UNIVERSIDAD TECNOLGICA METROPOLITANA

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, MATEMTICAS Y DEL MEDIO AMBIENTE

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGA
Ingeniera en fermentaciones

Cultivo por lotes: Determinacin de la

concentracin de sustrato limitante y
concentracin celular.
16 de Junio

Profesor: Roberto Landaeta Le Fort

Integrantes: Alexis Torres Miranda

lvaro Brito Arratia

Fabin Gonzlez Toro

Carol Gonzlez Muoz

ndice

1. Resumen ......................................................................................Error! Bookmark not defined.

2. Introduccin .................................................................................Error! Bookmark not defined.
3. Objetivos .................................................................................................................................... 1
4. Materiales y Metodologa ........................................................................................................ 2
5. Procedimiento experimental ................................................................................................... 2
6. Resultados ................................................................................................................................. 4
7. Discusin y conclusiones ........................................................................................................ 9
8. Bibliografa ............................................................................................................................... 10

1|Pgina
 1. Resumen

En esta experiencia se realiz una fermentacin por lotes, en donde se debi controlar las
condiciones en el reactor y determinar la evolucin de las concentraciones de biomasa y
sustrato limitante, para lo cual se emple la tcnica turbidimtrica, midiendo la
absorbancia de muestras extradas del fermentador, cada 30 minutos, en un periodo total
de 3 horas. La concentracin de biomasa se determin midiendo directamente la
absorbancia a 620 nm, utilizando la curva patrn de biomasa, y la concentracin de
sustrato se determin mediante el mtodo DNS, midiendo la absorbancia a 540 nm,
empleando posteriormente la curva patrn de glucosa. Se calcul la productividad
volumtrica del proceso, se obtuvo un rendimiento de sustrato en biomasa de 0,246 y una
velocidad especifica de crecimiento de 0,458. Se obtuvo una alta tasa de crecimiento
debido a que el proceso se realiz en presencia de oxgeno, lo que predispone el
crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.

2. Introduccin

En un proceso de fermentacin, los microorganismos son una parte muy activa del
proceso productivo. El microorganismo es lo ms importante en las fermentaciones
industriales y los aspectos de ingeniera estn supeditados al organismo. Dependiendo
del tipo de biocatalizador que tengamos, y las condiciones de este, ser ms rentable
usar un tipo u otro de medio, cierta cantidad de agua, entre otros. Es necesario
determinar la dinmica en la que realizars el proceso, lo que depende ms del producto
que del microorganismo. Tambin depende del tipo de medio que haya elegido.
Considerando la cintica de la entrada de medio podemos clasificar 3 tipos de cultivo:
Discontinuo (o Batch)
Discontinuos con alimentacin (o Feed-batch)
Continuos

El cultivo en lote (o por lotes) es un sistema cerrado, porque, despus de iniciado el

proceso (al mezclar los nutrientes y el microorganismo), solo se adiciona oxgeno,
antiespumantes y bases o cidos para el control del pH. La fermentacin se lleva a cabo
en un periodo definido de tiempo, durante el cual vara la composicin de biomasa y la de
metabolitos. Despus se interrumpe el proceso y se recupera el producto.

Para realizar exitosamente una fermentacin en lote, es necesario conocer la curva de

crecimiento del microorganismo: al saber el comportamiento de su crecimiento, se pueden
manipular las condiciones de manera que se obtenga un producto deseado, por ejemplo,
si lo que se requiere es la produccin de metabolitos primarios se debe alargar la fase
logartmica; si son metabolitos secundarios, se extiende la fase estacionaria y para
aumentar la cantidad de biomasa, se buscan las condiciones de mayor produccin de
clulas.

En este tipo de fermentacin se pueden distinguir cuatro etapas: la fase de latencia, la de

crecimiento exponencial, la fase estacionaria y la de muerte. (Fig. 1).

2|Pgina
 Fig. 1 Curva de crecimiento bacteriano.

En la fase de latencia se aprecia un aumento mnimo de la concentracin celular y se

atribuye a la adaptacin del microorganismo a las nuevas condiciones ambientales. La
duracin de esta fase depende del inculo y por este motivo se recomienda utilizar un
inculo que se encuentre en fase de crecimiento exponencial, con lo cual se logra reducir
el tiempo de la fase de latencia.

En esta experiencia se realizar un proceso de fermentacin por cultivo Batch, utilizando

una cepa de Saccharomyces cerevisiae y un medio de cultivo YPD, con el objetivo de
determinar el crecimiento del microorganismo en funcin del tiempo, los resultados sern
comparados con una curva de calibracin realizada anteriormente.

3. Objetivos

- Conocer el mtodo de operacin de un fermentador en cultivo por lotes.

- Aplicar mtodo DNS
- Determinar la concentracin celular de biomasa y sustrato limitante en el fermentador,
en intervalos de tiempo.
- Construir una curva de la evolucin de ambas concentraciones en el tiempo.
- Determinar la velocidad especfica de crecimiento
- Determinar el rendimiento de sustrato en biomasa.

1|Pgina
 4. Materiales y Metodologa

4.1. Reactivos:
- Medio de cultivo estril YPD (3 litros)
- Inculo de Saccharomy cescerevisiae (200 mL)
- Etanol 70%
- Reactivo DNS (cido 3-5 dinitrosaliclico)
- Agua destilada

4.2. Materiales:
- Fermentador (Tanque agitado Winpact de 5 L)
- Mechero.
- Bao termostatizado a 100 C.
- Bao para enfriar
- Espectrofotmetro.
- Centrifuga.
- Cubetas.
- Tubos de ensayo x 20.
- 2 Vasos precipitados de 250 mL.
- Pipetas graduadas.
- Set de micropipetas

4.3. Metodologa

Una vez iniciada la fermentacin a temperatura y pH controlado, tras inocular, se extrajo

muestras del caldo de cultivo, en intervalos de 30 min, procediendo a determinar mediante
espectrofotometra la concentracin celular de la muestra junto con la concentracin de
sustrato limitante en la muestra diluida, mediante el mtodo DNS.

A partir de la curva de calibrado obtenida en el prctico anterior, para biomasa y glucosa,

y con los datos obtenidos durante el proceso de fermentacin por lotes de este prctico,
se elabor una curva de evolucin de la concentracin de sustrato y biomasa en funcin
del tiempo.

5. Procedimiento experimental

Para iniciar la operacin, el fermentador debi estar calibrado y esterilizado, tras lo cual se
inici el sistema de agitacin, control de temperatura y pH. El volumen til en este caso
fue de 3,2 L, empleando una cepa de Saccharomyces cescerevisiae. Las condiciones de
operacin correspondieron a 35 C y pH=6,7 sin aireacin, empleando un medio de cultivo
YPD y agitacin.

2|Pgina
 5.1 Determinacin de concentracin celular.

Se realiz la determinacin de concentracin celular mediante el mtodo turbidimtrico,

midiendo la absorbancia a 620 nm. Para lo cual se debi extraer una muestra del
fermentador cada 30 minutos y se agreg una pequea cantidad a una celda de
espectrofotmetro, realizando la lectura directamente. La toma de muestras se realiz
teniendo las precauciones correspondientes para mantener la esterilidad y condiciones en
el equipo.

Se registr la absorbancia obtenida, para un tiempo dado, junto con la temperatura y pH

correspondiente. Mediante el valor de la absorbancia se obtiene la concentracin celular,
empleando la curva de calibrado para biomasa elaborada en el prctico anterior.

Luego se ingresan los datos de concentracin de biomasa versus tiempo, representando

el crecimiento durante la fermentacin.

5.2. Determinacin de glucosa mediante mtodo de DNS

De la muestra extrada con anterioridad, se trasvasija a tubos de centrfuga y se procede

a centrifugar a 10.000 rpm por 5 minutos, el sobrenadante obtenido es aadido a un tubo
de ensayo con tapa y se diluye con agua destilada a razn de 1:20, por duplicado.
Posteriormente se emple el protocolo DNS, donde se mezclaron 1 mL de muestra diluida
con 1 mL de reactivo DNS, los tubos se taparon y se colocaron en un bao a ebullicin
por 5 minutos. Se enfri en un bao con hielo y se aadi a cada tubo 10 mL de agua
destilada. Tras dejar reposar las soluciones, se midi la absorbancia a 540 nm.
Con la informacin obtenida de absorbancia, empleando la curva de calibrado de glucosa
elaborada en el prctico anterior, se determina la concentracin de glucosa presente en la
muestra, realizando la grfica de evolucin en el tiempo de fermentacin.

5.3 Clculo de rendimiento y productividad volumtrica.

El rendimiento de la fermentacin, corresponde a la cantidad de producto obtenido tras la

fermentacin, dividido por la cantidad de sustrato limitante consumido en el proceso. Es
decir, es la diferencial de la biomasa dividido en la diferencial de sustrato en la
fermentacin:

=
( )

La productividad volumtrica, corresponde a la concentracin de producto generado en un

tiempo determinado:

=

3|Pgina
5.4 Clculo de velocidad especfica de crecimiento:

La velocidad especfica, es posible de calcular mediante la expresin:

=
Desde donde es posible despejar . Para lo cual se requiere tener el valor de
concentracin celular inicial y final (Xo,X).

6. Resultados

6.1 Curvas de calibracin de concentracin de biomasa en el tiempo y

concentracin de glucosa en el tiempo.

A partir de la curva de calibracin, se calcula la concentracin de biomasa y glucosa

existente en la muestra tomada del fermentador, a diferentes absorbancias. Al modelar la
grfica recta con la ecuacin de la recta, se puede obtener la concentracin celular y de
glucosa realizando un despeje algebraico.

Curva de calibracin, A vs Conc. biomasa

1
0.9 y = 1.2086x + 0.0031
0.8 R = 0.9975
0.7
Absorbancia

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
Concentracin celular (g/L)

Grfico 1. Curva de calibracin biomasa, rango lineal. Abs vs biomasa

Mediante la ecuacin de la recta: A = 1,2086(Concentracin) + 0,0031

4|Pgina
 Curva de calibracin, A vs conc. glucosa
0.3
y = 0.3292x - 0.0545
0.25
R = 0.9999
0.2
Aborbancia

0.15

0.1

0.05

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Concentracin glucosa (g/L)

Grfico 2. Curva de calibracin para concentracin de glucosa Abs vs conc. glucosa

Se obtiene la ecuacin A = 0,3292(Concentracin) 0,0545

Se reemplazan los datos de A obtenidos, calculando segn:

0,0031
( ) = 1,2086
(Ec. 1)

+ 0,0545
( ) = 0,3292
(Ec. 2)

5|Pgina
6.2 Determinacin de concentracin de Biomasa y Glucosa en el tiempo.

La concentracin de biomasa presente en el fermentador fue determinada en intervalos

de 30 min, se utiliz curva de calibracin (Ec. 1), de manera que con el valor de la
Absorbancia se calcul el valor de concentracin celular. De la misma forma se obtuvo la
concentracin de glucosa con la (Ec. 2), las mediciones de glucosa se realizaron por
duplicado con el fin de promediarlas y obtener un menor margen de error.

Determinacin - Resultados medicin en el tiempo:

Tiempo Absorbancia Biomasa Absorbancia Sustrato

(Biomasa) (g/L) (Glucosa) (g/L)
0 0,366 0,300 0.460 (dilucin 31,268
1:20)
30 0,394 0,323 0.463 (dilucin 31,440
1:20)
60 0,456 0,375 0.506 (dilucin 34,052
1:20)
90 0,594 0,489 0.529 (dilucin 35,480
1:20)
120 0,688 0,567 0.477 (dilucin 32,290
1:20)
150 0,554 0,912 0.423 (dilucin 29,040
(dilucin 1:2) 1:20)
180 0.720 1,186 0.401 (dilucin 27,673
(dilucin 1:2) 1:20)
Tabla 1. Valores de Absorbancia, concentracin de biomasa y sustrato (glucosa)

6|Pgina
 Curva crecimiento X y S en Fermentacin
por lote
40.000

35.000
y = -0.0206x + 33.46
R = 0.2452
30.000
Concentracin [g/L]

25.000
Biomasa
20.000
[g/L]

15.000
Sustrato
10.000 [g/L]

y = 0.2583e0.0079x
5.000
R = 0.9506
0.000
0 50 100 150 200
Tiempo [minutos]

Grfico 3. Curva comportamiento de la biomasa y sustrato (glucosa) en el tiempo en cultivo Batch.

7|Pgina
 Curva crecimiento X en fermentacion por lote
1.400

1.200

1.000
y = 0.2583e0.0079x
Biomasa [g/L]

R = 0.9506
0.800

0.600 Biomasa [g/L]

0.400

0.200

0.000
0 50 100 150 200
Tiempo [miutos]

Grfico 4. Curva comportamiento de la biomasa en el tiempo en cultivo Batch.

6.2. Determinacin de rendimiento y productividad volumtrica

Rendimiento:

=
( )

1,186 0,3
= = 0,246
(31,268 27,673)

Rendimiento para el proceso de fermentacin por lote es = 0,246

Nota: Se considera el valor ms alto y ms bajo de concentracin de glucosa encontrado

en el proceso de fermentacin para obtener coherencia.

Productividad volumtrica:

=

8|Pgina

1,186 0,3

= = 0,2953
3

La productividad volumtrica es Qp = 0,2953

Determinacin de la velocidad especfica:

ln = t

1,186 1
ln =
0,3 3
0,458
=
hora

7. Discusin y conclusiones

En cuanto a la determinacin de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae se pudo

observar (grfico 4) que el microorganismo presento una fase de latencia muy corta,
desde el tiempo 0 hasta los 30 minutos aproximadamente esta fase responde a la
adaptacin del microorganismo al medio. El inoculo haba comenzado a cultivarse desde
la noche anterior dentro de un medio idntico, por lo tanto, al momento de inocular hacia
el reactor el microorganismo presentaba una fase estacionaria. Transcurridos los 30
minutos se pudo observar un crecimiento exponencial, donde la levadura en tres horas
fue capaz de triplicar su masa inicial. Para los ltimos dos valores de Absorbancia, para
medir biomasa, se aplic una dilucin 1:2 para mantener un rango de valores ptimos.

La concentracin de biomasa inicial al tiempo 0 es de 0,3 (g/L) y el valor final es de 1,186

(g/L) transcurridas 3 horas. Se puede ver el por qu es una de las cepas ms utilizadas en
procesos fermentativos, puesto que, prcticamente pudo triplicar su biomasa en
aproximadamente 3 horas, cabe destacar que el crecimiento fue medido con presencia de
oxgeno disuelto dentro del bioreactor. Este aumento en biomasa solo posible solo si el
medio contiene los nutrientes necesarios para un crecimiento ptimo del microorganismo
y el medio YPD utilizado es uno de los ms completos para el crecimiento de levaduras.
Al transcurrir las tres horas el porcentaje de oxgeno disuelto haba disminuido desde
100% hasta aproximadamente un 1 a 2 %, esto repercutira en una disminucin de la tasa
de crecimiento de la levadura si el proceso continuase.

9|Pgina
La concentracin de glucosa fue disminuyendo gradualmente en el tiempo, esto debido a
que la concentracin de biomasa estaba aumentando por lo que existe una mayor
demanda de sustrato dentro del bioreactor. Dentro de la curva de sustrato en el grafico 3
se tuvieron pics de desbalance en los minutos 30 y 90, esto puede ser debido a errores
operacionales al momento de tomar la muestra o al realizar el protocolo de reaccin por el
mtodo DNS. Adems, el reactivo DNS genera altos niveles de dispersin en la
absorbancia medida porque reacciona con todos los azucares reductores de una muestra.

El rendimiento obtenido fue de 0.246, el cual est en funcin de azucares reducidos y no

especficamente de glucosa. Esto se debe a que el reactivo DNS no reacciona
especficamente con el sustrato limitante (glucosa) sino que reacciona con todos los
azucares reductores presentes, como la peptona etc. Por lo tanto, el reactivo DNS no es
recomendado para procesos de fermentacin industrial debido a los altos niveles de
dispersin lo que impide un clculo correcto del rendimiento de sustrato con respecto a la
biomasa.

8. Bibliografa

Muoz, M., & Catrilaf , G. (23 de Septiembre de 2013). Estimacin de parmetros cinticos de
Saccharomyces cerevisiae en sistema de fermentacin Batch bajo distintas condiciones de
crecimiento. Recuperado el 25 de Mayo de 2017, de www.researchgate.net:
https://www.researchgate.net/profile/Miguel_Munoz_Flores/publication/257310255_Estimation
_of_kinetic_parameters_of_Saccharomyces_cerevisiae_in_batch_fermentation_during_different_
growth_conditions/links/00463524e576d9f2fc000000.pdf

Nelson, D., & Cox, M. (2009). Principios de Bioqumica. Barcelona: Ediciones Omega.

Suarez, C., Norge , G., & Guevara , C. (2016). Levadura Saccharomyces cerevisiae y la produccin
de alcohol. Revisin bibliogrfica. ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caa de Azcar, , 50 (1), 20-22.

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