Techniques dinsertion de lADN dans un

vecteur plasmidique
Principe Gnral
Gne dintrt + Plasmide Gne greff sur le plasmide

I. Utilisation denzymes de restriction

Exemple de clonage utilisant le vecteur pBR322 (premier vecteur dvelopp pour le gnie gntique)

-
Plasmide pBR 322 :
o Porte un gne de rsistance AmpF
o Porte un gne de rsistance TetF
o Porte un site de restriction BamH1 dans le gne de rsistance la ttracycline
Clivage BamH1 Plasmide cliv, on y rajoute le fragment dADN souhait (insert) qui ait les mmes
extrmits hybridation + ligase plasmide recombin avec linsert (+ une petite quantit de plasmide
original reform)
Remarque : lutilisation dune seule enzyme de restriction permet linsertion du fragment dADN dans 2
sens.
1. Coupure enzymatique du vecteur
2. Insertion du fragment dADN cloner, coup par BamH1
- Insertion dans 2 sens possibles mais donne le mme rsultat : le clonage est dit non directionnel
Le clonage directionnel est obtenu en utilisant deux enzymes de restriction, do lintrt des sites de
clonage multiples sur les vecteurs
Plasmide pUC clonage directionnel : coupure HindIII / BamH1
Le clonage directionnel est le plus utilis car il permet beaucoup moins de dchets.

II. Clonage Topo TA

Principe
- Taq polymrase a une activit ADN pol matrice indpendante qui ajoute un nuclotide A lextrmit
3
- La topoisomrase I du virus de la vaccine reconnat une squence dADN et coupe en restant fix
lextrmit 3 via un rsidu Tyr
- Utilisation dun vecteur de la Socit Invitrogen prsentant une thymidine unique 3 dbordante lie
la topoisomrase I de Vaccina
- Mlange avec un produit de PCR obtenu avec une enzyme Taq peu fidle
 III. Clonage par recombinases

A) Rappel sur la recombinaison site spcifique

- Recombinaison site spcifique : attP x attB :
o Recombinaison entre deux ADN un endroit prcis (Ex : intgration du phage dans E. coli)
o Coupure au niveau attP et attB, puis recombinaison
- Recombinaison site spcifique : attL x attR :
o Excision : sortie du phage du gnome bactrien
o Fait intervenir lintgrase et lexcisionage, codes par le phage, et IHF, code par E. coli
o attL et attR sont des squences rptes directes

Application en Gnie Gntique :

- Le nombre de sites dattachement sur le plasmide nest pas limit un seul

- Un lment central peut tre encadr par des sites att
- Cet encadrement permet de dplacer un gne sur un autre plasmide

B) Le systme de clonage Gateway

1) Principe
-Technique universelle de clonage, base sur :
o La recombinaison des sites att (B, P, L, R)
o Mlange denzymes appel Clonase contenant une intgrase (Int), un facteur dintgration
(IHF) et dans certains cas une excisionase (Xis)
Permet linsertion rapide de squences dADN dans de multiples vecteurs
ADN (vecteur donneur) Clone dentre (vecteurs de destination) Vecteurs dexpression

2) Obtention du vecteur dentre

- Par des enzymes de restriction et ligases
Coupure du vecteur donneur par des enzymes de restriction et dinsertion de linsert
- Par les produits de PCR flanqus par des sites attB
Raction BP :
o Recombinaison attB de produits de PCR avec attP provenant du vecteur donneur clone
dentre
o Enzyme catalysante : Clonase BP (Int et IHF)

3) Transfert de linsert sur dautres vecteurs

- Raction LR cration du clone dexpression
o Recombinaison attL du clone dentre avec attR provenant du vecteur de destination clone
dexpression
o Enzyme catalysante : Clonase LR (Int, Xis et HIF)

4) Application de la technologie Gateway

Clonage haut dbit dun ensemble de gnes codant diffrents RCPG (exemple trait en TD3)

C) Le clonage par la recombinaison Cre-lox

- Principe de la recombinaison Cre-lox
- Le systme Creator
 - Le systme Cre-lox est une recombinaison site spcifique du bactriophage

1) Principe de la recombinaison Cre-lox

-
Cre est une recombinase du phage P qui reconnat les sites Lox (Lox = locus of crossing-over)
-
Un site Lox est une squence dADN de 34pb comprenant 13 nuclotides palindromiques aux
extrmits
Schma de recombinaison entre sites lox ayant la mme orientation

2) Le systme Creator (Clontech)

- Il permet de sous-cloner un gne port par un vecteur donneur dans un vecteur accepteur pour
former un clone dexpression

3) Application du systme Cre / Lox : interruption gnique

D) Avantages des systmes de recombinaison

- Utilisation dune seule enzyme
- Evite le sous-clonage par des enzymes de restriction
- Clonage directionnel
- Les sites de recombinaison sont lextrieur des squences dintrt
- 10 min pour gnrer une vingtaine des vecteurs dexpression
- Absence de digestion, purification ou ligation

IV. Technique de clonage LIC

-Technique de clonage base sur :

o Lutilisation des proprits exonuclasiques 3 5 des DNA polymrases fidles (T4 pol.)
o Production et utilisation dextrmits simple brin longues et complmentaires sur linsert et
sur le vecteur
o Utilisation de lhybride insert / vecteur pour la transformation bactrienne sans lintervention
dune ligase exogne
- Principe : production et utilisation dextrmits simple brin dbordantes longues (> 10nt)
Insert + vecteur = hybride stable, utilisable pour transformer directement des bactries sans addition de
ligase

Technique dveloppe par la socit Novagen : Sries de vecteurs de la famille pET LIC

- pET30 LIC : TP de Biotechnologie

- Production dun insert avec des extrmits LIC complmentaires de celles prsentes sur le plasmide

Principe pour la production de linsert :

5 Extrmit LIC 3 Gne cible 3 Extrmit LIC 5 PCRT4 DNA pol + ATP ; 5-3 pol ; 3-5 exo
Insert
- Lhybride plasmide / insert est utilis tel quel sans intervention de ligase in vitro
- Les liaisons phosphodiesters sont mises en place par la ligase bactrienne endogne
Avantages :
o Evite lutilisation des enzymes de restriction
o Clonage directionnel
 o Compatible avec du clonage haut dbit

V. La technique EFC (enzyme free cloning)

- Amlioration de la technique LIC : ne ncessite quune seule enzyme

- Base sur la PCR asymtrique ( htro-stagger PCR ) afin de crer des extrmits dbordantes
longues simples brins diffrentes aux deux extrmits des brins du gne cible et ventuellement du
vecteur
Fragment dADN amplifier

PCR A PCR B
(extrmit dbordante (extrmit dbordante
sur lamorce sens) sur lamorce antisens)

Appariement du fragment de gne avec lextrmit dbordante correspondante
- Purification
- Mlange des produits issus des deux PCR
- Dnaturation par la temprature
Obtention de quatre simples brins Rhybridation temprature ambiante : 4 doubles brins
Complmentarit insert / vecteur

Exemple : insertion dans un vecteur pET

- Plasmide linaire pET LIC Novagen Hybridation Plasmide hybride

Remarque : le plasmide peut aussi tre gnr par PCR asymtrique