FCXM Final

Actualizacin en Crossmatch por
Citometra de Flujo
TM. Manuel Jimnez S.

Seccin Histocompatibilidad
Subdepartamento de Enfermedades No Transmisibles
Introduccin
En 1969 un artculo publicado por Patel y Terasaki,

demostraron inequvocamente que el factor de mayor
riesgo en el rechazo hiperagudo en el trasplante de
rganos slidos, fue la presencia de DSA en el suero del
receptor
El uso de la Citometra de Flujo en el trasplante de

rganos slidos ha evolucionado de manera importante
desde que se describi por primera vez el Crossmatch
por Citometra de Flujo en 1983.
Crossmatch por Citometra de
Flujo
El FCXM es una tcnica de fluorescencia indirecta,
independiente de Complemento, de alta sensibilidad.
Detecta bajas concentraciones de anticuerpos (IgG 1,2,3,4
IgM), que pueden causar rechazo acelerado en pacientes con
a-HLA.
Objetivo
-Detectar anticuerpos donante especfico, incluyendo

aquellos de bajo ttulo.
-Indicar necesidades farmacolgicas distintas, segn su fuerza

Ventajas de FCXM
Sensibilidad, 5-10x sobre XM-CDC/AHG

Se analiza mayor nmero de linfocitos con mayor
pureza.
Puede cuantificarse la concentracin de los
anticuerpos que producen positividad (ratio-
MESF)
Detecta anticuerpos fijadores, y no fijadores de
complemento
Detecta bajos niveles de anticuerpos
Utilidad en receptores de riesgo inmunolgico
Separacin de Linfocitos por Gradiente
de Ficoll-Hypaque
Tratamiento con Pronasa*
Incubacin Suero+Clulas( 30 a 4C)
Los resultados son

Lavados PBS (s/Ca++, Mg++) expresados como
positivo o negativo
basados en la
IgG-FITC 10 a 4C
diferencia de
fluorescencia entre el
Marcaje CD3-PE, CD19-TC (20 a 4C) suero paciente y el
suero control
negativo.
Lavados PBS Fijar
Lectura Citmetro
LINFOCITOS LINFOCITOS B CD19+ LINFOCITOS T CD3+
TOTALES
LT RATIO LT MESF LB RATIO LB MESF
Linfocitos T
Expresin de
resultados:
Diferencia de
Linfocitos B fluorescencia
Flujo
Linfocitos de Donante: Tratamiento con Pronasa
EL XM CF desarrollado en el ISP, incluye (a diferencia del XM CDC) un
tratamiento previo a las clulas del donante.
Este tratamiento esta dirigido a corregir la problemtica del interpretacin de los
resultados positivos en linfocitos B
-Receptores Fc, se encuentran en mayor

cantidad en Linfocitos B.
-Puede unir IgG en forma de agregados o en
forma de complejos inmunes. (IgG irrelevantes)
-Produciendo XMCF con resultados falsos
positivos.
Flujo
v Expresin de resultados
v MCS diferencia entre la mediana de fluorescencia de la

muestra y el control negativo.
v Ratio: intensidad de fluorescencia de la muestra

dividido por control (razn)
v % de linfocitos que adhieren anticuerpo
v MESF: expresin de datos en forma estandarizada, til

para comparar resultados en el tiempo en un paciente o
entre laboratorios.
Valores de corte segn la Literatura
ASHI
- LT ratio > 1.0
- LB ratio > 1.2
Linfocitos T Cut off Positivo: > 2000 MESF
Inespecfico: < 2000 MESF
FCXM positive was obtained using a cut-off threshold of 2000 MFI for
class I antibodies and 3500 for class II antibodies. These values enabled
the prediction of positive T and B cells crossmatch, respectively.
for flow cytometry at a MFI ratio between the patients
serum and the negative control serum (pool from AB group
normal donors) of 1.2 for T cells and 2 for B cells
Flujo
Determinacin de los valores de corte
Referencia: Wayne Shumway, LifeLink Foundation, Inc.

Module: Flow Crossmatch, Section III: Aplications.
Suero de 10 individuos sanos (negativos para anticuerpos

anti-HLA, sin elementos sensibilizantes)
Clulas de 10 donantes diferentes.
Determinar el valor promedio de una reaccin negativa
para linfocitos T y para linfocitos B en unidades lineares.
(Idealmente usar MESF)
Un buen valor de cut-off para MESF corresponde a 2
desviaciones estndar del valor promedio de las
determinaciones
Valores de referencia positividad Alo Crossmatch
Citometra de Flujo- ISP. Mediana +2DS
Sangre, Ganglio, Bazo

RMF MESF
LT CD3 + > 1.0 > 1876
LB CD19 + > 2.0 > 4595
RMF: Ratio en Mediana de Fluorescencia: Suero Paciente/Suero Control Negativo

XM CF MESF
Objetivo:
Cuantificar un Crossmatch por Citometra de Flujo, convirtiendo

los valores de fluorescencia de una muestra a valores MESF.
(Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome)
Permitiendo as, estandarizar los resultados hacindolos
comparables intra e inter-laboratorios independiente del equipo
utilizado.
Ofreciendo adems una determinacin ms precisa de la
cantidad de DSA detectados en el FCXM.
Calibradores MESF
Interpretacin de
los resultados
Transplatation Reviews, 23 (2009) 80-93

Interferencias en FCXM
Drogas Inmunosupresoras Resultado Falso Modificacin FCXM

Positivo/Negativo
Tymoglobulina LT Absorcin Conjugado
Rituximab LB Aumento Concentracin

Pronasa
IgIV LT/LB Aumento Lavados post
incubacin
Anticuerpos NO HLA Resultado Falso Modificacin FCXM

Positivo
Autoanticuerpos (IgG) LT/LB Auto XM
Agregados de IgG LB Inactivacin suero 56C
Control de Calidad Externo
Welsh Transplantation and Immunogenetics Laboratory

Welsh Blood Service
Ely Valley Road
Talbot Green
Pontyclun
SCHEME 2B - CROSSMATCHING BY FLOW CYTOMETRY

-10 muestras de clulas y un total de 40 sueros se envan
cada ao, distribuidas en 5 envos.
-Cada envo consiste en 2 muestras de clulas, cada una a
probar con un set de 4 sueros diferentes.
-La evaluacin se hace en base a los resultados para
Linfocitos T y para linfocitos B, por separado.
Correlacin Lminex Single vs
FCXM
Introduccin
El reciente desarrollo de las tcnicas de fase

slida para la deteccin de anticuerpos ha
mejorado la resolucin y la especificidad de los
resultados.
Es importante que la interaccin de todas estas

tcnicas permitan determinar la relevancia clnica
de los resultados, identificando el impacto real en
la sobrevida del injerto.
- n= 45 correlaciones
- pobre correlacin MFI Ab vs. FCXM LT o LB
Transplantation, 2011;91:527-535
-92 XM
-52 sueros
-Fuerte correlacin FCXM vs. MFI
- >3000 MFI FCXM (+)
Human Inmunology 73 (2012) 517-521

Estudio correlacin
DSA Single Lminex (MFI) vs. FCXM (Ratio, MESF)
- FCXM positivos programa donante vivo, control

post trasplante.
- Sueros determinacin Lminex Single DSA (+)
- Estimar correlacin DSA (MFI) vs. FCXM (ratio,

FCXM)
- Estimar valor predictivo de DSA (MFI) que

conllevan FCXM (+).
n Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil
Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil
n Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil DSA Clase
Versin I vs FCXM
Estudiantil LT Estudiantil
Versin Versin Estudiantil
15334
Variable(1) Variable(2) n Pearson p-valor
11324 Ratio
Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin LT Versin
Estudiantil MFI Clase
Estudiantil I 14 0,54 0,0480
DSA Clase I (MFI)
7314
3304
Versin Estudiantil
n Estudiantil
Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil
-706
-0,60Estudiantil 8,20 Estudiantil 17,00
DSA Clase I (MFI) vs.
Versin Estudiantil Versin Versin Versin Estudiantil 25,80 34,60
Versin Estudiantil Versin Estudiantil
n Estudiantil Versin Estudiantil
Versin Estudiantil
Versin Estudiantil
Versin Estudiantil
FCXM
Versin LT (ratio)Versin Estudiantil
Estudiantil
Versin Estudiantil
Versin Estudiantil
FCXM LT (ratio, MESF)
Versin Estudiantil
sin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil
sin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil DSA Clase
Versin I vs FCXM
Estudiantil LT Estudiantil
15334
11324 Variable(1) Variable(2)
n Pearson p-valor
DSA Clase I (MFI)
Versin Estudiantil MESF LT
Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil MFI Clase
Versin Estudiantil I 14 0,51 0,0633
7314
3304
sin Estudiantil -706
Versin Estudiantil -16237
Versin Estudiantil 77592 Estudiantil 171421
Versin Versin Estudiantil265250 359079
sin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil FCXM
Versin LT (MESF)
Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil
Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil
Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil DSA Clase
Versin II vs FCXM
Estudiantil LB Estudiantil
43469
Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Variable(1)
Versin Estudiantil Variable(2) n Pearson p-valor
32347
Ratio LB MFI Clase II 14 0,20 0,4968
DSA Clase II (MFI)
21225
10103
Estudiantil Versin -1019
Versin Estudiantil
Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil
1,00Estudiantil
Versin 17,50 Estudiantil 34,00
Versin
FCXM
Versin Estudiantil 50,50 67,00
Versin Estudiantil
LB (ratio)Versin Estudiantil
Versin Estudiantil DSA Clase II (MFI) vs.
Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil FCXM LB (ratio, MESF)
Versin Estudiantil
n Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil DSA Clase
Versin II vs FCXM
Estudiantil LB Estudiantil
43469
Variable(1) Variable(2) n Pearson p-valor
32347 MFI
Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil Versin ClaseVersin
Estudiantil II MESFEstudiantilLB 14 0,17 0,5651
DSA Clase II (MFI)
21225
10103
n Estudiantil Versin -1019
Versin Estudiantil -18162
Versin Estudiantil 175850Estudiantil 369862
Versin Versin Estudiantil563875 757887
n Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil FCXM
Versin LB (MESF)
Estudiantil Versin Estudiantil Versin Estudiantil
Crossmatch Citometra de Flujo
con
Donante Cadver
FCXM retrospectivo con donante
cadver
59 FCXM con donante cadver
(retrospectivo)
Receptores PRA Mx. > 30 % (cualquier

mtodo)
Correlacin con Lminex Single (DSA?+/-)
5 receptores Prioridad mdica

FCXM LT (ratio) vs. PRA Mx.
Valor de corte
1,0
FCXM LB (ratio) vs. PRA Mx.
Valor de corte
2,0
FCXM Donante Cadver
44 XM (-) 15 XM (+)
74% 25%
DSA (-) 9 LT-LB (+) 7 LB (+)
4 DSA clase I y II 1 DSA Clase I

3 DSA clase I 2 DSA Clase II
2 DSA (-) 4 DSA (-)
Citometra de Flujo DC
XM v (-) /XM CDC (-) / FCXM (+)
- 8% (5) Receptores PM
- 16% DSA (+) (10) - 8% (5) DSA pre exist.
- 10% DSA (-) (6)
- (1) Rechazo humoral (No HLA?)

- (2) Suero Histrico (2009) sueros Actuales (-)
- (1) Solo positividad MESF LB (ac. DQ dbil, DSA?)
- (1) Falso (+) (6870 MESF LB) cutoff 4595 MESF
- (1) Falso (+) LB
- 74% de los receptores XMv predictivo de FCXM (-)

- 8% de los receptores se detectaron DSA pre-existentes.
- 3% Falsos Positivos (todos en LB)
Pasos a seguir
Determinar por medios estadsticos, la relevancia clnica de los
anticuerpos anti HLA detectados en tcnicas de fase solida.
DSA MFI
Valores que
predicen un
crossmatch
(FCXM /CDC)
positivo
Human Inmunology 73(2012), 597-604
Casos Clnicos
Suero
Linfocitos T
Ratio MESF
Linfocitos B
Ratio MESF
Caso N 1
06.10.2011 1,0 615 1.0 0 Estudio con donante vivo
22.12.2011 1,0 0 4.0 28141
R: A2-3/B13-65(14)/DR4-7
Linfocitos T Linfocitos B
D: A2-68(28)/B13-39(16)/DR4-7
Suero Ratio MESF Ratio MESF
06.10.2011 1,0 615 1.0 0
06.10.2011 CDC c/s DTT
22.12.2011 1,0 0 4.0 28141
c/DTT: 7% s/DTT:7%
22.03.2012 1.0 0 1.0 0
Lminex Single
22.12.2011
06.10.2011 1,0 615 1.0 0
vPRA: 28% DSA: Negativo
22.03.2012 1.0 0 1.0 0
17.04.2012 1.0 0 1.0 0
Suero 22.12.2011 Inactivado
22.12.2011 1,0 615 5.0 26543 a 56C
22.12.2011 1,0 0 1.0 2328
Caso N 2
Estudio Donante Vivo
17.10.2011 Luminex Single

R: A31(19)-68(28)/B51(5)-39(16)/DR16(2)-14(6) vPRA: 62% DSA: Negativo
D: A31(19)-68(28)/B39(16)-/DR16(2)-11(5)
trasplante: 05.11.2006 TX-DC Luminex Single

20.02.2012
vPRA: 64% DSA: Negativo
03.06.2010 1,0 615 1.0 0
17.10.2011 1.0 0 1.0 0
Otros Antecedentes:
20.02.2012 1.0 0 5.0 33794 Receptor recibe dosis de
20.03.2012 1.0 0 3.0 22950 Rituximab en Febrero.
Suero Ratio MESF Ratio MESF Crossmatch modificado:
20.02.2012 1,0 0 1.0 0 Aumento concentracin
20.03.2012 1,0 0 1.0 0 de la Pronasa.
Caso N 3
Seguimiento Post Trasplante (Tx 2011)
27.03.2012 Luminex Single
Suero Ratio MESF Ratio MESF DSA: DQ6 1283 MFI
DR15 6349 MFI
27.03.2012 4,0 28669 22 488065
Antecdentes:
Post TX receptor recibe dosis
de 100 mg. de Timoglobulina
Crossmatch modificado:
27.03.2012 1,0 1557 7 39184
Conjugado Anti -IgG Absorbido
Caso N4
Receptor Estudio Donante Vivo
A2-32(19)/B7-64(14)/DR1-7
Lminex Single: vPRA :21% B44:02 1159 MFI
B44:03 551 MFI
B45:01 1281 MFI
B76 499 MFI
Linfocitos T Linfocitos B B82:02 1929 MFI
Donante 1
24,11.2011 1,0 1062 3,0 4919
A 24(9)-31(19)/B44(12)-35/DR7-
Suero Ratio MESF Ratio MESF Donante 2
07.02.2012 3,0 9461 6,0 31.710 A 1-29(19)/B44(12)-55(22)/DR17(3)-
Suero Ratio MESF Ratio MESF Donante 3
23.04.2012 2,0 3747 4,0 11.923 A 29(19)-32(19)/B44(12)-64(14)/DR7-
Consideraciones finales
En 74 % receptores TX > 30% PRA, el vXM fue

predictivo de un FCXM Negativo.
En el 8% de estos receptores, se detectaron DSA

pre existentes al Tx. Una de las causantes de
esto, fue la falta de actualizacin de los estudios
de anticuerpos por Single Luminex.
El valor de Cut-off descrito anteriormente, no

aplica como una gua exacta para definir la
presencia o no de anticuerpos especficos contra
el donante.
Consideraciones finales
Idealmente el cut-off se determina mediante un

estudio retrospectivo, correlacionando resultados
de FCXM con lneas de sobrevida clnica del
injerto a mediano y largo plazo.
Los anlisis de los resultados obtenidos a la

fecha, plantean el desafo de desarrollar estudios
estadsticos que permitan correlacionar las
distintas tcnicas, aportando de mejor manera en
las decisiones clnicas.
Gracias
Gracias

FCXM Final

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Actualizacin en Crossmatch por

TM. Manuel Jimnez S.

En 1969 un artculo publicado por Patel y Terasaki,

El uso de la Citometra de Flujo en el trasplante de

-Detectar anticuerpos donante especfico, incluyendo

-Indicar necesidades farmacolgicas distintas, segn su fuerza

Sensibilidad, 5-10x sobre XM-CDC/AHG

Tratamiento con Pronasa*

Incubacin Suero+Clulas( 30 a 4C)

Los resultados son

-Receptores Fc, se encuentran en mayor

v MCS diferencia entre la mediana de fluorescencia de la

v Ratio: intensidad de fluorescencia de la muestra

v % de linfocitos que adhieren anticuerpo

v MESF: expresin de datos en forma estandarizada, til

Referencia: Wayne Shumway, LifeLink Foundation, Inc.

Suero de 10 individuos sanos (negativos para anticuerpos

Sangre, Ganglio, Bazo

LB CD19 + > 2.0 > 4595

RMF: Ratio en Mediana de Fluorescencia: Suero Paciente/Suero Control Negativo

Cuantificar un Crossmatch por Citometra de Flujo, convirtiendo

Transplatation Reviews, 23 (2009) 80-93

Drogas Inmunosupresoras Resultado Falso Modificacin FCXM

Rituximab LB Aumento Concentracin

Anticuerpos NO HLA Resultado Falso Modificacin FCXM

Welsh Transplantation and Immunogenetics Laboratory

SCHEME 2B - CROSSMATCHING BY FLOW CYTOMETRY

El reciente desarrollo de las tcnicas de fase

Es importante que la interaccin de todas estas

Human Inmunology 73 (2012) 517-521

- FCXM positivos programa donante vivo, control

- Sueros determinacin Lminex Single DSA (+)

- Estimar correlacin DSA (MFI) vs. FCXM (ratio,

- Estimar valor predictivo de DSA (MFI) que

Receptores PRA Mx. > 30 % (cualquier

Correlacin con Lminex Single (DSA?+/-)

5 receptores Prioridad mdica

DSA (-) 9 LT-LB (+) 7 LB (+)

4 DSA clase I y II 1 DSA Clase I

- 10% DSA (-) (6)

- (1) Rechazo humoral (No HLA?)

- 74% de los receptores XMv predictivo de FCXM (-)

17.10.2011 Luminex Single

trasplante: 05.11.2006 TX-DC Luminex Single

En 74 % receptores TX > 30% PRA, el vXM fue

En el 8% de estos receptores, se detectaron DSA

El valor de Cut-off descrito anteriormente, no

Idealmente el cut-off se determina mediante un

Los anlisis de los resultados obtenidos a la

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