Taller 2

Tema: tcnica de la tincin simple y tincin de Gram fundamentos

Objetivo: observacin de clulas por tincin simple y tincin diferenciada de Gram

Diferencia entre microscopio y estereoscopio.

El llamado comnmente microscopio te permite aumentos hasta 100X (al menos

los ms comunes) y te permite contemplar bacterias. El estereoscopio (llamado
microscopio estereoscpico) te permite aumentos hasta de 45X (al menos los mas
modernos), pero no puedes apreciar bacterias por su factor lumnica, adems
otra diferencia es que los estereoscopios utilizan una visin a travs de dos lentes
(vista en estreo), por eso se le dice as.
El estereoscopio ocular dual permite a una imagen en 3-D para ser claramente
retratado con un sentido exacto de la profundidad. Un microscopio no tiene esta
capacidad. En su lugar, un microscopio tpicamente ser capaz de aumentar una
imagen en cualquier lugar de 40 a 1.000 veces el tamao original. Habilidades de
un estereoscopio de aumento suele rematar hacia fuera en alrededor de 20 veces.
Sin embargo, la percepcin de la profundidad permanece intacta y permite objetos
3-D que se desea ampliar preservando al mismo tiempo sus propiedades fsicas a
simple vista

Extendido previa a la coloracin:

Se toma un portaobjetos previamente desengrasado y se coloca en el

centro del mismo una gota del cultivo lquido, mediante asa de platino. Si el
cultivo es slido, se coloca primero una gota de solucin fisiolgica o agua
destilada estril sobre el portaobjeto. Luego, con ansa de platino se toma
una colonia del medio slido y se emulsiona con la solucin fisiolgica. Se
extiende con el ansa en forma de capa delgada y uniforme.
Se procede a la fijacin del extendido. Para ello se pasa lentamente el
portaobjeto, en forma horizontal, sobre la llama del mechero manteniendo
el extendido hacia arriba. La operacin se repite hasta sequedad total,
cuidando evitar la combustin del extendido.
Tincin simple
Sobre el extendido seco se colocan unas gotas de azul de metileno y se deja
actuar unos minutos. Se elimina el exceso de colorante lavando con agua de
forma suave, con ayuda de piseta. Se seca el extendido Se observa al
microscopio.

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Tincin diferenciada o de Gram

La tincin de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el
cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente,
se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta
por la formacin de un complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios del
peptidoglicano de la pared bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de
alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la
misma, tambin destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas
debido a que sta es soluble a la accin de solventes orgnicos, como la mezcla
de alcohola-cetona. Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad
de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las
Gram negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano.
La tincin diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos qumicos que se
aplican en secuencia a un frotis fijado por calor. El primer reactivo es llamado
tincin primaria o colorante primario. Su funcin es impartir color a todas las
clulas. Con el objetivo de establecer un contraste de color, el segundo reactivo
usado es un agente decolorante, el cual puede decolorar la clula completa o solo
parte de ella. El reactivo final, el colorante de contraste, le da a las clulas
decoloradas un color que contrasta con el del colorante primario. El colorante de
contraste no puede ser absorbido por clulas que no han perdido el colorante
primario. De esta manera, tipos de clulas o sus estructuras se pueden distinguir
unas de otras en funcin del colorante que es absorbido.

Tincin Primaria: Se utiliza Cristal Violeta, que tie todas las clulas
moradas.
Mordiente: Yodo o lugol. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa la
afinidad del colorante primario con la clula, formando complejos insolubles
con este. El complejo cristal violeta-yodo sirve para intensificar el color del
tenido.
Agente decolorante: Se utiliza alcohol etlico al 95%. El etanol tiene doble
funcin: deshidratante de protenas y solvente de lpidos. El alcohol
disuelve los lpidos de la parte externa de la pared celular Gram-negativa,
haciendo la pared ms porosa. De esta manera, el complejo Cristal violeta-
yodo es removido de la capa de mureina ms fina de las bacterias Gram
negativas, mientras que la pared ms gruesa de las Gram-positivas retiene
el tinte en su interior.
Tincin de Contraste: Safranina. Este tinte se utiliza para teir de rojo las
clulas previamente decoloradas, o sea, las Gram-negativas.

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Procedimiento

1. Colocar muestra
2. Secado
3. Teir con cristal violeta por 1 minuto
4. Lave con agua
5. Aplique yodo o lugol por 1 minuto
6. Lave con agua
7. Aplique alcohol al 95 %
8. Lave con agua
9. Aplique safranina por 1 minuto
10. Lave con agua
11. Seque al aire

Practica
Grafique la prctica de tincin de Gram y defina el tipo de bacteria que se est
observando en el microscopio

Bibliografa:
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practic
o4.pdf
http://outletcatalogo.com/articulos/Las-diferencias-importantes-entre-un-
estereoscopio-y-microscopio/
http://www.pucmmsti.edu.do/websise/estudiante/materias/201220132/ST-BIO-231-
P-071/BIO-231%20PRACTICA%202%202-12-13.pdf
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf