grupo oxhidrilo forma un doble enlace
constituyendo una unin ster con otro compuesto. Entre el C5 y el C6 hay un doble enlace. El que nos
interesa es el C7, que es fcilmente oxidable. El colesterol esterificado es el que forma uniones con
otros compuestos formando los derivados del colesterol como las hormonas esteroidales. El colesterol
no existe en las plantas.
FIJACIN DE LPIDOS
En la fijacin generalmente se usa formol cuando se trata de grasas neutras. Se pueden fijar un tiempo
prolongado sin que ocurra mayor extraccin puesto que son hidrfobos, no son solubles en el formol, la
intencin es fijar las protenas que los rodean, adems son muy estables. Algo similar ocurre con el
colesterol, generalmente se encuentra esterificado, estado en que es poco hidroflico, cuando est libre
el grupo oxhidrilo le da cierta polaridad hacindolo un poco hidroflico. Pero como generalmente est
esterificado tambin se puede fijar con formol sin que se pierda.
Los fosfolpidos, son abundantes en las membranas celulares y en la mielina, encontrndose slo trazas
en los depsitos de grasas. Interesa muchas veces hacer estudios de mielina, pues hay enfermedades en
que se produce desmielinizacin o en alguna investigacin en que interese ver presencia de
fosfolpidos, hay algunos fosfolpidos que estn unidos a protenas formando fosfolipoprotena, es
difcil encontrar fosfolpidos libres. La mielina es la membrana plasmtica de las clulas de Schwann
que rodean los axones y en las estrangulaciones de Ranvier no hay mielina. Entonces lo que se detecta
es una gran cantidad de membranas plasmticas enrolladas (pueden tener hasta 100 vueltas) formadas
por su bicapa lipdica con fosfolpidos y adems colesterol. Los fosfolpidos tienen una parte polar
(fosfatos y alcohol-amina) y una parte apolar (cola hidrocarbonada), la porcin polar se disuelve en la
formalina tamponada y son en gran parte eliminados, formando lo que se denomina figuras mielnicas,
que se refiere al estado intermedio de disolucin de fosfolpidos en el formol que forman a M.E.
estructuras similares a ovillos, esto refleja una falta de fijacin. Para evitar la disolucin de lpidos se
utiliza formol calcio en un tiempo corto, se usa 6 horas cuando es tejido congelado, cuando es tejido
para incluir en parafina se deja fijando 3- 4 das, la temperatura tambin va a influir, el calcio
insolubiliza en parte a los lpidos no totalmente. El mecanismo no es claro pero se postula que:
E puede formar complejos lipdicos insolubles, coacervados que seran grandes agrupaciones de
miscelas que los haran insolubles. El calcio inducira la formacin de miscelas.
E produciran la formacin de sales, fosfatos de calcio que son solubles a pH cido, por eso es
importante que se use formol a pH neutro.
El formol calcio insolubiliza en parte los fosfolpidos, pero muchas veces hay que incluir en parafina,
para ello hay que cromar. La cromacin insolubiliza los fosfolpidos de tal manera que puede incluirse
el tejido en parafina sin mayor perdida, el mecanismo no es muy claro, pero se cree que en los carbonos
que se unen a travs de dobles enlaces se une el cromo formando compuestos que despus se podan
polimerizar y eran insolubles, pero estudios posteriores con fosfolpidos sintticos que no tenan c.
grasos insaturados, igual fijaban colina, entonces estudios posteriores que usaban cromatografa vieron
que el cromo slo se una a los fosfolpidos que tenan colina, al parecer la presencia de dobles enlaces
influira, algo de cromo fijan, pero lo que ms fija cromo es la colina a la cual se une formando
cromatos. Entonces las tcnicas que usan cromo para identificar fosfolpidos, lo que estn identificando
en el fondo es fosfatidilcolina y esfingomielina. La manera de insolubilizar los fosfolpidos a travs de
la cromacin es que se une a la colina formando cromatos de colina y tambin algo influye la presencia
de dobles enlaces, pero es una participacin menor.
Despus que uno croma se tiene que lavar por lo menos por un das el tejido y la cromacin dura 2-3
das. Son tcnicas larga.
Medio Porcentaje de fosfolpidos extrados

Agua 7.1
CaCl2 1% 2.0
Formol 4% 2.7
Formol neutro 1.3
Roozmod (1969). Se hizo este experimento para ver la efectividad del in calcio sobre la conservacin
de los fosfolpidos. Esto se hizo por cromatografa y luego utilizando distintos solventes vieron la
extraccin de lpidos. Las DS eran pocas. Se demostr que el formol calcio en relacin al formol solo
disminuye la extraccin de fosfolpidos cuando la fijacin es corta. En una fijacin de 2-3 das para
tejido nervioso con formol calcio se mantienen los fosfolpidos, pero en una fijacin ms prolongada
como las que se realizan normalmente, tambin ocurre una extraccin importante de fosfolpidos. La
cromacin posterior tiene un tiempo definido, no se puede cromar por un tiempo largo pues el tejido se
endurece y se ve inespecfico porque se croman las protenas, se croma todo. Entonces con el cromo no
es recomendable guardar el tejido, en cambio con formol calcio s. En general cualquier fosfolpido se
conserva bien con formol calcio (formol neutro).
IDENTIFICACIN DE LPIDOS HIDRFOBOS
Se utilizan seudo colorantes llamados lisocromos. No son verdaderos colorantes porque no tienen
grupos auxocrmos, tienen slo cromforos. Son colorantes con grupos azo como cromforos y tienen
grupos hidroxilos (OH) en posicin orto en relacin al grupo azo, esto favorece que el H sea atrado por
el N que es muy electronegativo y se forma un doble enlace perdindose el auxocromo y el grupo azo,
se produce tautomerizacin. Al no tener auxocrmos, estos colorantes tien los lpidos al disolverse en
ellos, no por uniones qumicas con el tejido. Es decir, el mecanismo de tincin de los lisocromos es por
disolucin en los lpidos. Por esto, se debe utilizar lisocromos muy solubles en lpidos para que la
tincin sea rpida.
Caractersticas de los lisocromos:
No son verdaderos colorante.

No presentan grupos auxocrmos.
Presentan grupos cromforos.
Condiciones ptimas que deben tener los lisocromos:
Deben ser muy solubles en lpidos.

No tener gran afinidad por el solvente.
Deben ser ms solubles en los lpidos que en el solvente, eso es lo fundamental. El solvente no debe
extraer las grasas. Por ejemplo, vamos a utilizar etanol, entre el etanol de 70 y el de 100, se prefiere
el etanol de 70 que extrae menos grasas. Entonces, se debe utilizar un solvente que no extraiga mucho
las grasas y en el que el lisocromo no sea muy soluble, porque si el lisocromo es ms soluble en el
solvente no se va a traspasar a los lpidos o se va a traspasar muy poco.
No tener afinidad por otros constituyentes celulares. Al no tener auxocrmos no est ionizado,
entonces no tiene afinidad por otros constituyentes, slo por los lpidos a travs de disolucin.
Debe tener un color fuerte, que se vea bien para que los lpidos destaquen.
Se debe disolver en solventes que no extraigan lpidos. Todos los solventes extraen algo de lpidos,
pero se debe utilizar el que lo haga en menor cantidad. El que extrae menos lpidos es el propilen
glicol, pero entre los ms usados estn el etanol 70 y el alcohol isoproplico, no son grandes
extractores de lpidos y disuelven medianamente a los lisocromos.
El coeficiente de reparto de una sustancia S (lisocromo) entre dos lquidos no miscibles, esto de no
miscible es hasta por ah porque el lisocromo es miscible en el etanol y en los lpidos, pero tiene un
coeficiente de reparto grande si tenemos la concentracin de lisocromos en A (lpidos), comparado si
tenemos la concentracin de lisocromos en etanol (B). Tienen que presentar un coeficiente de reparto
grande, lo que indica que el lisocromo est en mayor concentracin en los lpidos que en el etanol, por
tanto es ms soluble en los lpidos que en el etanol, esto permite que el lisocromo pase del solvente a
los lpidos, llegando un momento en que no va a pasar ms, se va a establecer un equilibrio y ese es el
coeficiente de reparto, a un determinado tiempo se va a alcanzar una constante K. El coeficiente de
reparto es la razn entre la concentracin de la sustancia en estudio entre un solvente y otro, siempre va
a ser grande en relacin a los lpidos.
K = CA
CB
Lo que interesa entender es que los lisocromos deben ser ms solubles en los lpidos que en el solvente
y que el mecanismo de tincin es por disolucin y no por mecanismos electroestticos.
Sudn III, Sudn IV y Oil red
Es un colorante azo.
Lo que venden no es colorante puro, es una mezcla.
Da tinciones que son menos intensas que el Sudn IV.
El Sudn III y el IV no son tan buenos lisocromos como el Oil red porque son menos solubles en
lpidos.
El lisocromo de preferencia es el Oil red, pero es mucho ms caro por eso generalmente en los
servicios no se encuentra.
Todos estos lisocromos tien triglicridos y esteres del colesterol (porque son los esteres del colesterol
los que son apolares) por el mismo mecanismo: disolucin en los lpidos. No tien fosfolpidos porque
no se disuelven en ellos.
Sudn negro
Para teir lpidos en general se usa el Sudn negro.

La solucin no dura mucho porque se descompone fcilmente, dura 1 semana aproximadamente, tie
mejor cuando est preparado en el da o el da anterior.
Si se quiere hacer un estudio y no hay certeza que lo que se observa sea un lpido, es recomendable
realizar la tincin con Sudn negro.
Tambin es un lisocromo pero con caractersticas distintas. Es una mezcla de colorantes.
Es un colorante azo que tiene un grupo amino en posicin orto y otro en posicin para.
Esta mezcla de colorantes es un lisocromo que se disuelve en triglicridos, esteres de colesterol y a
diferencia de los otros, tambin se disuelve en fosfolpidos, en cidos grasos y cerebrsidos, menos en
colesterol libre porque no est en estado lquido, est en estado slido lo que no hace posible su
deteccin.
El grupo amino en posicin para puede ionizarse y actuar como un colorante catinico unindose a los
tejidos por uniones electroestticas, es ms probable que se ionice el grupo amino en posicin para que
en posicin orto. Cuando se ioniza el grupo para puede teir cidos grasos.
El Sudn negro puede teir de dos maneras:
E disolvindose en los lpido. Es muy soluble en lpidos, las tinciones con Sudn negro son muy
sensibles.
E actuar como colorante catinico, siempre que el pH no sea cido porque a ese pH tiende a
descomponerse en compuestos color caf que dan tinciones inespecficas. Si se deja mucho tiempo
tiende a teir ncleos, por la posibilidad de ionizar. Se recomienda utilizar los tiempos sealados por
las tcnicas y tambin tomar en cuenta la cantidad de lpidos.
Las tinciones que son vlidas son las de color negro o negro-azulado.
Para teir el colesterol libre el tejido se broma y con esto el bromo se une al colesterol transformndolo
a estado lquido. Entonces para ver lpidos totales, incluido el colesterol libre, primero hay que bromar
el tejido y luego realizar la reaccin del Sudn negro. En general para ver lpidos totales se realiza la
reaccin de Sudn negro y no interesa tanto ver colesterol libre.
Todos los lisocromos se preparan saturados porque al realizar tinciones se va sacando colorante de la
solucin de trabajo, se va gastando, por lo mismo se trabaja con pequeas cantidades, para no gastar
tanto lisocromo.
La tincin si se realiza en placa por goteo, existe slo una superficie de contacto entre los lpidos y el
colorante, entonces la tincin demora ms tiempo y es menos sensible, las pequeas gotas de lpidos no
se tien; en cambio al realizar la tincin por inmersin hay dos superficies de contacto, es ms rpido y
ms sensible, tambin influye la cantidad de lpidos presentes en el tejido.
CARACTERIZACIN DE LPIDOS CIDOS O NEUTROS
Para determinar el carcter cido o neutro de los fosfolpidos se utiliza un colorante que se llama
sulfato azul de nilo.
Es un colorante derivado de las azinas (C=N-N=C), pero este colorante en lugar de un N tiene un O,
entonces es una oxacina (C=O-N=C). Es un colorante bsico con un grupo amina como auxocromo,
que viene en mezcla con el lisocromo rojo de nilo. Entonces al teir con sulfato azul de nilo, este
colorante como es catinico tie los cidos grasos o algn fosfolpido cido que haya, pero en general
los fosfolpidos son polares, pero no cidos, entonces los grupos cidos presentes en el tejido
corresponden a cidos grasos y a otros componentes como proteoglicanos, c. nuclecos y protenas,
estos se van a teir de azul y se distinguen por la forma de gota que presentan y el rojo de nilo que
acta como lisocromo se va a disolver en los triglicridos que se teirn de color rosado.
Esta tcnica nunca hay que usarla sola porque es poco sensible, el rojo de nilo es un lisocromo no muy
soluble en lpidos, entonces pequeas gotas de triglicridos no son detectadas.
Sirve como un estudio preliminar para ver si hay lpidos cidos y neutros.
Cuando hay mezclas de fosfolpidos cidos y neutros, tiende a teirse azul, entonces es raro ver rosado,
se ve ms bien color fucsia (mezcla de azul y rosado).
Es inespecfico, tie cidos grasos y otros componentes, pero se distingue por la forma de gota que
presentan los lpidos.
FOSFOLPIDOS
Para ver fosfolpidos hay varias tcnicas, pero la ms usada es la tcnica de Backer (1946) que es muy
sensible, no es tan especfica y es muy largo, dura aproximadamente 1 semana.
El tejido que no va a se incluido se corta en trozos pequeos y se fija con formol calcio, la fijacin es
corta dura aproximadamente 6 horas. El formol calcio estabiliza los fosfolpidos por medio del formato
coacervado o sales con calcio y despus se realiza una cromacin con dicromato, que debe ser muy
precisa, primero se realiza a temperatura ambiente y luego a temperaturas ms altas para que se una el
cromo bien al tejido, el cromo se una a las colinas formando cromatos de colina. Los fosfolpidos que
se detectan con esta tcnica son los que tienen colina, los otros se ven teidos poco intenso. Lo que se
tie bien son la fosfatidilcolina y la esfingomielina. Despus, el cromo unido a la colina de los
fosfolpidos se detecta con hematena cida que se une al cromo formando una laca de color azul. Al
principio se ve todo el tejido cromado, pero esa unin de la hematena al cromo no es firme en todos
los casos, entonces hay que diferenciar. El ltimo paso es reconocer el cromo que est unido slo a la
colina para ello se diferencia con ferricianuro de potasio + borax, la diferenciacin tiene que ser
controlada. El mecanismo de diferenciacin de la hematena unida al cromo en forma dbil usando
ferricianuro de potasio con borax no est claro. Segn Backer, el ferricianuro mas el borax oxidaran la
hematena dando un color dbil.
Esta tcnica se usa mucho para detectar mitocondrias en los tbulos proximales, donde hay muchas
pues se necesita mucha energa para la absorcin. Sirve para detectar mitocondrias por la cantidad de
membranas internas y externas que tienen, por la cantidad de fosfolpidos que presentan.
Con esta tcnica se detectan finos haces de mielina porque han sido mantenidas por el cromo y es muy
sensible.
Adems de los fosfolpidos, se detectan protenas que tengan como grupos prostticos un metal, como
la hemoglobina. Entonces los GR tambin se tien al unirse la hematena al fierro de la hemoglobina.
Tambin se pueden detectar con esta tcnica otros componentes como proteoglicanos y c. nuclecos.
Debido a esto se recomienda hacer un control, lo que se usa es piridina caliente a 60C. Con este
control hay que tener cuidado porque extrae todos los lpidos, pero los que estn unidos fuertemente a
protenas no los extrae. Cuando previo a la tincin con el mtodo de Backer se hace la extraccin con
piridina a 60C y desaparece la tincin hay certeza que se trata de fosfolpidos, pero si se mantiene la
tincin no hay certeza que no se trate de fosfolpidos, puede tratarse de fosfolpidos unidos fuertemente
a protenas.
Usando el mtodo de Backer, se puede detectar tambin la esfingomielina. Esto se logra realizando
previamente una saponificacin, un tratamiento con una base, KOH. Se saponifica la fosfatidilcolina,
los cidos grasos pasan a formar jabones, pero no as la esfingomielina, que posteriormente puede ser
detectada con el mtodo de Backer.
El mtodo de OTAN distingue entre fosfolpidos insaturados hidrfobos y fosfolpidos insaturados

hidrfilos. Para ello utiliza el osmio como tetrxido de osmio, que en presencia de dobles enlaces se
reduce formando un precipitado de color negro y oxidando el doble enlace a aldehdos. Cuando se le
agrega clorato de potasio, el osmio se reduce a nivel de los lpidos insaturados hidrfobos, pero no a
nivel de los hidrfilos porque penetra en ellos impidiendo su reduccin, as se forma un precipitado
color negro slo en los lpidos hidrfobos. Cuando ponemos tetrxido de osmio en presencia de clorato
de potasio, se presentan de color negro slo los lpidos insaturados hidrfobos.
Primero se une el osmio a los dobles enlaces insaturados formando un ster cclico. Al agregar el
clorato de potasio, penetra a los lpidos hidrfilos y no a los hidrfobos impidiendo que el osmio unido
a los dobles enlaces se reduzca, fenmeno que s sucede en los lpidos hidrfobos, formndose un
precipitado negro de dixido de osmio. La deteccin del osmio oxidado unido a los lpidos hidrfilos se
realiza agregando -naftilamina formando un quelato insoluble de color rojo.
Entonces, en esta reaccin:
lpidos insaturados hidrfilos color rojo.
lpidos insaturados hidrfobos color negro.
Es una tcnica cara por la utilizacin del osmio.
REACCIN DEL PLASMALGENO
Los plasmalgenos son fosfolpidos que tienen como alcohol un glicerol y en el C1 en lugar de tener un
cido graso tienen un grupo aldehdo con una larga cadena de carbonos (18C-20C) con cola apolar
unido a travs de una unin ter-vinlica con el glicerol y unido al fosfato est un grupo etanol-amina o
colina, pero con mayor frecuencia se encuentra el etanol-amina.
Esta reaccin se hace siempre en tejidos congelados.
El grupo aldehdo presente en el C1 es fcilmente hidrolizado. Se utiliza cloruro de mercurio a un pH
ms o menos cido. En un tiempo corto se forma un compuesto hemi acetal inestable. Est unido el
mercurio por uniones hemi acetal y despus rpidamente esta unin inestable se va a disociar en dos:
alcohol y unido al tejido va a quedar el aldehdo. Este aldehdo se va a detectar con el reactivo de
Schiff.
En general no interesa el estudio de plasmalgenos, pero hay que saber que al trabajar con tejidos
congelados, al ponerlo en cualquier solucin con pH cido fcilmente el aldehdo de los plasmalgenos
se va a disociar produciendo una reaccin PAS positiva en forma espontnea. Por esto se recomienda
hacer siempre un control cuando se trabaje identificando glicolpidos porque se puede confundir la
presencia de plasmalgenos con glicolpidos.
La reaccin del plasmalgeno es muy sencilla, en lugar de hacer la hidrlisis con cloruro de mercurio
se podra hacer con cido clorhdrico 6N, es mucho ms eficiente para hacer la hidrlisis, el problema
es que es mucho ms drstico y el tejido congelado es ms delicado que el tejido incluido.
Posteriormente se separa en alcohol y aldehdo, pudiendo detectar el aldehdo con el reactivo de Schiff.
Siempre hay que hacer un control con esta tcnica, un corte tratado con cloruro de mercurio y otro sin
tratar y luego poner en el reactivo de Schiff.
DETECCIN DE COLESTEROL
No existe una buena tcnica para detectar colesterol.

Primero se realiza la oxidacin del colesterol con alumbre de fierro a nivel del C7. una vez oxidado se
detecta con una mezcla a partes iguales de cido actico y cido sulfrico, ambos P.A. La mezcla tiene
que ser en fro. Una vez que el colesterol ha sido oxidado por 3-4 das, si es ms tiempo es mejor, se
lava el tejido y se le agrega la mezcla de c. actico-c. sulfrico y en los lugares en que hay colesterol
aparece un color verde.
Es una reaccin inestable y caprichosa. El color verde dura aproximadamente 30 min. y si aparece
color rojo, no es colesterol, tiene que ser color verde. El color rojo corresponde a otros pigmentos
presentes en el tejido.
Es una tcnica drstica debido a la utilizacin de la mezcla de c. actico-c. sulfrico que daa el
tejido, observndose una mala conservacin de la morfologa.
EXTRACCIN DIFERENCIAL DE LPIDOS
Si se quiere estudiar triglicridos, fosfolpidos u otro lpido en particular. Se puede complementar el

estudio con la realizacin de una extraccin diferencial de lpidos. Se hace con solventes a distintas
condiciones y extraen determinados lpidos.
Solventes orgnicos Lpidos extrados

Acetona fra anhdrida Triglicridos, colesterol
(lpidos hidrfobos)
Acetona caliente Cerebrsidos
Cloroformo-metanol Todos los lpidos
Piridina a 60C Todos los lpidos (menos los unidos
fuertemente a protenas)
Cuando se hace un estudio de lpidos siempre hay que hacer este tipo de controles para caracterizar
bien lo que se est identificando
IDENTIFICACIN DE MIELINA
La mielina se forma a partir del enrollamiento de la membrana plasmtica de las clulas de Schwann
vecinas.
Composicin lipdica de la mielina:
colesterol en gran cantidad.

pocos triglicridos porque en las membranas hay pocos.
cerebrsidos.
sulfatidos, que son cerebrsidos con grupos sulfatos.
fosfatidilcolina que son los que se van a cromar.
esfingomielina
Mtodos para la deteccin de mielina
Hematena cida de Backer: detecta esfingomielina y fosfatidilcolina.

Mtodo de OTAN: detecta lpidos insaturados hidrfilos e hidrfobos. En el caso de la mielina se
ver principalmente de color rojo por los fosfolpidos.
Mtodos que utilizan mordientes + hematoxilina: estos son los mtodos ms utilizados en tejidos
incluidos en parafina.
Luxol fast blue: es el mtodo ms fcil.
Para los tejidos incluidos en parafina se recomienda fijar en formol calcio 2-3 das, con lo que se logra
conservar bien los haces gruesos de mielina y realizar luego una cromacin para conservar bien haces
finos de mielina. La cromacin se realiza con dicromato de potasio 2.5% durante 3-4 das. Luego lavar
bien en agua corriente por 16 hrs. y realizar la inclusin en parafina. De esta forma se conserva bien la
mielina que ya est totalmente insolubilizada.
Los mtodos que utilizan hematoxilina utilizan como mordientes ms comunes alumbre de fierro,
cloruro de fierro, carbonato de litio, dicromato de potasio. Incluso los tejidos que han sido cromados,
tienen incorporado cromo en el tejido como cromato de colina y se utiliza como mordiente. Para
detectar los metales se usa hematoxilinas que han sido oxidadas qumicamente o que han sido oxidadas
en forma natural dejndolas al aire para que se forme la hematena que se une al metal. Luego de la
tincin con la hematena se diferencian, para esto se puede usar el mismo mordiente (competencia).
Con la diferenciacin, las zonas en que la hematoxilina est unida dbilmente se diferencian
rpidamente y se pueden detectar finos haces de mielina. Estos estudios se usan en los servicios de
neuroanatoma.
Luxol fast blue

Es la tcnica ms usada por ser sencilla, pero es poco especfica.
El luxol fast blue es un derivado de las ftalocianinas igual que el alcian blue. Las ptalocianinas se
forman por condensacin de 4-amino, 3-iminoindoleinas con un cobre central. El luxol fast blue tiene
grupos sulfato y el auxocromo es una diaril guanidina que es un catin.
Es un derivado de las ptalocianinas cpricas, tiene un auxocromo diaril guanidina, es un colorante
bsico. La caracterstica que tiene es que es muy soluble en los fosfolpidos, lo que podra ser el
mecanismo de tincin. Probablemente uno de los mecanismos que participaran en la tincin, que es
muy sensible, es la disolucin en la fosfatidilcolina y en el etanol-amina, en los dos fosfolpidos que
tienen colina. No es especfico, como es un colorante catinico puede teir tambin protenas, pero se
puede detectar bien los haces de mielina.
Da un color azul fuerte.
LIPIDOS
Cecilia Alliende
Fijacin
El formol preserva bien a las grasas neutras sin que estas sean considerablemente
extradas. Esto se debe a que son lpidos apolares hidrfobos muy estables los cuales no
necesitan una verdadera fijacin. Es muy importante fijar a las estructuras que rodean a los
lpidos. Se debe evitar: alcohol, acetona y los fijadores cidos producen hidrlisis de los
cidos grasos del glicerol u otro alcohol.
Una fijacin prolongada con formol no produce una mayor prdida de los lpidos
apolares, triglicridos y colesterol.
Cuando se fijan fosfolpidos o lpidos polares, una cantidad considerable de lpidos

entra en solucin por accin del formol. Esto se debe a que la parte polar de los lpidos es
fuertemente hidrfila, al atraer agua el lpido aumenta su volumen y se forman las figuras
mielnicas las que son fases intermedias en la disolucin de los lpidos.
Para disminuir la disolucin de lpidos se le agrega calcio o cadmio al formol, se

incrementa la preservacin de fosfolpidos posiblemente por la formacin de un complejo
lipdico insoluble. El calcio forma sales con los grupos fosfatos.
En el trabajo de Roozemond (1969) se han visto los siguientes resultados:
Medio % fosfolpidos extrados

Agua 7.1 +/- 0.6
1% CaCl 2 +/- 0.3
4% formaldehdo 2.7 +/- 0.3
4% formol + 1% CaCl 1.3 +/- 0.3
Las sales de Ca no son totalmente efectivas en la insolubilizacin de los lpidos.

Despus de fijar en formol calcio se hace una postcromacin que insolubiliza a los lpidos
hasta el punto que puedan incluirse en parafina.
Los tejidos se tratan un tiempo prolongado con dicromato de potasio a temperatura

ambiente y a 60 C.
Adems sugiere la formacin de un complejo salino por combinacin de los iones

Cr2O7 y un grupo amonio cuaternario fuertemente ionizado de la colina.
En un comienzo se sostuvo que el dicromato actuara como oxidante a nivel de los dobles
enlaces de los cidos grasos insaturados, ocurrira una oxidacin y polimerizacin lo que
provocara prdida de solubilidad de los lpidos en solventes orgnicos.
Lo anterior no parece ser efectivo. Casselman comprob con fosfatidilcolina
sinttica que contena slo cidos grasos saturados que los lpidos se cromaban
perfectamente.
Trabajos de Bourgeous y col. (1962) y Adams (1965) han demostrado por test
realizados in vitro y estudios cromatogrficos que slo los fosfolpidos que contienen
colina, fosfatidilcolina y esfingomielina fijan el cromo.
La presencia de grupos insaturados no pareciera tener una importancia fundamental

en el mecanismo de reaccin, pero es posible que jueguen un papel accesorio intensificando
la reaccin.
IDENTIFICACIN DE LPIDOS POR LISOCROMOS
Los lisocromos no son verdaderos colorantes pues a pesar de poseer grupos

cromforos no presentan auxocromos, por lo tanto no se unen a los lpidos por mecanismos
electrostticos. Los lisocromos colorean a los lpidos porque se solubilizan en los lpidos.
Los lisocromos no son ionizados ni ionizables (?) son insolubles en agua.
Condiciones ptimas de un lisocromo:
1. debe ser muy soluble en lpidos

2. no tener afinidad por otros constituyentes celulares (no presentan grupos
auxocromos inicos)
3. debe ser suficientemente coloreado para ser puesto en evidencia con un contraste
satisfactorio
4. que se disuelva en solventes que no extraigan gran cantidad de lpidos.
El solvente utilizado debe disolver el lisocromo, pero no demasiado para que la

transferencia hacia el lpido sea rpida. En este tipo de coloracin hay una simple
transferencia del lisocromo desde el solvente en el cual se encuentra el lisocromo al lpido
al cual va colorear. La condicin fundamental de este tipo de coloracin es que el
coeficiente de reparto est a favor de una disolucin del lisocromo en el lpido. Los
lisocromos son ms solubles en el lpido que en el solvente utilizado.
Los colorantes liposolubles son utilizados en un solvente elegido de tal suerte que el
coeficiente de reparto entre la sustancia lipdica y el solvente sea muy grande.
El coeficiente de reparto de una sustancia entre dos lquidos no miscibles A y B es la

razn entre la concentracin A/B de la sustancia respectiva en los lquidos A y B.
K = A/B
A una temperatura determinada el coeficiente de reparto es una constante. Cuando
un corte de lpidos es tratado con un lisocromo en un solvente determinado este pasa a la
sustancia grasa hasta que se alcanza un equilibrio, es pues una transferencia de un solvente
mediocre a un buen solvente.
Principales lisocromos:
Sudan III
Sudan IV (colorea en forma ms intensa)
Sudan III y IV al ser estudiados cromatogrficamente se encontr que son una mezcla
de colorantes. Sudan III: uno o dos colorantes mayores y tres o cuatro componentes
menores. Sudan IV es una mezcla de 4 componentes mayores con 3 menores.
Son colorantes ortoazoicos con un grupo OH fenlico o naftlico que debera funcionar
como auxocromo, sin embargo, a causa de la proximidad del grupo azoico N=N- en
posicin orto se tautomeriza y as la capacidad de ionizarse del grupo OH es anulada.
Sudanes III comerciales varan en su composicin y calidad de tincin.
Para teir lpidos neutros hidrfobos el ms recomendado es el Red Oil, tie

triglicridos y esteres de colesterol.
Para teir todo tipo de lpidos se utiliza el Negro Sudan introducido por Lison (1934).
Su estructura qumica es nica entre los colorantes de los lpidos pues se trata de un
colorante azoico portador de dos grupos aminos secundarios. Comercialmente se vende
como una mezcla de 2 ismeros orto y para. En soluciones antiguas se forman por
descomposicin de los ..otros colorantes que tien protenas y cidos nucleicos
(soluciones de 1 semana).
Con el negro sudan B se demuestran lpidos hidrfobos e hidrfilos. Tie: triglicridos,

esteres de colesterol, cidos grasos, cerebrsidos, fosfolpidos.
Sudan B puede disolverse en lpidos hidrofbicos, pero adems en virtud de sus dos
aminos secundarios potencialmente ionizables tambin puede actuar como colorante
catinico y se une al fosfato de los fosfolpidos en los cuales es ms soluble que los otros
sudanes. El ismero para es ms bsico que el orto a causa que en el orto un N ionizable
est unido por puentes de H a un N del grupo azo lo que impide la ionizacin.
El negro sudan es muy sensible. Tie pequeos depsitos de lpidos, es el lisocromo de

eleccin para el estudio de lpidos en general.
Los lisocromos se pueden disolver en los lpidos a temperaturas superiores al punto de

fusin. Los lpidos cuyos cidos grasos son todos saturados tienen un punto de fusin
cercano a 60 C.
Los lpidos insaturados son lquidos a temperatura ambiente. El colesterol tiene un
punto de fusin 150 C y sus esteres saturados tambin tienen un alto punto de fusin. Se
pueden teir estos lpidos con sudan negro si los cortes son primero bromados. El bromo
reacciona con los enlaces insaturados de los cidos grasos y tambin con el colesterol para
formar un aceite el cual es lquido a temperatura ambiente.
La tcnica bromacin negro sudan reacciona con todos los lpidos. Los nicos no
teidos seran los triglicridos cuyos cidos grasos son todos saturados. Si se omite la
bromacin no se tie el colesterol libre.
El negro sudan en soluciones cidas se descompone con formacin de productos de

hidrlisis de color caf capaz de colorear los ncleos, protenas y mucopolisacridos. Se
considera como tincin de lpidos slo las coloraciones negras.
Solventes ms utilizados que extraen menos lpidos:

Propilenglicol al 100%
Alcohol etlico 70%
Alcohol isoproplico 65%
Mtodos que caracterizan los lpidos en forma diferencial
1. Carcter cido o neutro de los lpidos

2. Fosfolpidos
3. Plasmalgeno
4. Colesterol y sus esteres
1.-Carcter cido y neutro de los lpidos
El azul de Nilo comercial no es un producto puro. Est formado por una oxaxina de
color representada por el sulfato azul de Nilo. Colorante bsico insoluble en lpidos, soluble
en agua y alcohol.
Oxaxina.. que contiene O:
Oxaxona insoluble en agua pero soluble en lpidos es un lisocromo llamado Rojo de Nilo.
Mecanismo de coloracin:
El rojo de Nilo es un lisocromo y colorea como tal disolvindose en los lpidos (grasas
neutras) en fase lquida.
El azul de Nilo es un colorante bsico que colorea a todos los grupos cidos, sean
provenientes de lpidos o no. Los lpidos que tienen grupos cidos se tien intensamente
enmascarando la coloracin rosada; cuando hay una mezcla de lpidos cidos y neutros se
ven de un color azul rojizo. Las grasas neutras se ven de un color rosado cuando estn en
gran cantidad (poco sensible).
Con el sulfato de azul de Nilo adems de teirse los cido grasos libres que pueden
estar en ciertas patologas una gran cantidad tambin se pueden teir los fosfolpidos,
glicolpidos, colesterol y sus esteres.
Sulfato de azul de Nilo sirve como un test preliminar para indicar la distribucin de
lpidos neutros versus los cidos.
Si se remueven los lpidos hidrofbicos por acetona solo se tiene la tincin azul
correspondiente a lpidos cidos.
Se debe utilizar aa un pH no cido ( a pH cido la tincin de lpidos es ..
2.- Identificacin de fosfolpidos
Fosfolpidos:
Fosfoglicridos: fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol,

fosfatidilserina, fosfatidilhidroxiprolina, plasmalgeno.
Esfingolpidos: esfingomielina
Los fosfolpidos se encuentran casi exclusivamente en membranas celulares y

lipoprotenas. Solamente se presentan trazas de ellos en los depsitos de grasas neutras. Su
papel principal sera estructural , no se almacenan en gran cantidad.
Para identificar fosfolpidos que contienen colina el mtodo de Baker (1946) es la

tcnica ms utilizada:
1. fijacin con formol-calcio, una fijacin corta (6 horas). El Ca insolubiliza a los

lpidos por formacin de complejos o formando sales con los grupos fosfatos. La
fijacin debe ser corta para evitar solubilizacin de los grupos fosfatos.
2. postcromacin con dicromato de potasio (mecanismo visto en fijacin).
Los fosfolpidos se vuelven completamente insolubles en solventes orgnicos despus

del tratamiento con el Cr resisten la inclusin en parafina; el mecanismo de cromacin no
se conoce bien, probablemente participan los dobles enlaces y la colina.
En la tcnica de Baker el tiempo de cromacin no debe exceder al indicado en la

tcnica, pues en cromaciones ms prolongadas el Cr se une a los grupos cidos.
3. el cromo ligado a los fosfolpidos se reconoce con la hematena cida, se forma una
laca con la hematena.
4. diferenciacin en una solucin alcalina de ferrocianuro de potasio. Tie estructuras
como mitocondrias y la mielina que contiene esfingomielina y fosfatidilcolina.
Adems del valor histoqumico de identificar fosfolpidosen, el mtodo de Baker

es el mejor mtodo para teir mitocondrias. El modo de accin del diferenciador es
desconocido. Baker sugiere que puede oxidar la hematena a un compuesto ms dbilmente
teido.
Especificidad la fosfatidilcolina y esfingomielina dan reaccin positiva, el resto de

los fosfolpidos dan una reaccin muy dbil. Tambin tie otras sustancias no lipdicas
como: cidos nucleicos y protenas con grupos prostticos metlicos como la
hemoglobina,
Control : extraccin con piridina a 60 C, se extrae gran parte de los fosfolpidos, los
fosfolpidos fuertemente unidos a protenas no se extraen. Una sustancia que se tie con el
mtodo de Baker antes de la extraccin con piridina y despus da tincin negativa se debe
considerar como fosfolpido. Una sustancia que se tie y contina teida despus de la
extraccin con piridina no se puede concluir que no sean fosfolpidos porque existen
fosfolpidos fuertemente asociados a protenas que no son extrados con piridina caliente.
El mtodo de Baker es un mtodo muy sensible.
Las uniones esteres entre cidos grasos y glicerol pueden ser rotas por una hidrlisis
alcalina, saponificacin (?). Los cidos grasos son liberados como jabones solubles.
La unin amida de los cidos grasos con la esfingosina no es hidrolizada en las mismas
condiciones de tiempo y temperatura. Consecuentemente los cidos grasos de la
esfingomielina no son hidrolizados despus de la saponificacin y pueden ser detectados
con el mtodo de Baker (saponificacin-mtodo de Baker es especfico para la
esfingomielina).
El inconveniente de la tcnica de Baker es la larga duracin (6 das)
Mtodo de OTAN
Se utiliza para distinguir en un mismo corte lpidos insaturados hidrfobos de los lpidos
insaturados hidrfilos. Una mezcla de
No es reducido ms que a nivel de los lpidos insaturados hidrfobos, pero no a

nivel de lpidos insaturados hidrfilos. El clorato de potasio penetra en las miscelas de
lpidos insaturados hidrfilos e impide la reduccin del tetrxido de osmio, pero el osmio
no reducido se une a los dobles enlaces de los lpidos hidrfilos insaturados y puede
ponerse en evidencia por una reaccin de quelacin por medio de naftol .con la cual da
una coloracin roja.
Los lpidos saturados no reducen ni fijan el .y quedan..
Resultados con OTAN:

Lpidos insaturados hidrfobos : color negro
Lpidos insaturados hidrfilos : color rojo.
3.- Identificacin de plasmalgeno
El plasmalgeno se caracteriza por poseer un aldehdo superior estearico o

palmtico unido por unin eter vinilica al glicerol.
Para identificar el plasmalgeno se utiliza la reaccin plasmal introducida por

Feulgen y Volt (1924).
En cortes de tejido sin fijar se realiza un breve tratamiento con cloruro de mercurio
al 1% el que libera al grupo aldehdo del plasmalgeno al que se identifica con el reactivo
de Schiff.
El mercurio se une al doble enlace de la unin vinlica. El producto inicial es un

hemiacetal inestable el cual se disocia en alcohol y aldehdo. El cloruro de mercurio queda
unido al C2 del aldehdo el que es detectado por el reactivo de Schiff.
El eter vinilico es fcilmente hidrolizable en un medio cido HCl 6 N, es ms

efectivo que HgCl2 pero no es utilizado porque es ms drstico.
Si se omite el tratamiento con HgCl2 y se deja un tiempo prolongado (ms de 20

minutos) en el reactivo de Schiff se produce la hidrlisis del aldehdo por el pH cido del
reactivo.
Cuando se realiza la reaccin se debe con reactivo de Schiff (?)

1 corte tratado con HgCl2
1 corte sin hidrlisis
tincin corta con reactivo de Schiff (10 minutos).
4.- Colesterol
Mtodo de Schultz
Oxidacin del colesterol, 7 dehidroxicolesterol con alumbre frrico. El colesterol
oxidado se trata con una mezcla a partes iguales de cido sulfrico y cido actico.
Especfica para el colesterol y sus esteres. Es inestable de color verde caracterstico

de la reaccin, dura poco tiempo. Es especfica pero poco sensible.
Reaccin digitonina
Antes de teir con el mtodo de Schultz para distinguir entre colesterol libre y sus
esteres se trata el tejido con digitonina.
Extraccin diferencial de lpidos con solventes orgnicos.

Acetona fra totalmente anhidrida: triglicridos y colesterol (lpidos hidrofbicos),
cerebrsidos.
Acetona caliente
Cloroformo-metanol: todos los lpidos
Piridina caliente: todos los lpidos excepto aquellos fuertemente unidos a protenas.
Para disolver los lpidos fuertemente unidos a protenas se usa un solvente acidificado,
rompe unin lpido-protena y disuelve los lpidos.
Mielina
Algunos axones del sistema perifrico estn rodeados de una vaina de mielina y
contiguo a la vaina de mielina hay una capa de clulas de Schwann, se enrolla espiralmente
en torno al axn puede ser muy grueso (100 capas concntricas).
La vaina de Schwann y la vaina de mielina estn interrumpidas a intercvalos

regulares por los ndulos de Ranvier que son puntos de discontinuidad entre las clulas de
Schwann vecinas a lo largo del axn. Aqu el axn est en parte desnudo pues queda
envuelto incompletamente por la compleja ordenacin de expansiones de las clulas de
Schwann.
En el SNC las clulas de Schwann son reemplazadas por clulas de la

oligodendroglia.
Qumicamente la mielina consiste en una mezcla de lpidos complejos y protenas.
La fraccin lipdica constituye alrededor del 60 a 70% de la mielina, contiene grasas
neutras, fosfolpidos, cerebrsidos y colesterol.
Como estos fosfolpidos estn en su mayor parte unidos a protenas son

parcialmente extrados en la inclusin en parafina. El mtodo de Baker demuestra mielina
pero como es un mtodo muy largo requiere cortes por congelacin se han desarrollado
algunos mtodos que identifican mielina en tejidos incluidos en parafina.
Hay 2 metdicas ms utilizadas:
1. mtodos que utilizan un mordiente y hematoxilina

2. mtodos que utilizan luxol fast blue, colorante derivado de las ptalocianinas de
cobre.
Fijacin para incluir en parafina:

Trozos de tejidos se fijan 2 a 3 das en formol-calcio, cromacin con bicromato de
potasio al 2.5 % durante 3 a 4 das. Lavado con agua corriente 15 a 16 horas, incluir en
parafina.
Materiales fijados slo en formaldehdo sin cromacin tien bien a las fibras
gruesas de mielina, fibras finas requieren ser cromadas para su conservacin.
Si los tejidos han sido cromados y los cortes se tien con hematoxilina se forma una
laca con el cromo unido a los fosfolpidos y despus se diferencia hasta que se destaquen
solo las fibras mielnicas.
Como diferenciadores se utiliza ferrocianuro alcalino.
Si los tejidos no han sido cromados como mordientes se utilizan sales de fierro
(alumbre de fierro o de litio (carbonato de litio), etc.
Despus se tien con hematena y se diferencian con alumbre de Fe, cloruro de Fe o

ferrocianuro de potasio saturado con carbonato de litio.
El principal inconveniente de estos mtodos es la diferenciacin que es crtica y que

demora varios das.
Luxol fast blue es un colorante catinico derivado de las ptalocianinas de cobre, la

estructura exacta del colorante no se conoce, seran sales de aril guanidina:
Es insoluble en agua y es utilizado en solucin alcohlica. Luxol fast blue es muy soluble
en fosfolpidos fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina. Esta solubilidad puede ser la base
para teir la mielina. No es especfico, probablemente tambin entre en los dominios
hidrofbicos de algunas protenas.
El catin arilguanidico es liberado a la solucin en el momento de la tincin dejando

solo el ..coloreado.
Si se contrasta con un colorante catinico rojo o violeta como cresil violeta no se ve

una solamente a los .sustancia de Nissl sino tambin a los aminos de luxol fast blue
presentes en la mielina incrementando la intensidad de la coloracin.-
Diagnstico de Histopatologa Lipdica- Esteban rdenes 1
Aplicaciones de la Histoqumica al Diagnstico de Enfermedades

Relacionadas con Transtornos del Almacenamiento de Lpidos
Prof. Esteban rdenes G.
Mircoles 30 de Octubre de 2002
En esta clase trataremos algunas aplicaciones de la Histoqumica al estudio de los lpidos en

condiciones patolgicas, especialmente relacionadas con transtornos en el almacenamiento de stos.
Las aplicaciones ms frecuentes de las tcnicas hasta ahora desarrolladas en nuestras actividades
prcticas de laboratorio son las siguientes:
Hepatopatas: esteatosis, cirrosis de Laenec, lipoidosis.

Vesculopatas: colesterolosis vesicular
Cardiovasculopatas:ateromatosis, cardiomiopata xantomatosa, degeneracin grasa,
Neuropatas. Enfermedades desmielinizantes
Neoplasias. Liposarcomas, etc.
En las patologas hepticas, una de las alteraciones ms comunes es la esteatosis (presencia de

una gran vacuola lipdica en clula parenquimatosa) as como la cirrosis con esteatosis,
particularmente en este caso la Cirrosis de Laennec de tipo nutritivo-alcohlica, y las lipoidosis
(infiltracin de tejido adiposo en el tejido, por ejemplo en pncreas). La lipoidosis no suele darse en
hgado.
Respecto de la patologa vesicular lo ms usual es la colesterolosis vesicular; no siempre es
necesario estudiar los lpidos para el diagnstico, aunque en algn caso se podra requerir.
Importantes son las cardiovasculopatas, stas son una de las causas principales de muerte en el
mundo actualmente, principalmente por la arteriosclerosis. La ateromatosis es un depsito de
sustancias de origen lipdico que se acumulan en las paredes vasculares, susceptibles tambin de ser
estudiadas con HQ. Tambin hay cardiomiopatas que cursan con acumulacin de lpidos, como por
ej la xantomatosis (xantoma: acumulacin de lpidos en ciertos tejidos), por clulas como histiocitos
cuyo citoplasma es de aspecto espumoso. Pueden encontrarse xantomas en la piel como zonas de
manchas amarillas solevantadas populares constituidas por mltiples acmulos de clulas de aspecto
espumoso similares a las de la suprarrenal. Hay tambin una cardiomiopata xantomatosa en que se
acumulan este tipo de clulas; tambin degeneracin grasa o esteatosis en msculo cardaco.
Las neuropatas, bastante importantes en clnica, especialmente las que cursan con cuadros
desmielinizantes por diversos orgenes, pudiendo estudiarse la mielina u otros compuestos lipdicos.
Por ltimo algunas de las neoplasias se caracterizan por presentar lpidos, y antes de la IHQ se usaba
el estudio de lpidos para determinar, por ejemplo, si un tumor pleomrfico era un liposarcoma.
A continuacin se presenta una tabla de alteraciones cardiovasculares y aplicaciones histoqumicas al

estudio de stas:
Aplicaciones de la Histoqumica a la Patologa Cardiovascular
Condicin Material detectado Tcnica

Aterosclerosis Colesterol libre y esterificado Negro Sudn B
Bromuro-Negro Sudn B
Oil Red O +Luz polarizada
PAN
Cambios reparativos en la Macrfagos y lpidos de ateroma Esterasa-Negro Sudn B
Aterosclerosis -Galactosidasa-Oil Red O
Infarto al Miocardio Deshidrogenasas Prueba del Nitroazul tetrazolio
Amiloidosis Primaria Amiloide Rojo Congo
Enfermedad de Pompe Glicgeno Carmin de Best
P.A.S.-Diastasa
Degeneracin grasa Triglicridos Negro Sudn B
Oil Red O
Atrofia parda Lipofuscina Schmorl
P.A.S.
Ziehl-Neelsen
Autofluorescencia
Cardiomiopatas Nervios adrenrgicos Fluorescencia inducida por
catecolamina-Formaldehdo
a) Obstructiva
b) Metablica (induccin por Triglicridos Negro Sudn B
alcohol y drogas) Oil Red O
c) Xantomatosa infantil
(histiocitoide)
Fuente:
En el caso de la aterosclerosis se detecta colesterol esterificado o libre en las placas ateromatosas; se

podran estudiar tempranos acmulos de colesterol libres o conjugados (esteroficados) en la ntima
de las arterias, usndose el Sudan Black B, Oil red O y tambin luz polarizada. El colesterol puede
estar en alguna de sus formas cristalizado y presentar birrefringencia.
(interviene la inefable Prof. Alliende y dice(EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEESTA ES LA PREGUNTA,
JAJAJA): El colesterol esterificado se detecta con el Sudn y el Oil red porque es apolar y est lquido, en tanto el que
est libre est cristalizado, entonces para detectarlo hay que tratarlo con Bromo y una vez bromado ste permite que se
lice y se pueda entonces detectar con el negro Sudn u otra tincin)
Claro, la otra tcnica mencionada es la del Sudan Black B con Bromo.
En los cambios reparativos en la arteriosclerosis hay macrfagos y lpidos del ateroma, se pueden
estudiar enzimas para detectar los cambios de los macrfagos, para los lpidos Sudan Black B o para
los macrfagos usar tcnicas de IHQ con marcadores especficos para stos (CD-68, CD-31 o 1-
antiquimotripsina) o estudiar la -Galactosidasa, enzima presente en los macrfagos. A continuacin
se mostrar una fotografa donde se demuestran simultneamente la enzima, presencia de
macrfagos y de lpidos. El infarto miocrdico, en particular, se relaciona con la presencia de lpidos,
estudindose en ese caso la presencia de deshidrogenasas. En esta tabla se mencionan otras
patologas como las amiloidosis, acmulos de glicgeno y otros; degeneracin grasa, estudio de
triglicridos en que se emplean Oil red y Sudn Black. Luego veremos los pigmentos y lipofuscina y
sus reacciones; existen los denominados lipopigmentos o lipofuscinas que reaccionan positivamente
para Sudn entre otras reacciones; por ende no hay que confundirse cuando por ejemplo en corazn
se observa un lipopigmento alrededor de los ncleos y el citoplasma, que es la lipofuscina y que da
positividad para Sudn Black B despus de la inclusin en parafina, con lpidos verdaderos como
grasas neutras que pudieran encontrarse en una degeneracin grasa. Se mencionan tambin
cardiomiopatas metablicas inducidas por ingesta de alcohol y drogas con acumulacin de grasas en
el msculo cardaco. En este caso veremos triglicridos con las tcnicas de Sudan Black B y Oil red
O, y tambin con los Sudanes III y IV. Se prefiere el Sudn Black porque destaca ms y el Oil red
tambin, dan una tincin ms intensa. Y lo ltimo mencionado son las xantomatosis del corazn.
Los lpidos se encuentran en macrfagos de aspecto espumoso o histiocitos. En la fotografa se
observa una lesin arteriosclertica en la ntima de una arteria teida con Sudn III y la reaccin
para histiocitos:
Este es un proceso arteriosclertico en vas de

reparacin. Ha sufrido complicaciones, como
ocurre normalmente en la arteriosclerosis,
cules son estas complicaciones? Calcificacin,
ulceracin, fibrosis, entre otras. La fibrosis
ocurre con un fenmeno reparativo, pues hubo
dao, se acumularon lpidos, se hizo papilla y
luego viene el cuadro regenerativo con fibrosis,
y cuando empieza sta habitualmente llegan
histiocitos a la zona que pueden ser detectados
por la reaccin de la -galactosidasa (en azul) y la presencia de lpidos (en rojo). Esto no es
necesario para el diagnstico, pero en estudios de investigacin en que se requiera estudiar la
evolucin del proceso estas herramientas son tiles.
Enfermedades o neuropatas desmielinizantes que pueden afectar el SNP o SNC; se mencionan

algunas patologas que afectan al SNC:
Esclerosis mltiple
Encefalitis virales
Encefalitis por priones
Deficiencias vitamnicas
Intoxicaciones
stas pueden llevar a desmielinizacin de los axones en el SNC. En la pgina siguiente se muestra
una tabla de enfermedades del SNC que se tom de un libro de Aplicaciones de Histoqumica a la
Patologa; en esta tabla aparecen desde gangliosidosis (enfermedades por acumulacin de lpidos
que afectan al SNC), hay varias, la enfermedad de Tay-Sachs, la enfermedad de Batten, la de
Gaucher, la de Krabbe y otras, la leucodistrofia metacromtica, la de Niemann-Pick tipos A y B, etc.
En la tabla se menciona el defecto enzimtico (lo mismo ocurre en enfermedades por acumulacin de
glicgeno), el sustrato que se acumula (en el caso de la enfermedad de Gaucher es un
glucocerebrsido, en Niemann-Pick es esfingomielina y colesterol), los sitios tpicos de
almacenamiento; no solamente el SNC est comprometido, sino tambin hgado, bazo, pero
tpicamente en cada enfermedad presentan tendencia a acumularse en un determinado rgano, lo
que es importante para hacer el diagnstico. Por ejemplo en Niemann-Pick se acumula en la
sustancia blanca y neuronas, en el bazo, hgado, msculo y endotelio. Otros aspectos sealados en
la tabla son los sitios para diagnstico por microscopa y las tcnicas de tincin. Muchas de estas
sustancias son P.A.S. (+), cuando son glicolpidos, adems de presentar reactividad con tcnicas
como Sudn, luz polarizada u otras. En muchos casos se puede estudiar la mielina con tcnicas
especficas para sta y ver si recubre los axones o no.
Aplicaciones de la Histoqumica al estudio de los

Desrdenes Metablicos del Sistema Nervioso
Desorden Defecto Substancias Sitios de Tejido a Mtodos de

estudiadas Almacenamiento analizar Tincin y otras
pruebas
Gangliosidosis-GM1 -Galactosidasa Ganglisido-GM1, Neuronas, hgado, Sangre, P.A.S., Tionina, -
(2 tipos) oligosacridos, bazo, rin mdula Galactosidasa,
tetrahexsido sea, TLC, ME
ceramida biopsia
rectal,
hgado
Gangliosidosis-GM2 Hexosaminidasa Ganglisido-GM2, Neuronas Biopsia P.A.S., Tionina,
(muchos tipos, Tay- trihexsido rectal TLC
Sachs, Sandhoff, ceramida
etc)
Enfermedad de Desconocida Substancias de Neuronas, Biopsia P.A.S., Negro
Batten tipo lipofuscina msculo, hgado, rectal, Sudn, Luxol fast
(lipofuscinosis rin, pncreas, sangre blue, Fosfatasa
ceroide) muchos clulas cida,
tipos sanguneas, Autofluorescencia,
glndulas ME
sudorparas
Enfermedad de Glucocerebrosidasa Glucocerebrsido Bazo, hgado, Mdula P.A.S, Fosfatasa
Gaucher (3 tipos) (-glucosidasa) ncleos basales sea, cida, TLC, ME
cerebrales (forma hgado
infantil)
Leucodistrofia de Galactocerebrosidasa Gactocerebrsido Sustancia blanca Cerebro P.A.S., Fosfatasa
Krabbe cerebral en clulas (nervio cida, Leasing
globoides perifrico) nervioso, TLC, ME
Leucodistrofia Aril sulfatasa A Sulftidos Sustancia blanca Orina, Violeta de cresilo
Metacromtica cerebral, nervio nervio fast, azul de
(sulfatidosis) perifrico, rin, perifrico toluidina,
vejiga urinaria (biopsia de acriflavina-DMAB,
piel) TLC
Enfermedad de Esfingomielinasa Esfingomielina, Neuronas, Sangre, Negro Sudn,
Niemann-Pick tipo colesterol sustancia blanca, mdula hematena cida,
A (infantil) bazo msculo, sea, fosfatasa cida,
hgado, endotelio hgado, TLC, ME
biopsia
rectal
Enfermedad de Esfingomielinasa Esfingomielina, Bazo, hgado, Mdula Negro Sudn,
Niemann-Pick tipo colesterol msculo sea, hematena cida,
B(adulto) hgado, fosfatasa cida,
biopsia TLC, ME
rectal (para
excluir
participacin
neuronal)
Enfermedad de Desconocida Oligosacridos Neuronas, hgado, Mdula Cell P.A.S., cell
Niemann-Pick tipo cidos bazo sea, dig P.A.S.,
C (lipoidosis hidrosolubles de biopsia Fosfatasa cida,
oftalmopljica) composicin rectal, Tionina,TLC, ME
desconocida hgado
Enfermedad de -Galactosidasa Trihexsido Rin,msculo Mdula Negro Sudn, luz
Fabry ceramida liso, bazo sea, rin, polarizada, ME,
piel, orina TLC, u orina
Enfermedad de -Glucosidasa Glicgeno Lisosomas de Sangre, Cell P.A.S.,

Pompe (GSD 2) cida (maltasa cualquier tipo msculo, Fosfatasa cida,
cida) celular, ncleo corazn ME
basal cerebral,
hgado, corazn,
bazo, msculo,
endotelio
Mucopolisacaridosis Mucopolisacridos Neuronas (no Orina, sangre, Azul de
(muchos tipos) cidos (heparan mps), hgado, hgado, toluidina, fierro
sulfato, condroitin bazo, corazn fibroblastos en coloidal, P.A.S,
sulfato, queratan cultivo ME
sulfato), muchos
ganglisidos
Enfermedad de ceramidasa Ceramidas Neuronas, Ndulos Negro Sudn,
Farber Ganglisido-GM1 hgado, ndulos linfticos, luz polarizada,
linfticos hgado, biopsia P.A.S., Tionina,
rectal TLC, ME
Adrenoleucodistrofia desconocida steres de cidos Suprarrenal, Suprarrenal, ME, GLC, Oil red
grasos de cadena sustancia blanca cerebro O, extraccin
muy larga
Manosidosis -Manosidasa Oligosacridos Neuronas, Sangre, mdula Cell, P.A.S., ME,
que contienen hgado, bazo, sea TLC
manosa endotelio
Leyendas: TLC= cromatografa de capa delgada; ME= microscopa electrnica; GLC= cromatografa lquida de gas; cell=
celoidinizado; dig= digestin.
Fuente:
Es ms fcil en todo caso acceder al estudio de enfermedades desmielinizantes del SNP que con
frecuencia son secundarias a algn tipo de lesin del nervio:
Desmielinizacin segmentaria (primaria)

Neuropata diabtica
Neuropata diftrica
S. De Giulian-Barr
Degeneracin secundaria
Aun as existen algunas patologas desmielinizantes primarias del SNP como ocurre con la
desmielinizacin segmentaria. Una forma experimental de producir una degeneracin secundaria es
seccionando quirrgicamente el nervio en algn animal, pudiendo verse un efecto equivalente al de
estas enfermedades. Cuando se produce un dao en algn punto del nervio el resto de ste queda
como si estuviese seccionado. Si tenemos un nervio normal de un ratn, teido con una
hematoxilina cida-dicromato que tie el nervio de color azul, adems de Oil red (lpidos) y verde
metilo (ncleos), el aspecto que presenta es el siguiente:
Prcticamente no se observa grasa (rojo) y la
estructura es ms o menos homognea en el
corte longitudinal de nervio perifrico.
A los 10 das de haber cortado el nervio se encuentra lo siguiente:
La mielina est alterada, gran parte del nervio,

con prdida de mielina en algunas reas y
otras con degeneracin de la mielina, su
estructura alterada, y se encuentran acmulos
de grasas teibles con el Oil red, lo que
aumenta cuando han transcurrido 14 das
desde el seccionamiento (figura siguiente). La
mielina sigue degenerando, grandes ramas de
nervio sin mielina, queda poca mielina
conservada y la cantidad de grasa aumenta.
Se puede entonces hacer el estudio con estas 2 tcnicas y evaluar el tiempo transcurrido desde
iniciado este fenmeno en un determinado nervio perifrico. Como podemos ver este campo es
extenssimo y tiene aplicaciones muy especializadas. Bsicamente las tcnicas son las ya conocidas:
Sudn, Oil red, tcnicas para mielina (tincin con hematoxilinas especiales, hematoxilinas cidas,
tinciones con osmio [OTAN], luxol). Todas estas patologas mencionadas son muy infrecuentes y se
dan fundamentalmente en nios, vindose ms en la bibliografa que en la prctica. Es factible que
en algn hospital de nios puedan conocerse. No necesariamente se estudia la A.P. sino el estudio
de las enzimas que puedan estar fallando por mtodos bioqumicos (muestras de sangre). La
mayora de estas enfermedades no tienen tratamiento. Las enfermedades desmielinizantes son ms
frecuentes de estudiar cuando su causa obedece a traumatismos, enfermedades virales, en servicios
de neuropatologa se hacen estudios de este tipo.
En muchos casos el nervio ha sufrido dao
hacia proximal, con frecuencia el dao est en
un punto ms alto en la va nerviosa, en
lesiones del brazo o atrofia muscular ha
ocurrido frecuentemente lesin a nivel de la
neurona. No siempre es en el nervio la lesin,
lo que produce cuadros desmielinizantes.
A continuacin veremos una serie de fotografas correspondientes a diversas patologas en las cuales
se vern algunas aplicaciones del estudio de lpidos. Lipoidosis heptica de tipo xantomatosa, que
no es la tpica esteatosis en que los hepatocitos estn llenos de lpidos.
Lpido Solubilidad
Colesterol Agua= 0.2mg/100ml
Alcohol= 1.29% v/v
Alcohol caliente= 28 g en 100 g de
alcohol 96% a 80
ter= 1 g/2.8 ml
Cloroformo= 1 g/ 4.5 ml
Piridina= 1 g/ 1.5 ml
Benceno, ter de petrleo, aceites,
grasas, soluciones acuosas de sales
biliares.
Esfingomielinas Alta solubilidad= Alcohol absoluto
caliente, cido actico, cloroformo
Baja solubilidad= piridina, ter,
acetona, agua (estos ltimos casi
nada)
Ganglisidos Insolubles en compuestos no polares
Solubilidad creciente en compuestos
polares de acuerdo con el largo de los
residuos carbohidratos y cido silico
Cerebrsidos
Grasas neutras
Solventes orgnicos Lpidos extrados

Acetona fra anhdrida Triglicridos, colesterol
(lpidos hidrfobos)
Acetona caliente Cerebrsidos
Cloroformo-metanol Todos los lpidos
Piridina a 60C Todos los lpidos (menos los unidos
fuertemente a protenas)
Saponificacin por hidrlisis alcalina Grasas neutras y fosfoglicridos
Histoqumica de Pigmentos- Esteban rdenes 1
Identificacin Histoqumica de Pigmentos

Prof. Esteban rdenes G.
Martes 26 de Noviembre de 2002
En esta clase nos corresponde estudiar sustancias pigmentadas de inters biolgico y clnico-
patolgico. Mencionaremos algunos de ellos y realizaremos el estudio histoqumico de stos. Si los
clasificamos en trminos generales, algunos son artefactos introducidos generalmente por la tcnica
empleada, por ejemplo un fijador a base de mercurio producir un precipitado pigmentado, tambin
por efectos del fijador, aunque este no deje precipitados puede alterar las sustancias internas como
el material sanguneo para producir pigmentos como el pigmento formolado; otros son pigmentos
endgenos parte de los procesos biolgicos o patolgicos y que sern nuestro foco de atencin; y
por ltimo pigmentos exgenos introducidos desde el exterior e incorporados al organismo, ejemplo
de ello es la antracosis (carbn acumulado en pulmones y ganglios) as como el pigmento de los
tatuajes que queda incorporado en los macrfagos de la piel.
Una forma de diferenciar pigmentos es su localizacin, pudiendo agruparse en 2 grandes tipos:

pigmentos intracelulares y extracelulares, que prestan gran utilidad al momento de
diagnosticar pigmentos.
Pigmentos producidos por artefactos:
Pigmento Formolado: Pigmento fundamentalmente extracelular producido por interaccin

principalmente de la formalina cida (habitualmente a pH 3.0-4.0) en tejidos hemorrgicos o
muy congestivos. Se ha sugerido que estara relacionado con las hematenas (es de origen
hemtico), se desconoce su estructura no tiene fierro, por lo que no sera equivalente a la
hemosiderina que s tiene fierro, pero es derivado de la interaccin con los GR; lo importante
es reconocerlo para no confundirlo con otros pigmentos y extraerlo si es necesario. La forma
nica de identificarlo, porque no se tie con otros mtodos (no da otras reacciones), salvo que
es birrefringente con luz polarizada, se extrae con alcohol-cido pcrico o Bouin por algunos
minutos y desaparece, y se previene usando formalina neutra o tamponada.
Las microfotografas muestra el aspecto del pigmento formolado; en el rea hemorrgica se ven
reas ms oscuras de color caf a negro a campo claro y con luz polarizada se ve birrefringente
Pigmento Malrico: Pigmento intracelular de importancia clnica, pues aunque en nuestro

pas no tenemos focos de malaria, es una de las enfermedades infecto-contagiosas ms
difundidas en el mundo que da cuenta de la muerte de millones de personas al ao. Produce
un pigmento especial muy particular parecido al pigmento formolado, pero es menos soluble.
Es una hemazona, que se forma en el interior de glbulos rojos que contienen el Plasmodium
falcparum u otros plasmodium por interaccin de stos con la Hb; este parsito durante el
proceso de parasitismo de los glbulos rojos detoxifica las molculas heme que contienen
hierro formando un compuesto polimerizado. Se ha observado tambin en fagocitos que han
incorporado glbulos rojos infectados. Se remueve con alcohol-cido pcrico, pero con un
tratamiento ms prolongado que el pigmento formolado.
En la micrografa se ven eritrocitos nucleados de ave, y macrfagos en que se observa el pigmento

de color pardo oscuro (indicado con flechas). Es importante como ayuda diagnstica, si se le
encuentra en un frotis sanguneo debe sospecharse inmediatamente pues siempre est presente,
aun cuando no se observe el parsito.
Pigmento mercurial
Depsitos de dicromato
Estos ltimos ya conocidos por los efectos de la fijacin y que han sido
Pigmentos endgenos:
Pigmentos de origen hemtico o de la cadena respiratoria: Fundamentalmente relacionados

con la hemoglobina. Se pueden clasificar en los siguientes tipos:
Tipo porfirinas
Porfirinas
Hemoglobinas: No existen mtodos especficos histoqumicos de deteccin de stas
porque los reactivos disponibles destruyen los tejidos, slo se detecta por su
coloracin tpica.
Citocromos
Mioglobina
Metaloprotenas no porfirinas
Con hierro: Hemosiderina. Pigmento de color pardo, generalmente intracelular

(eventualmente se encuentra fuera de la clula pero siempre est dentro de macrfagos, u
otras clulas con capacidad fagoctica), que contiene Fe+++ demostrable con la reaccin de
Pearls; contiene ferritina (molcula transportadora de fierro en sangre) en cantidades
variables. La Hemosiderina es importante en el diagnstico patolgico porque es la evidencia
de un proceso hemorrgico antiguo. Los procesos hemorrgicos son importantes en patologa
pues hay enfermedades que cursan con hemorragias microscpicas, que en ocasiones son de
origen reciente (es importante encontrarlas recientemente para hacer el diagnstico), las
prpuras, las vasculitis en la piel tienen aumento en la permeabilidad vascular, extravasacin
de eritrocitos; podemos encontrar una lesin temprana con GR indemnes, o tarda, con
presencia de hemosiderina, que evidencia la ocurrencia de hemorragia. Para su
identificacin se realiza la identificacin del fierro con el mtodo de Pearls: No se identifica la
Hemosiderina como tal, sino especficamente los iones frricos. La hemosiderina y la ferritina
liberan iones Fe+++ en presencia de un cido mineral diludo. El in Fe+++ en presencia de
iones de ferrocianuro forma un precipitado de color llamado azul de Prusia (esencialmente
compuesto de ferrocianuro frrico). El azul de Prusia se ha empleado en la industria textil por
aos, aunque an se desconoce su frmula exacta. Se sabe que parte de este colorante es
ferrocianuro frrico. A continuacin se muestra la reaccin del in frrico con el
ferrocianuro de potasio, que forma ferrocianuro frrico de color azul y queda precipitado en
los tejidos control. Recuerden que se usa ferrocianuro de potasio.
Se mezcla ferrocianuro de potasio a 20% con partes iguales de HCl 1 N, se expone la placa de 15 a
30 minutos, se lava en agua para detener la reaccin y se deshidrata y monta.
Existe otra reaccin, que permite identificar iones ferroso, utilizando ferricianuro de potasio
(Turnbull). La principal reaccin de reconocimiento es la de Perls pero la que veremos a
continuacin es una alternativa. La identificacin de iones ferroso (Fe++) se puede realizar con un
proceso ms complejo que implica la reduccin del fierro frrico Fe+++ (identificacin de todo el
fierro)a Fe++ y luego se identifica con ferricianuro de potasio, con lo que se genera ferricianuro
ferroso, de color azul similar al azul de Prusia, postulndose incluso que el compuesto fomado es
bsicamente el mismo (es decir, no est clara la qumica final de estas reacciones), pero llamado
azul de Turnbull; primero se trata al tejido con sulfuro de amonio, formndose sulfuro ferroso
(soluble), que se disocia en iones ferroso y sulfuro, que se va como gas. El sulfuro ferroso reacciona
con el ferricianuro de potasio formndose un compuesto tipo ferricianuro ferroso o azul de Turnbull,
que es una molcula compleja y se considera esencialmente similar al azul de Prusia.
En la primera etapa se reduce el in frrico a ferroso, como muestra la reaccin sobre estas lneas, y
luego el in ferroso se hace reaccionar con ferricianuro de potasio para dar lugar a ferricianuro
ferroso (azul de Turnbull), esencialmente similar al azul de prusia.
En cualquier caso, la reaccin se da de esta forma. En las micrografas siguientes se muestra un

caso de hemocromatosis heptica (acumulacin excesiva de hierro (Hemosiderina) en clulas
parenquimatosas o fagocticas) y grandes cantidades de pigmento identificados con la reaccin de
Perls.
En mdula sea se puede hacer deteccin de hemosiderina o fierro porque la hemosiderina es

resultado de la destruccin de GR para recuperar el hierro, que es un elemento muy preciado en la
economa corporal, alrededor del 90 % de l presente en la Hb y un 10 % en la hemosiderina;
cualquier cantidad de eritrocitos eliminados por cumplir su vida til o por procesos hemorrgicos con
salida de los vasos, se recupera el hierro; se rompe la clula, se rompe la Hb, y el hierro es
acumulado como hemosiderina y luego captado para ser transportado por la ferritina a la mdula
donde se reutiliza; el valor diagnstico en mdula est relacionado con la evaluacin de la actividad
de renovacin y lisis de eritrocitos, identificando las clulas fagocticas. Cuando se trata la mdula
con descalcificadores debe tenerse cuidado porque puede haber prdida de hierro por solubilizacin,
especialmente al trabajar con cido ntrico.
Con cobre: Ceruloplasmina (circulante); el cobre se acumula.
Pigmentos biliares: Importantes por su presencia en patologas
Bilirrubina
Biliverdina
Urobilina
Estercobilina
Estos presentes en el tracto digestivo. Todos son hematgenos, derivados del catabolismo de la
hemoglobina (Hb)
Melaninas: (Melaninas cutneas, Neuromelanina, Melanina retinal) Pigmentos
importantes para nuestra adaptacin al ambiente, pues ha facilitado nuestra supervivencia a
las radiaciones, especialmente a las UV. Son pigmentos especiales que capturan y absorben
prcticamente todo el espectro de luz visible y por ende, al estar localizado en piel nos protege
de las radiaciones solares. Las personas que carecen de estos pigmentos como los albinos,
son muy susceptibles a desarrollar cnceres de piel. La proteccin brindada por el pigmento
melannico es tal que las personas morenas son menos susceptibles a cncer de la piel, el que
por efectos del sol se da en zonas ms expuestas al sol: cara, manos, mamas, mejillas,
afortunadamente benignos en su mayor parte: carcinoma basocelular, espinocelular, que son
consecuencia directa de la radiacin solar. Cuando estudien piel de la cara, en la dermis
siempre van a encontrar degeneracin basoflica del tejido conjuntivo; el tejido conjuntivo
pierde su estructura y se transforma en una masa parecida a amiloide, cambio producido por
efecto del sol y que se conoce como elastosis solar; en personas mayores de 30 aos en la
piel de la cara hay que observar la diferencia con la piel de otras zonas; en la cara tiene
dermis muy afectada, ms evidente esto en personas de tez blanca que en morenos (tienen
una evolucin mejor respecto a la exposicin a radiacin solar); las razas blancas se
desarrollaron aparentemente en reas menos expuestas al sol (Europa, Norte de Europa,
zonas ms fras), en tanto las razas de color lo hicieron en zonas ms clidas, expuestas al sol
(frica); en la actualidad hay una gran mezcla racial por la globalizacin, que nos permite
encontrar todo tipo de individuos en todas partes, lo que nos expone ms a desarrollar
tumores; las melaninas, es el factor natural de proteccin solar. No hay un solo tipo de
melanina, sino varios, por su ubicacin, reactividad y otras caractersticas. Hemos hablado
fundamentalmente de las melaninas cutneas, pero tambin hay neuromelanina, que confiere
un color al cuerpo oscuro en el cerebro, tambin presente en coroides; tambin hay melaninas
retinales. Estas son variantes; pese a no tenerse claridad respecto de la composicin de la
melanina, s se sabe cul es el proceso de la melanognesis. En trminos generales se
sintetiza a partir de tirosina por accin de la dihidroxifenilalanina oxidasa (DOPA oxidasa),
formndose fenilalanina a partir de tirosina por accin de DOPA oxidasa. Esta misma enzima
acta sobre fenilalanina formando un pigmento intermedio y luego la melanina, cuya
estructura es caracterstica, los grnulos de melanina que permanecen en citoplasma y que
estn rodeados, habitualmente, por membranas. Veamos un esquema representativo de la
melanognesis:
A partir del RE se forman las membranas que van a rodear finalmente los grnulos de
melanina, y que dan inicialmente origen a vesculas que luego quedan llenas de pigmento, que
a M.E. se ve como sigue:
Dentro de este grnulo se encuentra polimerizado (en alguna forma) este pigmento de color
caf que es la melanina. Estos grnulos pueden ser traspasados de una clula a otra, lo que
ocurre en melanocitos (clulas de la piel que tienen la DOPA oxidasa y por ende son capaces
de producir la melanognesis);los melanocitos pueden traspasar estos grnulos de pigmento a
otras clulas vecinas (epiteliales de la epidermis, algunas de ellas, especialmente en las capas
basales, estn llenas de melanina), o traspasarlas a clulas con caractersticas fagocticas, los
melanfagos o melanforos (del Gr. Phoros: portador de), que no generan melanina. Los
melanocitos son de origen embriolgico neuroectodrmico, lo que se sabe por su
inmunofenotipo. Comparten la reaccin de S-100 (marcador tpico de tejido
neuroectodrmico). En patologa tiene gran importancia; existen procesos en que hay
ausencia de melanina por ejemplo en reas focales, como ocurre en el bitligo, que son zonas
blancas de piel desprovistas de melanina en un individuo de coloracin normal, y que tienen
distinto origen: psicosomtico, en individuos con ciertas caractersticas de personalidad, en
quienes la aparicin de bitligo crea un crculo vicioso (se siente socialmente inhibida por sus
manchas y ms aparecen); secundarios a inflamaciones locales u otras lesiones. En biopsias
puede ser necesario evaluar la presencia de melanina y de melanocitos. Tambin es
necesario investigar el pigmento en lesiones tumorales, como por ejemplo el melanoma
(tumor maligno relacionado con la exposicin al sol), que simula otros tumores, y da
metstasis difciles de diagnosticar; en su sitio primario de origen no es difcil de identificar
morfolgicamente, pero en metstasis es muy difcil. Las melaninas parecen estar firmemente
unidos a protenas, por lo que son muy difciles de extraer (se ve fcilmente en cortes pasados
por xilol, alcoholes, fijadores) a menos que se utilicen agentes cidos que destruyen los
tejidos. S se pueden decolorar con agentes oxidantes como: H2O2, KMnO4, HCl, FeCl3, cido
ascrbico y clorato de potasio, son insolubles en solventes orgnicos, mientras que tienen
buena solubilidad en NaOH 1N. A continuacin vemos un ejemplo de lesiones pigmentadas:
En la micrografa se ve una lesin benigna (encapsulada), que tiene su componente celular

bastante dispersa dentro del rea de encapsulamiento (lo que podra conducir a pensar que es
maligna), conocida como nevo azul, que a diferencia del nevo celular que tiene clulas nvicas
tpicas en nidos en la dermis o conjuncin dermoepidrmica, no presenta clulas nvicas, sino
una acumulacin de melanocitos generalmente fusiformes mezclados con melanfagos, siempre
situado en profundidad en la dermis, y forma un ndulo bilobular con clulas muy alargadas, que
casi siempre tienden a disponerse en paralelo a la epidermis, y que en clnica se ve como una
mancha azul.
La imagen que vemos arriba es un melanoma (primario en el lugar en que se sita, o

metasttico) y evidentemente est lleno de melanina (como problema se puede plantear que sea
melanina o hemosiderina, o bien melanfagos cargados de melanina); debe tipificarse la clula y
el pigmento.
El tipo de tumor que vemos a continuacin es muy problemtico pues se puede tratar de una
metstasis de un tumor de clulas claras, pero es un melanoma amelantico (generalmente los
melanomas son amelanticos, no producen melanina, por lo que representan un serio problema
pues se asemejan a los tumores de clulas claras de ovario por ejemplo), caso en que no se
podr demostrar la existencia de melanina, slo habra que tipificar la clula para saber si se trata
o no de un melanocito.
Para la identificacin de Melanina existen 4 mtodos que se pueden emplear:

Mtodos de reduccin: Schmorl, Masson-Fontana. La melanina tiene capacidad reductora por su
estructura.
Masson-Fontana (Masson 1914; Fontana 1912): El fundamento de esta tcnica es que la
melanina es argentafin y como tal reduce soluciones de plata amoniacal a plata metlica, sin
necesidad de agentes externos. Los cortes se incuban con solucin de plata amoniacal a t
ambiente toda la noche en oscuridad.
Posteriormente, se elimina la plata no reducida con tiosulfato.
Se observa a continuacin una micrografa de piel normal con reaccin argentafin de melanina en
la zona basal de la epidermis hasta los estratos intermedios, y bajo la epidermis un grupo de
clulas nvicas muy teidas.
Reaccin de Schmorl: La melanina es capaz de reducir ferricianuro frrico a ferrocianuro frrico,
los cortes se incuban en una solucin que contiene cloruro frrico y ferricianuro de potasio y se
forma un precipitado de color azul semejante al azul de Prusia.
Otra caracterstica de la melanina es la capacidad de formar quelato con iones ferroso si stos le
son proporcionados, como ocurre en la reaccin de captura del ion ferroso de Lillie, que veremos
a continuacin.
Reaccin de captura del in ferroso (Lillie, 1957): Es uno de los mtodos ms sensibles para
melanina, que se basa en la capacidad de las melaninas para formar quelatos con el hierro
ferroso (sulfato ferroso) que quedan capturados dentro del pigmento y se forma una melanina
ferrosa, y posteriormente se incuban los cortes con ferricianuro de potasio formndose
ferricianuro ferroso semejante a azul de Turnbull. El resultado de esta reaccin se muestra en la
siguiente micrografa de un nevo ctico o celular, diferente al nevo azul; se ve la epidermis normal
con su melanina y un grupo de clulas nvicas drmicas:
Reaccin DOPA: Slo se menciona por razones histricas, demuestra la actividad de la enzima
DOPA oxidasa, requiere el uso de una mezcla incubadora que contiene D.L.3:4
dihidroxifenilalanina (DOPA) en buffer fosfato a pH 7.4; se incuban cortes por congelacin sin fijar
a 37C por 45 min a 2 horas, y las reas de actividad enzimtica se observan de color pardo
oscuro; se pueden hacer cortes por congelacin.
Otros mtodo usados como elementos diagnsticos tambin son aquellos que implican la
decoloracin de la melanina.
Decoloracin de melanina: Las melaninas se decoloran con agentes oxidantes, al parecer por
ruptura de su anillo fenlico que tendra dobles enlaces que le dan la caracterstica de color caf,
que al hacer la oxidacin se perdera el cromforo de la melanina; se pueden emplear:
Perxido de hidrgeno (clsicamente utilizado): Tratando los cortes por varias horas se
decoloran. Es de utilidad diagnstica para identificar melanina, al igual que el cido ascrbico
pues son especficos.
Permanganato de potasio: Puede aplicarse a 60 en estufa o en microondas; como
inconveniente, decolora otros pigmentos, por lo que no sirve para hacer diagnstico de
melanina. Sin embargo, la decoloracin que ocasiona puede ser til cuando se requiere ver
todo lo que oculta la melanina o el enmasacaramiento de cromgenos como DAB (de color
similar a melanina) usados en IHQ, en que por ejemplo en el caso de melanoma se requiere
saber donde est la reaccin en clulas pigmentadas; por lo que siempre hay que hacer la
decoloracin antes de hacer la IHQ facilitndose la interpretacin de resultados; la
decoloracin en perxido de hidrgeno puede tomar hasta 48 horas lo que vara para las
diferentes melaninas; se puede controlar la decoloracin. No es necesario esperar que se
decolore para hacer el diagnstico. Para caracterizar melanina se pone una lmina en
perxido y se hacen otras tcnicas.
Los 2 anteriores son aquellos que emplearemos. Otros mtodos para identificar la melanina son :
Mtodos enzimticos: DOPA oxidasa, que ya est obsoleto, pues se ha reemplazado por mtodos
de IHQ como el S-100, vimentina o antgenos especficos como el Melan-A que identifica
melanomas y el HMB-45, que tambin identifica melanoma y reemplazan a la DOPA. Cuando se
haca enzimohistoqumica para DOPA oxidasa se empleaba, por ejemplo en el tumor que vimos
en la ltima foto para demostrar si era melanoma o no, pues si daba DOPA (+) significaba que
estas clulas eran melanognicas, es decir, tenan la maquinaria enzimtica necesaria para
producir melanina aunque no la estuviesen produciendo.
Mtodos fluorescentes
Lipopigmentos: Pigmentos producidos por desgaste
Con hierro
Sin hierro
Lipofuscinas
Ceroides
En general los lipopigmentos corresponden a lipofuscinas y ceroides. Estos son siempre

intracelulares, de color pardo-amarillento en granitos de tamao variable (pequeos) que
seran el resultado de la oxidacin de lpidos y lipoprotenas. Tambin se les llama pigmento de
desgaste producindose a todas las edades acumulndose en el tiempo, y se observan en:
hepatocitos, miocardio, neuronas, corteza suprarrenal (zona reticulada), clulas intersticiales del
testculo (testculo tiene parnquima de color pardo). Son pigmentos heterogneos (en cantidad
y composicin), al parecer dependiendo del grado de oxidacin (mayor antigedad) que posean
sus componentes.
El pigmento ceroide fue considerado separadamente (Lillie et al. 1941 y 1942) porque no da la
reaccin de Schmorl con ferricianuro frrico (menos oxidado), pero hoy se piensa que los
ceroides son lipofuscinas menos oxidadas (Pearce).
Reacciones tpicas:
Sudan black B post inclusin en parafina (por ello se llaman lipopigmentos, dan reacciones
para lpidos)
Schmorl (variable)
PAS (variable)
Ziehl-Neelsen (tambin tpicas; es alcohol-cido resistente, captura al colorante y resiste el tto.
con alcohol- cido.
Se ve el aspecto en hgado, con granulaciones variables, desde puntos pequeos a grandes:
La siguiente es corazn con H-E en que se ve el pigmento tambin, con rea de infarto, fibras
normales y lipofuscina:
A continuacin tambin se ve una preparacin con H-E con disposicin polar de los grnulos de
lipofuscina:
En ancianos el corazn se ve pardo, flccido; el trmino lipofuscina proviene de la atrofia fusca (caf)
Carotenoides
Clorofilas
Estos dos ltimos no los estudiaremos porque en humanos prcticamente no tiene importancia,
adems de ser solubles en lpidos y no se ven en los cortes.
Pigmentos biliares: Grupo de sustancias pigmentadas derivadas de la destruccin de glbulos rojos y

el catabolismo de la hemoglobina (normal o patolgico como en las prpuras (sndromes
hemorragparo mltiple) o en cuadros de rechazo). Entre estos se incluyen: bilirrubina (conjugada
con glucuronato y no conjugada), biliverdina y hematoidina. Se observa normalmente en la bilis y en
procesos patolgicos que afectan la excrecin normal de estos compuestos por el sistema biliar por
hemlisis o por obstruccin de las vas biliares; normalmente la bilirrubina acta como coadyuvante
de la digestin o como parte de los pigmentos de las heces. Revisemos brevemente el metabolismo
de la hemoglobina:
En el esquema que se muestra a continuacin se representa la sntesis de hemoglobina a partir de
precursores que parten desde porfobilingeno hasta el grupo hem y la hemoglobina. A partir de
hemoglobina, y por un proceso catablico, se libera el hierro que es recuperado para ser empleado
nuevamente en la sntesis de eritrocitos, quedando libre el grupo hem, que se puede abrir, como
veremos a continuacin, transformndose en biliverdina y por reduccin de ste en bilirrubina, que
puede ser transportada en sangre por albmina hasta el hgado donde es capturada y conjugada,
hacindose ms hidrosoluble y luego eliminada por las vas biliares como bilis. En las vas biliares
puede estar como bilirrubina o biliverdina si est oxidada, o bien transformarse en urobilingeno y
ser reutilizado por dilisis o pasar a uro o estercobilina para ser excretado por intestino (estos
pigmentos biliares transformados son los que dan el caracterstico color pardo a las heces).
A continuacin vemos un esquema general de la molcula de hemoglobina (Hb) formada por un

grupo terapirrlico (es decir, formado por 4 grupos pirroles) con un ncleo central de hierro, que
constituye el grupo Hem, es que est unido a la protena globina que est unida en el sentido planar
de la molcula de Hem.
cuando se genera bilirrubina se retira el hierro, se separa la globina y el anillo tetrapirrlico se puede
abrir quedando una molcula lineal, la biliverdina, que se diferencia de la bilirrubina por la presencia
de un par de hidrgenos; mientras la biliverdina est oxidada, la bilirrubina est reducida. Esto es
importante porque una forma de identificarlo es mediante esta reaccin.
En procesos patolgicos como la cirrosis biliar que vemos en la fotografa de arriba, podemos
observar grandes acmulos de pigmento biliar; en la cirrosis biliar se ha producido un dao en el
parnquima heptico con acumulacin de pigmentos en grandes cantidades por una obstruccin del
sistema biliar; puede haber tenido una obstruccin crnica de cualquier segmento del sistema biliar
desde el coldoco hasta la ampolla de Vater en duodeno, siendo un proceso crnico que lleva a la
acumulacin retrgrada de pigmento, aumento de la presin en los vasos y conductos biliares, con el
consecuente dao al parnquima heptico que puede llegar a una cirrosis o un estado reparativo
nodular distinto a la cirrosis comn, con micromdulos pero con gran acumulacin de pigmentos (de
hecho el hgado en la foto se ve verde oscuro).
Como veremos en las siguientes micrografas, cuando se ve en la histologa lo caracterstico es
encontrar una colestasis intraheptica, o trombos biliares, que originalmente aparecen como
pequeos trombos en los conductillos biliares interhepatocitarios; estos trombos se van agrandando,
dilatndose al mismo tiempo los conductillos biliares en que se encuentran, rompindose finalmente
la clula; si observan bien vern que se trataba de un hepatocito, pero alrededor de l hay una
reaccin inflamatoria por la destruccin de clulas debido a la hipertensin del sistema de excrecin
biliar, observndose grandes manchas de pigmentos en la ltima micrografa, que corresponden a
depsitos de pigmentos biliares, que corresponden a un preparado de hgado con trombosis biliar.
Identificacin del pigmento biliar:

Mtodos de oxidacin de la bilirrubina: La bilirrubina se ve pardo amarillento, pero al oxidarla
se logra su conversin a biliverdina (verdosa)
Reaccin de Kutlik (1957). Utiliza cloruro frrico en presencia de cido actico o bien
alumbre de hierro (frrico) en agua. La bilis es oxidada a biliverdina (verde) y colecianina (azul
verdoso)
Reaccin de Stein (1935). Emplea una solucin de yodo. La bilirrubina (pardo) se oxida a
biliverdina (verde)
Otras reacciones que permiten identificar el pigmento biliar son:
Reaccin de Fouchet (1917), que utiliza cloruro frrico en TCA.
Reacin de Glenner (1957), que utiliza bicromato de potasio en cortes por congelacin.
Es importante comparar con un corte sin oxidar para verificar si hay cambios de color. El color
observado, segn sealan algunos autores frecuentemente es verde pues hay biliverdina
preexistente. La real utilidad slo es posible determinarla cuando hay reas de color pardo
(bilirrubina) y se observa la existencia de cambio de color en esas reas, comprobndose la
posibilidad de cambio de color por oxidacin.
Otra reaccin clsica para el pigmento biliar es la de Reaccin de Gmelin.(Tiedermann y Gmelin,

1826). La reaccin positiva se caracteriza por una secuencia de cambios de color que sufre la bilis
cuando es tratada con HNO3 (o HSO4) concentrados: amarillo, verde, azul, rojo, prpura. No
siempre resulta. Es poco confiable, no permanente y altamente peligrosa pues los cidos con que
trabaja son muy concentrados. En ocasiones la reaccin es tan rpida que al observarla se ha
producido y culmina con la destruccin del tejido. Es preferible hacer el mtodo de Stein o Kutlik.
Sin embargo, si se desea realizarla es preferible hacerla ms lentamente, con el cido diluido a la
mitad lo que da ms tiempo de observacin.
Una tercera forma general de identificar el pigmento biliar es mediante reacciones con sales de
diazonio.
Reaccin de van den Berg para bilirrubina directa e indirecta (Raia, 1965 y 1967). Esta se hace en
suero, y la realizan en Laboratorio clnico para determinar la bilirrubina conjugada y no conjugada.
En un examen de laboratorio aparecen distintas proporciones de estas formas de bilirrubina
Utiliza 2:4 dicloroanilina diazotizada (compuesto azoico)
Permite distinguir entre bilirrubina glucuronato (conjugada) y no conjugada.
Reaccin directa. El glucuronato, que es ms soluble en agua reacciona directamente con la solucin
diazo. Reacciona con la reaccin de incubacin sin acelerante.
Reaccin indirecta. La bilirrubina no conjugada, menos soluble en agua, requiere la participacin de
un acelerante (una mezcla incubadora que contiene cafena, urea, benzoato, formalina). Da un color
pardo amarillento.
La tabla anterior nos muestra un resumen de la reactividad de los pigmentos biliares con diferentes
mtodos histoqumicos (el color que dan). La reaccin de Raia es equivalente a la de van der Berg.
Finalmente, se muestra una tabla de comparacin entre los distintos mtodos y pigmentos que
estudiamos, que se tom de Zugibe.
IDENTIFICACIN HISTOQUMICA DE PIGMENTOS

Pigmento Color y Forma Ubicacin Causa Extraccin
Formolado Caf oscuro Extracelular Formol cido + tejido Bouin (min)
congestivo Etanol-cido pcrico
Malrico Pardo Intracelular (en M y Malaria, plasmodium Soluble en alcohol
GR) cido unas hrs
Hemosiderina Pardo Intracelular (en M) Hemorragia -
Melanina Caf Intracelular Pigmentacin normal Agentes oxidantes,
(melanocitos, clula H2O2, permanganato
epitelial, melanforos) de potasio, cido
ascrbico
Lipofuscina Pardo amarillo Intracelular Oxidacin de lpidos y -
pequeos lipoprotenas
Biliar Amarillento en H-E Extracelular en Destruccin de GR y -
canalculos biliares del catabolismo de la
hemoglobina.
Procesos patolgicos
que afectan la
excrecin normal de
la bilis
Respecto de los cromafines, estos grnulos no corresponden a pigmentos, sino a componentes del
sistema APUD, que son ms bien detectados por IHQ, que no se ven con tinciones corrientes.

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