CENTRO UNIVERSITARIO NEWTON

INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS

ENGENHARIA QUMICA

LUCAS BESSA LOPES

ESTUDO PARA IMPLEMENTAO DE ANLISE DE CRNEOS E

LCTEOS VIA TESTE ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT
ASSAY)

BELO HORIZONTE
2016
 CENTRO UNIVERSITARIO NEWTON
INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS

ENGENHARIA QUMICA

LUCAS BESSA LOPES

ESTUDO PARA IMPLEMENTAO DE ANLISE DE CRNEOS E

LCTEOS VIA TESTE ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT
ASSAY)

Relatrio apresentado ao Curso de Engenharia

Qumica do Centro Universitrio Newton, na
Disciplina de Estgio Supervisionado, como
trabalho final de Estgio.

Orientador: Professora Raquel

BELO HORIZONTE
2016
 SUMRIO

1 INTRODUAO ............................................................................................................... 3
1.1 Descrio da empresa .................................................................................................. 3

1.1.1 Histrico ........................................................................................................... 4

1.1.2 Organograma ................................................................................................... 4

1.2 Anlise de Situao (Problematizao)....................................................................... 5

1.3 Justificativa ................................................................................................................... 5

2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 5
2.1 Objetivo geral ................................................................................................................ 5

2.2 Objetivos especficos ................................................................................................... 6

3 CRONOGRAMA ............................................................................................................. 6
4 DESENVOLVIMENTO DOS OBJETIVOS ESPECFICOS ............................................. 7
4.1 Revisar bibliografia pertinente a anlise..................................................................... 7

4.2 Desenvolver o procedimento operacional para anlise do glten via ELISA. ........ 10

4.3 Avaliar a curva de calibrao como uma etapa de validao de mtodo. .............. 14

4.4 Avaliao do coeficiente de Variao e da relao B/B0 como etapa de validao

do metodo .......................................................................................................................... 18

5 CONSIDERAES FINAIS.......................................................................................... 24
6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................. 25
 3

1 INTRODUAO

O presente trabalho visa conciliar a teoria e pratica abordada pelo curso com a
convivncia real do mercado de trabalho, uma vez que voltado para a otimizao ou
criao de processos dentro da empresa na qual ocorre o estgio, favorecendo assim
com que o aluno possa desenvolver uma maior autonomia e proficincia profissional.

Como ramo empresarial da empresa na qual o estgio ocorre (GMO) voltao para
analises fsico-qumicas e microbiolgicas de alimentos, aguas e cosmticos, h
sempre uma demanda por novos mtodos mais eficazes e menos custosos ou
trabalhosos, a fim de otimizar os processos alm de garantir melhor faixa de anlise
e reduo de custos. Neste trabalho ser abordado um estudo terico para posterior
implementao do equipamento ELISA no controle de qualidade de crneos e lcteos,
desta forma ser feita uma coleta de tcnicas j validadas ou em processo de
validao para analises destes, apresentando de forma mais detalhada os mtodos
utilizados, para que este sirva de base para uma anlise de custos e viabilidade para
a implementao do teste nas anlises que forem abordadas.

1.1 Descrio da empresa

A GMO Centro de Pesquisas e Controle de Qualidade Ltda. localiza-se a Rua

Belmiro de Almeida, 198 Bairro So Cristvo, cep 31230-230, Belo Horizonte,
Minas Gerais. Trata-se de uma empresa privada criada em 1987, tendo como scios
Francisca Gracion Freire Giro, Raimundo Hilton Giro Nogueira, Hilton Freire Giro
e Adriana Freire Giro. Atua no ramo de anlises microbiolgicas e fsico-qumicas
em produtos alimentcios (principalmente crneos e lcteos), cosmticos e gua.

Possui um laboratrio de anlises fsico qumicas e um de analises microbiolgicas.

composta por 35 funcionrios, sendo estes divididos em 10 do setor admnistrativo,12
do setor de analise fsico-qumica, 9 do de analises microbiolgicas, 2 da direo e
finalmente 2 funcionrios no setor da qualidade. Os ensaios que fazem parte dos
escopos de acreditao e/ou habilitao atendem aos requisitos da norma NBR
ISO/IEC 17025, dos clientes e rgos regulamentadores.
 4

1.1.1 Histrico

O GMO Centro de Pesquisas e Controle de Qualidade Ltda. foi fundado em maio de

1987, com a finalidade de preencher uma lacuna at ento existente no mercado de
anlise de produtos e insumos destinados alimentao humana. GMO o nome
fantasia que significa Giro, Marcus e Olavo, que foram os scios fundadores. No
incio, a empresa tambm prestava servios de diagnstico na rea de veterinria,
mas logo procurou mudar e concentrar o foco das atividades no controle de qualidade,
tendo em vista que a diversificao, no entender da empresa, era um empecilho
prestao de servios de boa qualidade. Hoje, o GMO uma referncia neste
mercado, no s no estado de Minas Gerais como em outras unidades da federao.

Os clientes atendidos pertencem aos mais variados segmentos, indo desde as

grandes cozinhas industriais, passando pelos fabricantes de massas, frigorficos,
laticnios, indstria de produtos crneos, etc., alm de cosmticos e medicamentos.

1.1.2 Organograma
A figura 1 apresenta o fluxograma com as divises principais da empresa.

Figura 1: Fluxograma da empresa em setores

 5

O setor de realizao do estgio o laboratrio fsico-qumico por via mida, neste

so realizadas vrias anlises de compostos em alimentos diversos, verificando se
estes seguem os limites estabelecidos por lei ou ento quantificando compostos
especficos a desejo do cliente.

1.2 Anlise de Situao (Problematizao)

Como prestador de servio o GMO est sempre disposto a atender de forma eficaz e
com qualidade a maior gama de clientes possvel. Desta forma a implementao de
novas anlises, fornece uma abertura na dimenso do atendimento da mesma sobre
novos produtos das empresas j cadastradas bem como de novas empresas,
acarretando no aumento da produtividade final e num maior retorno para a empresa.

1.3 Justificativa

Recentemente a empresa adquiriu um equipamento ELISA para auxiliar na demanda

das anlises. Desta forma coloc-lo em pleno funcionamento uma questo de
grande interesse tanto da parte produtiva quanto financeira, uma vez que o novo
equipamento fornece novas possibilidades de anlises j feitas por outros mtodos,
assim como o controle de novas substancias que podem ser incrementadas na lista
de ensaios feitos pela empresa. Caso no implementado seu uso, o equipamento
tornar-se-ia uma despesa considervel, visto que no sendo utilizado no capaz de
gerar um retorno financeiro que cubra os gastos de sua compra e manuteno.

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Estudo e preparao para implementao de anlises em produtos crneos e

lcteos atravs do ELISA (Ensaio de Imunoadsoro enzimtica).
 6

2.2 Objetivos especficos

1- Revisar bibliografia pertinente a anlise
2- Desenvolver o procedimento operacional para anlise do glten via ELISA.
3- Avaliar a curva de calibrao como uma etapa de validao de mtodo.
4- Avaliao do coeficiente de Variao e da relao B/B0 como etapa de
validao do mtodo

3 CRONOGRAMA

Meses
Atividades
Setembro Outubro Novembro Dezembro

Pr Projeto

Objetivo especifico 1

Objetivo especifico 2

Objetivo especifico 3

Objetivo especifico 4

Analise dos resultados

Finalizao
 7

4 DESENVOLVIMENTO DOS OBJETIVOS ESPECFICOS

4.1 Revisar bibliografia pertinente a anlise

crescente a preocupao com compostos prejudiciais nos alimentos em geral. Isto

se deve ao grande nmero de compostos qumicos empregados na conservao ou
desenvolvimento dos alimentos, bem como a contaminao dos alimentos durante
alguma etapa do processo de fabricao. Com isto o controle de qualidade sobre os
mesmos torna-se cada vez mais intenso, a fim de garantir que o consumidor final
esteja de fato consumindo um produto seguro.

Dentre esses problemas destaca-se os compostos que apresentam o glten. Mesmo

que seja de forma natural, parte dos constituintes do glten so capazes de gerar uma
resposta imune em indivduos que possuem doena celaca.

A doena celaca (DC) uma intolerncia permanente ao glten, caracterizada por

atrofia total ou subtotal da mucosa do intestino delgado proximal e consequente m
absoro de alimentos, em indivduos geneticamente susceptveis. (WALKER-SMITH,
1996).

Com isso h obrigao do fabricante em informar se o produto que comercializa

contem ou no glten conforme a Lei n10.674. E em casos em que o alimento
especificado como sem glten, este deve obedecer o limite mximo de glten
estabelecido pelo CODEX, que de 20 ppm de glten. Apesar do Brasil no possuir
uma lei que limita o teor mximo

Devido baixa quantidade de glten nesses alimentos, a tcnica utilizada para a

anlise do mesmo deve ser bem sensvel ao analito e de preferncia bem seletiva,
uma vez que as matrizes das amostras sofrem grande mudana de um alimento para
outro, dificultando ainda mais a dosagem mais prxima do valor real em cada um. A
tcnica que est sendo empregada com sucesso o ensaio de imunoadsorao
enzimtica para glten (ELISA R5), mtodo este j validado pelo AOAC servindo por
tanto de base para anlise quantitativa do teor de glten em alimentos em geral.

O glten compreende a poro proteica do trigo, centeio ou cevada e subdividido

em duas classes proteicas. As prolaminas que so protenas solveis em etanol e
insolveis em gua e as gluteninas que so solveis em agua e precipitam em etanol.
A anlise do glten feita de forma indireta pelo teor de gliadina, secalina e hordeina
que so as prolaminas presentes no trigo, centeio e cevada.
A tcnica ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) trata-se de um ensaio
Imunoenzimatico para identificao e quantificao de antgenos. O mtodo baseia
em reaes especificas entre um anticorpo com o antgeno1 em questo, aps a
ligao do antgeno com o anticorpo, formando um complexo antgeno anticorpo,
acrescenta-se uma protena ou um anticorpo conjugado com uma protena. Estes se

1 Substancias capazes de interagir com os anticorpos do hospedeiro gerando ou no resposta imune.

 8

ligam a complexo anticorpo-antgeno e com adio de um substrato e um agente

cromgeno possvel verificar a presena do antgeno. Uma vez que ao se formar o
complexo h uma modificao da colorao do agente cromgeno, gerando assim um
gradiente de colorao conforme a concentrao do antgeno na amostra. Esta
concentrao pode ser analisada atravs de um espectrofotmetro na regio do
visvel, relacionando assim a intensidade da cor da amostra quantidade de antgeno
presente na mesma.

O ELISA possui algumas variantes quanto a forma de anlise sendo os mais

importantes para anlise do glten os mtodos competitivo e sandwich. O que ser
utilizado para anlise de glten neste trabalho ser o mtodo sandwich uma vez que
um mtodo j validado e utilizado como padro para esta anlise.

No ELISA competitivo so adsorvidos anticorpos nos poos da placa, e sobre estes

so adicionadas as amostras e um soluo do conjugado associado ao mesmo
antgeno de anlise. Desta forma o antgeno presente na amostra compete com o
antgeno-conjugado pelo anticorpo fixado na placa. Neste caso a medida de
concentrao inversamente proporcional a intensidade da cor ofertada pela reao
do cromgeno. Uma vez que quanto mais intensa a colorao menos antgenos da
amostra esto ligados ao anticorpo fixado.

No mtodo sandwich da mesma que no competitivo h um anticorpo fixado nos

poos da placa (anticorpo R5) esse anticorpo especifico para a poro proteica do
glten (gliadina2) que capaz de desencadear uma resposta imune no ser humano.
Sobre este sero adicionados padres com concentraes definidas do antgeno
(gliadina) para construo da curva de calibrao e a amostra com o antgeno, aps
acrescenta-se um novo anticorpo igual ao fixado (R5), porem j conjugado a uma
protena especifica geralmente uma peroxidase3, que ao reagir com o substrato e o
agente cromgeno posteriormente resultar numa mudana de colorao de acordo
com a concentrao do antgeno analisado. Ao final dos perodos de incubao
necessrios e ao se adicionar todos as espcies citadas, adiciona-se uma soluo de
cido sulfrico, que para a reao para que no haja variao indesejada na colorao
do agente cromgeno, e a medida do teor seja mais aproximada o possvel do valor
real.

Antes de comear a anlise as amostras passam por um pr-tratamento uma vez que
necessitamos de uma soluo incolor que contenha uma poro homognea do glten
que estava na amostra. A anlise como j dito no quantifica o glten mas sim a
gliadina, como esta solvel em etanol, pode-se extrair a mesma da amostra
previamente homogeneizada e pesada com um poro quantificada de etanol PA.
Porem em alimentos termicamente processados a distribuio das prolaminas pelo
alimento fica prejudicada, variando de forma discrepante de uma regio para a outra
e mesmo com uma homogeneizao previa h pouco disponibilidade da mesma.

2 Poro proteica do glten que insolvel em agua e solvel em etanol e est presente no trigo.
3 Enzima que catalisa a reao de decomposio do peroxido de hidrognio.
 9

Logo em casos de amostras termicamente processadas tem-se que utilizar um

solvente especifico para elas, que est disponvel no kit de analise com o nome de
cooktail. Assim com o uso dessa soluo de extrao e do seguimento rigoroso das
demais etapas consegue-se preparar uma amostra representativa.

Apesar da alta especificidade do mtodo por utilizar anticorpos monoclonais e de seu

baixo limite de quantificao e deteco, h uma gama de fatores que podem interferir
significativamente na obteno de valores reais do teor de glten. Por isso de
extrema importncia que se siga todas as instrues contidas no procedimento tcnico
de forma rigorosa a fim de minimizar ao mximo esses erros.
Por ser uma anlise delicada trabalhando-se com micro volumes, a pipetagem torna-
se uma das principais fontes de erro na realizao do ensaio de quantificao do
glten. Desta forma seguir as boas prticas para o manuseio de micropipeta torna-se
indispensvel no durante a realizao do ensaio. Como a maior parte das etapas do
processo possui um tempo especifico (informaes contidas no procedimento tcnico
apresentado no objetivo 2), o uso de um micropipeta de canal nico pode contribuir
bastante para erros do processo, o que se agrava ainda mais com o aumento do
nmero de amostras que sero lidas, necessitando-se dessa forma do uso de
micropipetas multicanal o que facilitar o trabalho e diminuir a chances de equvocos
durante a anlise.

Ligada a parte de pipetagem est a lavagem da placa no decorrer das etapas que a
pedem, essa lavagem extremamente importante para o sucesso do ensaio. Como
cada parte da anlise na placa envolve a ligao entre agentes biolgicos e qumicos,
tem-se a necessidade de sempre retirar aqueles que no esto ligados e que podem
ocasionar erros na quantificao final. A lavagem atuar nesse momento, retirando as
compostos bioqumicos que no esto ligados nem microplaca e nem aos anticorpos
e deste modo devem ser retirados. Deve-se atentar no s ao fato de acrescentar a
soluo de lavagem mas tambm sua retirada que muito importante, por isso
depois que se adiciona o volume requerido do tampo de lavagem em cada poo,
retira-se vigorosamente o mesmo da microplaca, e golpeia-se a microplaca contra um
empilhado de papel absorvente a fim de retirar toda a soluo de lavagem.

Por fim o maior cuidado que deve-se ter est relacionado contaminao que o
ambiente pode oferecer anlise. Por isso antes de se comear a homogeneizao
da amostra, todos os equipamentos, utenslios e bancadas devem estar bem limpos
e sanitizados com lcool 70 a fim de evitar qualquer contaminao cruzada com as
amostras. Deve-se ter cuidado tambm com o jaleco e luvas que se tiverem tido
qualquer contato com alimento que contem glten anteriormente devem ser lavados
ou descartados conforme se julgue necessrio, lembrando-se que a contaminao
cruzada ocorre at mesmo a nvel areo, devendo-se proceder se possvel em local
com ar isento de possveis contaminantes.
 10

4.2 Desenvolver o procedimento operacional para anlise do glten via

ELISA.
H bastante material bibliogrfico discorrendo a respeito do glten e dos celacos,
porm no h muitos que falam sobre as tcnicas de analise, que pelo visto ainda so
bem poucas que conseguem obter resultados com exatido e preciso satisfatrios.
Isso ocorre provavelmente pela constituio no fixa do glten, bem como a variao
de sua quantidade nos alimentos dificultando sua quantificao.

Aps pesquisar por materiais que discorressem sobre os procedimentos e mtodos de

anlises do glten foram encontrados o Manual do Kit Ridascreen Gliadin (R-Biopharm)
e a Association of Official Analytical Chemists (AOAC) e dois artigos, sendo apenas
um tratava do mtodo idntico ao utilizado. Alm disso tanto a bula do kit quanto a
AOAC estavam em ingls mostrando que ainda mais complicado encontrar material
nacional que trata dessas tcnicas.

Assim aps tradues e adaptaes de acordo com os reagentes e equipamentos

disponveis no laboratorio foi possvel desenvolver o procedimento tcnico operacional
que se segue.

1. OBJETIVO
Determinao do teor de glten em amostras de Crneos, Lcteos e Farinceos.
Para a anlise utilizado o kit comercial ELISA R5 (Ridascreen Gliadin, R-Biopharm,
Barnstad, Alemanha), trata-se de um ensaio imunoenzimtico (ELISA) do tipo
sandwich.
Esse baseia-se na reao entre o anticorpo monoclonal (R5) adsorvido nos poos da
placa com o antgeno (gliadina, hordeina e secalina) formando o complexo Anticorpo-
Antgeno e posteriormente a ligao deste complexo a um outro anticorpo (R5)
conjugado a uma enzima (peroxidase). Sobre esses adiciona-se o agente cromgeno
e um substrato, com a reao ocorre uma mudana na colorao do cromgeno (de
incolor para azul), para interromper a reao adiciona-se uma soluo de parada
(cido sulfrico 1N) que causa uma alterao da colorao azul para amarelo, cuja
intensidade medida a 450 nm proporcional concentrao do antgeno na amostra.
Atravs da concentrao de gliadina encontrada possvel determinar o teor de glten
pela simples multiplicao do teor de gliadina por 2, j que o teor de gliadina
representa metade do de glten.

2. APLICABILIDADE
Anlise de alimentos processados ou no termicamente.
 11

3. RESPONSABILIDADE
Auxiliares Tcnicos
Supervisor

4. MATERIAL NECESSRIO
Reagentes
Kit Ridascreen Gliadin
Soluo de etanol 70% (v/v).
Soluo de etanol 80% (v/v).
lcool Etlico P.A.
gua Purificada
Materiais e equipamentos
Triturador
Vortex
Eppendorf (1,5 mL)
Centrfuga
Estufa de secagem.
Leitor de micro placas com filtro para medio a 450
nm
Micro placa ELISA revestida com anticorpo R5
Tubos falcon 15 mL
Frascos 10 mL
Micropipetador de 20 a 200 L e de 200 a 1000 L

5. NORMAS DE SEGURANA

Seguir orientaes POP.LFQ. 001

Manipular a soluo Cooktail sob a capela, pois contm -mercaptoetanol.
Evitar contato direto da soluo de parada com qualquer parte do corpo, pois
contm cido Sulfrico 1N.

6. CONSIDERAES GERAIS
Higienizao do local e dos materiais utilizados com lcool 70% (v/v) para evitar
contaminaes cruzadas.
Realizao do preparo das amostras em local diferente da anlise das
mesmas.
Austeridade nos procedimentos de preparo das amostras.
Manter os poos da micro placa sempre cobertos para que no haja
contaminao.
Retirar de forma efetiva as solues nos poos durante as lavagens.

7. DESCRIO DAS ATIVIDADES

7.1 Preparo das solues (quantidade para 2 tiras)
1. Preparar de soluo de etanol a 70%v/v
2. Preparar Soluo etanol a 80%v/v
3. Diluir em 1:5 a soluo Tampo Diluente concentrada (3 mL sol. + 12 mL de
gua purificada)
 12

4. Diluir em 1:10 a soluo Tampo de Lavagem concentrada (100 ml sol. + 900

mL de gua purificada)
5. Diluir em 1:11 a soluo Conjugado (200 L sol. Conjugado + 2 mL de gua
purificada) Obs: Deve ser diluda no momento de uso, quantidade
suficiente para 2 tiras completas.
7.2 Preparo das amostras

7.2.1 Amostras liquidas

1. Homogeneizar 300 mL da amostra.
2. Coletar 0,25 mL da amostra, adicionar 2,5 ml da soluo Cocktail e
homogeneizar no vrtex.
3. Incubar durante 40 min a 50 C em banho Maria, se necessrio homogeneze
no vrtex novamente.
4. Aguardar o arrefecimento da amostra, em seguida, mistur-la com 7,5 ml de
etanol 80%.
5. Fechar o frasco e agitar por 1 h em um agitador orbital temperatura
ambiente (20 - 25 C)
6. Centrifugar por 10 minutos (2500 g) temperatura ambiente (20 - 25 C)

7.2.2 Amostras Slidas

1. Homogeneizar 300 g da amostra.
2. Coletar 0,2500 g da amostra, adicionar 2,5 ml da soluo Cocktail e
homogeneizar.
3. Incubar durante 40 min a 50 C em banho Maria.
4. Aguardar o arrefecimento da amostra, em seguida, mistur-la com 7,5 ml de
etanol 80%.
5. Fechar o frasco e agitar por 1 h em um agitador orbital temperatura
ambiente
6. Centrifugar por 10 minutos (2500 g) temperatura ambiente (20 - 25 C)

7.2.3 Amostras de Crneos

1. Triturar 300g de amostra ate formao de massa homognea.
2. Coletar 0,2500 g da amostra, adicionar 2,5 ml da soluo Cocktail e
homogeneizar.
3. Incubar durante 40 min a 50 C em banho Maria.
4. Aguardar o arrefecimento da amostra, em seguida, mistur-la com 7,5 ml de
etanol 80%.
5. Fechar o frasco e agitar por 1 h em um agitador orbital temperatura
ambiente (20 - 25 C)
6. Centrifugar por 10 minutos (2500 g) temperatura ambiente (20 - 25 C)

7.2.4 Amostras com Tanino e/ou polifenois (chocolate, caf, cacau, farinha
de castanha, condimentos)
1. Homogeneizar 300 g da amostra.
 13

2. Coletar 0,2500 g da amostra e adicionar 0,25g de Leite em p desnatado

qualidade alimentar, adicionar 2,5 ml da soluo Cocktail e homogeneizar.
3. Incubar durante 40 min a 50 C em banho Maria.
4. Aguardar o arrefecimento da amostra, em seguida, mistur-la com 7,5 ml de
etanol 80%.
5. Fechar o frasco e agitar por 1 h em um agitador orbital temperatura
ambiente.
6. Centrifugar por 10 minutos (2500 g) temperatura ambiente (20 - 25 C)

7.3 Quantificao da Gliadina

1. Transferir o sobrenadante para um frasco

2. Diluir em 1:12,5 (80 L sobrenadante + 920 L soluo Tampo Diluente
diluda) fazer em duplicata (Obs.: esta diluio serve para preencher 2
tiras completas)
3. Separar nmero de tiras de poos necessrio para anlise em duplicata.
4. Preencher os poos da microplaca com 100 ul de cada padro e amostra em
duplicata
5. Incubar a temperatura ambiente com microplaca tampada, por 30 min.
6. Identificar as fileiras onde esto os padres e amostras.
7. Retirar vigorosamente a soluo dos poos da microplaca
8. Adicionar 250 L da soluo de lavagem diluda em cada poo e retirar
vigorosamente, repetir esta lavagem mais 2 vezes.
9. Acrescentar 100 L da soluo do conjugado diluda em cada poo e incubar
por 30 min a temperatura ambiente
10. Repetir o procedimento 8.
11. Acrescentar 50 L do substrato e 50 L do cromgeno em cada poo da
micro placa, agitar levemente e incubar por 30 min em temperatura ambiente
e ao abrigo de luz.
12. Adicionar 100 L da soluo de para em cada poo e aguardar 30 min para
realizao da leitura.
13. Fazer a leitura da microplaca no leitor a 450 nm.

8. CLCULOS

. . 2
( )=
1000
Onde:
C a concentrao de gliadina (g/kg)
Fd o fator de diluio final da amostra (mais utilizado de 500x)
2 o fator de converso de gliadina para glten, uma vez que o teor de glten o
dobro do de gliadina.
 14

4.3 Avaliar a curva de calibrao como uma etapa de validao de mtodo.

A curva de calibrao uma curva grfica que correlaciona duas grandezas a fim de
obter um dos valores relacionados em funo do outro. Como muitos mtodos e
equipamentos de anlises laboratoriais no conseguem fornecer de forma imediata a
concentrao de um analito em anlise, muitas vezes necessria a construo da
curva padro para correlacionar a propriedade medida atravs do aparelho com a
concentrao de padres, que so solues contendo o analito desejado em
concentraes muito bem conhecidas, desta forma possvel, por exemplo, criar uma
curva de calibrao em um espectrofotmetro UV-vis que correlacione a absorbncia
encontrada no aparelho para cada soluo padro utilizada. Geralmente a curva de
calibrao obedece um formato de reta (Equao 1).
Y = Ax + B (Equao 1)

Onde Y nos mtodos espectrofotomtricos geralmente a absorbncia, A o

coeficiente de inclinao da reta, x a concentrao do analito cujas as unidades so
as mesmas das dos padres utilizados para construo da curva e B o coeficiente
angular da reta.

A partir destes dados possvel quantificar um analito a partir da absorbncia

encontrada na amostra, e substituindo-se esta na equao de reta gerada pela curva
de calibrao para o ensaio em questo.

A anlise da linearidade de curvas de calibrao de estrema importncia na

validao e confirmao dos mtodos laboratoriais que a utilizam de forma geral.
Depois de formulada a curva de calibrao deve ser a avaliada a fim de verificar se o
mtodo analtico esta produzindo resultados diretamente proporcionais
concentrao do analito, bem como se seus limites superiores e inferiores atendem
as especificaes necessrias para as anlises feitas.

Um dos critrios de avaliao da linearidade das curvas a avalio dos desvios dos
pontos produzidos atravs dos padres, uma vez que a tendncia desses pontos deva
descrever uma reta como observado. Porem devido a erros de diversas naturezas,
como de equipamento, de manipulador, de vidrarias e outras ferramentas utilizadas,
 15

podem haver pontos com desvio discrepante, causando uma distoro da reta
invalidando a curva.

A identificao dos pontos da curva de calibrao que estou com grande desvio os
chamados outliers, pode ser feita atravs do teste de valor extremo (Teste de Grubbs).
Este teste trata-se de uma funo estatstica amostral, que utilizada com a formula
(Equao 2 ) e Tabela 1.
Tabela 1 : Dados de Zc para o teste de Grubbs em
diferentes intervalos de confiana.
n 0,1 0,05 0,025 0,01 0,005
3 1,148 1,153 1,154 1,155 1,155
4 1,425 1,462 1,481 1,492 1,496
5 1,602 1,671 1,715 1,749 1,764
6 1,729 1,822 1,887 1,944 1,973
7 1,828 1,938 2,02 2,097 2,139
8 1,909 2,032 2,127 2,221 2,274
9 1,977 2,11 2,215 2,323 2,387
10 2,036 2,176 2,29 2,41 2,482
11 2,088 2,234 2,355 2,484 2,564
12 2,134 2,285 2,412 2,549 2,636
13 2,176 2,331 2,462 2,607 2,699
14 2,213 2,372 2,507 2,658 2,755
15 2,248 2,409 2,548 2,705 2,806
16 2,279 2,443 2,586 2,747 2,852
17 2,309 2,475 2,62 2,785 2,894
18 2,336 2,504 2,652 2,821 2,932
19 2,361 2,531 2,681 2,853 2,968
20 2,385 2,557 2,708 2,884 3,001
21 2,408 2,58 2,734 2,912 3,031
22 2,429 2,603 2,758 2,939 3,06
23 2,449 2,624 2,78 2,963 3,087
24 2,468 2,644 2,802 2,987 3,112
25 2,486 2,663 2,822 3,009 3,135
26 2,503 2,681 2,841 3,029 3,158
27 2,52 2,698 2,859 3,049 3,179
Fonte: Portal action.4

4Disponivel em: http://www.portalaction.com.br/incerteza-de-medicao/19-teste-de-valor-extremo-

grubbs.
 16

xi x
Z= (Equao 2)
s

Onde xi o valor amostral , x

a mdia amostral e s o desvio padro amostral.
Com o valor de Z possvel compara com o Zc da tabela 1 o qual est correlacionado
com o nmero de amostras, caso o Z < Z c o ponto est com desvio aceitvel em caso
de outliers o Z > Z c.

Com base nesses dados possvel rastrear quais os pontos que no satisfazem a
curva desejada e refaze-los de forma praticas ou em casos permitidos exclui-los da
curva.

Apesar de grande parte dos mtodos analticos instrumentais trabalharem com curvas
de calibrao na forma de reta, a anlise de glten utilizando o espectrofotmetro leitor
de ELISA no adeque os dados encontrados nesta forma. Para trabalhar os dados e
absorbncia e concentrao o software do aparelho trabalho com uma interpolao
cubica sob os valores encontrados. A partir desta obtm-se um grfico semelhante ao
descrito na figura 1.

Pode-se verificar que a anlise desta curva no e to simples uma vez que no se
trata de um ajuste linear. Neste caso possvel analisar a curva por meio de um
software matemtico como Excel, encontram-se um modelo de curva adequado,
prossegue-se com uma interpolao polinomial, a fim de alocar o valor de absorbncia
encontrado na curva de calibrao e obter o valor da concentrao do analito (glten).

Por se tratar de uma curva mais complexa os critrios de linearidade e testes de

outliers no se aplicam to bem a essa curva. Ainda no h uma validao especifica
para o mtodo ELISA, desta forma orientado utilizar os critrios estabelecidos para
outros ensaios que envolvem instrumentos semelhantes, como as
espectrofotometrias. Porem como j dito o modelo linear de curva desses mtodos
impossibilita o mesmo tratamento de dados ao ELISA. Assim no momento para a
anlise de glten em especifico uma vez que o tipo de tratamento de dado apesar de
utilizar o mesmo aparelho modifica-se conforme o analito que quantificado, uma vez
 17

que as relaes entre a absorbncia e concentrao podem assumir vrios formatos

de curvas de retas a polinomiais mais completas.

O Kit de anlise vem acompanhado de uma curva de calibrao referncia. E

recomendado a sobreposio da curva obtida no ensaio com a de referencia para
avaliar desvios grandes, porm no so reportados valores que delimitam o grau de
desvio entre a curva de calibrao encontrada e a curva padro do kit, complicando
desta forma uma anlise mais detalhada.

A figura 1 apresenta uma curva padro a qual deve ser utilizada como comparao
para as curvas obtidas em anlises como o exemplo a curva feita para analise de
amostras de pao de queijo e biscoito sequilhos apresentada na figura 2.

Figura 1 Curva de calibrao padro certificada pelo Kit Figura 2 Curva de calibrao utilizada em uma das
de anlise. anlises.

Fonte: O autor (2016) Fonte: O autor (2016)

 18

Como pode-se observar a curva de calibrao encontrada se assemelha bastante a

curva padro para comparao. Desta maneira pode-se ter uma confiana maior nos
valores encontrados para esta anlise. Vale ressaltar ainda que apesar dos padres
expressarem a curva em ppb, o valor de concentrao final expresso em valores
relativos a ppm, esta adequao da curva com concentrao bem menor feita para
que tenha-se uma sensibilidade maior aos erros de mtodo e manuseio em geral,
diminuindo desta forma a chance de obter-se valores mais discrepantes que o ideal.

Os limites de quantificao do glten como pode ser visto na curva so de 5 a 80 ppm,

isto ocorre porque de forma geral o interesse na anlise para identificar o alimento
como contendo ou no contendo glten, desta forma como o limite do teor de glten
em alimentos ditos sem glten de de 5 ppm segundo a ANVISA, o prprio limite de
quantificao do mtodo o limite regulamento at ento. Vale lembrar que apesar
desta medida estipulada pela ANVISA, o CODEX alimentarius prev um limite de 20
ppm para alimentos ditos sem glten.

4.4 Avaliao do coeficiente de Variao e da relao B/B0 como

Como visto no objetivo anterior o mtodo usado para o tratamento dos dados da curva
de calibrao para a anlise via ELISA uma interpolao polinomial de 3 grau, isto
gera uma curva que no apresenta uma tendncia linear. Assim so necessrios
outras analises de dados alm da linearidade que neste caso no aplicvel.

Um mtodo de anlise estatstica dos dados que nos oferece um valor interessante
para a verificao dos dados obtidos na anlise quanto sua exatido e preciso o
coeficiente de variao. Este pode ser compreendido como uma forma de medir o
grau de disperso dos resultados obtidos em relao mdia. Desta forma consegue-
se estabelecer um grau de confiana nos valores obtidos para as absorbncias
encontradas na curva de calibrao bem como para as amostras. O coeficiente de
variao pode ser definido matematicamente com a equao 3.

(Equao 3)
 19

Onde C.V. o coefeiciente de variao, a mdia populacional, o desvio padro,

a mdia amostral e S o desvio padro amostral. O controle de qualidade que
utilizado como referncia pelo kit de anlise preconiza que o C.V. seja menor ou igual
a 10% tanto para os padres utilizados na construo da curva de calibrao quanto
para as absorbncias encontradas para as duplicatas das amostras. Este valor
garante com que as duplicatas das amostras analisadas estejam com uma disperso
muito pequena e aceitvel em relao mdia das mesmas medidas.

Para a anlise destes dados foi tomada a ltima batelada de anlises feita com 8
amostras com matriz diversificada de alimentos, cuja a curva de calibrao esta
apresenta na figura 3 e os valores de absorbncias para os padres e seus
respectivos valores de C.V. esto contidos na tabela 2.

Figura 3: Curva de calibrao utilizado no ensaio em batelada

Fonte: O autor (2016)

 20

Tabela 2 Relao entre a curva de calibrao e o C.V. das absorbncias

obtidas
Concentrao do padro Absorbncias obtidas
Valor do C.V. (%)
(g/kg) para duplicata da curva
5 0.331 0.317 3.1
10 0.603 0.584 2.3
20 1.028 1.032 0.3
40 1.598 1.530 3.1
80 2.099 2.079 0.7
Fonte: O autor(2016)

As amostras com seus respectivos cdigos e os valores de C.V. so listados na tabela

3, para todos os clculos de C.V. foi utilizada a equao 3 trabalhando com os dados
amostrais uma vez que o nmero de amostras bem pequeno no podendo ser
tratado de forma populacional.

Tabela 3 Relao dos valores de C.V. encontrados para as amostras analisadas.

Cdigo Valor do C.V.

Amostra Absorbncias
(%)

19435 Escondidinho de Carne 0.368 0.375 17.8

19352 Biscoito Papa Ovo 0.391 0.438 19.9
19353 Biscoito de Polvilho 0.338 0.019 8.6
19351 Queijo Frescatino 0.122 0.119 5.8
19350 Queijo Frescatino 0.175 0.186 8.7
19354 Sequilhos Sabor Coco 0.222 0.260 11.5
19436 Pizza 2.577 2.228 115.0
19765 Farinha de Trigo 2.184 2.102 102.6
Fonte: O autor(2016)
 21

Como pode-se observar houve uma discrepncia muito elevada em alguns valores de
C.V. que deveriam se aproximar a valores menores que 10%. Isto pode ser devido a
vrios fatores crticos durante a realizao da anlise bom como do prprio estado do
kit visto que este estava bem prximo do vencimento e havia sido aberto a bastante
tempo. As etapas que pipetagem so bastante crticas nessa anlise bem como as
etapas de lavagem, que podem ocasionar bastante flutuaes nos valores de
absorbncias obtidos refletindo diretamente nos valores de C.V. e outros utilizados
para validao e/ou confirmao do mtodo.

Outra causa possvel est nas etapas de preparao das amostras, uma vez que
nesta as amostras ficam vulnerveis a contaminaes externas de glten, cujo o valor
mnimo suspenso no ar poder influenciar significativamente na anlise devido sua
alta especificidade e ao baixo limite de deteco e quantificao do mtodo.

A outra forma complementar de avaliao que proposta pelo prprio kit a anlise
da relao de B/B0, esta foi realizada nos ensaios interlaboratoriais que constam em
documentos da empresa fornecedora do kit para a validao do mtodo como oficial
para anlise do glten pela AOAC.

Os valores de B e B0 tratam-se da absorbncia do padro ou amostra e da

absorbncia obtida para o padro de maior concentrao. Esta uma ferramenta para
a normalizao das curvas, para que possa se ter uma noo do qual distante ou
prximo est o desvio da curva de calibrao obtida em relao curva de calibrao
fornecida pelo prprio kit como parmetro de comparao, como as curvas so
obtidas por interpolao e no por funes de tendncia esta uma forma pratica e
com relativa confiana para se inferir o qual aceitvel est a curva de calibrao obtida
durante a batelada analisada.

A tabela 4 correlaciona os valores de B/B0 com os valores obtidos na curva de

calibrao disposta na figura 3 a partir da mdia das absorbncias descritas na tabela
2.
 22

Tabela 4 Relao entre as absorbncias da curva de calibrao utilizada e o B/B0

Concentrao dos
Mdia das absorbncias Valor de B/B0 (%)
Padres (ng/kg)
0 0.040 1,9
5 0.324 15,5
10 0.593 28,4
20 1.030 49,3
40 1.564 74,9
80 2.089 100,0

Fonte: O autor(2016)

Os valores encontrados de B/B0 da tabela 4 sero utilizados para se plotar um grfico

destes dados juntamente com o mesmo parmetro da curva de calibrao
disponibilizada pelo kit. Ao se plotar ambas as curvas no mesmo grfico ser possvel
observar os desvios entre a curva utilizada na anlise (figura 3) e a curva padro do
kit ( figura 2), assim haver mais uma anlise de dados para complementar o
coeficiente de variao citado anteriormente, favorecendo uma anlise das curvas
mais prximo ao real valor, tendo assim uma melhor segurana na declarao dos
resultados obtidos uma vez que analise trabalha com um analito potencialmente
danoso a pessoas com intolerncia ao mesmo, gerando dessa forma uma
preocupao ainda maior na liberao de um resultado confivel e reprodutvel.

Tabela 5 Relao entre as absorbncias da curva de calibrao padro e o B/B 0

Concentrao dos
Mdia das absorbncias Valor de B/B0 (%)
Padres (ng/kg)
0 0,049 2,1
5 0,287 12,2
10 0,591 25,1
20 1,039 44,2
40 1,690 71,9
80 2,351 100,0
 23

Fonte: O autor(2016)
O grfico 1 relaciona os B/B0 da curva padro com a curva utilizada e as
concentraes dos padres de 0, 5, 10, 20, 40 e 80 ng/kg.

Grfico 1 - Relao entre o parametro B/B0 da curva de calibrao

padro e a utilizada no ensaio
120.0

Curva de Calibrao Certificada

100.0
Curva de calibrao do ensaio

80.0
B/B0 (%)

60.0

40.0

20.0

0.0
0 50 100
Concentrao dos padres (ng/kg)

Fonte: O autor(2016)

Como observa-se no grfico 1, a relao B/B0 da curva utilizada para o ensaio se

aproxima de maneira significativa da curva gerada com os dados de B/B 0 da curva de
calibrao de referncia fornecida pelo kit. Desta maneira esta uma informao
complementar a C.V., comprovando que a curva de calibrao obtida no ensaio
realmente est dentro dos limites propostos, gerando dessa forma uma anlise mais
confivel do analito.
 24

5 CONSIDERAES FINAIS

Ao final do trabalho obteve-se resultados no tao dentro do esperado quanto a leitura

de amostras, o que pode ter sido devido validade do kit utilizado que j estava muito
prximo de expirar e este ficou aberto por bastante tempo sem ser utilizado. Porem
foi possvel desenvolver o procedimento tcnico operacional que possibilitou a
realizao das analises, como foi proposto durante o desenvolvimento do projeto. Por
fim os dados colhidos para o incio da validao do mtodo no foram suficientes para
determinar de fato todas as anlises necessrias para validar o mesmo. Devido ao
termino do tempo para mais analises no foi possvel aprofundar mais nas etapas de
validao do mtodo. Mas ao final foi proposto para continuidade do processo de
validao dentro da empresa, a aquisio de padres de referncia, a fim de avaliar e
comprovar o limite de quantificao do mtodo, como uma forma de assegurar que os
valores que esto sendo obtidos so confiveis, e que o mtodo nas condies
operadas est de fato retornando o limite de quantificao informado pelo fornecedor.

O presente trabalho possibilitou o desenvolvimento de capacidades pro atividade,

trabalho em equipe, domnio de tcnicas laboratoriais, assim como aprofundou o
estudo sobre os processos envolvidos na anlise, complementando contedos de
estudo como a estatstica envolvida na anlise das curvas e outras caractersticas
para a validao do mtodo, permeando as reas de biotecnologia e microbiologia de
forma prtica e aplicvel, possibilitando a anlise e otimizao da tcnica abordada.
 25

6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ABREU, Rejane W. de et al . Deteco de glten em alimentos por meio de

ELISA.Rev. Inst. Adolfo Lutz (Impr.), So Paulo, v. 65, n. 3, 2006 . Disponvel
em: <http://periodicos.ses.sp.bvs.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0073-985520
06000300005&lng=pt&nrm=iso>. Acesso em: 15 de Out. 2016.

Association of Official Analytical Chemists. Gluten parcialmente hidrolisado em

produtos com base em cereais fermentados. Mtodo 2015.05. 20 Edio. Capitulo 32
pg. 69.

BARBOSA, Snia Frana Correia; ABREU, Rejane Weissheimer de; ZENEBON,

Odair. Mtodos analticos para deteco de glten em alimentos. Rev. Inst. Adolfo
Lutz (Impr.), So Paulo, v. 66, n. 2, 2007. Disponvel em <http://periodicos.ses.s
p.bvs.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0073-98552007000200001&lng=pt&nrm
=iso>. Acesso em 02 de Out. 2016.

SDEPANIAN, Vera Lucia; MORAIS, Mauro Batista de; FAGUNDES-NETO, Ulysses.

Doena celaca: a evoluo dos conhecimentos desde sua centenria descrio
original at os dias atuais. Arq. Gastroenterol. So Paulo, v. 36, n. 4, p. 244-
257, Dec. 1999. Disponivel em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script= sci_a rtt
ext&pid=S000 4-28031999000400013&lng=en&nrm=iso>. Acesso em: 20 de
Set. 2016.